CN114787335B - 用于高产培养难培养厌氧微生物的培养基补充剂及包含其的培养基组合物 - Google Patents

用于高产培养难培养厌氧微生物的培养基补充剂及包含其的培养基组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包含N‑乙酰己糖胺、L‑天冬氨酸、L‑半胱氨酸及钴胺素的用于高产培养厌氧微生物的培养基补充剂、包含其的用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物及培养方法，根据本发明，可提供一种创新的方法，该方法可以高浓度培养高产培养极其困难的厌氧微生物，并且具有成本效益，特别是可以大规模培养适用于食品及药品用途的难培养厌氧微生物。

Description

用于高产培养难培养厌氧微生物的培养基补充剂及包含其的 培养基组合物
技术领域
本发明涉及用于高浓度培养难培养厌氧微生物的新型培养基补充剂、包含其的培养基组合物及利用其的养难培养厌氧微生物的高产培方法，更具体地，涉及能够大规模生产包括嗜黏蛋白阿克曼菌的难培养厌氧微生物，并适用于药品及食品用途的培养基补充剂、培养基组合物及培养方法。
背景技术
人类微生物组(human microbiome)是指定植于人体的微生物群落和这些微生物群落的基因组。微生物组被发现与人的健康密切相关，因此引起了很多关注。
随着无菌动物模型(germ-free animal model)、下一代测序(Next-GenerationSequencing，NGS)、多组学分析(multi-omics analysis)等生物技术领域研究技术的快速发展，不仅能够分析肠道微生物的组成和结构，还可以研究微生物组的功能与疾病的相关性，由此发表了更多的研究成果。微生物组治疗剂或者药用益生菌治疗剂(医用益生菌)最近引起了人们的关注，因为其可以用作尚无有效治疗剂的感染病、免疫性疾病、代谢性疾病的替代治疗剂。如果微生物组治疗剂或者药品益生菌治疗剂能够通过大规模生产实现商业化，则有望有利地适用于各种疑难杂症。
由于人体肠道内部处于厌氧状态，构成微生物组的微生物多为厌氧微生物，这些厌氧微生物中的大部分可用的碳源和氮源非常有限，而且具有对氧气极其敏感的专性厌氧的生理特性，因此很难以高浓度和大规模培养用于产业化。专性厌氧微生物极难培养，更难获得高生物质产量。
例如，栖息在大肠的黏膜层并且作为药品益生菌候选药物有前景的嗜黏蛋白阿克曼菌，通常可以通过向培养基中添加猪胃粘液素(hoggastric mucin)作为碳源和氮源进行培养(Derrien等人，2004)。另外，嗜黏蛋白阿克曼菌菌株也在哥伦比亚肉汤(CB)以及脑心浸液(BHI)肉汤中培养，而这些培养基均包含动物来源的成分，而且，可培养性低于大部分基于粘液素的培养基，因此只能增殖到通过添加粘液素的培养基而获得的最终光密度的一半。
由于动物-源性成分可能含有病毒或者细菌来源的污染物，或者可能含有过敏源、抗原肽或者其他不良产物，因此被认为不适合用于人类的食品或者药物用途的厌氧微生物培养。尽管迄今为止做出了相当大的努力，但是用于培养现有厌氧微生物的培养基组成挑剔，价格昂贵，而且无法高产培养厌氧微生物，因此具有不能用于特殊研究目的以外的其他产业用途的限制。
发明内容
技术问题
本发明是为了克服上述现有技术的限制以及问题，本发明的一目的在于，提供一种培养基补充剂及培养基组合物，产业上大规模培养用作微生物组治疗剂或者药品益生菌的厌氧微生物时，能够长期稳定地以高产量制备以适合用作药品、食品或者饲料。
本发明的另一目的在于，提供一种培养方法，能够经济地培养难培养厌氧微生物至高最终光密度。
解决问题的方案
用于解决上述问题的本发明的一方面，涉及一种包含N-乙酰己糖胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸及钴胺素的用于高产培养厌氧微生物的培养基补充剂。
本发明的培养基补充剂可包含5g/L的N-乙酰己糖胺、8g/L的L-天冬氨酸、0.5g/L的L-半胱氨酸及0.0001～0.005g/L的钴胺素。
上述厌氧微生物为人的肠道专性厌氧微生物，可以是普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)、嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)、白痢丁酸球菌(Butyricicoccus pullicaecorum)、食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)或者长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，但不限于此。
用于解决上述问题的本发明的再一方面，涉及，
一种用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物，包含植物蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾，其特征在于，包含果糖及乳糖作为碳源，包含N-乙酰己糖胺、L-天冬氨酸和L-半胱氨酸的氨基酸混合物及钴胺素作为补充剂。
本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物可含有2.5g/L的果糖、2.5g/L的乳糖、20g/L的植物蛋白胨、10g/L的酵母提取物、2.5g/L的磷酸氢二钾、5g/L的N-乙酰己糖胺、8g/L的L-天冬氨酸、0.5g/L的L-半胱氨酸及0.0001～0.005g/L的钴胺素。
上述植物蛋白胨可选自由大豆蛋白胨(soy peptone)、小麦蛋白胨(wheatpeptone)、棉花蛋白胨(cotton peptone)、豌豆蛋白胨(pea peptone)、蚕豆蛋白胨(broadbean peptone)、羽扇豆蛋白胨(lupin peptone)以及马铃薯蛋白胨(potatopeptone)组成的组中，但不限于此。
用于解决上述问题的本发明的另一方面，涉及一种厌氧微生物的高产培养方法，其特征在于，将厌氧微生物接种到上述的培养基组合物中，使其在厌氧条件下增殖。
上述培养步骤可在pH6.6～7.0、培养温度35～39℃、搅拌速度40～50rpm、氮饱和度80～90％、氢饱和度0～5％、二氧化碳饱和度5～20％的条件下进行。
本发明的厌氧微生物的高产培养方法，其特征在于，所培养的厌氧微生物达到通过平板计数法测定的活菌数1010CFU/mL以上的细胞密度。
发明的效果
根据本发明的各种实施例，产业上大规模培养用作微生物组治疗剂或者药品益生菌的厌氧微生物时，能够稳定地以高产量制备以适合用作药品、食品或者饲料。
根据本发明的培养基补充剂及培养基组合物，能够高浓度培养嗜黏蛋白阿克曼菌以适用于药品或者食品用途，上述嗜黏蛋白阿克曼菌是有前景的药品益生菌候选药物，但由于对氧气极其敏感，即使微量氧气也能被杀死，因此无法大规模生产。
在本发明的培养基补充剂或者培养用培养基中高产培养的厌氧微生物可广泛用于药品益生菌的药品、乳酸菌制剂、乳制品及益生菌。
附图说明
图1为示出嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的碳代谢过程的示意图。
图2为示出由天冬氨酸生物合成各种氨基酸的过程的示意图。
图3为示出在包含本发明的培养基补充剂的培养基中培养的厌氧微生物的每个菌种细胞的形态的照片。
图4为示出在本发明实施例中培养嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的培养器中的培养基的颜色随培养时间而变化的照片。
图5为示出嗜黏蛋白阿克曼菌的显微镜观察结果以及通过利用特异性引物进行的PCR分析结果来确认培养液纯度的结果。
图6为示出在添加有果糖的本发明的培养基中嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的生长曲线(A)以及pH(B)随培养时间而变化的图表。
图7为示出在添加有麦芽糖的本发明的培养基中嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的生长曲线(A)以及pH(B)随培养时间而变化的图表。
图8为示出在添加有果糖的本发明的培养基中，当仅利用高纯度氮气来培养时嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的生长曲线(A)以及pH(B)随培养时间而变化的图表。
具体实施方式
以下，将参照附图详细说明本发明。
在本发明中，术语“培养基(media)”或者“培养用培养基(culture media)”是指包含微生物生长或者增殖所需的所有营养素及必要的物理生长参数的固体、半固体或者液体培养基。
如本说明书所用，术语微生物的“培养”或者“生长”是指通过让微生物有机体在有利于其生长的条件下在规定培养用培养基中繁殖来使其增大。
在本发明中，培养基的“补充剂”是指由选定组分组成的添加物，以促进所需厌氧微生物的生长、增殖或者其他特征。
如本说明书所用，术语“厌氧微生物”是指由于对氧气敏感而在氧气的存在下不生长的微生物。厌氧微生物可包括专性(strict or obligate)厌氧微生物及兼性(facultative)厌氧微生物。
如本申请所用，术语“包含”及其变体当这些术语出现在说明书及权利要求书中时不具有限制意义。另外，在本说明书中，以终点(endpoint)表示的数值范围包括该范围内的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5等)。
本发明的一方面涉及包含N-乙酰己糖胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸及钴胺素的用于高产培养厌氧微生物的培养基补充剂。上述培养基补充剂可包含N-乙酰己糖胺5g/L、L-天冬氨酸8g/L、L-半胱氨酸0.5g/L及钴胺素0.0001g～0.005g/L。
本发明的培养基补充剂主要用于厌氧微生物的培养，而这些厌氧微生物为人的肠道专性厌氧微生物(gastrointestinal strict-anaerobic microorganism)。
这些厌氧微生物的例子可包括普氏栖粪杆菌、粪厌氧棒杆菌、嗜黏蛋白阿克曼菌、白痢丁酸球菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)或者长双歧杆菌，但不限于此。
本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基补充剂包含N-乙酰己糖胺(N-acetylhexosamines)。N-乙酰己糖胺(N-acetylhexosamines)可包括N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)或者N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，优选包括N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。图1为示出嗜黏蛋白阿克曼菌的碳代谢过程的示意图。参照图1，由于嗜黏蛋白阿克曼菌具有将乳糖转化为半乳糖和葡萄糖的酶β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，以及将麦芽糖转化为葡萄糖的酶α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，因此乳糖、麦芽糖、果糖等碳源均通过糖酵解(glycolysis)来用于形成高能量分子腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)。外部供给的N-乙酰葡糖胺(Glc-NAc)用于细胞壁合成(肽聚糖生物合成)以及能量代谢，N-乙酰葡糖胺代谢产生氨，氨可以中和细胞质也可以供给为氮源。除了N-乙酰葡糖胺(Glc-NAc)之外，还可以添加N-乙酰半乳糖胺(Gal-NAc)。
可包含约2.5～5g/L的上述N-乙酰己糖胺。
氨基酸对于维持在细胞培养用培养基中培养的细胞的代谢功能很重要。为了在高浓度培养厌氧微生物时保持良好的增殖，外部蛋白源是必不可少的。本发明人发现，各种氨基酸中的天冬氨酸和半胱氨酸的组合作为厌氧微生物的蛋白源或氮源非常有效。氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸等，可被嗜黏蛋白阿克曼菌降解的粘液素的特征为富含丝氨酸、氨酸、脯氨酸及半胱氨酸的氨基酸序列的重复结构。但是，在本发明中，可通过在这些氨基酸中添加天冬氨酸和半胱氨酸来高产增殖嗜黏蛋白阿克曼菌。天冬氨酸和半胱氨酸能够以D-形态及L-形态存在。
图2示出由天冬氨酸生物合成各种氨基酸的过程的示意图。参照图2，天冬氨酸可转化为苏氨酸及蛋氨酸生物合成的中间体高丝氨酸(homoserine)，可由天冬氨酸生物合成包括丝氨酸、脯氨酸的各种氨基酸。而且，天冬氨酸可通过增加合成核酸(nucleic acid)、脂肪酸(fatty acid)和谷胱甘肽(glutathione，一些细菌中非常重要的抗氧化剂)所需的磷酸戊糖(pentose phosphates)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的生成来改善对酸胁迫的抵抗力。并且，天冬氨酸生物合成赖氨酸(Lysine)和苏氨酸(Threoine)有助于一些菌种的增殖，天冬氨酸的摄入还增加了肠道微生物群的多样性。
本发明的培养基补充剂的组合物例如可分别包含约4～8g/L和约0.5～1g/L的天冬氨酸和半胱氨酸。
本发明的培养基补充剂包含钴胺素(cobalamin)，即维生素B12。钴胺素被细胞用作辅助因子。当培养用培养基不含粘液素时，需要大量的钴胺素以便厌氧微生物高密度生长。钴胺素可包含等同于钴胺素的化合物。例如，钴胺素可包含氰钴胺素、甲基钴胺素、腺苷钴胺素(adenosyl cobalamin)、羟钴胺素(hydroxyl cobalamin)以及其他功能相等的化合物。本发明的培养用培养基补充剂可包含约0.0001～0.005g/L的钴胺素。
维生素包括生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆素HCl、D-泛酸(hemiCa)、核黄素、硫胺素HCL等，然而，当培养基中加入钴胺素时，厌氧微生物的相对丰富度增加，即使添加其他维生素其效果与单独添加钴胺素的效果没有显著差异。嗜黏蛋白阿克曼菌的基因组分析中，确认到包括ATCC BAA-835菌株和EB-AMDK19菌株的大多数菌株具有与B族维生素(B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9)的生物合成(biosynthesis)相关的基因，但没有与维生素B12的生物合成相关的基因。并且，在嗜黏蛋白阿克曼菌中，钴胺素可作为琥珀酸合成丙酸的重要辅酶。
本发明的另一方面涉及一种包含本发明的培养基补充剂的用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物。
当通过大规模培养进行产业生产时，用于准备本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物的基础培养基优选为液体培养基，其可以为包含植物蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾的培养基。
本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物基于包含植物蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾的培养基，并包含果糖及乳糖作为碳源，包含N-乙酰己糖胺、L-天冬氨酸和L-半胱氨酸的氨基酸混合物及钴胺素作为补充剂。
本发明的培养基组合物适用于厌氧微生物，特别是专性厌氧微生物的培养。专性厌氧微生物的非限制性例子包括普氏栖粪杆菌、粪厌氧棒杆菌、嗜黏蛋白阿克曼菌、白痢丁酸球菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌或者长双歧杆菌，但不限于此。本发明的培养基组合物尤其适用于以产业规模高产培养阿克曼氏菌属，特别是嗜黏蛋白阿克曼菌。
本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物可含有20g/L的植物蛋白胨、10g/L的酵母提取物、2.5g/L的磷酸氢二钾、2.5g/L的果糖、2.5g/L的乳糖、5g/L的N-乙酰己糖胺、8g/L的L-天冬氨酸、0.5g/L的L-半胱氨酸及0.0001～0.005g/L的钴胺素。
本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基可包含植物蛋白胨。植物蛋白胨为植物蛋白水解产物(hydrolysate)。其可以来源于任何植物。上述植物蛋白胨例如可选自由大豆蛋白胨(soy peptone)、小麦蛋白胨(wheat peptone)、棉花蛋白胨(cotton peptone)、豌豆蛋白胨(pea peptone)、蚕豆蛋白胨(broadbean peptone)、羽扇豆蛋白胨(lupinpeptone)以及马铃薯蛋白胨(potato peptone)组成的组中。上述植物蛋白胨例如可包含约15～20g/L的上述植物蛋白胨。
本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基包含酵母提取物。当添加酵母提取物时，蛋白源的增加可进一步增加非-动物来源的培养基中的厌氧微生物地增殖。酵母提取物可以为酵母自溶物(autolysate)、经过超滤的酵母提取物或者合成酵母提取物。酵母提取物的浓度可以为5g/L至10g/L，如约10g/L。
本发明的培养基还含有含磷酸盐成分，如Na2HPO4、K2HPO4或者KH2PO4。将这些成分加入至细胞培养用培养基中以维持等渗条件并防止渗透失衡。本发明的培养基组合物的pH保持在6.5至8.0，优选6.0至7.0，更优选大约pH6.8±1。
本发明的用于高产培养厌氧微生物的培养基组合物包含果糖和乳糖作为碳源及能量源，可任选地进一步包含麦芽糖。果糖或者麦芽糖的浓度可以为2.5g/L至5.0g/L，如约2.5g/L。
也可以包含葡萄糖作为碳源，但是当添加葡萄糖时，虽然会引起微生物的指数生长，但不会持续很长时间。葡萄糖可以基于通过β(1→4)-糖苷键与半乳糖连接的乳糖来提供，并且N-乙酰葡糖胺和葡萄糖可在代谢途径中相互转化，因此果糖和乳糖的组合比葡萄糖更优选。
在本发明中，培养用培养基为包含多个组分的“粉末培养基(powdered medium)”，或者“浓缩培养基(concentrated medium)”，以常规粉末或者浓缩物的形态提供，或者与规定体积的水结合以向液体培养基提供所需浓度的特定组分。这种粉末培养基或者浓缩培养基在使用前，可溶解在适宜的水，通常为无菌水。
在本发明中，培养基或者培养基组合物包括适合培养厌氧微生物的浓度的组分的最终培养基，以及适合稀释的粉末或者浓缩培养基。
本发明的培养用培养基可任选地包含用于培养厌氧微生物的还原剂。适宜的还原剂可降低培养用培养基的氧化还原电位，去除溶解氧(oxygen scavanger)，从而促进厌氧微生物的生长。适宜的还原剂例如包含巯基乙酸钠、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、硫化钠(Na2S)及其组合，但不限于此。
根据本发明一实施例，本发明的培养基的厌氧性可通过利用氮气(N2)、氢气(H2)以及二氧化碳(CO2)以100：0：0至90：5：5的体积比混合而成的混合气体置换培养基中的氧气来组成。根据本发明一实施例，培养基中的气压可以为0.1至0.3atm，优选为0.2atm(0.02MPa)。
本发明的另一方面，涉及一种厌氧微生物的高产培养方法，其特征在于，将厌氧微生物接种到上述说明的本发明的培养基组合物中，使其在厌氧条件下增殖。
如本领域技术人员熟知的，微生物的培养条件可以影响微生物的生长速度。在本发明中，培养步骤可在以下条件下实施：pH6.6～7.0、培养温度35～39℃、搅拌速度40～50rpm、氮饱和度80～90％、氢饱和度0～5％、二氧化碳饱和度5～20％。
在本发明中，厌氧微生物的培养进行至细胞密度为0.6以上，其通过利用酶标仪在600nm的波长处测定的光密度(OD600)来确定，此时，可以高浓度培养，以达到活菌数1010CFU/mL以上的细胞密度，如通过平板计数法测定的。
厌氧微生物高浓度培养的培养温度优选为35～39℃，特别是36～38℃。在培养时，可以搅拌接种有微生物群落悬浮液的组合物。例如，培养器的每分钟转速(rpm)可以为40rpm至50rpm，但不限于此。培养时间可以根据厌氧微生物的生长状态适当调整，通常为20～100小时，特别是24～48小时左右为宜。
根据本发明一实施例，本发明的培养基的厌氧性可通过利用氮气(N2)、氢气(H2)以及二氧化碳(CO2)以90：5：5至80：0：20的体积比混合而成的混合气体置换培养基中的氧气来组成。以1mL的培养基体积为基准，利用混合气体置换培养基中的氧气，优选进行30秒以上，最优选2分钟。
嗜黏蛋白阿克曼菌在代谢途径中使用氢离子进行腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成，在厌氧条件下，氢气(H2)对Ni依赖性氢化酶(Ni-dependent hydrogenase)的厌氧呼吸很重要。因此，为了在本发明的培养基中高浓度培养嗜黏蛋白阿克曼菌EB-AMDK19菌株，需要注入含有氢气的混合气体或者含有能溶于水并生成碳酸和氢离子的二氧化碳的气体。
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于此。除非另有说明，本实施例中提及的所述份数及百分比均以重量计，所有温度均以摄氏度表示。
并且，在以下实施例中，厌氧微生物的浓度(生物质的产生量)通过在培养期间使用分光光度计测定600nm处的培养液的光密度来获得。ΔOD计算为培养初期与培养48小时(或者72小时)后吸光度的差值。
实施例
实施例1：培养用培养基中粘液素替代成分组成的优化
基于胰酪大豆胨液体培养基(Tryptic Soy Broth，TSB)，探索了可以替代粘液素的底物及成分的最佳组合。为此，如表1所示，在每种准备的培养基中以0.1％v/v的比例接种嗜黏蛋白阿克曼菌EB-AMDK19(KCTC13761BP)菌株后，在37℃、厌氧条件(90％的N2、5％的CO2、5％的H2)下培养24～48小时，测定光密度(OD600)的变化，其结果见下表1。
表1
嗜黏蛋白阿克曼菌菌株在TSB培养基中几乎没有增殖，但当添加N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和苏氨酸作为能够替代粘液素的成分时可以培养。然而，当用天冬氨酸(Aspartate)代替苏氨酸时，在相同浓度(4g/L)下可培养性得到改善，并且可培养性增加至添加最大8g/L浓度的天冬氨酸时。
如上表1所示，基于TSB在添加有N-乙酰葡糖胺、乳糖、天冬氨酸及维生素的培养基中的吸光度的变化量为0.4左右，此时测定的活菌数为109CFU/mL，与此相比，PM培养基中的吸光度的变化量为0.1左右，此时测定的活菌数为108CFU/mL，与TSB培养基相差10倍以上。
这被认为是因为草酰乙酸/天冬氨酸氨基酸家族由赖氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、苏氨酸及异亮氨酸组成，并且天冬氨酸在代谢过程中可转化为赖氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸及苏氨酸。
实施例2：在具有不同碳源的培养基中的可培养性比较
为了排除动物来源的成分或者使用动物来源的酶制备的成分，基于植物蛋白胨和酵母提取物，对本发明的培养基补充剂的厌氧微生物的可培养性进行了测试。
将大豆蛋白胨作为植物蛋白胨和酵母提取物分别以5、10、15、20g/L的浓度相互组合进行测试，结果，20g/L浓度的大豆蛋白胨和10g/L浓度的酵母提取物的组合表现出最佳的可培养性，以2.5g/L的浓度添加磷酸氢二钾用于调节pH，从而制备基础培养基。
为了研究影响厌氧微生物嗜黏蛋白阿克曼菌可培养性的碳源，如下表2所示，将各种碳源添加至氮源基础培养基中，并以0.1％v/v的比例接种嗜黏蛋白阿克曼菌EB-AMDK19(KCTC13761BP)菌株后，在37℃、厌氧条件(90％的N2、5％的CO2、5％的H2)下培养24～48小时后，测定光密度(OD600)的变化，其结果见下表3。
表2
表3
如上表3所示，相对于以乳糖作为碳源并添加N-乙酰葡糖胺或添加N-乙酰葡糖胺和葡萄糖的情况，添加果糖时嗜黏蛋白阿克曼菌菌株表现出更加优异的可培养性。吸光度的变化量(ΔOD)平均0.5～0.6左右，测定活菌数为约1010CFU/mL，从而证实本发明的培养基中的活菌数增加了10～100倍，可培养性得到显著提高。并且，当添加两个葡萄糖分子通过β(1→4)-糖苷键连接的麦芽糖(Maltose)时，与添加葡萄糖时相比，可培养性得到改善。
实施例3：选择对改善可培养性重要的B族维生素
在本实施例中，确认了将B族维生素添加至嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的培养用培养基中是否改善了可培养性。为了选择影响厌氧微生物的增殖的特定维生素，对属于B族维生素的所有维生素(B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B10、B12)中的每一种或者维生素B复合体进行了测试。
如表4所示，在每种准备的培养基中以0.1％v/v的比例接种嗜黏蛋白阿克曼菌菌株后，在37℃、厌氧条件(90％的N2、5％的CO2、5％的H2)下，培养24～48小时，测定光密度(OD600)的变化，其结果见下表4。
表4
如上表4所示，只有当培养基中含有氰钴胺素(维生素B12)(B12、B2+B6+B9+B12、B1+B2+B3+B5+B6+B7+B9+B12或者B1+B2+B3+B5+B6+B7+B9+B10+B12)时，可培养性增加，单独添加维生素B12与添加B族维生素复合体相比没有显著差异。
并且，为了找到钴胺素的最佳浓度，在改变钴胺素的浓度的同时进行培养后，测定光密度(OD600)的变化，其结果见下表5。
表5
如上表5所示，确定添加至培养基的维生素B12的最佳浓度的结果发现，在小于1mg/L的浓度下可培养性逐渐降低，在0.1mg/L至5mg/L的浓度下可培养性没有显著差异，因此认为0.1mg/L的浓度时最合适的。
实施例4：培养基成分的优化
为了探索厌氧微生物高浓度培养所需的必需组分及最佳组合，在相同条件下，在具有各种成分组合的培养基中培养嗜黏蛋白阿克曼菌菌株。其结果见下表6。
表6
研究各成分对本发明的培养基中培养的影响的结果证实，在上述组合中，单糖的含氮气衍生物N-乙酰葡糖胺被确定为对嗜黏蛋白阿克曼菌培养最必需的成分，N-乙酰葡糖胺以及共享部分代谢途径的碳源果糖和乳糖为高浓度培养必要成分。确认到主要氨基酸源大豆蛋白胨、天冬氨酸以及氰钴胺素的组合为改善可培养性的重要成分。
麦芽糖可以替代葡萄糖或者果糖，培养初期增殖速度与果糖或葡萄糖相比更快，可培养性也没有显著差异。但是，目前麦芽糖与果糖或葡萄糖相比价格稍贵，因此果糖可被认为是最合适的产业培养基。综上所述，如上表6所示，可以确认本发明的培养基中的所有组分均为高浓度培养嗜黏蛋白阿克曼菌菌株所需的，当所有成分组合时，表现出最佳的可培养性。
实施例5：本发明的培养基中各种嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的可培养性确认
除了使用上表2所示的培养基并且如下表7中所示改变培养菌株的种类之外，以与实施例1相同的方式进行实验。以0.1％v/v的比例接种嗜黏蛋白阿克曼菌菌株后，在37℃、厌氧条件(90％的N2、5％的CO2、5％的H2)下培养24～48小时，测定光密度(OD600)的变化，其结果见下表7。
表7
如上表7所示，通过使用本发明的培养基来确认嗜黏蛋白阿克曼菌标准菌株(ATCCBAA-835T)以及不同嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的可培养性的结果发现，所有嗜黏蛋白阿克曼菌菌株具有相似的培养水平，因此，可用作所有嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的高浓度培养培养基。
实施例6：各种难培养专性厌氧微生物的可培养性比较
除了如下表8中所示的改变培养菌株的种类之外，以与实施例1相同的方式进行实验。以0.1％v/v的比例接种普氏栖粪杆菌、粪厌氧棒杆菌或者长双歧杆菌菌株后，在37℃、厌氧条件(90％的N2、5％的CO2、5％的H2)下培养24～48小时，测定光密度(OD600)的变化，其结果见下表8。为了比较，还在已知表现出优异的可培养性的对照培养基中培养，以与本发明的培养基中的可培养性进行比较。作为对照培养基，在相同条件下，F.prausnitzii在补充有5g/L的酵母提取物、1g/L的纤维二糖及1g/L的麦芽糖的脑心浸液培养基(Brain HeartInfusion，BHI)中培养。A.caccae在补充有5g/L的酵母提取物的TSB培养基中培养，B.longum在BL肉汤培养基中培养。
表8
如上表8所示，普氏栖粪杆菌、粪厌氧棒杆菌等难培养专性厌氧微生物以及长双歧杆菌的可培养性测试结果表明，与已知具有优异的可培养性的对照培养基相比，本发明的培养基具有更优异的可培养性。
实施例7：大规模培养工艺条件的优化-每种培养条件下的可培养性比较分析
使用如图4所示的3L规模的厌氧发酵系统以及表2的培养基中碳源的种类改变的培养基，在下表9所示的条件下进行培养，并且确认嗜黏蛋白阿克曼菌菌株的生长曲线(growth curve)以及pH的变化。另外，细菌数量和形态变化通过显微镜观察确认并显示在图5，平活菌数利用平板计数法(plate count method)测定并显示在表10。
表9
表10
使用本发明的培养基在厌氧发酵系统中培养嗜黏蛋白阿克曼菌EB-AMDK19菌株的结果证实，在接种后5～25小时出现指数生长期，pH在9～18.5小时也急剧发生变化。在培养24小时的基础上，光密度(OD600)为0.798左右，此时测定的活菌数为5.5×1010CFU/mL(参照图6及表10)。
确认到，在本发明的培养基中用麦芽糖替代果糖时，在接种后3.5～21小时出现指数生长期，pH在7～14小时也急剧发生变化。与使用果糖培养的结果相比，含有麦芽糖的本发明的培养基中的滞后期缩短了1.5小时，在培养24小时的基础上，吸光度略微降低至0.632左右，而此时测定的活菌数为5.1×1010CFU/mL，无显著差异(参照图7及表9)。
在包含果糖的本发明的培养基中，使用更经济且更适合产业化的无氢气的气体{高纯度氮气(100％的N2)或者由80％的N2和20％的CO2组成的混合气体}代替混合气体(90％的N2、5％的CO2、5％的H2)进行培养，在高纯度氮气的情况下，可培养性显著低于常规培养，但是在由80％的N2和20％的CO2组成的气体中的可培养性无显著差异(参照图8及表10)。
并且，如上表10所示，确认到本发明的培养基中的所有组分均为高浓度培养嗜黏蛋白阿克曼菌菌株所需的，并且需要注入额外的包含氢气或者二氧化碳的混合气体。

Claims (6)

1.一种用于培养厌氧微生物的培养基组合物，包含15g/L至20g/L的植物蛋白胨、5g/L至10g/L酵母提取物、磷酸氢二钾，其特征在于，包含乳糖以及从果糖和麦芽糖中选出的至少一种作为碳源，包含2.5g/L至5g/L的N-乙酰己糖胺、4g/L至8g/L的L-天冬氨酸和0.5g/L至1g/L的L-半胱氨酸的氨基酸混合物及0.0001g/L至0.005g/L的钴胺素作为补充剂，其中果糖或者麦芽糖的含量为2.5g/L至5.0g/L，其中培养基组合物的pH保持在6.5至8.0，并且
其中上述厌氧微生物从普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)、嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)或者长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中选出。
2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，上述培养基组合物包含20g/L的植物蛋白胨、10g/L的酵母提取物、2.5g/L的磷酸氢二钾、2.5g/L的果糖、2.5g/L的乳糖、5g/L的N-乙酰己糖胺、8g/L的L-天冬氨酸、0.5g/L的L-半胱氨酸及0.0001～0.005g/L的钴胺素。
3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，上述植物蛋白胨选自由大豆蛋白胨、小麦蛋白胨、棉花蛋白胨、豌豆蛋白胨、蚕豆蛋白胨、羽扇豆蛋白胨以及马铃薯蛋白胨组成的组中。
4.一种厌氧微生物的培养方法，其特征在于，将厌氧微生物接种到权利要求1至3中任一项所述的培养基组合物中，使其在厌氧条件下增殖，
其中上述厌氧微生物从普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)、嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)或者长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中选出。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，上述培养步骤在pH6.5～7.0、培养温度35～39℃、搅拌速度40～50rpm、氮饱和度80～90％、二氧化碳饱和度5～20％及氢饱和度0～5％的条件下进行。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所培养的厌氧微生物达到通过平板计数法测定的活菌数1010CFU/mL以上的细胞密度。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3132176C (en) * 2020-11-11 2023-03-14 Enterobiome Inc. Medium supplement for high-yield industrial culture of fastidious anaerobes and medium composition containing the same
WO2024177567A1 (en) * 2023-02-20 2024-08-29 National University Of Singapore Method of enhancing vitamin b12 production in plant-based media

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018106844A1 (en) * 2016-12-06 2018-06-14 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to isolated and purified microbes
CN110079474A (zh) * 2019-04-12 2019-08-02 沈阳药科大学 一种高密度培养艾克曼嗜黏蛋白菌的方法
WO2020079026A1 (en) * 2018-10-15 2020-04-23 Pharmabiome Ag A method of manufacturing a consortium of bacterial strains

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130021920A (ko) 2011-08-24 2013-03-06 포항공과대학교 산학협력단 Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ 또는 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물
KR101740893B1 (ko) 2014-05-20 2017-06-13 주식회사 엠디헬스케어 Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ 균에서 유래하는 세포밖 소포를 유효성분으로 함유하는 대사질환의 치료 또는 예방용 조성물
KR20240001261A (ko) * 2015-05-06 2024-01-03 바게닝겐 유니버시테이트 아커만시아의 배양 방법
KR101809172B1 (ko) 2016-07-11 2017-12-14 한국생명공학연구원 뮤신이 없는 배지에서 배양한 아커만시아 뮤시니필라 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102197180B1 (ko) 2018-10-11 2020-12-31 주식회사 고바이오랩 아커만시아 뮤시니필라 균주 및 이를 포함하는 식욕 억제 및 대사성 질환 예방, 개선, 완화 및 치료용 조성물
CA3132176C (en) * 2020-11-11 2023-03-14 Enterobiome Inc. Medium supplement for high-yield industrial culture of fastidious anaerobes and medium composition containing the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018106844A1 (en) * 2016-12-06 2018-06-14 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to isolated and purified microbes
CN110267669A (zh) * 2016-12-06 2019-09-20 潘德勒姆治疗公司 与分离并纯化的微生物有关的方法和组合物
WO2020079026A1 (en) * 2018-10-15 2020-04-23 Pharmabiome Ag A method of manufacturing a consortium of bacterial strains
CN110079474A (zh) * 2019-04-12 2019-08-02 沈阳药科大学 一种高密度培养艾克曼嗜黏蛋白菌的方法

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