KR102051482B1

KR102051482B1 - 헤모필루스 인플루엔자에 비형 항원의 생산 방법

Info

Publication number: KR102051482B1
Application number: KR1020157002676A
Authority: KR
Inventors: 제로미 르 히르; 파스칼 로우비에레; 페비엔 발비라토; 니콜라스 린들레이
Original assignee: 사노피 파스퇴르 에스에이
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2019-12-03
Also published as: SI2885397T1; TR201810678T4; CA2878053C; US20170211111A1; ES2681993T3; KR20150036311A; SG11201408194SA; DK2885397T3; BR112014033082A2; US10144940B2; CA2878053A1; PL2885397T3; CY1120465T1; IL236208A0; ZA201500028B; PH12014502730B1; HUE038865T2; RU2644246C2; HRP20181206T1; PE20150192A1

Abstract

본 발명은 산업적인 규모의, 백신용으로 사용되는 헤모필루스 인플루엔자에 b형의 캡슐 폴리사카라이드(PRP)의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 방법에 따라 헤모필루스 인플루엔자에 b형(Hib)의 균주를 배양 배지에서 배양하고, 배양 상등액을 수확하고 이로부터 캡슐 폴리사카라이드를 추출하기 위해서 처리하며, 상기 배양 배지는 적어도 -하나의 탄소 공급원, -프로토포르피린, -염, -아미노산, -NAD 또는 NADH, -비타민, -pH 조절 수단을 포함하고, 화학적으로 한정됨을 특징으로 한다.

Description

헤모필루스 인플루엔자에 비형 항원의 생산 방법{METHOD FOR PRODUCING HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B ANTIGENS}

본 발명은 산업적인 규모의, 헤모필루스 인플루엔자에 b형(Hib)의 캡슐 폴리사카라이드의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 방법에 따라 Hib의 균주를 특정한 배양 배지에서 배양하고, 상기 배지의 조성은 화학적으로 한정되며 따라서 질소 또는 탄소의 복합 공급원을 포함하지 않는다.

종래 기술, 및 특히 출원 WO2009/007641은, 헤모필루스 인플루엔자에 b형의 배양 목적이 백신 조성물에 항원으로서 후속 도입되는 캡슐 폴리사카라이드를 생산하는 것인 경우 권장되는 바와 같이, 동물 공급원으로부터의 어떠한 원소로 포함하지 않는 헤모필루스 인플루엔자 b형의 개선된 배양 배지를 개시한다. 상기 종래 기술에서 개시된 배지에서, 대개 동물 펩톤으로 이루어지는 질소의 공급원은 식물 펩톤으로 대체된다.

상기와 같은 배지는 특히 소 해면상 뇌염과 같은 질병의 전염 위험성의 제거에 관한 약품의 안전성에 관하여 큰 진보를 나타내며; 따라서 보건당국 권장사항에 부합될 수 있게 한다.

그러나, 상기 펩톤류의 조성은 제공되는 배치에 따라 변할 수 있으며, 이는 생성되는 세균량 및 또한 관심 항원의 수율의 변화를 도출할 수 있고, 이는 백신 생산자로 하여금 상기 공정의 실행 동안 특정 매개변수들을 변경시킴으로써 제한이나 교정을 시도하게 한다. 그러나, 약품의 산업적인 생산과 관련하여, 각각의 실행에서 가능한한 적은 변경이 요구되는 확고한 공정을 이용할 수 있고 각각의 단계에서 하나의 배치에서부터 또 다른 배치에 이르기까지 상기 공정의 결과의 재현이 가능한 것이 바람직할 수 있다.

상기와 같은 공정은 또한, 세균으로부터 항원을 생산하는 경우에, 단지 최대로 가능한 양의 세균을 수득하는 것뿐만 아니라 항원 역가와 생산되는 세균량간에 최상의 비를 획득하기 위해서, 기준은 아니지만, 산업적 수익성에 적합한 수율을 허용해야 하며; 따라서 상기 세균을 그의 대사가 캡슐 폴리사카라이드의 생산을 향하게 하는 조건 하에서 배양하는 것이 바람직하다.

이를 위해서, 본 발명의 주제는 산업적인 규모의, 헤모필루스 인플루엔자에 b형의 캡슐 폴리사카라이드(PRP)의 생산 방법이며, 상기 방법에 따라 헤모필루스 인플루엔자에 b형(Hib)의 균주를 배양 배지에서 배양하고, 배양 상등액을 수확하고 상기로부터 상기 캡슐 폴리사카라이드를 추출하기 위해서 처리하며, 상기 배지는 적어도:

-하나의 탄소 공급원,

-프로토포르피린,

-염,

-아미노산,

-NAD 또는 NADH,

-비타민,

-pH 조절 수단

을 포함하고, 화학적으로 한정됨을 특징으로 한다.

본 발명에 의해서, 확고한 산업 공정을 가질 수 있으며 바이오매스를 상응하게 증가시킬 필요 없이 캡슐 폴리사카라이드의 생산을 증가시킬 수 있고, 이에 의해 생산되는 PRP에 비해 생산되는 리포폴리사카라이드(LPS)의 양을 감소시킬 수 있다.

또한, 상기 배양 배지의 조성물 중 단백질의 부재는 소포제에 관해 요구되는 필요성을 감소시키고, 배양 상등액으로부터 상기 캡슐 폴리사카라이드로 이루어지는 항원을 수득할 수 있게 하는 정제 단계를 단순화한다.

본 발명에 따라, 상기 배양 배지는 pH-조절 수단을 포함한다. 상기 pH-조절 수단은 상기 배지에 산 또는 염기를 첨가하기 위한 수단과 함께 pH-측정 수단 및/또는 완충염으로 이루어질 수 있다. 상기 수율을 상기 pH의 조절을 통해 최적화할 수 있다.

하나의 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 방법은 또한 파상풍 단백질과 같은 담체 단백질에 상기 생성되는 PRP를 접합시키는 것이다.

본 발명의 주제는 또한 백신 조성물의 제조 방법이며, 상기 방법에 따라:

- 캡슐 폴리사카라이드(PRP)로 이루어지는, 헤모필루스 인플루엔자에 b형(Hib)에 대한 항원을 산업적인 규모로, Hib의 균주를 각 배지 구성성분의 성질 및 양이 완벽하게 한정되고 적어도 하기를 포함하는 화학적으로 한정된 배지에서 배양함으로써 제조하고:

-하나의 탄소 공급원,

-프로토포르피린,

-염,

-아미노산,

-NAD 또는 NADH,

-비타민, 및 또한

-pH 조절 수단;

- 상기 배양 상등액을 수확하고 이로부터 정제된 캡슐 폴리사카라이드를 추출하기 위해서 처리하고,

- 상기 캡슐 폴리사카라이드를 담체 단백질에 접합시킨다.

하나의 실시태양에 따라, 상기 수득된 접합체를 또한, 여러 질병들에 대한 동시 면역화를 허용하는 백신 조합을 획득하기 위해서 하기의 감염들 중 하나 이상에 대한 백신화를 목적으로 하는 하나 이상의 항원과 병용한다: 디프테리아, 파상풍, 소아마비, B형 간염, 수두, 이하선염, 풍진, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 또는 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)에 의해 유발된 감염, 로타바이러스에 의해 유발된 감염.

본 발명에 따르면, 상기 배양 배지는 화학적으로 한정된다, 즉 각 구성성분들의 화학 구조 및 또한 양은 공지되어 있다. 상기와 같은 배지는 질소 또는 탄소의 복합 공급원, 예를 들어 펩톤, 카제인, 혈청 등이 없으며, 따라서 경우에 따라, 동물로부터 직접 기원하는 원소를 함유하지 않음이 보증될 수 있다.

본 발명은 산업적인 규모의, 헤모필루스 인플루엔자 b형의 캡슐 폴리사카라이드의 생산 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 방법은 산업적인 구속에 양립될 수 있는 바이오매스 및 캡슐 폴리사카라이드 또는 PRP의 수율을 획득할 수 있게 한다. 상기와 같은 방법은 특히, 배지의 특정한 조절(예를 들어 pH 또는 pO₂) 없이 유전 암호 중에 캡슐 합성을 가능하게 하는 작용들을 암호화하는 cap 유전자좌의 2 개 이상의 사본을 갖는 헤모필루스 인플루엔자 b형 균주로부터, 12 시간의 배양 후에 694 ㎚에서 2.4 이상의 O.D.에 상응하는 바이오매스 및 적어도 240 ㎎/배양배지 리터의 관련된 양의 PRP를 수득하게 할 수 있다. 상기 생성되는 PRP의 양의 측정을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피-펄스화된 전류측정(HPAEC-PAD) 기법(다이오넥스(Dionex)), 또는 동등한 결과를 제공하는 방법에 의해 측정한다. 유리하게, 본 발명에 따른 방법은 적어도 270 ㎎/배양배지 리터, 및 훨씬 더 유리하게는 적어도 300 ㎎/리터 량의 PRP를 수득할 수 있게 한다.

탄소의 가능한 공급원들 중에서, 상기 헤모필루스 인플루엔자에 b형 균주에 의해 대사될 수 있는 모든 공급원들, 특히 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 글리세롤, 자일로스, 리보스, 퓨코스, 시알산 및 락테이트를 들 수 있다. 또한 2 개 이상의 상이한 공급원, 특히 락테이트 및 글루코스를 사용하는 것도 가능하다. 본 발명에 따라, 출발 배지 중에 존재하는 글루코스의 양은 5 내지 25 g/ℓ, 보다 특히 10 내지 20 g/ℓ, 및 보다 특히 12 내지 16 g/ℓ이다.

상기 출발 배지 중에 존재하는 락테이트의 양은 0 내지 15 g/ℓ, 및 보다 특히 0.5 내지 10 g/ℓ일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 상기 배지의 프로토포르피린은 합성 프로토포르피린, 예를 들어 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사에 의해 참조번호 258385(프로토포르피린 이나트륨염)로 제공되는 것이다. 따라서, 동물 기원의 물질이 전혀 없음을 보증할 수 있는 배지를 사용할 수 있다. 한편으로, 합성 프로토포르피린 IX가 사용되며, 이의 화학식은 하기와 같다:

상기 식에서,

R은 H, 또는 대이온, 바람직하게는 알칼리 금속, 특히 나트륨의 대이온을 나타낸다.

상기와 같은 프로토포르피린 IX, 및 그의 제조 방법은 특허 출원 FR 2 914 302에 개시되었다.

본 발명에 따라, 상기 출발 배지 중에 존재하는 프로토포르피린의 양은 유리하게는 0.1 내지 10 ㎎/ℓ, 및 보다 특히 0.25 내지 2 ㎎/ℓ이다.

본 발명에 따른 배양 배지는 세포 생육에 필요한 미네랄을 제공하는 염을 포함하며, 상기 염은 세균에 유리한 삼투압을 보장하고 또한 pH에 대한 완충 능력을 발휘할 수 있게 한다. 바람직하게, 1가 양이온, 예를 들어 Na⁺ 및/또는 K⁺, 2가 양이온, 예를 들어 Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Co⁺⁺, Zn⁺⁺, Mn⁺⁺, Fe⁺⁺, HPO₄ ^--, H₂PO₄ ^- 및/또는 PO₄ ^--- 형태의 포스페이트 음이온 및 염수 용액 형태의 SO₄ ^-- 및 Cl^- 음이온의 혼합물이 사용되며, 이들 각각의 몰농도는 대개 10^-4 mM 내지 1000 mM의 농도 범위내에서 변할 수 있다.

상기 배양 배지 중에 존재하는 염은 특히 하기 중에서 선택된다: K₂HPO₄; KH₂PO₄; MgSO₄.7H₂O; Na₂HPO₄.12H₂O; NaH₂PO₄.2H₂O; CaCl₂.2H₂O; FeSO₄.7H₂O; ZnSO₄.7H₂O; CoCl₂.6H₂O; MnSO₄.H₂O.

상기 염 농도를 200 내지 700 밀리오스몰/ℓ, 특히 300 내지 400 밀리오스몰/ℓ, 특히 350 밀리오스몰/ℓ의 오스몰 농도, 및 6.5 내지 7.5 범위의 pH를 갖도록 선택한다.

이 때문에, 본 발명에 따른 배양 배지는 특히 하기를 포함할 수 있다:

- 150 내지 1500 ㎎/ℓ 농도의 MgSO₄.7H₂O,

- 6.5 내지 52 ㎎/ℓ 농도의 CaCl₂.2H₂O,

- 1.25 내지 10 ㎎/ℓ 농도의 FeSO₄.7H₂O,

- 2.5 내지 80 ㎎/ℓ 농도의 ZnSO₄.7H₂O,

- 0.5 내지 2 ㎎/ℓ 농도의 CoCl₂.6H₂O,

- 2.5 내지 10 ㎎/ℓ 농도의 MnSO₄.H₂O,

- 0 내지 4 ㎖/ℓ 량으로 60%의, 특히 나트륨 락테이트 형태의 나트륨,

- 완충 효과가 Na₂HPO₄.12H₂O/NaH₂PO₄.2H₂O에 의해 제공되는 경우, 각각 100 내지 1200 ㎎/ℓ 농도의 K₂HPO₄ 및 KH₂PO₄,

- 15 내지 120 g/ℓ 농도의 Na₂HPO₄.12H₂O,

- Na₂HPO₄.12H₂O보다 10 내지 30 배 더 낮은 농도의 NaH₂PO₄.2H₂O.

한편으로, 상기 완충 효과는 K₂HPO₄/KH₂PO₄ 쌍에 의해 제공될 수 있으며; 이 경우에, 상기 K₂HPO₄ 농도는 15 내지 120 g/ℓ이고, KH₂PO₄ 농도는 K₂HPO₄ 보다 10 내지 30 배 더 낮고; 상기 Na₂HPO₄.12H₂O 및 NaH₂PO₄.2H₂O의 농도는 100 내지 1200 ㎎/ℓ일 수 있다.

상기 언급된 염들 중에서, 아연의 존재가, 특히 2.5 내지 80 ㎎/ℓ, 또는 보다 특히 5 내지 20 ㎎/ℓ 범위의 농도로, 바이오매스 및 PRP의 생산에 특히 유리함을 주목할 수 있었다. 매우 양호한 결과가 20 ㎎/ℓ의 농도에서 획득되었다.

상기 배양 배지의 pH를 배양 단계 동안, 특히 NaOH 또는 KOH와 같은 매우 농축된 염기의 첨가에 의해 조절하는 경우에, 상기 배지 중에 존재하는 염의 양, 및 특히 완충제 쌍 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 또는 K₂HPO₄/KH₂PO₄의 양을 감소시키는 것이 가능하나, 단 오스몰 농도를 NaCl의 임의의 첨가를 통해 적합한 값, 즉 200 내지 700 mOsm/ℓ로 유지시켜야 한다.

본 발명에 따라, 상기 배양 배지는 또한 NAD 또는 NAD의 공급원, 또는 임의의 다른 등가의 조효소의 공급원을 포함한다. NAD(또는 β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드)(또한 조효소 I 또는 인자 V라 칭한다)는 헤모필루스 인플루엔자에 b형의 배양에 필수적인 생육 인자이다. 상기는 0.5 내지 50 ㎎/ℓ, 및 보다 특히 2 내지 10 ㎎/ℓ, 특히 5 ㎎/ℓ 배양배지의 농도로 존재하는 것이 유리하다. 상기를 그의 NADH 환원된 형태로 상기 배지에 도입시킬 수 있다. NAD에 대한 대안으로, 본 발명에 따른 배양 배지는 세균이 사용할 수 있는 NAD 전구체 요소, 예를 들어 NADP/NADPH(β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트) 또는 NMN(β-니코틴아미드 아데닌 모노뉴클레오타이드) 또는 NR(니코틴아미드 리보사이드), 3-아세틸피리딘 아데닌 다이뉴클레오타이드(APAD) 또는 3-아세틸피리딘 모노뉴클레오타이드(APMN)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 배양 배지는 유리하게는 하기 중에서 선택되는 아미노산을 함유한다: 아르기닌, 알라닌, 리신, 히스티딘, 트립토판, 발린, 아이소류신, 류신, 타이로신, 페닐알라닌, 시스틴(또는 등가물), 아스파라진, 글루타민, 아스파트산 및 글루탐산.

본 발명에 따른 배양 배지의 한 가지 제형은 아르기닌, 알라닌, 히스티딘, 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 시스틴, 아스파트산 및 글루탐산만을 포함한다. 한편으로, 상기 언급된 아미노산들이 모두 상기 배양 배지 중에 존재한다.

본 발명의 하나의 특정한 방식에 따라, 시스틴을 글루타치온 또는 시스테인으로 대체한다.

하나의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 방법은 하기의 아미노산이 없는 배양 배지를 사용한다: L-메티오닌, L-글리신, L-프롤린, L-세린 및 L-쓰레오닌. 이는 이들 아미노산의 존재가 바이오매스를 증가시키지만, PRP 생산을 상응하게 증가시키지 않기 때문이다. 상기 아미노산은 시그마에 의해 공급되는 매우 순수한 분말의 형태로 공급된다. 특히 유리하게는, 이들 아미노산은 합성 기원을 갖거나, 또는 전염성 감염, 및 특히 BSE(소 해면상 뇌염)에 의한 임의의 오염 위험성을 배제하기 위해서 동물로부터 직접 기원하는 원소를 함유하지 않는다는 사실을 보장하는 과정에 의해 수득되었다.

각 아미노산의 양은 세포 생육 및 PRP 생산을 최적화하기 위해 선택된다. 아스파트산, 아스파라진 및 글루타민의 양은 세포 배양 중 결핍을 일으키도록 선택되어, 상기 세포의 대사가 캡슐 폴리사카라이드의 생산을 향할 수 있게 하는 반면, 다른 아미노산들의 양은 상기 배양 단계 동안 결핍이 존재하지 않도록 선택된다.

본 발명에 따라, 상기 배양 배지는 또한 티아민, 판토테네이트, 유라실, 하이포잔틴, 비오틴, 리보플라빈 및 피리독신 중에서 선택되는 비타민을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해서, "비타민"이란 용어는 또한 질소 염기인 유라실 및 하이포잔틴을 포함한다.

특히 유리하게는, 본 발명에 따른 배양 배지 중에 존재하는 비타민은 비-동물 기원, 특히 합성 기원을 가지며, 이에 의해 전염성 감염, 및 특히 BSE(소 해면상 뇌염)에 의한 임의의 오염 위험성을 배제시킬 수 있다. 특히 시그마에 의해 공급되는 비타민을 사용하며, 그의 순도는 정확하게 공지되어 있고, 이에 의해 배양 배지의 제조 중에 매우 정확한 투여가 가능하다. 상기 배지 중에 존재하는 비타민의 양은 바이오매스 및 PRP의 생산을 최적화하기 위해서 선택된다.

본 발명의 한 가지 특정한 방식에 따라, 상기 배양 배지는 아르기닌 및 유라실을 대용할 수 있는 시트룰린을 포함한다.

이 경우에, 상기 배양 배지 중에 포함되는 시트룰린의 양은 유리하게는 150 내지 500 ㎎/ℓ이다.

본 발명에 따른 배양 배지에 의해서, 보다 많은 탄수화물을 소비하지 않고 보다 많은 오염물질, 특히 LPS를 생산하지 않으면서 동시에, 종래 기술에 따른 배지를 사용하는 경우보다 더 많은 양의 폴리리보실 리비톨 포스페이트를 생산할 수 있었다.

본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 배양되는 헤모필루스 인플루엔자에 b형 균주는 그의 유전 암호 중에 2 개 이상의 cap 유전자좌 사본을 갖는 캡슐화된 균주이다. 상기 cap 유전자좌는 크기가 17 내지 18 kb로, 발현이 상기 캡슐의 합성 및 수출과 관련되는 유전자들을 함께 분류한다.

상기 캡슐의 발현은, 상기 세균을 특정한 아가상에서 배양시 상기 세균에 백색 색상을 제공하며; 결과적으로 상기 cap 유전자좌를 갖는 세균의 콜로니를 "백색 콜로니"라 칭하는 반면, 상기 캡슐 폴리사카라이드를 상기 캡슐의 표면으로 수출하지 않는 세균은 "회색 콜로니"라 칭한다. 상기 캡슐의 발현은 잠재적으로 유전자 불안정성으로 되기 쉬우며, 이는 캡슐-결핍 돌연변이체의 출현을 도출할 수 있고, 결과적으로 PRP 생산을 감소시키게 될 것이다. 연구는 본 발명에 따른 방법에 사용되는 화학적으로 한정된 배지가 약 20 세포 세대 동안 사용되는 균주의 양호한 유전자 안정성을 보장할 수 있게 함을 입증할 수 있었다.

본 발명에 따라, 바이오매스를 점차적으로 증가시키기 위해서 다수의 연속적인 단계들로 헤모필루스 인플루엔자에 b형 세균의 배양을 수행할 수 있다.

이 경우에, 동결건조물 또는 동결된 샘플로부터 기원하는 세균을 일정 부피의 배지(일반적으로 1 리터를 초과하지 않는다)에 접종한다. 밤새 배양후에 또는 배지의 광학 밀도가 충분할 때, 상기 첫 번째 배양물을, 상기 첫 번째 것과 동일하지만 그의 부피가 10 내지 20 배 이상일 수 있는 두 번째 배양 배지로 옮긴다. 상기 두 번째 배지에 접종되는 세균의 양을, 세균 집단의 빠른 생육을 촉진하기 위해서, 694 ㎚에서 상기 두 번째 배양 배지의 초기 광학 밀도(O.D.)가 0.2 내지 0.4이도록 조절한다. 상기 두 번째 배양을 대개는 발효기에서 수행하지만, 다른 유형의 용기를 사용할 수 있다(플라스크, 스피너 등). 상기 배양을 발효기에서 수행하는 경우, 상기 배양의 지속기간 동안 통상적으로 37 ℃ +/- 1 ℃의 온도, 일정한 교반, 0.1 바의 압력, 30%의 pO₂, 및 분당 배지 부피당 0.25 기체 부피의 공기 유량이 사용된다. 상기 유형의 배양에 대한 다른 매개변수들을 선택하는 것은 당해 분야의 숙련가들의 능력안에 있다. 세균의 지수 증식기의 끝에서, 상기 바이오매스를 동일한 과정 등을 사용하여 더 큰 용량의 또 다른 발효기로 옮김으로써 추가로 확대시킬 수 있다. 상기 수득되는 배양 부피는 1000 리터에 달하거나 또는 심지어 이를 초과할 수 있다. 상기 배양(들)을 일반적으로는 "배치방식"에 따라 수행한다.

최종적으로, 최종 배양물의 상등액을 상기 세균의 불활성화 후에 취한다. 상기 불활성화를 통상적으로는 0.35% 내지 0.37%(V/V)의 최종 농도의 포르몰 용액을 사용하여 수행한다. 상기 상등액을 원심분리 단계에 의해 상기 세균으로부터 통상적으로 분리시킨다. 이어서 생성된 상등액 중에 함유된 PRP를 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 통상적인 공정에 따라 추출하고 정제한다.

이어서 상기 수확되고 정제된 PRP를 유리하게는, 상기를 T-의존성으로 만들고 특히 어린아이들의 면역화를 위해서 담체 단백질, 예를 들어 파상풍 단백질에 접합시킨다. 이어서 상기와 같이 수득된 PRP-T 항원을 단독으로 1가 백신에 사용하거나, 또는 여러 질병들에 대한 동시 백신화가 가능하도록 다른 항원들과 병용할 수 있다.

특히 유리하게는, 본 발명은 백신 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법에 따라 상기 수득된 접합체를, 소아과 백신에 대개 존재하는 하나 이상의 항원, 및 특히 디프테리아, 파상풍, 소아마비, B형 간염, 수두, 이하선염, 풍진, 네이세리아 메닌지티디스 또는 스트렙토코커스 뉴모니아에에 의해 유발된 감염, 로타바이러스에 의해 유발된 감염 등에 대한 항원과 병용한다.

하나의 실시태양에 따라, 상기 PRP-T 접합체는 분말 형태로 존재하는 반면, 다른 항원들은 액체 형태로 존재하고, 이들 항원은 모두 투여 전에 즉석에서 혼합되며; 하나의 또 다른 실시태양에 따라, 상기 백신 조성물은 전적으로 액체이다.

따라서 본 발명에 따른 제조 방법은 상기 PRP-T 접합체 외에, 디프테리아, 파상풍 및 B형 간염 항원을 포함하는 4가 백신 조합을 제조할 수 있다. 한편으로, 상기 PRP-T 접합체 외에, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 및 2 무세포 보르데텔라 백일해 항원(톡소이드 및 섬유상 헤마글루티닌) 또는 3 무세포 보르데텔라 백일해 항원(선행 2 개 + 퍼탁틴) 또는 그 밖에 5 무세포 보르데텔라 백일해 항원(선행 3 개 + 응집원들)을 포함하는 4가 백신 조합을 제조할 수 있다.

또한 상기 PRP-T 접합체 외에, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 2, 3 또는 5 무세포 보르데텔라 백일해 항원 및 또한 불활성화된 1, 2 및 3형 폴리오바이러스를 포함하는 5가 백신 조합을 제조할 수 있다.

또한 상기 PRP-T 접합체 외에, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 2, 3 또는 5 무세포 보르데텔라 백일해 항원, B형 간염 및 또한 불활성화된 1, 2 및 3형 폴리오바이러스를 포함하는 6가 백신 조합을 제조할 수 있다. 상기와 같은 6가 조합은 특히 액체일 수 있으며 0.5 ㎖ 용량당

- 20 IU 량의 디프테리아 톡소이드,

- 40 IU 량의 파상풍 톡소이드,

- 10 ㎍ 비율의 B형 간염 표면 항원,

- 25 ㎍ 비율의 백일해 톡소이드,

- 25 ㎍ 비율의 백일해 섬유상 헤마글루티닌,

- 12 ㎍ PRP 비율의 PRP-T,

- 각각 40, 8 및 32 DU 량의 불활성화된 1, 2 및 3형 폴리오바이러스,

- 0.6 ㎎ Al³ ⁺ 비율의 수산화 알루미늄

을 포함할 수 있다.

한편으로, 백일해 항원이 완전 보르데텔라 페르투시스 세균으로 이루어지는 백신 조합을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 배양 방법에 의해서, 바이오매스의 양을 증가시키지 않으면서(이에 의해 오염 LPS의 양을 감소시킬 수 있다) 폴리리보실 리비톨 포스페이트의 생산을 증가시킬 수 있으며; 본 발명에 따른 방법의 상기 이점은, 상기 생성물을 항원으로서 백신 조성물에 도입시키고 상기 LPS의 양을 최소로 감소시켜야 하는 백신 산업에 매우 중요하다. 보다 많은 양의 PRP에 대해 생성되는 LPS의 양을 증가시키지 않을 수 있는 방법을 이용할 수 있음은 후속의 정제 공정을 단순화시킬 가능성을 제공한다.

도 1은 실시예 7의 각각의 배지에 대하여 매시간, 694 nm에서의 O.D.를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 배양 배지의 제조

본 발명에 따른 배양 배지를, 농축 용액을 즉석에서 첨가하는 기본 배지로부터 제조하였다.

상기 기본 배지의 조성을 하기 표 1에 나타낸다:

화합물	1L에 대한 양(mg)	공급처	제품참조번호
60% 나트륨 락테이트	1.5 ml	프롤라보(Prolabo)	27925.292
K₂HPO₄	300	VWR 프롤라보	26931.263
KH₂PO₄	300	VWR 프롤라보	26923.298
MgSO₄.7H₂O	368	VWR 프롤라보	25165.260
Na₂HPO₄.12H₂O	28620	VWR 프롤라보	28028.298
NaH₂PO₄. 2H₂O	1870	VWR 프롤라보	28015.294
L-아르기닌	87	시그마	A5006 또는 A8094
L-알라닌	134	시그마	A7627 또는 A7469 또는 A4349
L-아스파라진	198	시그마	A0884 또는 A7094
L-리신	140	시그마	L5626 또는 L8662 또는 L7039
L-글루타민	220	시그마	G3126 또는 G8540 또는 G5792
L-히스티딘	78	시그마	H8000 또는 H6034 또는 H3911
L-트립토판	200	시그마	T0254 또는 T8941 또는 T4196
L-발린	115	시그마	V0500 또는 V0513 또는 V4638
L-아이소류신	130	시그마	I2752 또는 I7403 또는 I5281
L-류신	130	시그마	L8000 또는 L6914 또는 L8912
L-타이로신	180	시그마	T3754 또는 T8566 또는 T4321
L-페닐알라닌	165	시그마	P5482
L-시스틴	61	시그마	C8755 또는 C7602 또는 C5735
L-아스파트산	1065	시그마	A9256 또는 A5474
L-글루탐산	1471	시그마	G1251 또는 G8415
피리독신 HCl	4	시그마	P5669
리보플라빈	0.2	시그마	R4500
티아민 HCl	4	시그마	T4625
비오틴	4	시그마	B4501
Ca 판토테네이트	4.5	시그마	P5710
유라실	70	시그마	U0750
하이포잔틴	20	시그마	H9377
FeSO₄.7H₂O	2.5	알드리치	450278
ZnSO₄.7H₂O	5	시그마	Z4750
CoCl₂ . 6H₂O	1	플루카(Fluka)	60818
MnSO₄. H₂O	5	시그마	M7634
CaCl₂ . 2H₂O	13	판레악(Panreac)	131232.1211

1 리터의 배지에, 다양한 화합물들을 상기 표에 개시된 순서로 대략 100 ㎖의 탈염수에 자기 막대를 사용하여 교반하면서 가하였다. 첨가 전에, 상기 분말들은 모두 작은 분량의 탈염수에 미리, 일부의 경우 산이나 염기를 첨가하여, 용해되었다. 따라서, 발린, 아이소류신 및 류신의 경우, 상기 표에 나타낸 양에, 140 ㎕의 10 N KOH를 가할 필요가 있었고; 타이로신에는 280 ㎕의 10 N KOH를; 페닐알라닌에는 210 ㎕의 37% HCl을, 시스틴에는 70 ㎕의 37% HCl을 가할 필요가 있었다.

최종적으로, pH를 10 N KOH(pH가 너무 높은 경우에 37% HCl을 사용할 수도 있었다)로 7.2±0.1로 조절하고, 이어서 탈염수를 사용하여 상기 부피를 목적하는 양으로 만들었다.

이어서 상기 배지를 0.22 ㎛의 컷-오프 한계를 갖는 필터상에서 여과에 의해 멸균하였다.

따라서 상기 배지를 5 ℃에서 72 시간 동안 보관할 수 있었다.

상기 배지의 접종전에, 접종 준비가 되고 상기 표 1에 개시된 요소들 외에 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 농도를 갖는 하기의 추가적인 요소들을 포함하는 1 리터의 배지를 수득하기 위해서 하기를 가하였다:

- VWR 사에 의해 참조번호 24379.294로 공급된 무수 D(+)글루코스로부터 제조된 512.8 g/ℓ의 글루코스 27.3 ㎖,

- 시그마 사에 의해 β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 하이드레이트(참조번호 43410)란 이름으로 공급된, 1 g/ℓ의 NAD 용액 5 ㎖,

- 0.25 g/ℓ 농도의 프로토포르피린 및 5 ㎖/ℓ 농도의 수산화 암모늄을 포함하는 모액 4 ㎖; 상기 프로토포르피린은 시그마 알드리치 사에 의해 프로토포르피린 IX 이나트륨 염(참조번호 258385)이란 이름으로 공급되고 상기 수산화 암모늄은 VWR 사에 의해 암모늄 용액 28%(참조번호 21190.292)란 이름으로 공급된다:

실시예 2: 종래 기술에 따른 배양 배지의 제조

종래 기술에 따른 배양 배지를, 특정 농축 용액들을 기본 배지에 가하여 제조하였다.

상기 기본 배지의 조성을 하기 표 3에 나타낸다:

상기 기본 배지를 제조하기 위해서, 상기 요소들을 각각 표에 나타낸 순서로, 100 ㎖의 탈염수에 자기 막대를 사용하여 연속적으로 교반하면서 가하였다. 분말 형태로 공급된 상기 각각의 요소들은 작은 분량의 탈염수에 미리 용해되었다.

상기 완두콩 펩톤은 케리(Kerry) 사의 것이고 참조번호 Hy-pea 7404로 판매된다. (NH₄)₂SO₄는 VWR 사에 의해 참조번호 21333.296으로 공급된다. 다른 요소들은 동일한 공급처로부터의 것들이며 본 발명에 따른 배지의 제조에 대해서 실시예 1에 개시된 바와 동일한 참조번호들로 공급된다.

최종 pH를 10 N KOH(pH가 너무 높은 경우에 37% HCl을 사용할 수도 있었다)로 7.2±0.1로 조절하였다.

이어서 탈염수를 가하여 목적하는 부피를 획득하였으며, 이어서 이를 120 ℃에서 30 분의 주기에 따라 오토클레이빙에 의해 멸균하였다.

일단 멸균되었으면, 상기 배지를 4 ℃에서 15일 동안 보관할 수 있었다.

농축 용액 A, B, C 및 D를 상기 기본 배지에 가하였다.

용액 A는 VWR 사에 의해 무수 D(+) 글루코스(참조번호 24379.294)라는 이름으로 공급되는, 512.8 g/ℓ 농도의 무수 글루코스를 포함하는 용액이다.

용액 B는 시그마 사에 의해 β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 하이드레이트(참조번호 43410)라는 이름으로 공급되는, 1 g/ℓ 농도의 NAD를 포함하는 모액이다.

용액 C는 0.25 g/ℓ 농도의 프로토포르피린 및 5 ㎖/ℓ 농도의 수산화 암모늄을 포함하는 모액이며; 상기 프로토포르피린은 시그마 알드리치 사에 의해 프로토포르피린 IX 이나트륨 염(참조번호 258385)이란 이름으로 공급되고 상기 수산화 암모늄은 VWR 사에 의해 암모늄 용액 28%(참조번호 21190.292)란 이름으로 공급된다.

용액 D는 125 g/ℓ의 자기분해 효모 추출물 한외여과물(Ufel)을 포함하는 농축된 용액이며; 바이오스프링거(Biospringer) 사에 의해 Ultrafiltrat d’extrait autolytique de levure (Ufel)[자기분해 효모 추출물 한외여과물](참조번호 스프링거0701)라는 이름으로 공급된다.

이들 각각의 용액을 컷-오프 한계가 0.22 ㎛인 필터상에서 여과에 의해 멸균한다.

하기를 1 리터의 기본 배지에 가하였다:

- 35.1 ㎖의 용액 A

- 5 ㎖의 용액 B

- 4 ㎖의 용액 C

- 40 ㎖의 용액 D.

상기 기본 배지에 상기 각각의 용액의 첨가를 층류 후드 하에서 수행하였으며, 이는 접종 전에 상기 표 3에 언급된 요소들 외에 하기 표 4에 나타낸 농도의 추가적인 요소들을 갖는 배양 배지를 생성시켰다:

실시예 3: 실시예 1에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 배지와 실시예 2에 개시된 바와 같은 종래 기술의 배지와의 PRP 생산의 비교

이들 비교 실험을 2-단계 배양 프로토콜에 따라 수행하였다:

- 8 시간의 기간 동안, 130 rpm(분당 회전수)에서 교반하면서 36 ℃에서, 칸막이가 없는 1-리터 유리 삼각 플라스크에서 예비배양하는 단계로, 상기 단계의 끝에서 상기 균주는 선형 증식기의 끝에 있다; 상기 예비배양은 280 ㎖의 배양 배지를 0.5%(부피/부피)의 농도로 2 개 이상의 cap 유전자좌 사본을 함유하는 헤모필루스 인플루엔자에 b형 세균의 접종물로 접종함으로써 개시된다;

- 이어서 90 ㎖의 상기 예비배양물을 이동시켜 1.8 리터의 배양 배지를 함유하는 2-리터 바이오스탯(Biostat) B 플러스 발효기를 접종할 수 있었다. 상기 발효기를 400 rpm에서 교반하면서, 12 시간 동안 0.45 lpm(분당 리터)로 통기시키면서 37 ℃에서 유지시켰다.

12 시간의 배양 후에, 694 ㎚에서의 O.D.를 측정하였으며, 이는 바이오매스를 측정할 수 있게 하였다. 왜냐하면 선행의 시험 동안 694 ㎚에서 측정된 광학 밀도 1 단위가 0.64 g의 바이오매스(건조 질량)/리터에 상응하는 것으로 측정될 수 있었기 때문이다.

상기 배양 상등액 중의 총 PRP의 양을 문헌[Sturgess et al., Vaccine 17 (1999) 1169-1178]에 개시된 바와 매우 유사한 방법에 따라, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피-펄스화된 전류측정(HPAEC-PAD)에 의해 측정하였다. 상기 배양 상등액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켜 여과하고, 이어서 500 ㎕의 상등액을 10 kDa의 컷오프 한계를 갖는 아미콘(Amicon) 울트라 컬럼(밀리포어(Millipore) 참조번호 UFC5010BK)의 사용을 통해 한외여과하고, 이어서 NaOH를 가하여 염기성 가수분해 단계를 수행하였다. 상기 가수분해를 주변 온도에서 최소 4 시간 동안 수행하였다. 상기 분석의 유효성을, 상기 가수분해 용액 중에 존재하는 내부 표준인 글루코스아민-1-포스페이트(GlcN1P)를 사용하고 공지된 PRP 농도를 갖는 내부 대조군을 규칙적으로 통과시킴으로써 조절하였다. 스터게스 등의 지시에 관하여, 이동상은 35 mM NaOH 및 114 mM CH₃COONa로 구성되었으며 재생 단계는 10 분간 100 mM NaOH 및 400 mM CH₃COONa로 수행되었다.

상기 획득된 결과들을 하기 표 5에 나타낸다:

상기 결과는 PRP 생산성에 대한 본 발명에 따른 방법의 이점을 나타내며; 실제로, 같은 부피의 배양 배지에 대해서, 상기 수득된 바이오매스가 종래 기술에 따른 배양 배지의 경우 더 큰 반면, 다른 한편으로 PRP의 양은 더 작은 것이 주목되었다.

실시예 4: 본 발명의 방법에 따른 배양 상등액, 및 종래 기술의 방법에 따른 배양 상등액 중에 존재하는 RPR 및 LPS 의 양의 비교

상기 헤모필루스 인플루엔자 b형의 배양을 본 발명에 따른 배지 및 종래 기술에 따른 배지와, 실시예 3에 개시된 방식(그러나 종래 기술에 따른 방법의 기본 배지는 실시예 3에 따른 배지 중에 존재하는 완두콩 펩톤 대신에 솔라비아(Solabia) 사에 의해 공급되는 카제인산 가수분해물(참조번호 A1434) 10 g/ℓ를 포함하는 차이가 있다)으로 비교 수행하였다.

상기 예비배양 시간은 실시예 3에서와 같이 8 시간이고 배양 시간은 12 시간이다.

상기 PRP의 분석 및 LPS의 분석을 모두 HPAEC-PAD에 의해 수행하나; LPS의 분석은, 동일한 프로토콜을 겪은 표준 범위의 정제된 LPS를 사용하는, 특정한 모노사카라이드인 헵토스의 정량분석에 의해 수행되며, 상기 분석에 대한 내부 대조군은 람노스이다.

상기 획득된 결과를 하기 표 6에 나타낸다:

상기 획득된 결과는 PRP의 양에 비해 생성된 LPS의 양을 감소시킬 수 있는 본 발명에 따른 방법의 이점을 나타낸다.

이는 적합한 안전 수준을 유지시키는 동시에 정제 공정을 매우 많이 단순화하기 때문에, 본 발명에 따른 방법의 중대한 이점을 나타낸다.

실시예 5: 아연의 중요성을 평가하기 위한 시험

배양 배지 중 아연의 존재의 중요성을 연구하였다.

이런 취지로, 3 개의 배지를 비교하였다:

- MS라 칭하는, 실시예 1에 개시된 바와 같은 배지,

- MS Zn-라 칭하는, 실시예 1과 동일한 조성을 갖지만 ZnSO₄가 없는 배지,

- MS Zn++라 칭하는, 실시예 1에 개시된 바와 같지만, 4 배 더 많은, 즉 20 ㎎/ℓ의 ZnSO₄ 농도를 갖는 배지.

이어서 상기 배지를 0.22 ㎛의 컷오프 한계를 갖는 필터상에서 여과에 의해 멸균하였다.

칸막이가 없는 1-리터 유리 삼각 플라스크에서의 예비배양 단계를 먼저, 실시예 4에 개시된 바와 같은 배지 280 ㎖을 유전 암호 중에 2 개 이상의 cap 유전자좌 사본을 갖는 헤모필루스 인플루엔자에 b형 세균의 동결된 샘플로 접종시킴으로써, 130 rpm에서 교반하면서 36 ℃에서 16 시간 동안 수행하였다. 이어서 9.5 ㎖의 예비배양물을 상기 배양물의 접종 전에 시험하고자 하는 각각의 배양 배지에서 세척하고, 상기 접종을 170 ㎖의 시험하고자 하는 배양 배지를 함유하는 칸막이가 있는 500 ㎖ 폴리카보네이트 삼각 플라스크에서 매번 수행하였으며; 상기 배양을 37 ℃에서 12 시간 동안 수행하고 교반을 150 rpm에서 수행하였다.

각각의 배지에 대해서, 배양의 끝에서 바이오매스, PRP 농도 및 또한 LPS의 양을, 실시예 3 및 4에 개시된 바와 동일한 방식으로 측정하고, PRP/바이오매스 및 또한 LPS/바이오매스 및 PRP/LPS 비를 계산하였다.

획득된 결과를 하기 표 7에 나타낸다:

상기 결과는 배양 배지 중 아연의 존재가 바이오매스의 생산 및 또한 PRP의 생산을, LPS의 양을 비례적으로 증가시키지 않으면서, 현저하게 증가시킬 수 있음을 보였다.

실시예 6: 5-리터 발효기에서 시험

헤모필루스 인플루엔자에 b형의 배양을, 오직 공급자에 의해 무-동물임이 보장된 제품만을 사용하고 특허 출원 FR 2 914 302에 개시된 바와 같고 솔비아스 아게(Solvias AG) 사에 의해 프로토포르피린 IX 이나트륨 염(참조번호 SOL20402)이란 이름으로 공급된 합성 프로토포르피린을 사용하여 실시예 1의 본 발명에 따라 개시된 배양 배지에서 수행하였다. 이어서 상기 시험을 실시예 3에 개시된 방식으로 수행하였으나, 단 사용된 발효기는, 550 rpm에서 교반되고 0.5 lpm으로 통기되는, 37 ℃에서 조절된 5-리터 발효기였다. 이때 접종 부피는 280 ㎖, 즉 전체 예비 배양 삼각 플라스크였다.

상기 PRP 및 LPS 농도를 실시예 3 및 4에 개시된 프로토콜에 따라 측정하였다.

상기 획득된 결과를 하기 표 8에 나타낸다:

상기 결과는 선행 결과를 입증하며, 다량의 PRP를 수득하기 위한 본 발명에 따른 방법의 이점을 나타낸다.

실시예 7: 실시예 1에 개시된 발명에 따른 배지 및 종래 기술에 개시된 화학적으로 한정된 배지와의 바이오매스 및 PRP 의 생산의 비교

헤모필루스 인플루엔자에 b형의 배양을 실시예 1에서 본 발명에 따라 개시된 배양 배지 및 또한 헤모필루스 인플루엔자에의 배양과 관련하여 발행물들에 개시되고 화학적으로 한정된 대로 제공된 8 개의 배지에서 수행하였다.

상기 8 개의 배지를 저자의 권고에 따라 제조하였다. 상기 배지들은 연대순으로 하기 문헌들의 배지들이다:

- Talmadge and Herriott: Biochemical and Biophysical Research Communications, (March 1960), Vol.2 N°3, p 203-206),

- Butler: J. gen. Microbiol. (1962), 27, 51-60,

- Wolin: J. Bacteriol. Vol.85, (1963) Notes, p 253-254,

- Herriott et al. : Journal of Bacteriology, (Feb. 1970), Vol. 101, N°2, 513-516,

- Klein and Luginbuhl: Journal of General Microbiology (1979), 113, 409-411,

- Coleman et al. : Journal of Clinical Microbiology, (Sept 2003), Vol.41, N°9 p. 4408-4410.

상기 8 개 배지의 제조에 사용된 제품들에 대한 참조번호들을 하기 표 9에 재연한다:

제품	공급처	제품 참조번호
유리딘	시그마	U3003
이노신	시그마	I4125
아데노신ㅇ	시그마	A4036
구아닌	시그마	G6779
구아노신	시그마	G6264
비타민 B12	시그마	V2876
시트롤린	시그마	C7629
콜린 클로라이드	플루카	26978
티미딘	시그마	T9250
이노시톨	시그마	I5125
푸트레신 다이하이드로클로라이드	시그마	P5780
니코틴아미드	시그마	N0636
돼지 헤마틴	시그마	H3281
헤민	플루카	51280
나트륨 올리에이트	시그마	O7501
나트륨 아세테이트	플루카	71185
폴산	시그마	F7876
폴리비닐 알코올	시그마	341584
트라이에탄올아민	시그마	90278
글리실글리신 완충제	리비오스(Libios)	B-GLYGLY250
트윈 40	시그마	P1504
트윈 80	시그마	P1754
트리스 완충제	VWR	33621.260
에틸렌다이아민테트라아세테이트	VWR	20302.180
HEPES	시그마	H3375
글루타치온	시그마	G6013
아데닌	시그마	A8626
프롤린	시그마	P0380
쓰레오닌	시그마	T8625
글리신	시그마	G7126
메티오닌	시그마	M9625
세린	시그마	S4500
글리세롤	VWR	24387.292
K₂SO₄	VWR	26994.293
KCl	VWR	26764.298
MgCl₂. 6H₂O	판레악(Panreac)	131396.1211
NaCl	VWR	27810.295
NaHCO₃	VWR	27778.260
NH₄Cl	VWR	21236.291
L-글루타민 및 25 mM HEPES를 갖는 RPMI 1640	인비트로젠 (Invitrogen)	콜맨(Coleman)(2003)의 발행물에 인용된 이전 참조번호 ref. 61870036 => 신규 ref. 52400025
나트륨 피루베이트 MEM 100 mM	인비트로젠 (Invitrogen)	콜맨(Coleman)(2003)의 발행물에 인용된 이전 참조번호 ref. 11360070 => 신규 ref. 11360039

이어서 상기 배지들을 0.22 ㎛의 컷오프 한계를 갖는 필터상에서 여과에 의해 멸균하였다.

각각의 시험을 3 회 이상 수행하였다.

각각의 배지에 대해서, 매시간, 694 ㎚에서의 O.D.를 측정하고 PRP 농도를 배양의 끝에서 실시예 3에 개시된 바와 동일한 방식으로 측정하였다.

상기 O.D. 결과를 도 1에 재연한다.

상기 PRP 측정 결과를 하기 표 10에 나타낸다:

실시예 8: 산업적인 규모의 PRP 생산(1000 리터)

아연(이때 농도는 5 ㎎/ℓ 대신에 20 ㎎/ℓ이다)을 제외하고, 실시예 1의 조성을 갖는 본 발명에 따른 배양 배지를 제조하였다. 이는 실시예 5가, 상기 농도가 LPS의 양을 증가시키지 않으면서 보다 많은 PRP를 생산할 수 있음을 보였기 때문이다.

상기 배지는 상기 예비배양 및 최종 배양의 경우와 pH(초기 pH 7.2±0.1, 이어서 상기 예비배양의 경우 자유 pH이고 생산 배양의 경우 pH를 6.7±0.1로 조절하였다)를 제외하고 동일하였다.

상기 배지를 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 앞서 작은 분량의 정제수에 용해시킨(이때 일부의 경우 산 또는 염기를 첨가한다(실시예 1 참조)) 화합물들을 혼합한 후, 및 충분량의 정제수를 가하기 전에, 상기 pH를 상기 예비배양에 대해서 7.2±0.1로 조절하고 최종 배양의 경우 6.7±0.1로 조절하였다(10 N 수산화 칼륨 또는 수산화 나트륨 또는 37% HCl에 의해서). 이어서 상기 배지를 0.22 ㎛의 컷오프 한계를 갖는 필터상에서 여과에 의해 멸균하였다.

상기 배지의 접종전에, 접종 준비가 되고 실시예 1의 표 1에 개시된 요소들 외에, 실시예 1의 표 2에 나타낸 바와 같은 농도를 갖는 추가적인 요소들(단 글루코스의 최종 농도는 14 g/ℓ 대신에 14.87 g/ℓ이었다)을 포함하는 배지를 수득하기 위해서 하기를 가하였다:

- VWR 사에 의해 참조번호 24379.294로 공급된 무수 D(+)글루코스로부터 제조된 512.8 g/ℓ의 글루코스,

- 시그마 사에 의해 β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 하이드레이트(참조번호 43410)란 이름으로 공급된, 1 g/ℓ의 NAD 용액,

- 0.25 g/ℓ 농도의 프로토포르피린 및 5 ㎖/ℓ 농도의 수산화 암모늄을 포함하는 모액; 상기 프로토포르피린은 솔비아스 아게에 의해 프로토포르피린 IX 이나트륨 염(참조번호 SOL20402)이란 이름으로 공급되고 상기 수산화 암모늄은 VWR 사에 의해 암모늄 용액 28%(참조번호 21190.292)란 이름으로 공급된다.

1000-리터 규모의 공정은 일련의 3 개의 예비배양물을 포함하였다:

- 첫 번째 예비배양을 17 내지 18 시간의 기간 동안, 130 rpm(분당 회전수)에서 교반하면서 37 ℃에서, 290 ㎖의 완전 배양 배지를 함유하는, 칸막이가 없는 1-리터 삼각 플라스크에서 수행하였다. 상기 예비배양은 상기 배양 배지를 0.014의 초기 표적 OD₆₉₄ _㎚에 상응하는 접종 수준으로 2 개 이상의 cap 유전자좌 사본을 함유하는 헤모필루스 인플루엔자에 b형 세균의 접종물로 접종함으로써 개시되었다;

- 두 번째 예비배양을 6.8-리터 발효기에서 수행하였다. 5.2 리터의 완전 배양 배지를 함유하는 2 개의 발효기를 각각 260 ㎖의 시리즈 1의 예비배양물로 접종하였다. 이들 발효기를 37 ℃±1에서 4 시간 동안 유지시켰으며, 이때 초기 pH는 7.2±0.2이고, pO₂를 교반의 증가(500에서 800 rpm), 이어서 통기의 증가(0.5에서 2.5 lpm), 및 이어서 0 내지 6 lpm의 순수한 O₂의 유량을 수반하는 캐스케이드로 30%에서 유지시켰다.

- 세 번째 예비배양 시리즈를 시리즈 2로부터 기원하는 예비배양물 5.8 리터가 접종된 완전 배지 57 리터를 함유하는 120-리터 발효기에서 수행하였다. 상기 발효기를 37 ℃±1에서 3 시간 10 동안 유지시켰으며, 이때 초기 pH는 7.2±0.2이고, pO₂를 교반의 증가(300에서 425 rpm), 이어서 통기의 증가(6에서 28 lpm), 및 이어서 0 내지 50 lpm의 순수한 O₂의 유량을 수반하는 캐스케이드로 30%에서 유지시켰다.

상기 산업적인 배양을 시리즈 3의 예비배양물 39 리터가 접종된 완전 배지 778 리터를 함유하는 1000-리터 발효기에서 수행하였다. 상기 발효기를 32 ℃±1에서 유지시켰으며, 이때 pH를 6.7±0.2에서 조절하고(2.5 N 수산화 나트륨 용액으로), pO₂를 교반의 증가(100에서 230 rpm), 이어서 통기의 증가(70에서 150 lpm), 및 이어서 0 내지 500 lpm의 순수한 O₂의 유량을 수반하는 캐스케이드로 70%에서 유지시켰다. 더욱이, 소포제(바이오스푸멕스(Biospumex), 4%)를 요청시 폼 수준에 따라 가하였다.

12 시간 배양 후에, 694 ㎚에서의 O.D.를 측정하였으며, 이는 바이오매스를 측정할 수 있게 하였다(0.64 g의 건조 바이오매스에 상응하는 1 OD 단위의 대응에 따라). 상기 PRP 및 LPS 농도를 실시예 3 및 4에 개시된 프로토콜에 따라 측정하였다.

상기 획득된 결과를 하기 표 11에 나타낸다:

이들 결과는 PRP 생산성 및 PRP/LPS 비에 대한 본 발명에 따른 방법의 이점을 나타내었으며, 상기 결과는 산업적인 규모에서 입증되었다.

Claims

백신용으로 사용되는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) b형의 캡슐 폴리사카라이드(PRP)의 생산 방법으로, 헤모필루스 인플루엔자에 b형(Hib)의 균주를 배양 배지에서 배양하고, 배양 상등액을 수확하며, 배양 상등액으로부터 상기 캡슐 폴리사카라이드를 추출하기 위해서 처리하며, 상기 배양 배지가 적어도:
-하나 이상의 탄소 공급원,
-프로토포르피린,
-염,
-아미노산,
-NAD 또는 NADH,
-비타민, 및
-pH 조절 수단
을 포함하고, 화학적으로 한정되며 적어도 아연을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
pH 조절 수단이 완충염으로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 탄소 공급원은 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 글리세롤, 자일로스, 리보스, 퓨코스, 시알산 및 락테이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 탄소의 공급원인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
프로토포르피린이 합성 프로토포르피린 IX임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
염이 칼륨, 마그네슘, 나트륨, 칼슘, 철, 아연, 코발트 및 망간염 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
염이 K₂HPO₄; KH₂PO₄; MgSO₄.7H₂O; Na₂HPO₄.12H₂O; NaH₂PO₄.2H₂O; CaCl₂.2H₂O; FeSO₄.7H₂O; ZnSO₄.7H₂O; CoCl₂.6H₂O; MnSO₄.H₂O 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
아미노산이
·아르기닌,
·알라닌,
·아스파라진, 글루타민, 아스파트산, 글루탐산 중 하나 이상,
·리신,
·히스티딘,
·트립토판,
·발린,
·아이소류신,
·류신,
·타이로신,
·페닐알라닌, 및
·시스틴
중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서,
배양 배지가 적어도 아르기닌, 알라닌, 히스티딘, 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 시스틴, 아스파트산 및 글루탐산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서,
시스틴을 글루타치온 또는 시스테인으로 대체함을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서,
시스틴을 글루타치온 또는 시스테인으로 대체함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
비타민이 티아민, 판토테네이트, 유라실, 하이포잔틴, 비오틴, 리보플라빈 및 피리독신 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 배양 배지가 시트룰린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항의 방법에 따른 캡슐 폴리사카라이드을 제조하는 단계; 및
상기 수득된 캡슐 폴리사카라이드를 담체 단백질에 접합하는 단계;를 포함하는 백신 조성물의 제조를 위한 방법.
제 1 항의 방법에 따른 캡슐 폴리사카라이드을 제조하는 단계; 및
상기 수득된 캡슐 폴리사카라이드를 담체 단백질에 접합하는 단계;를 포함하며, 상기 담체 단백질은 파상풍 톡소이드인, 백신 조성물의 제조를 위한 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 여러 질병들에 대한 동시 면역화를 허용하는 백신 조합을 획득하기 위해서 디프테리아, 파상풍, 소아마비, B형 간염, 수두, 이하선염, 풍진, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 또는 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)에 의해 유발된 감염, 로타바이러스에 의해 유발된 감염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 감염에 대한 백신화를 목적으로 하는 하나 이상의 항원과 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 디프테리아, 파상풍 및 B형 간염 항원과 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 및 2 무세포 보르데텔라 백일해 항원(톡소이드 및 섬유상 헤마글루티닌)과 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 및 3 무세포 보르데텔라 백일해 항원(톡소이드, 퍼탁틴 및 섬유상 헤마글루티닌)과 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 및 5 무세포 보르데텔라 백일해 항원(톡소이드, 퍼탁틴, 응집원 및 섬유상 헤마글루티닌)과 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 2, 3 또는 5 무세포 보르데텔라 백일해 항원 및 또한 불활성화된 1, 2 및 3형 폴리오바이러스와 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, B형 간염, 2, 3 또는 5 무세포 보르데텔라 백일해 항원 및 또한 불활성화된 1, 2 및 3형 폴리오바이러스와 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 방법은 상기 접합하는 단계를 거쳐 수득된 접합체를 완전 보르데텔라 백일해 세균과 병용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.