CN104583390A - 用于生产b型流感嗜血杆菌抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在工业规模上生产用于疫苗目的b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖(PRP)的方法，根据所述方法，将b型流感嗜血杆菌(Hib)的菌株在培养基中培养，收获该培养上清液，处理该培养上清液以便从其提取荚膜多糖，所述培养基包含至少：–一种碳源，–原卟啉，–盐，–氨基酸，–NAD或NADH，–维生素，–pH调节手段，其特征在于所述培养基是在化学上确定的。

Description

用于生产b型流感嗜血杆菌抗原的方法
本发明涉及用于在工业规模上生产b型流感嗜血杆菌(Hib)的荚膜多糖的方法，根据所述方法，将Hib的菌株在特定培养基中培养，所述培养基的组成是在化学上进行定义的，且因此不包含任何复杂的氮源或碳源。
现有技术，具体而言申请W2009007641，描述了用于b型流感嗜血杆菌的改进培养基，其不包含任何来自动物源的要素，如当培养b型流感嗜血杆菌的目的在于产生将随后作为抗原引入疫苗组合物的荚膜多糖时所推荐。在该现有技术中描述的培养基中，用植物蛋白胨代替通常由动物蛋白胨组成的氮源。
此类培养基在药物产品的安全性方面而言代表了很大进展，特别是关于消除了疾病诸如牛海绵状脑炎传播的风险；因此，它们允许符合卫生监督机构的推荐。
然而，蛋白胨的组成可以根据所提供的批次而变化，这可以导致产生的细菌量和还有有用抗原的产量的变化，这是疫苗生产者试图通过改变在方法的实施过程中的某些参数来限制或校正的。然而，在药物产品的工业生产的背景下，期望能够具有可用的稳健方法，其需要在每次实施时尽可能少的改变，并且其在每个步骤的结果在批次间是可再现的。
此类方法还必须允许产率与工业盈利相容，在从细菌产生抗原的情况下，标准不仅仅是仅获得最大可能量的细菌，而且获得抗原滴度和产生的细菌量之间的最佳比率；其因此对于在向着产生荚膜多糖引导细菌的代谢的条件下培养的细菌是期望的。
为此，本发明的主题是用于在工业规模上生产意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b）的荚膜多糖(PRP)的方法，根据所述方法，将b型流感嗜血杆菌(Hib)的菌株在培养基中培养，收获该培养上清液，处理该培养上清液以便从其提取荚膜多糖，所述培养基包含至少：
– 一种碳源，
– 原卟啉，
– 盐，
– 氨基酸，
– NAD或NADH，
– 维生素，
– pH调节手段，
其特征在于所述培养基是在化学上确定的。
凭借本发明，通过能够具有稳健的工业方法，提高荚膜多糖的产率，而不必相应地增加生物量，由此使得可能相对于所生产的PRP量降低产生的脂多糖(LPS)的量。
此外，培养基组成中不存在蛋白降低了所需的消泡剂产品方面的需求，且简化了纯化步骤，这使得可能从培养上清液获得由荚膜多糖组成的抗原。
根据本发明，所述培养基包含pH调节手段。这些pH调节手段可以由缓冲盐和/或与用于将酸或碱添加至培养基的装置组合的pH测量装置组成。借助于pH的调节，产率可以进行优化。
根据一个实施方案，根据本发明的方法还在于将产生的PRP缀合至载体蛋白，诸如破伤风蛋白。
本发明的一个主题还是用于制备疫苗组合物的方法，根据所述方法：
- 通过于在化学上确定的培养基中培养Hib的菌株在工业规模上制备由荚膜多糖(PRP)组成的针对b型流感嗜血杆菌(Hib)的抗原，所述培养基的每种成分的性质和量是完全确定的，且包含至少：
　　– 一种碳源，
　　– 原卟啉，
　　– 盐，
　　– 氨基酸，
　　– NAD或NADH，
　　– 维生素，
　　– 以及pH调节手段，
- 收获培养上清液，和处理该培养上清液以便由其提取纯化的荚膜多糖，
- 将荚膜多糖缀合至载体蛋白。
根据一个实施方案，还将获得的缀合物与意欲用于针对以下感染中的一种或多种的接种的至少一种或多种抗原组合：白喉、破伤风、脊髓灰质炎、乙型肝炎、水痘、腮腺炎、风疹、由脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）或肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）引起的感染、由轮状病毒引起的感染，以便获得允许针对数种疾病同时免疫的疫苗组合。
根据本发明，培养基是在化学上确定的，即每种成分的化学结构和还有量是已知的。此类培养基不含复杂的氮源或碳源，诸如蛋白胨、酪蛋白、血清等，并且可以因此，如果需要，保证不含任何直接源自动物的要素。
本发明涉及用于在工业规模上生产b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖的方法。此类方法使得可能获得与工业约束相容的生物量和荚膜多糖或PRP的产率。此类方法使得特别可能从在其遗传密码中具有至少2个拷贝的cap基因座(编码实现荚膜合成的功能)的b型流感嗜血杆菌的菌株，在培养12小时后获得对应于至少2.4的694 nm的D.O.的生物量和至少240 mg/升培养基的PRP的相关量的PRP，而不用特定调节培养基(诸如pH或pO2)。产生的PRP的量的确定通过高效阴离子交换色谱法与脉冲安培检测器(HPAEC-PAD) (Dionex)联用的技术，或给出等同结果的方法来测量。有利地，根据本发明的方法使得获得至少270 mg/升培养基的PRP的量，甚至更有利地至少300 mg/升的量。
在可能的碳源中，可以提到所有可以由b型流感嗜血杆菌的菌株代谢的碳源，特别是：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、岩藻糖、唾液酸和乳酸。还可以使用2种或更多种不同的源，特别是乳酸和葡萄糖。
根据本发明，在起始培养基中存在的葡萄糖的量为5和25 g/l之间，更特别是10至20 g/l，且更特别是12至16 g/l。
起始培养基中存在的乳酸的量可以是0和15 g/l之间，更特别是0.5至10 g/l。
根据本发明的一个实施方案，培养基的原卟啉是合成的原卟啉，例如由Sigma-Aldrich公司以编号258385(原卟啉二钠盐)提供的原卟啉。因此，可以使用可保证是完全不含动物来源的物质的培养基。或者，使用合成的原卟啉IX，其式如下：
其中R表示H或抗衡离子，优选碱金属的抗衡离子，特别是钠。
此类原卟啉IX，和其制备方法，已经描述于专利申请FR 2 914 302中。
根据本发明，在起始培养基中存在的原卟啉的量有利地为0.1和10 mg/l之间，更特别是0.25和2 mg/l之间。
根据本发明的培养基包含盐，所述盐提供对于细胞生长必要的矿物质，使得可能确保对于细菌有利的渗透压，并且还对pH施加缓冲能力。
优选地，使用一价阳离子（如Na+和/或K+）、二价阳离子（如Ca++、Mg++、Co++、Zn++、Mn++、Fe++），呈HPO4 --、H2PO4-和/或PO4---形式的磷酸根阴离子，呈盐水溶液形式的SO4 --和Cl-阴离子的混合物，其中每种的体积摩尔浓度通常可以在10-4 mM至1000 mM的浓度范围内变化。
在培养基中存在的盐特别选自：
K2HPO4；KH2PO4；MgSO4. 7 H2O；Na2HPO4.12 H2O；NaH2PO4. 2 H2O；CaCl2. 2 H2O；FeSO4. 7 H2O；ZnSO4. 7 H2O；CoCl2. 6 H2O；MnSO4. H2O。
选择盐浓度以便具有200-700 milliosmole/l之间，特别是300和400 milliosmole/l之间，特别是350 milliosmole/l的摩尔渗透压浓度和范围为6.5至7.5的pH。
为此，根据本发明的培养基可以特别包含：
- 在150-1500 mg/l之间的浓度的MgSO4.7 H2O，
- 在6.5-52 mg/l之间的浓度的CaCl2.2 H2O，
- 在1.25-10 mg/l之间的浓度的FeSO4.7 H2O，
- 在2.5-80 mg/l之间的浓度的ZnSO4.7 H2O，
- 在0.5-2 mg/l之间的CoCl2.6 H2O，
- 在2.5-10 mg/l之间的MnSO4.H2O，
- 钠，其特别为以0-4 ml/l之间的量的60%乳酸钠的形式
- K2HPO4和KH2PO4，当缓冲效应由Na2HPO4.12 H2O/NaH2PO4.2 H2O提供时，对于其中每种浓度为100-1200 mg/升，
- 浓度为15-120 g/l之间的Na2HPO4.12 H2O，
- 浓度为Na2HPO4.12 H2O的1/10至1/30的NaH2PO4.2 H2O。
或者，可能通过K2HPO4 / KH2PO4对提供缓冲作用；在这种情况下，K2HPO4浓度为15-120 g/l之间，并且KH2PO4浓度是K2HPO4的浓度的1/10至1/30；Na2HPO4.12 H2O和NaH2PO4.2 H2O的浓度这时可以为100-1200 mg/升之间。
所提及的盐中，已经可能注意的是，锌的存在对于生物量和PRP的产生是特别有利的。特别是浓度范围为2.5至80 mg/l，或更特别是5至20 mg/l。非常好的结果已经在20 mg/l的浓度获得。
在培养阶段过程中通过特别添加高度浓缩的碱如NaOH或KOH调节培养基的pH的情况下，可以降低在培养基中存在的盐的量，特别地，缓冲剂对Na2HPO4/NaH2PO4或K2HPO4/ KH2PO4的量，然而，条件是通过任选添加NaCl将摩尔渗透压浓度维持在合适的值，即在200-700 mOsm/l之间。
根据本发明，所述培养基还包含NAD或NAD源或任何其它等效辅酶。NAD(或β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，也称为辅酶I或因子V，是一种对b型流感嗜血杆菌的培养必不可少的生长因子。其有利地以培养基的0.5-50 mg/l之间，更具体地2-10 mg/l之间，特别地5 mg/l的浓度存在。可以将其以它的NADH还原形式引入培养基。可替代NAD，根据本发明的培养基可以包含细菌将能够使用的NAD前体要素，诸如NADP/ NADPH(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯/盐)或NMN(β-烟酰胺腺嘌呤单核苷酸)或NR(烟酰胺核糖核苷)、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD)或3-乙酰吡啶单核苷酸(APMN)。
根据本发明，所述培养基含有氨基酸，所述氨基酸有利地选自：精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸(或等效物)、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。
根据本发明的培养基的一种制剂仅包含精氨酸、丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。或者，所有提及的氨基酸存在于培养基中。
根据本发明的一个具体方式，用谷胱甘肽或半胱氨酸替代胱氨酸。
根据一个优选的实施方案，根据本发明的方法使用不含以下氨基酸的培养基：L-甲硫氨酸、L-甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-苏氨酸。这是因为这些氨基酸的存在导致生物量的增加，但不导致PRP产生的相应增加。
氨基酸以由Sigma供应的非常纯粉末的形式提供。特别有利地，这些氨基酸具有合成来源，或者已经凭借保证以下事实的方法获得：它们不含直接源自动物的任何要素，以便排除任何传染性感染、特别是ESB(牛海绵状脑炎)污染的风险。
选择每种氨基酸的量，以便优化细胞生长和PRP生产。选择天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的量，以便在细胞培养过程中引起缺陷，从而使得可能将细胞的代谢引导向荚膜多糖的生产，而选择其他氨基酸的量，从而使得在培养阶段过程中没有缺陷。
根据本发明，所述培养基还含有维生素，所述维生素选自：硫胺素、泛酸盐、尿嘧啶、次黄嘌呤、生物素、核黄素和吡哆醇。对于本发明的目的，术语"维生素"还涵盖尿嘧啶和黄嘌呤，它们是含氮碱。
特别有利地，在根据本发明的培养基中存在的维生素具有非动物来源，特别是合成来源，由此使得可能排除通过任何传染性感染、特别是通过ESB(牛海绵状脑炎)引起的污染的风险。特别使用由Sigma供应的维生素，其纯度是精确已知的，从而允许在培养基的制备过程中的非常精确的剂量。
选择在培养基中存在的维生素的量，以便优化生物量和PRP的生产。
根据本发明的一个具体方式，所述培养基包含瓜氨酸，所述瓜氨酸可以取代精氨酸和尿嘧啶。
在这种情况下，培养基中包括的瓜氨酸的量有利地为150-500 mg/l之间。
凭借根据本发明的培养基，已经能够生产比当使用根据现有技术的培养基时更大量的磷酸多核糖基核糖醇，而同时不消耗更多碳水化合物，且不产生更多污染物，特别是LPS。
根据本发明的一个实施方案，培养的b型流感嗜血杆菌的菌株是荚膜菌株，其在其遗传密码中具有至少2个拷贝的cap基因座。该cap基因座，大小在17和18 kb之间，重组合基因，所述基因的表达与荚膜的合成和输出相关联。
当在特定琼脂上培养时，荚膜的表达为细菌提供白色；具有该cap基因座的细菌的菌落因此被称为"白色菌落"，而不将荚膜多糖输出至荚膜表面的细菌被称为"灰色菌落"。荚膜的表达经受潜在遗传不稳定性，这可导致荚膜缺陷突变体的出现，这将因此导致PRP产生的降低。研究已经允许表明，根据本发明的方法中使用的在化学上确定的培养基允许确保在约二十细胞世代中使用的菌株的良好遗传稳定性。
根据本发明，可在几个连续步骤中进行b型流感嗜血杆菌细菌的培养，以便逐渐增加生物量。
在这种情况下，将源自冷干物或源自冷冻样品的细菌接种到通常不超过1升的体积的培养基中。在培养过夜之后或当培养基的光密度足够时，将该第一培养物转移到与第一培养基相同、但其体积可以是高达10至20倍大的第二培养基中。调节接种到第二培养基的细菌量，从而使得第二培养基在694 nm的初始光密度(D.O.)是在0.2至0.4之间，以便促进细菌群体的迅速生长。该第二培养通常在发酵罐中进行，但是也可以使用其他类型的容器(烧瓶，离心器等)。当在发酵罐中进行培养时，在整个培养过程中 通常使用37℃+/- 1℃的温度，恒定搅拌，0.1巴的压力，30%的pO2以及0.25气体体积/培养基体积/分钟的空气流速。选择其他参数用于这种类型的培养在本领域技术人员的能力范围之内。在指数细菌生长阶段结束时，可以通过使用相同程序等将生物量转移到更大容量的另一个发酵罐中进一步放大生物量。所获得的培养体积可以是达到，或甚至超过1000升。所述培养通常根据“逐批（Batch）”模式来进行。
最后，在灭活细菌之后获取最终培养物的上清液。所述灭活通常在0.35%-0.37%(v/v)的最终浓度下使用福尔马林溶液来实施。上清液通常借助离心步骤与细菌分离。所得上清液中含有的PRP然后根据本领域技术人员众所周知的常规方法来提取和纯化。
然后有利地将收获且纯化的PRP缀合至载体蛋白诸如破伤风蛋白，以便使其T-依赖性，并且特别允许免疫幼儿。如此获得的PRP-T抗原然后可以在单价疫苗中单独使用，或者与其它抗原组合，以便允许针对数种疾病的同时接种。
特别有利地，本发明提供了制备疫苗组合物的方法，根据所述方法，将获得的缀合物与以下组合：至少一种或多种小儿科疫苗中通常存在的抗原，特别是针对白喉、破伤风、脊髓灰质炎、乙型肝炎、由脑膜炎奈瑟氏菌或肺炎链球菌引起的感染、水痘、腮腺炎、风疹、由轮状病毒引起的感染等的抗原。
根据一个实施方案，所述PRP-T缀合物以粉末形式存在，而其他抗原为液体形式，所有抗原在临施用前混合；根据一个替代实施方案，疫苗组合物完全是液体。
因此，根据本发明的制备方法使得可能制备除了PRP-T缀合物以外还包含白喉、破伤风和乙型肝炎抗原的四价疫苗组合。或者，它使得可能制备四价疫苗组合，除了PRP-T缀合物以外，所述四价疫苗组合还包含白喉类毒素、破伤风类毒素和2种无细胞百日咳博代氏杆菌抗原(antigènes acellulaires de Bordetella pertussis)(类毒素和丝状血凝素)或3种无细胞百日咳博代氏杆菌抗原(先前两种+百日咳杆菌粘附素)或者5种无细胞百日咳博代氏杆菌抗原(先前三种+凝集原)。
它还使得可能制备五价疫苗组合，除了PRP-T缀合物以外，所述五价疫苗组合还包含白喉类毒素、破伤风类毒素、2、3或5种无细胞百日咳博代氏杆菌抗原和还有灭活的1、2和3型脊髓灰质炎病毒。
它还使得可能制备六价疫苗组合，除了PRP-T缀合物以外，所述六价疫苗组合还包含白喉类毒素、破伤风类毒素、2、3或5种无细胞百日咳博代氏杆菌抗原、乙型肝炎和还有灭活的1、2和3型脊髓灰质炎病毒。此类六价组合可以特别是液体，并且每0.5 ml剂量可以包含：
- 20 UI的量的白喉类毒素，
- 40 UI的量的破伤风类毒素，
- 10 μg的比例的乙型肝炎表面抗原，
- 25 μg的比例的百日咳类毒素，
- 25 μg的比例的百日咳丝状血凝素，
- 12 μg PRP的比例的PRP-T，
- 各自量为40、8和32 DU的灭活的1、2和3型脊髓灰质炎病毒，
- 0.6 mg Al3+的比例的氢氧化铝。
或者，它使得可能制备疫苗组合，其中所述百日咳抗原由完整百日咳博代氏杆菌细菌组成。
凭借根据本发明的培养方法，可能增加磷酸多核糖核糖醇的产量，而不增加生物质的量，由此使得可能降低污染LPS的量；根据本发明的方法的该优点对于疫苗行业是非常重要的，在该行业中将这些产物作为抗原引入疫苗组合物中并且在该行业中LPS的量必须降低到最小。具有允许不增加用于更大量的PRP所产生的LPS的量的方法的事实提供了简化后续纯化过程的可能性。
实施例1：根据本发明的培养基的制备
根据本发明的培养基从基础培养基进行制备，向所述基础培养基中即时添加富集溶液。
基础培养基的组成示于下表I中：
表I：
化合物 用于1升的量(mg) 供应商 产品编号
60%乳酸钠 1.5 ml Prolabo 27925.292
K2HPO4 300 VWR Prolabo 26931.263
KH2PO4 300 VWR Prolabo 26923.298
MgSO4.7H2O 368 VWR Prolabo 25165.260
Na2HPO4.12H2O 28620 VWR Prolabo 28028.298
NaH2PO4. 2H2O 1870 VWR Prolabo 28015.294
L-精氨酸 87 Sigma A5006或 A8094
L-丙氨酸 134 Sigma A7627或 A7469或 A4349
L-天冬酰胺 198 Sigma A0884或 A7094
L-赖氨酸 140 Sigma L5626或 L8662或 L7039
L-谷氨酰胺 220 Sigma G3126或 G8540或 G5792
L-组氨酸 78 Sigma H8000或 H6034或 H3911
L-色氨酸 200 Sigma T0254或 T8941或 T4196
L-缬氨酸 115 Sigma V0500或  V0513或 V4638
L-异亮氨酸 130 Sigma I2752或 I7403或 I5281
L-亮氨酸 130 Sigma L8000或 L6914或 L8912
L-酪氨酸 180 Sigma T3754或 T8566或 T4321
L-苯丙氨酸 165 Sigma P5482
L-胱氨酸 61 Sigma C8755或 C7602或 C5735
L-天冬氨酸 1065 Sigma A9256或 A5474
L-谷氨酸 1471 Sigma G1251或 G8415
盐酸吡哆醇 4 Sigma P5669
核黄素 0.2 Sigma R4500
盐酸硫胺素 4 Sigma T4625
生物素 4 Sigma B4501
泛酸钙 4.5 Sigma P5710
尿嘧啶 70 Sigma U0750
次黄嘌呤 20 Sigma H9377
FeSO4.7H2O 2.5 Adrich 450278
ZnSO4.7H2O 5 Sigma Z4750
CoCl2 . 6H2O 1 Fulka 60818
MnSO4. H2O 5 Sigma M7634
CaCl2 . 2H2O 13 Panreac 131232.1211
为了制备1升培养基，使用磁力棒在搅拌的情况下将各种化合物以上表中所述的顺序添加至约100 ml软化水中。添加之前，所有粉末都已经预先溶解在小量软化水中，在某些情况下，添加酸或碱。
因此，对于缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，有必要加入140 μl 10 N KOH至表中所示的量；对于酪氨酸，有必要添加280 μl 10 N KOH；对于苯丙氨酸，有必要添加210 μl 37% HCl，且对于胱氨酸，有必要添加70 μl 37% HCl。
最后，将pH用10N KOH调节至7.2 ± 0.1(在pH太高的情况下，将使用37％ HCl)，然后使用软化水来使体积增加至所需量。
然后将培养基通过在具有0.22 μm的截止阈值的过滤器上过滤的方式进行除菌。
因此可将培养基在5℃储存72小时。
在接种培养基之前，添加以下物质：
- 27.3 ml 512.8 g/l的葡萄糖，从由VWR公司以编号24379.294供应的无水D(+)葡萄糖制备，
- 5 ml 1 g/l的NAD溶液，由Sigma公司以名称β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide hydrate(编号43410)供应，
- 4 ml储存溶液，其包含0.25 g/l的浓度的原卟啉和5 ml/l的浓度的氢氧化铵；原卟啉由Sigma Aldrich公司以名称Protoporphyrine IX Disodium Salt(编号258385)供应，氢氧化铵由VWR公司以名称Ammoniac solution 28%(编号21190.292)供应，
以便获得1升准备用于接种的培养基，且该培养基除了上表I中所述的要素以外还包含浓度如下表II中所示的以下额外要素：
表II：
化合物 培养基中接种前的浓度
原卟啉 1 mg/l
氨水 17.7 μg/l
无水葡萄糖 14 g/l
NAD 5 mg/l
实施例2：根据现有技术的培养基的制备
根据现有技术的培养基通过将特定富集溶液添加至基础培养基中来制备。
基础培养基的组成示于下表III中：
表III：
化合物 基础培养基中的浓度
豌豆蛋白胨 7.42 g/l
60%乳酸钠 1.5 ml/l
Na2HPO4.12H2O 31.14 g/l
NaH2PO4. 2H2O 2.03 g/l
胱氨酸(L) 0.07 g/l
HCl (10N) 0.07 ml/l
色氨酸(L) 0.02 g/l
(NH4)2SO4 1 g/l
MgSO4. 7H2O 0.4 g/l
CaCl2 . 2H2O 0.02 g/l
为了制备这种基础培养基，使用磁力棒将各种要素以它们在表中所述的顺序添加至100 ml连续搅拌的软化水。以粉末形式供应的每种要素都已经预先溶解在小量软化水中。
豌豆蛋白胨来自Kerry公司且以编号Hy-pea 7404销售。(NH4)2SO4由VWR公司以编号21333.296供应。其他要素来自相同供应商，且以与实施例1中所述用于制备根据本发明的培养基的编号相同的编号供应。
将最终pH用10N KOH调节至7.2 ± 0.1(在pH太高的情况下，将使用37％ HCl)。
然后添加软化水以便获得所需体积，然后将其通过根据在120℃30分钟的循环的高压灭菌进行灭菌。
一旦灭菌，可以将培养基在4℃储存15天。
将富集溶液A、B、C和D添加至该基础培养基。
溶液A是包含512.8 g/l的浓度的无水葡萄糖的溶液，由VWR公司以名称无水D(+)葡萄糖(编号24379.294)供应。
溶液B是包含1 g/l的浓度的NAD的储存溶液，由Sigma公司以名称β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide hydrate(编号43410)供应。
溶液C是包含0.25 g/l的浓度的原卟啉和5 ml/l的浓度的氢氧化铵的储存溶液；原卟啉由Sigma Aldrich公司以名称Protoporphyrine IX Disodium Salt(编号258385)供应，氢氧化铵由VWR公司以名称Ammoniac solution 28%(编号21190.292)供应。
溶液D是包含125 g/l的自溶酵母提取物超滤液(Ufel)的浓缩溶液；其由Biospringer公司以名称Ultrafiltrat d’extrait autolytique de levure (Ufel)[自溶酵母提取物超滤液] (编号springer 0701)供应。
这些溶液中的每种通过在截止阈值为0.22 μm的过滤器上过滤来除菌。
将以下物质添加至1升基础培养基：
- 35.1 ml溶液A
- 5 ml溶液B
- 4 ml溶液C
- 40 ml溶液D。
在层流净化罩下实施将每种溶液添加至基础培养基，且导致产生培养基，所述培养基在接种前，除了上表III中提到的要素以外，具有下表IV中所示浓度的以下额外要素：
表IV：
化合物 培养基中接种前的浓度
自溶酵母提取物超滤液(Ufel) 4.9 g/l
原卟啉 1 mg/l
氨水 17.7 μg/l
无水葡萄糖 18 g/l
NAD 5 mg/l
实施例3：用如实施例1中所述的根据本发明的培养基和用如实施例2中所述的现有技术的培养基的PRP产生的比较
这些比较实验根据2步骤培养方案来实施：
- 在36℃在130 rpm(每分钟转数)搅拌的情况下在无挡板的1升玻璃Erlenmeyer烧瓶中预培养的步骤，持续8小时时间段，在其结束时，菌株处于线性生长期结束时；这种预培养通过用0.5％(体积/体积)浓度的含有至少2个拷贝的cap基因座的b型流感嗜血杆菌细菌的接种物接种280 ml培养基而起始；
- 然后90 ml预培养物的转移允许接种含有1.8升培养基的2升Biostat B plus发酵罐。该发酵罐维持在37℃，以400 rpm搅拌，0.45 lpm(每分钟升)通气12小时。
培养12小时后，测量在694 nm的D.O.，这使得可能测定生物量。这是因为，在以前测试过程中，可测定在694 nm测量的一个单位的光密度对应于0.64 g生物量(干重)/升。
在培养上清液中总PRP的量根据与Sturgess等人(Vaccine 17 (1999) 1169-1178)的公开物中所述的方法非常类似的方法，通过与脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)联用的高效阴离子交换色谱来测定。培养上清液通过使其通过0.22 μm过滤器来过滤，然后将500 μl上清液经由使用具有10 kDa的截止阈值的Amicon ultra柱(微孔过滤器编号UFC5010BK)进行超滤，然后通过添加NaOH进行碱性水解步骤。
水解在环境温度实施最少4小时。
定量的有效性通过使用在水解溶液中存在的内部标准物葡糖胺-1-磷酸酯(GlcN1P)且通过定期通过具有已知PRP浓度的内部对照来控制。关于Sturgess等人的指示，流动相由35 mM NaOH和114 mM CH3COONa构成，且再生相用100 mM NaOH和400 mM CH3COONa实施10分钟。
获得的结果示于下表Ⅴ中：
表Ⅴ：
这些结果显示，根据本发明的方法对于PRP产率的优点：事实上注意的是，对于相同体积的培养基，尽管用根据现有技术的培养基获得的生物量更大，但是另一方面，PRP的量是更小的。
实施例4：在根据本发明的方法的培养上清液中和在根据现有技术的方法的培养上清液中存在的PRP和LPS的量的比较
b型流感嗜血杆菌的培养以实施例3中描述的方式用根据本发明的培养基和用根据现有技术的培养基相当地进行实施，然而，区别为根据现有技术的方法的基础培养基包含10 g/l由Solabia公司(编号A1434)供应的酪蛋白的酸水解物代替在根据实施例3的培养基中存在的豌豆蛋白胨。
预培养时间为，如同在实施例3中，8小时，且培养时间为12小时。
PRP的测定和LPS的测定两者都通过HPAEC-PAD进行实施；但LPS的测定通过定量特定单糖（庚糖）、使用已经经历相同工序的纯化LPS的标准系列来实施，其中用于该测定的内部对照为鼠李糖。
获得的结果示于下表VI中：
表VI：
获得的结果显示根据本发明的方法的优点，其允许相对于PRP的量降低产生的LPS的量。
这代表根据本发明的方法的显著优点，因为这非常多地简化了纯化操作，同时维持了适当的安全水平。
实施例5：用于评价锌的重要性的测试
研究了在培养基中锌的存在的重要性。
为此，比较3种培养基：
- 培养基，如在实施例1中所述的培养基，被称为MS，
- 具有与实施例1的组成相同的组成、但没有ZnSO4的培养基，被称为MS Zn-，
- 培养基，如在实施例1中描述的培养基，但ZnSO4浓度为4倍高，即20 mg/l，被称为MS Zn++。
然后将培养基通过在具有0.22 μm的截止阈值的过滤器上过滤进行除菌。
首先在36℃在130 rpm搅拌的情况下在16小时期间进行在无挡板的1升玻璃Erlenmeyer烧瓶中预培养的步骤，其通过用在其遗传密码中具有至少2个拷贝的cap基因座的b型流感嗜血杆菌细菌的冷冻样品接种280 ml如实施例4中所述的培养基来进行。
然后将9.5 ml预培养物在每种待测试的培养基中进行洗涤，然后进行培养物的接种，所述培养物的接种每次在含有170 ml待测试的培养基的有挡板的500ml聚碳酸酯Erlenmeyer烧瓶中进行；在37℃进行培养12小时，且以150 rpm进行搅拌。
对于每种培养基，以与实施例3和4中描述的相同方式测定在培养结束时的生物质、PRP浓度和有LPS的量，并且计算PRP/生物质和还有LPS /生物质和PRP/ LPS比率。
获得的结果示于下表VII中：
表VII：
  MS MS Zn- MS Zn++
培养基的生物量(g干重/升) 1.98 1.23 2.22
培养基的PRP浓度(mg/升) 319 203 372
生物量的比产率(mg PRP/g) 160 165 167
培养基的LPS浓度(mg/升) 11.5 8.8 12.1
生物量的LPS/生物量比率(mg/g) 6.1 7.2 5.5
PRP/LPS比率(mg/mg) 30 23 31
这些结果显示，在培养基中锌的存在允许显著增加生物质的产量和还有PRP的产量，然而，没有成比例增加LPS的量。
实施例6：5升发酵罐中的测试
b型流感嗜血杆菌的培养根据本发明在实施例1中所述的培养基中实施，其仅使用由供应商保证的无动物成分的产品和使用如专利申请FR 2 914 302中所述且由Solvias AG公司以名称：Protoporphyrin IX Disodium Salt(编号SOL20402)供应的合成原卟啉进行。然后所述测试以在实施例3中所述的方式实施，除了所使用的发酵罐是调节在37℃、以550 rpm搅拌和以0.5 lpm通气的5升发酵罐。接种体积则为280 ml，即整个预培养Erlenmeyer烧瓶。
PRP和LPS浓度根据实施例3和4中所述的方案进行测定。
获得的结果示于下表VIII中：
表VIII：
这些结果证实了先前结果，并且显示根据本发明的方法对于获得大量PRP的优点。
实施例7：用如实施例1中所述的根据本发明的培养基和用如现有技术中所述的在化学上确定的培养基的生物量和PRP产生的比较
b型流感嗜血杆菌的培养根据本发明在实施例1中所述的培养基中以及在还有关于流感嗜血杆菌的培养的出版物中描述且呈现为在化学上确定的8种培养基中进行实施。
这8种培养基根据作者的推荐进行制备。它们是，以年代顺序，以下培养基：
- Talmadge和Herriott: Biochemical and Biophysical Research Communications, (March 1960), Vol.2 N°3, p 203-206),
- Butler: J. gen. Microbiol. (1962), 27, 51-60,
- Wolin: J. Bacteriol. Vol.85, (1963) Notes, p 253-254,
- Herriott等人: Journal of Bacteriology, (Feb. 1970), Vol. 101, N°2, 513-516,
- Klein和Luginbuhl: Journal of General Microbiology (1979), 113, 409-411
- Coleman等人: Journal of Clinical Microbiology, (Sept 2003), Vol.41, N°9 p. 4408-4410。
用于制备这8种培养基的产品的参考文献重现于下表IX中：
表IX：
产品 供应商 产品编号
尿苷 Sigma U3003
肌苷 Sigma I4125
腺苷 Sigma A4036
鸟嘌呤 Sigma G6779
鸟苷 Sigma G6264
维生素B12 Sigma V2876
瓜氨酸 Sigma C7629
氯化胆碱 Fluka 26978
胸苷 Sigma T9250
肌醇 Sigma I5125
腐胺二盐酸盐 Sigma P5780
烟酰胺 Sigma N0636
猪正铁血红素 Sigma H3281
氯正铁血红素 Fulka 51280
油酸钠 Sigma O7501
乙酸钠 Fulka 71185
叶酸 Sigma F7876
聚乙烯醇 Sigma 341584
三乙醇胺 Sigma 90278
甘氨酰甘氨酸缓冲剂 Libios B-GLYGLY250
Tween 40 Sigma P1504
Tween 80 Sigma P1754
Tris缓冲剂 VWR 33621.260
乙二胺四乙酸盐 VWR 20302.180
HEPES Sigma H3375
谷胱甘肽 Sigma G6013
腺嘌呤 Sigma A8626
脯氨酸 Sigma P0380
苏氨酸 Sigma T8625
甘氨酸 Sigma G7126
甲硫氨酸 Sigma M9625
丝氨酸 Sigma S4500
甘油 VWR 24387.292
K2SO4 VWR 26994.293
KCl VWR 26764.298
MgCl2. 6H2O Panreac 131396.1211
NaCl VWR 27810.295
NaHCO3 VWR 27778.260
NH4Cl VWR 21236.291
具有L-谷氨酰胺和25 mM HEPES的RPMI 1640 Invitrogen Coleman (2003)的出版物中引用的以前编号，编号61870036 => 新编号52400025
丙酮酸钠  MEM 100 mM Invitrogen Coleman (2003)的出版物中引用的以前编号，编号11360070 => 新编号11360039
然后将培养基通过在具有0.22 μm的截止阈值的过滤器上过滤的方式除菌。
首先在36℃、在16小时期间在130 rpm搅拌的情况下实施在无挡板的1升玻璃Erlenmeyer烧瓶中预培养的步骤，其通过用在其遗传密码中具有至少2个拷贝的cap基因座的b型流感嗜血杆菌细菌的冷冻样品接种280 ml如实施例4中所述的培养基来进行。
然后将9.5 ml预培养物在每种待测试的培养基中洗涤，然后进行培养物的接种，所述培养物的接种每次在含有170 ml待测试的培养基的有挡板的500ml聚碳酸酯Erlenmeyer烧瓶中进行；在37℃和150 rpm搅拌下进行该培养12小时。
每次测试实施至少3次。
对于每种培养基，每小时，测量在694 nm的D.O.，且以如实施例3中所述相同的方式在培养结束时测定PRP浓度。
D.O.结果重现在图1中。
PRP测定的结果示于下表X中：
表X：
实施例8：工业规模PRP生产(1000升)
制备根据本发明的培养基，其具有实施例1的组成，除了锌，其中锌的浓度为20 mg/l，而不是5 mg/l。这是因为实施例5显示该浓度使得可能产生更多PRP，而不增加LPS的量。
所述培养基对于预培养和最终培养是相同的，除了pH(初始pH为7.2 ± 0.1，然后对于预培养的pH随意，且对于生产培养将pH调节在6.7 ± 0.1)。
培养基如实施例1中所述进行制备。在已经混合预先溶解在小量纯净水中的化合物，在某些情况下，添加酸或碱(参见实施例1)之后，以及添加适量的纯净水至补足之前，将pH调节至7.2 ± 0.1用于预培养，且将pH调节至6.7 ± 0.1用于最终培养(用10 N氢氧化钾或氢氧化钠或37％HCl)。
然后将培养基通过在具有0.22 μm的截止阈值的过滤器上过滤的方式进行除菌。
因此可将培养基在5℃储存72小时。
接种培养基之前，添加以下物质：
- 512.8 g/l的葡萄糖，从由VWR公司以编号24379.294供应的无水D(+)葡萄糖制备，
- 1 g/l的NAD溶液，由Sigma公司以名称β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide hydrate(编号43410)供应，
- 储存溶液，其包含0.25 g/l的浓度的原卟啉和5 ml/l的浓度的氢氧化铵；原卟啉由Solvias AG公司以名称Protoporphyrin IX Disodium Salt(编号SOL20402)供应，氢氧化铵由VWR公司以名称Ammoniac solution 28%(编号21190.292)供应，
以便获得准备用于进行接种且除了在实施例1的表I中所述的要素以外还包含具有如在实施例1的表II中所示浓度的额外要素(除了葡萄糖的最终浓度为14.87 g/l而不是14 g/l)的培养基。
1000升规模方法包含一系列3次预培养：
- 第一预培养在37℃在以130 rpm(每分钟转数)搅拌的情况下在含有290 ml完全培养基的无挡板的1升Erlenmeyer烧瓶中进行17-18小时。这些预培养通过用含有至少2个拷贝的cap基因座的b型流感嗜血杆菌细菌的接种物接种该培养基而开始，接种水平对应于0.014的初始目标DO694 nm；
- 第二预培养系列在6.8升发酵罐中进行。两个含有5.2升完全培养基的发酵罐每个用260 ml系列1的预培养物进行接种。将这些发酵罐在以下条件维持4小时：在37℃±1，初始pH为7.2 ± 0.2，pO2使用级联(cascade)维持在30％，所述级联涉及搅拌的增加(500至800 rpm)、然后通气的增加(0.5至2.5 lpm)和然后在0-6 lpm之间的纯O2的流速；
- 第三预培养系列在120升发酵罐中进行，所述发酵罐含有57升用5.8升源自系列2的预培养物接种的完全培养基。将该发酵罐在以下条件维持3小时：在37℃±1，初始pH为7.2 ± 0.2，pO2使用级联维持在30％，所述级联涉及搅拌的增加(300至425 rpm)、然后通气的增加(6至28 lpm)和然后在0-50 lpm之间的纯O2的流速。
工业培养在1000升发酵罐中进行，所述发酵罐含有778升用39升系列3的预培养物接种的完全培养基。将该发酵罐维持在以下条件：在32℃±1，pH调节在6.7 ± 0.2(用2.5 N氢氧化钠溶液)，pO2凭借级联维持在70％，所述级联涉及搅拌的增加(100至230 rpm)、然后通气的增加(70至150 lpm)和然后在0-500 lpm之间的纯O2的流速。此外，根据泡沫水平按照需要添加消泡剂(4%的Biospumex)。
培养12小时后，测量在694 nm的D.O.，这使得可能测定生物量(根据一个DO单位对应于0.64 g干生物质)。PRP和LPS浓度根据实施例3和4中所述的方案测定。
获得的结果示于下表XI中：
表XI：
这些结果显示根据本发明的方法对于PRP产率和PRP/LPS比率的优点，所述结果已经在工业规模上得到证明。

Claims (16)

1.用于在工业规模上生产意欲用于疫苗目的的b型流感嗜血杆菌(Haemophilus infulenzae)的荚膜多糖(PRP)的方法，根据所述方法，将b型流感嗜血杆菌(Hib)的菌株在培养基中培养，收获培养上清液，处理该培养上清液以便从其提取荚膜多糖，所述培养基包含至少：
– 一种碳源，
– 原卟啉，
– 盐，
– 氨基酸，
– NAD或NADH，
– 维生素，
– pH调节手段，
其特征在于所述培养基是在化学上确定的。
2.根据前一权利要求的方法，其特征在于所述培养基至少包含锌。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述pH调节手段由缓冲盐组成。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述碳源可以是多重的且选自：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘油、木糖、核糖、岩藻糖、唾液酸和乳酸。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述原卟啉是合成的原卟啉IX。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述盐选自钾盐、镁盐、钠盐、钙盐、铁盐、锌盐、钴盐和锰盐。
7.根据前一权利要求的方法，其特征在于所述盐选自： K2HPO4；KH2PO4；MgSO4.7 H2O；Na2HPO4.12H2O；NaH2PO4.2H2O；CaCl2.2H2O；FeSO4.7H2O；ZnSO4.7H2O；CoCl2.6 H2O；MnSO4.H2O。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述氨基酸选自：
● 精氨酸,
● 丙氨酸,
● 以下中的至少一种：天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸,
● 赖氨酸,
● 组氨酸,
● 色氨酸,
● 缬氨酸,
● 异亮氨酸,
● 亮氨酸,
● 酪氨酸,
● 苯丙氨酸,
● 胱氨酸或等效物。
9.根据前一权利要求的方法，其特征在于所述培养基至少包含精氨酸、丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于用谷胱甘肽或半胱氨酸替代胱氨酸。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述维生素选自：硫胺素、泛酸盐、尿嘧啶、次黄嘌呤、生物素、核黄素和吡哆醇。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于用瓜氨酸替代精氨酸和尿嘧啶。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于其还包括将获得的荚膜多糖缀合至载体蛋白的步骤。
14.根据前一权利要求的方法，其特征在于所述载体蛋白是破伤风类毒素。
15.根据前述权利要求中任一项的获得的荚膜多糖用于制备疫苗组合物的用途。
16.用于制备疫苗组合物的方法，根据所述方法：
- a) 通过于在化学上确定的培养基中培养Hib的菌株在工业规模上制备由荚膜多糖(PRP)组成的针对b型流感嗜血杆菌(Hib)的抗原，所述培养基的每种成分的性质和量是完全确定的，且包含至少：
　　– 一种碳源，
　　– 原卟啉，
　　– 盐，
　　– 氨基酸，
　　– NAD或NADH，
　　– 维生素，
　　– 以及pH调节手段，
- b) 收获该培养上清液，处理该培养上清液以便由其提取纯化的荚膜多糖，
- c) 将步骤b)中获得的荚膜多糖缀合至载体蛋白，
- d) 将步骤c)中获得的缀合物与用于针对以下感染中的一种或多种的接种的至少一种或多种抗原组合：白喉、破伤风、脊髓灰质炎、乙型肝炎、水痘、腮腺炎、风疹、由脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis ）或肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）引起的感染、由轮状病毒引起的感染，以便获得允许针对数种疾病同时免疫的疫苗组合。
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