TW201734198A - 生產l-組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌變異株與使用其生產l-組胺酸之方法 - Google Patents
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Abstract
在本文中提供一種生產L-組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌變異株與藉由使用其生產L-組胺酸的方法。
Description
本發明是有關於一種生產L-組胺酸之新穎變異株以及藉由使用其生產L-組胺酸的方法。
本申請案主張於2016年3月14日在韓國智慧財產局提出申請的韓國專利申請案第10-2016-0030092號的權利,所述韓國專利申請案的揭露內容併入本案供參考。
L-組胺酸是20種標準胺基酸中的一種,且被分類為用於使兒童生長的必需胺基酸。另外,L-組胺酸會參與例如抗氧化、免疫調節等重要的生理過程,且因此L-組胺酸用於醫療行業中,例如消化道潰瘍治療劑及循環系統治療劑的原材料、胺基酸溶液等。
血紅素中富含L-組胺酸且主要藉由使用血粉作為原材料進行蛋白質水解萃取來生產L-組胺酸。然而,此種方法具有低的效率且會造成環境污染。同時,可藉由微生物發酵來生產L-組胺酸,但此種方法尚未大規模工業化。此乃因L-組胺酸的生物合成與磷酸核糖焦磷酸酯(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)具有競爭關係,焦磷酸核糖是用於合成核苷酸的前驅物,且具有高能量需要及複雜的生物合成製程以及調節機制。
可利用誘導變異及選擇變異株的方法以及藉由基因改造(genetic modification)調節品系的新陳代謝的方法來提高發酵方法中使用的微生物的L-組胺酸生產能力。
因此,為了藉由使用微生物進行發酵來生產L-組胺酸,需要開發能夠穩定地生產高濃度的L-組胺酸的品系以及生產L-組胺酸的方法。
本申請案的態樣提供一種生產L-組胺酸的麩胺酸棒狀桿菌變異株KCCM11795P。
本文使用的用語「L-組胺酸」是指具有咪唑側鏈及式C6
H9
N3
O2
的鹼性胺基酸。L-組胺酸是加速血紅素及白血球的生產的胺基酸,且用作組胺酸合成的必需組分,並且會參與組織的再生及生長。
同時,在微生物中,可藉由以下方式來生產L-組胺酸:開始使5-磷酸核糖基-1-焦磷酸酯(PRPP)與腺核苷三磷酸(ATP)縮合,然後自麩醯胺接收氮以生產L-組胺醇,以及最終藉由組胺醇脫氫酶(histidinol dehydronase)進行脫氫。生物合成途徑較其他胺基酸的生物合成途徑更複雜,且因對L-組胺酸或其衍生物的回饋抑制而具有大規模生產高濃度的L-組胺酸的問題。因此,藉由以下方式來揭示以高產率來生產L-組胺酸的微生物:誘導出抵抗L-組胺酸的衍生物的變異株,以使得即使在高濃度的L-組胺酸中仍藉由減輕對L-組胺酸或其衍生物的回饋抑制來使變異株生長。因此,本申請案的變異株對L-組胺酸的衍生物具有抵抗力。
本文所用的用語「L-組胺酸的衍生物」泛指結合有另一胺基酸、取代基或官能基的L-組胺酸。在本申請案中,用語「L-組胺酸的衍生物」包含能夠誘導與L-組胺酸的生物合成相關的回饋抑制的材料,例如,1,2,4-三唑-3-丙胺酸等,但本申請案並非僅限於此。可使用L-組胺酸的衍生物來辨識在選擇L-組胺酸生產變異株的製程中,所述變異株是否會減輕對L-組胺酸或其衍生物的回饋抑制。
本文所用的用語「L-組胺酸生產變異株」意指發生經變異而以較在母品系中高的濃度生產L-組胺酸的微生物。就此而言,可利用此項技術中習知的各種方法中的一種方法來誘導微生物的變異,且可利用物理變異誘導方法或化學變異誘導方法。舉例而言,本申請案中的合適的化學變異誘導因子可為N-甲基-N'-硝基-N亞硝基胍(NTG)、二環氧丁烷、磺化乙基甲烷(ethylmethane sulfonate)、芥子化合物、肼、及亞硝酸,但並非僅限於所列實例。另外,物理變異誘導因子可包括紫外線及γ輻射,但並非僅限於所述實例。當誘導變異時,母品系受具有足以留下特定大小的可存活族群的濃度的變異誘導因子影響。可存活族群的大小根據變異誘導因子的類型而變化且相依於可存活族群中的由具有恆定致死率(fatality rate)的變異因子所誘導的變異量。舉例而言,N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍可具有使得近似10%至50%的起始族群保持存活的致死率。由硝酸誘導的變異可使得近似0.01%至0.1%的起始族群存活,而由紫外線誘導的變異可使得近似1.0%的起始族群存活,但本申請案並非僅限於此。
另外,L-組胺酸生產變異株可為能夠發生變異的任何微生物,且合適的微生物的實例包括屬於以下的微生物:艾氏菌屬、腸桿菌屬、耶氏桿菌屬、克雷白氏菌屬、伊文氏桿菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、及乳酸菌屬,但本申請案並非僅限於此。具體而言,本申請案的微生物可為屬於棒狀桿菌屬的微生物或屬於艾氏菌屬的微生物,更具體而言為麩胺酸棒狀桿菌,但本申請案並非僅限於此。
本申請案的另一態樣提供一種生產L-組胺酸的方法,所述方法包括:在培養基中培養麩胺酸棒狀桿菌變異株KCCM11795P;以及自所述變異株或所述培養基回收L-組胺酸。
現在將詳細闡述根據本申請案實施例的生產L-組胺酸的所述方法。
本文所用的用語「培養」意指使微生物能夠在適宜地及人為地控制的環境條件下生長。在本申請案中,可利用此項技術中習知的一種對麩胺酸棒狀桿菌進行培養的方法來執行微生物的培養。具體而言,培養方法的實例包括但不限於分批培養、連續培養、及分批補料培養。所述各種方法揭露於例如「生化工程(Biochemical Engineering)(詹姆斯M.李,普倫蒂斯霍爾國際出版(Prentice-Hall International Editions),pp138-176,1991年)」等中。
本文所用的用語「培養基」用於培養細菌(具體而言,麩胺酸棒狀桿菌)的母品系或變異株,且意指含有碳源、氮源、及無機鹽以使得品系能夠生產L-組胺酸的培養基。所述培養基可包含用於對變異株進行培養的培養基組分以及在使微生物生長的同時釋放至培養基中的各種材料(具體而言,作為目標材料的L-組胺酸)。
用於進行培養的培養基必須以適宜的方式來滿足特定品系的要求。用於棒狀桿菌品系的培養基是已知的(例如,普通細菌學方法手冊(Manual of Methods for General Bacteriology).美國細菌學學會(American Society for Bacteriology).美國華盛頓特區(Washington D.C., USA),1981年)。包含於培養基中的碳源的實例包括:糖及碳水化合物類,例如葡萄糖、蔗糖、檸檬酸鈉、果糖、乳糖、及麥芽糖;油及脂肪,例如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、及椰子油;脂肪酸,例如棕櫚酸、硬脂酸、及亞麻油酸;醇,例如甘油及乙醇;以及有機酸,例如乙酸,但本申請案並非僅限於此。該些所列材料可單獨使用或以組合形式使用。
包含於培養基中的氮源可為例如蛋白腖、肉萃取物、酵母萃取物、乾酵母、玉米漿、大豆餅、脲、硫脲、銨鹽、硝酸鹽、及其他含有機氮或無機氮的化合物,但本申請案並非僅限於此。包含於培養基中的無機鹽可為含有鎂、錳、鉀、鈣、鐵、鋅、鈷等的化合物,但本申請案並非僅限於此。
可用於培養基中的磷源包括磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀或對應的含鈉的鹽,但本申請案並非僅限於此。另外,培養基(culture medium)可包含生長所必需的金屬鹽,例如硫酸鎂或硫酸鐵。該些化合物可單獨使用或以組合形式使用,但並非僅限於此。
另外,本申請案的培養基除碳源、氮源、及無機鹽之外可更包含胺基酸、維生素、核酸、及相關化合物。可在培養製程期間藉由利用適宜的方法連續地或以分批方式向培養基中添加前述原材料。
同時,可藉由適宜地使用鹼性化合物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、或氨)或酸性化合物(例如,磷酸或硫酸)來調整培養基的pH。另外,可使用消泡劑(例如脂肪酸聚乙二醇酯)來抑制氣泡的形成。為維持好氧條件,可將氧氣或含氧的氣體(例如,空氣)注入至培養基中。培養產物的溫度一般可介於20℃至45℃範圍內,但並非僅限於此。培養製程繼續進行直至在最大程度上獲得生產出的所期望量的L-組胺酸。為達成此目的,培養製程一般可執行10小時至160小時,但本申請案並非僅限於此。可將所生產L-組胺酸釋放至培養基中抑或可將所生產L-組胺酸包含於微生物中。
可利用此項技術中習知的各種方法(例如,離心分離、過濾、陰離子交換層析法、結晶化、及高效液相層析法(high performance liquid chromatography,HPLC))而執行自其中培養有變異株的培養基或變異株回收L-組胺酸,但本申請案並非僅限於此。
本申請案的另一態樣提供一種包含麩胺酸棒狀桿菌變異株KCCM11795P的L-組胺酸生產組成物。
根據一實施例,L-組胺酸生產組成物除麩胺酸棒狀桿菌變異株KCCM11795P之外可更包含所述品系的培養產物。
本文所用的用語「培養產物」被解釋為包含包括藉由在上述培養基中培養某一段時間而獲得的品系的培養基、其代謝物、額外養分等,或自其移除了所培養品系的培養物。本申請案的麩胺酸棒狀桿菌變異株KCCM11795P是生產高濃度的L-組胺酸的品系,且因此,可藉由此項技術中習知的各種方法而自包含所述品系及其培養產物的組成物回收L-組胺酸,從而生產L-組胺酸。
現在將詳細參考實施例,在附圖中對所述實施例的實例進行說明,其中相同參考編號自始至終指代相同元素。就此而言,本發明實施例可具有不同形式且不應被視為僅限於本文所述的說明。因此,下文藉由參考各圖僅闡述所述實施例以闡釋各態樣。
實例
1
:能夠生產
L-
組胺酸的變異株的選擇
為了獲得能夠生產L-組胺酸的微生物變異株,利用以下方法來誘導微生物的變異。具體而言,在活性培養基中將作為母品系的麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032培養了16小時以使其活化,在121℃下用15分鐘將經活化品系接種至經消毒種子培養基中,並培養了14小時,且自其回收了5毫升培養物。用100毫莫耳檸檬酸緩衝劑洗滌了所回收的培養物,且然後向其中添加了N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)而達到最終濃度為200毫克/升以用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍對所述品系處理20分鐘,並且用100毫莫耳磷酸鹽緩衝劑洗滌了所得培養物。將經N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍處理的品系平鋪於基本培養基(minimal medium)上,且然後計算其死亡率,並且計算出死亡率為85%。
為了獲得抵抗作為L-組胺酸的衍生物的1,2,4-三唑-3-丙胺酸的變異株,將經N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍處理的品系平鋪於其中1,2,4-三唑-3-丙胺酸的最終濃度為20毫莫耳、30毫莫耳、40毫莫耳、及50毫莫耳的基本培養基中的每一者上,並在30℃下培養了5天。自由具有四種不同濃度的1,2,4-三唑-3-丙胺酸的培養基獲得的變異株而獲得了抵抗1,2,4-三唑-3-丙胺酸的3種類型的變異株。
實例
2
:麩胺酸棒狀桿菌
HCJ-86
的選擇以及辨識其生產
L-
組胺酸的能力
利用以下方法辨識出了在實例1中所獲得的抵抗1,2,4-三唑-3-丙胺酸的三種類型的變異株的L-組胺酸生產能力。
在含有25毫升種子培養基的250毫升角板式(corner-baffled)燒瓶中接種了母品系麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032及所述三種類型的變異株中的每一者,然後在30℃及200 轉/分鐘下搖晃培養了20小時以獲得種子培養物。隨後,在含有24毫升生產培養基的250毫升角板式燒瓶中接種了1毫升種子培養物並在30℃及200轉/分鐘下培養了72小時,從而生產出了L-組胺酸。在完成培養製程之後,藉由高效液相層析法(HPLC)量測了L-組胺酸的生產率。詳細分析方法及濃度示於下表1及表2中。 <表1>
<表2>
根據所述結果,確認了野生型麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032無法生產L-組胺酸,而變異株3生產了1.6克/升的L-組胺酸(參見表2及圖1(a)與圖1(b))。因此,將變異株3命名為麩胺酸棒狀桿菌HCJ-86,且根據布達佩斯條約(Budapest treaty)於2015年12月22日以登錄號:KCCM11795P保藏於作為國際保藏局的韓國微生物培養物中心(Korean Culture Center of Microorganisms)中。根據所述結果,確認了對L-組胺酸及1,2,4-三唑-3-丙胺酸具有抵抗力的麩胺酸棒狀桿菌HCJ-86相較於野生型品系可藉由減輕對L-組胺酸或其衍生物的回饋抑制而以高效率及高產率來生產L-組胺酸。
實例1及實例2中所使用的培養基的組成物如下表3所示。 <表3>
本申請案的麩胺酸棒狀桿菌變異株KCCM11795P對L-組胺酸及其衍生物具有抵抗力,且因此,藉由減輕自其發生的回饋抑制,可藉由發酵而以較在麩胺酸棒狀桿菌母品系中高的濃度來穩定地生產L-組胺酸。
儘管已闡述了本發明的一或多個示例性實施例,但此項技術中具有通常知識者將理解,在本文中,在不背離本發明的本質特徵的條件下可做出各種形式及細節上的改變。因此,應理解,本文所述的示例性實施例應被視為僅具有說明性意義而並非用於限制。本發明的範圍並未在上述說明中示出而是在申請專利範圍中示出,且申請專利範圍以及處於其等效範圍內的所有不同之處的含義及範圍均將被解釋為併入本發明中。
無
結合附圖閱讀以下詳細說明,將更清楚地理解本發明的以上及其他目標、特徵以及其他優點,在附圖中: 圖1(a)與圖1(b)分別說明示出自麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032及麩胺酸棒狀桿菌變異株KCCM11795P生產的L-組胺酸的定量分析結果的層析圖。
寄存號碼 [國外寄存資訊] 寄存機構名稱:韓國微生物培養物中心 寄存日期:2015年12月22 寄存號碼:KCCM11795P
Claims (4)
- 一種麩胺酸棒狀桿菌變異株品系KCCM11795P,對L-組胺酸的衍生物具有抵抗力且生產L-組胺酸。
- 如申請專利範圍第1項所述的麩胺酸棒狀桿菌變異株品系KCCM11795P,其中所述L-組胺酸的衍生物包含1,2,4-三唑-3-丙胺酸。
- 一種生產L-組胺酸的方法,所述方法包括: 在培養基中培養如申請專利範圍第1項或第2項所述的麩胺酸棒狀桿菌變異株品系KCCM11795P;以及 自所述變異株或所述培養基回收L-組胺酸。
- 一種L-組胺酸生產組成物,包含如申請專利範圍第1項或第2項所述的麩胺酸棒狀桿菌變異株品系KCCM11795P。
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