RU2751495C1 - Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма - Google Patents
Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2751495C1 RU2751495C1 RU2019108587A RU2019108587A RU2751495C1 RU 2751495 C1 RU2751495 C1 RU 2751495C1 RU 2019108587 A RU2019108587 A RU 2019108587A RU 2019108587 A RU2019108587 A RU 2019108587A RU 2751495 C1 RU2751495 C1 RU 2751495C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- leucine
- microorganism
- corynebacterium glutamicum
- producing
- acid
- Prior art date
Links
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 131
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 title claims abstract description 67
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 title claims abstract description 63
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 11
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 28
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 14
- -1 terleucine Chemical compound 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- NILQLFBWTXNUOE-UHFFFAOYSA-N 1-aminocyclopentanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(N)CCCC1 NILQLFBWTXNUOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000008544 L-leucines Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 5
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 102100030840 AT-rich interactive domain-containing protein 4B Human genes 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000792935 Homo sapiens AT-rich interactive domain-containing protein 4B Proteins 0.000 description 3
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- NMDWGEGFJUBKLB-YFKPBYRVSA-N (2S)-2-hydroxy-2-methyl-3-oxobutanoic acid Chemical compound CC(=O)[C@](C)(O)C(O)=O NMDWGEGFJUBKLB-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTMXBOCTJPQVDZ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dihydroxy-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)C(O)(O)C(O)=O CTMXBOCTJPQVDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- ZFIVKAOQEXOYFY-UHFFFAOYSA-N Diepoxybutane Chemical compound C1OC1C1OC1 ZFIVKAOQEXOYFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical class ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002613 leucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится биотехнологии и микробиологии, в частности к микроорганизму, обладающему продуктивностью по L-лейцину, и способу получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма и, более конкретно, к мутанту Corynebacterium glutamicum, обладающему устойчивостью к L-лейцину и его производному и улучшенной продуктивностью по L-лейцину, и к способу получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма. Изобретение позволяет получать L-лейцин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему L-лейцин, и способу получения L-лейцина с использованием указанного микроорганизма.
Предшествующий уровень техники
К аминокислотам с разветвленной цепью относятся три типа аминокислот (то есть L-валин, L-лейцин и L-изолейцин), и известно, что они метаболизируются в основном в мышцах и используются в качестве источника энергии во время физической активности. Наряду с увеличением информированности в отношении важных ролей этих аминокислот с разветвленной цепью в поддержании и увеличении мышечной массы во время физической активности, их применение также увеличивается. В частности, L-лейцин представляет собой незаменимую аминокислоту и широко применяется лекарственных средствах, пищевых продуктах, пищевых добавках, химических соединениях для производственных нужд и так далее.
Между тем, эти аминокислоты с разветвленной цепью продуцируются в основном микроорганизмами рода Escherichia или рода Corynebacterium, и известно, что их биосинтез осуществляется из 2-кетоизокапроновой кислоты, предшественника, после прохождения нескольких стадий от пировиноградной кислоты (патенты Кореи №№10-0220018 и 10-0438146). Однако, проблема с ферментами, вовлеченными в биосинтез лейцина, заключается в том, что они подвержены ингибированию по типу обратной связи, вызванному конечным продуктом, то есть L-лейцином или его производным, что затрудняет крупномасштабное промышленное получение L-лейцина.
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки микроорганизмов, продуцирующих L-лейцин с высоким выходом по сравнению со стандартными штаммами. В результате они открыли, что мутанты, полученные с использованием микроорганизма, продуцирующего глутаминовую кислоту, проявляют устойчивость к норлейцину (NL) (то есть производному лейцина), и что эти мутанты свободны от ингибирования по типу обратной связи L-лейцином или его производным, и таким образом L-лейцин продуцируется с высоким выходом, тем самым выполняя настоящее изобретение.
Техническое решение
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить мутант Corynebacterium glutamicum, обладающий новой L-лейцин-продуцирующей способностью.
Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения L-лейцина с использованием этого мутанта Corynebacterium glutamicum.
Полезные эффекты изобретения
Микроорганизм рода Corynebacterium glutamicum представляет собой микроорганизм, обладающий устойчивостью к L-лейцину или его производному, и, следовательно, может предотвращать ингибирование по типу обратной связи и обладает улучшенной продуктивностью по L-лейцину по сравнению с его родительским штаммом. Соответственно, способ получения L-лейцина с использованием микроорганизма по настоящему изобретению позволяет получать L-лейцин с высокой эффективностью и высоким выходом.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 представлена блок-схема, иллюстрирующая путь биосинтеза L-лейцина, который представляет собой конечный продукт по настоящему изобретению.
Наилучшее воплощение изобретения
В одном аспекте настоящего изобретения предложен новый мутант Corynebacterium glutamicum (модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum), продуцирующий L-лейцин, и, в частности, мутант, депонированный с номером доступа KCCM11661P, и мутант, депонированный с номером доступа KCCM11662P, для получения L-лейцина.
Как его используют здесь, термин “L-лейцин”, который представляет собой незаменимую аминокислоту, относится к L-аминокислоте, представленной формулой HO2CCH(NH2)CH2CH(CH3)2, которая структурно соответствует аминокислотам с разветвленной цепью, наряду с L-валином и L-изолейцином.
Между тем, в отношении биосинтеза L-лейцина у микроорганизмов известно, что биосинтез L-лейцина осуществляется из пировиноградной кислоты через ацетомолочную кислоту, дигидроксиизовалериановую кислоту, кетоизовалериановую кислоту, 2-изопропиляблочную кислоту, 3-изопропиляблочную кислоту и кетоизокапроновую кислоту путем биосинтетического процесса, показанного на Фиг. 1. Дополнительно, биосинтез L-лейцина осуществляется путем катализа биосинтетического процесса с использованием таких ферментов как синтаза ацетогидроксикислот, изомероредуктаза ацетогидроксикислот, дегидратаза дигидроксикислот, синтаза изопропиляблочной кислоты, дегидратаза изопропиляблочной кислоты, дегидрогеназа изопропиляблочной кислоты и трансаминаза B. Однако трудно промышленным путем производить только один тип аминокислоты с разветвленной цепью путем ферментации, потому что ферменты, используемые в этих путях, являются такими же, как в процессе биосинтеза аминокислот с разветвленной цепью (то есть L-валина, L-изолейцина и L-лейцина). Дополнительно, вследствие наличия ингибирования по типу обратной связи конечным продуктом (то есть L-лейцином или его производным), существует проблема с промышленным крупномасштабным производством L-лейцина. В этом отношении мутант по настоящему изобретению может обладать устойчивостью к L-лейцину или его производному.
Как его используют здесь, термин “производное” может относиться к соединениям, о которых известно, что они обладают способностью ингибировать способность микроорганизмов продуцировать L-лейцин путем индуцирования ингибирования по типу обратной связи в отношении биосинтеза L-лейцина, конечного продукта по настоящему изобретению. Примеры соединений могут включать изолейцин, терлейцин, норлейцин, циклолейцин и так далее, но без ограничения этим. В частности, мутант может обладать устойчивостью к по меньшей мере одному веществу, выбранному из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, терлейцина, норлейцина и циклолейцина, и более конкретно к норлейцину. В целом, известно, что биосинтез L-лейцина ингибируется, когда L-лейцин накапливается выше определенного уровня в клетке. Следовательно, любой штамм, обладающий устойчивостью к этому производному, может освободиться от ингибирования L-лейцином и может продуцировать L-лейцин даже при высокой концентрации L-лейцина.
Желаемый мутант микроорганизма, продуцирующий L-лейцин, по настоящему изобретению может быть получен путем мутагенеза его родительского штамма. В частности, мутагенез микроорганизма может быть выполнен различными способами, хорошо известными в данной области техники, и можно использовать либо физический, либо химический мутагенез. Например, примеры химических мутагенов, подходящих для настоящего изобретения, могут включать N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), диэпоксибутан, этилметансульфонат, соединения иприта, гидразин и нитрит, но химические мутагены не ограничиваются этим. Дополнительно, примеры физических мутагенов могут включать ультрафиолет и гамма-излучение, но физические мутагены не ограничены этим.
При индуцировании мутагенеза родительский штамм подвергается воздействию мутагена в концентрации, при которой может оставаться выжившая популяция родительского штамма определенного размера. Размер варьирует в зависимости от типа мутагена и зависит от количества индуцированной мутации в выжившей популяции при постоянном уровне гибели. Например, в случае NTG уровень гибели может оставлять жизнеспособными приблизительно от 10% до 50% от начальной популяции. При мутагенезе с помощью азотистой кислоты могут оставаться жизнеспособными приблизительно от 0,01% до 0,1% от начальной популяции, и при мутагенезе с помощью ультрафиолетового света может оставаться жизнеспособным приблизительно 1,0% начальной популяции, но мутагены не ограничены этими.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения L-лейцина, включающий культивирование мутанта Corynebacterium glutamicum и выделение L-лейцина из мутанта Corynebacterium glutamicum или из его культуры.
Как его используют здесь, термин “культивирование” обозначает, что микроорганизмы выращивают подходящим образом искусственно контролируемых условиях окружающей среды. Культивирование микроорганизма по настоящему изобретению может быть выполнено с использованием способа культивирования Corynebacterium glutamicum, широко известного в данной области техники. В частности, примеры способов культивирования могут включать периодическое культивирование, непрерывное культивирование и периодическое культивирование с подпиткой, но способы культивирования не ограничены этим. Эти различные способы раскрыты, например, в “Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, стр. 138-176, 1991) и тому подобных.
Как его используют здесь, термин “культура” относится к материалу, содержащему среду, в которой выращивают или вырастили микроорганизм подходящим образом искусственно контролируемых условиях окружающей среды. Культура не включает выращенный микроорганизм в узком смысле слова, но может включать его в широком смысле. Термин “культура” включает различные вещества, которые были высвобождены в среду микроорганизмом во время его роста вместе с компонентами среды, включенными для культивирования микроорганизма, и в частности, лейцина, который представляет собой целевой материал.
Среда, используемая для культивирования, должна соответствовать требованиям для культивирования определенного штамма соответствующим образом. Примеры культуральных сред для Corynebacterium раскрыты (например, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., U.S.A., 1981). Примеры источников углерода для использования могут включать сахариды и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота, но источники углерода не ограничены ими. Эти вещества можно использовать по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота для использования могут включать пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину; или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, но источники азота не ограничены этим. Источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации. Примеры источников фосфора для использования могут включать дигидроортофосфат калия, гидроортофосфат калия или соответствующие их натрийсодержащие соли, но источники фосфора не ограничены ими. Дополнительно, культуральные среды могут включать соли металлов, такие как сульфат магния и сульфат железа, которые необходимы для роста. Дополнительно к вышеперечисленным веществам могут быть включены необходимые для роста вещества, такие как аминокислоты и витамины. Также в культуральной среде могут быть использованы подходящие предшественники. Вышеупомянутые вещества можно добавлять в культуральные среды подходящим образом при периодическом культивировании или непрерывном культивировании во время культивирования.
Между тем, pH культуры может быть подходящим образом отрегулирован с использованием основных соединений, таких как гидроксид натрия, гидроксид калия и аммиак, или кислотных соединений, таких как фосфорная кислота и серная кислота. Дополнительно, образование пузырей воздуха можно предупредить, используя пеногаситель, такой как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. Для поддержания аэробных условий в культуру вводят кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Обычно температура культуральных сред может находиться в диапазоне от 20°C до 45°C. Культивирование продолжают до тех пор, пока продукция L-лейцина не достигнет ее максимального уровня, который обычно достигается через 10-160 часов. L-лейцин может высвобождаться в культуральные среды или содержаться внутри клеток.
Выделение L-лейцина из клеток или из культуральных сред может быть выполнено традиционным способом, известным в данной области техники, например центрифугированием, фильтрованием, анионообменной хроматографией, кристаллизацией, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и так далее, но способ не ограничен ими.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Здесь и далее настоящее изобретение будет раскрыто подробно с помощью примеров воплощений. Однако эти примеры воплощений предназначены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1. Отбор мутантов путем искусственного мутагенеза
Для получения мутантных микроорганизмов, продуцирующих L-лейцин, у микроорганизмов были индуцированы модификации с помощью следующих способов.
В частности, родительские штаммы (то есть продуцирующие глутаминовую кислоту Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 и Corynebacterium glutamicum ATCC 13869), которые были активированы путем культивирования в активирующей среде в течение 16 часов, инокулировали в посевную среду, стерилизованную при 121°C в течение 15 минут, и культивировали в ней в течение 14 часов. Затем 5 мл культуральной среды отбирали и промывали 100 мМ цитратным буфером и затем к ней добавляли N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) до конечной концентрации 200 мг/л. После обработки в течение 20 минут культуральную среду промывали 100 мМ фосфатным буфером. Штаммы, обработанные NTG, распределяли по минимальной среде и измеряли уровень гибели. В результате было подтверждено, что уровень гибели составил 85%. Для отбора модифицированных штаммов, обладающих устойчивостью к норлейцину (NL), который соответствует производному L-лейцина, штаммы, обработанные NTG, распределяли на минимальной среде, содержащей NL в конечной концентрации 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ и 50 мМ, соответственно. Затем штаммы культивировали при 30°C в течение 5 суток и затем получали мутанты, обладающие устойчивостью к NL.
Полученные таким образом мутанты были обозначены как Corynebacterium glutamicum KCJ-24 и Corynebacterium glutamicum KCJ-28, соответственно, и были депонированы в Корейском Центре Культур Микроорганизмов (KCCM), который представляет собой международный орган депонирования согласно Будапештскому договору, 22 января 2015 года с номерами доступа KCCM11661P и KCCM11662P, соответственно.
Состав культуральных сред, используемых в Примерах 1 и 2, был следующим:
Активирующая среда
Мясной экстракт 1%, полипептон 1%, хлорид натрия 0,5%, дрожжевой экстракт 1%, агар 2%, pH 7,2;
Посевная среда
Глюкоза 5%, бактопептон 1%, хлорид натрия 0,25%, дрожжевой экстракт 1%, мочевина 0,4%, pH 7,2;
Минимальная среда
Глюкоза 1,0%, сульфат аммония 0,4%, сульфат магния 0,04%, дигидроортофосфат калия 0,1%, мочевина 0,1%, тиамин 0,001%, биотин 200 мкг/л, агар 2%, pH 7,0.
Пример 2. Исследование L-лейцин-продуцирующей способности мутантов
Corynebacterium glutamicum KCJ-24 и Corynebacterium glutamicum KCJ-28, которые были получены в Примере 1, и для которых была подтверждена их устойчивость к NL в высоких концентрациях, культивировали следующим способом, для того, чтобы подтвердить их L-лейцин-продуцирующую способность.
Каждый из Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 и Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (то есть родительских штаммов) и двух мутантов инокулировали в колбы на 250 мл с угловыми перегородками, содержащие 25 мл посевной среды, описанной ниже, и культивировали при 30°C в течение 20 часов при встряхивании при 200 об/мин для получения посевных культуральных сред. После этого 1 мл каждой из посевных культуральных сред инокулировали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл следующей продукционной среды и культивировали при 30°C в течение 72 часов со встряхиванием при 200 об/мин для получения L-лейцина.
Состав продукционной среды, использованной в настоящем Примере 2, был следующим.
Продукционная среда
Глюкоза 5%, сульфат аммония 2%, дигидроортофосфат калия 0,1%, гептагидрат сульфата магния 0,05%, жидкий кукурузный экстракт (CSL) 2,0%, биотин 200 мкг/л, pH 7,2.
После завершения культивирования уровень продукции L-лейцина измеряли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Концентрации L-лейцина в культуральных средах для каждого штамма для экспериментов приведены в Таблице 1 ниже.
Таблица 1. Сравнение L-лейцин-продуцирующей способности Corynebacterium glutamicum KCJ-24 и Corynebacterium glutamicum KCJ-28
Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 (Родительский штамм) |
Corynebacterium glutamicum KCJ-24 (Модифицированный штамм) |
Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (Родительский штамм) |
Corynebacterium glutamicum KCJ-28 (Модифицированный штамм) |
|
Конц. L-лейцина (г/л) | 0,1 | 2,7 | 0,3 | 3,1 |
В результате, как показано в Таблице 1, родительские штаммы (то есть Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 и Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) продуцировали 0,1 г/л и 0,3 г/л L-лейцина, соответственно, а мутанты (то есть Corynebacterium glutamicum KCJ-24 и Corynebacterium glutamicum KCJ-28) согласно настоящему изобретению продуцировали 2,7 г/л и 3,1 г/л L-лейцина, соответственно, что подтверждает то, что L-лейцин-продуцирующая способность мутантов увеличивалась по меньшей мере примерно в 10 раз по сравнению с таковой родительских штаммов.
Приведенные выше результаты позволяют предположить, что мутанты, обладающие устойчивостью к L-лейцину и норлейцину, не подвержены ингибированию лейцином или его производным по типу обратной связи и, следовательно, могут продуцировать L-лейцин с высокой эффективностью и с высоким выходом.
Claims (6)
1. Штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-лейцин, депонированный с номером доступа KCCM11661P.
2. Штамм Corynebacterium glutamicum по п. 1, обладающий устойчивостью к L-лейцину и его производному, которое выбрано из группы, состоящей из изолейцина, терлейцина, норлейцина и циклолейцина.
3. Штамм Corynebacterium glutamicum по п. 2, где производное L-лейцина представляет собой норлейцин (NL).
4. Способ получения L-лейцина, включающий
культивирование штамма Corynebacterium glutamicum по п. 1; и
выделение L-лейцина из штамма Corynebacterium glutamicum или из культуры.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2015-0119785 | 2015-08-25 | ||
KR1020150119785A KR101796830B1 (ko) | 2015-08-25 | 2015-08-25 | L-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 l-류신의 제조방법 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018108115A Division RU2693663C1 (ru) | 2015-08-25 | 2016-08-25 | Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2751495C1 true RU2751495C1 (ru) | 2021-07-14 |
Family
ID=58100520
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018108115A RU2693663C1 (ru) | 2015-08-25 | 2016-08-25 | Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма |
RU2019108587A RU2751495C1 (ru) | 2015-08-25 | 2016-08-25 | Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018108115A RU2693663C1 (ru) | 2015-08-25 | 2016-08-25 | Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10351859B2 (ru) |
EP (1) | EP3342871B1 (ru) |
JP (1) | JP6578056B2 (ru) |
KR (1) | KR101796830B1 (ru) |
CN (1) | CN108138192A (ru) |
BR (1) | BR112018003636A2 (ru) |
CA (1) | CA2996446C (ru) |
ES (1) | ES2805320T3 (ru) |
HK (1) | HK1249764A1 (ru) |
HU (1) | HUE049715T2 (ru) |
MY (1) | MY188870A (ru) |
PH (1) | PH12018500426A1 (ru) |
RU (2) | RU2693663C1 (ru) |
WO (1) | WO2017034343A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101796830B1 (ko) * | 2015-08-25 | 2017-11-13 | 씨제이제일제당 (주) | L-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 l-류신의 제조방법 |
KR101766964B1 (ko) * | 2015-08-27 | 2017-08-09 | 씨제이제일제당 (주) | L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 |
CN114085800A (zh) * | 2016-12-28 | 2022-02-25 | Cj第一制糖株式会社 | 新型异丙基苹果酸合酶变异体及使用其生产l-亮氨酸的方法 |
KR101996129B1 (ko) | 2017-07-11 | 2019-07-04 | 씨제이제일제당 (주) | 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법 |
KR102153534B1 (ko) | 2019-09-02 | 2020-09-09 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법 |
KR102143964B1 (ko) | 2019-12-06 | 2020-08-12 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 류신 생산방법 |
KR102207867B1 (ko) | 2020-01-21 | 2021-01-26 | 씨제이제일제당 주식회사 | Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법 |
KR102360900B1 (ko) * | 2020-05-20 | 2022-02-09 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 |
KR102263091B1 (ko) | 2020-05-21 | 2021-06-09 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-분지쇄 아미노산 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 l-분지쇄 아미노산 생산방법 |
AU2021296672A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-02-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Method for preparing amino acid granules from fermented liquid |
MX2023006460A (es) | 2020-12-11 | 2023-06-15 | Cj Cheiljedang Corp | Proteasa dependiente de atp mutante y procedimiento para la produccion de l-aminoacidos mediante el uso de la misma. |
TW202333581A (zh) | 2021-12-24 | 2023-09-01 | 南韓商Cj第一製糖股份有限公司 | 由發酵液製備含胺基酸製品之方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0271838A2 (en) * | 1986-12-13 | 1988-06-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel microorganisms capable of assimilating lactose |
RU2059726C1 (ru) * | 1993-03-17 | 1996-05-10 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм бактерий corynebacterium sp. - продуцент l-лейцина |
US5763231A (en) * | 1995-03-30 | 1998-06-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing L-leucine |
US20070231259A1 (en) * | 1999-06-25 | 2007-10-04 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3865690A (en) * | 1969-11-06 | 1975-02-11 | Ajinomoto Kk | Fermentative production of L-leucine |
JPS4824275B1 (ru) * | 1969-11-06 | 1973-07-19 | ||
KR100438146B1 (ko) * | 1996-11-28 | 2004-11-03 | 씨제이 주식회사 | L-루이신생산미생물인코리네박테리움글루타미컴ch25 |
KR19980039740U (ko) * | 1996-12-20 | 1998-09-15 | 박병재 | 수동 변속기의 인풋 베어링 리테이너 |
KR100200516B1 (ko) * | 1997-05-09 | 1999-06-15 | 손 경 식 | 신규한l-루이신생산미생물인코리네박테리움글루타미컴(corynebacteriumglutamicum)ch35 |
KR100220018B1 (ko) * | 1997-06-25 | 1999-10-01 | 손 경 식 | L-루이신을 생산하는 신규한 미생물 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CH45 |
CN1314798C (zh) * | 2005-06-06 | 2007-05-09 | 无锡晶海氨基酸有限公司 | 一种l-亮氨酸高产菌及用其发酵法生产l-亮氨酸 |
CN1834228A (zh) * | 2006-03-30 | 2006-09-20 | 天津科技大学 | 黄色短杆菌突变株及其在发酵法生产l-异亮氨酸中的应用 |
CN103031265B (zh) * | 2013-01-11 | 2014-04-16 | 新泰市佳禾生物科技有限公司 | 谷氨酸棒杆菌突变株及其在发酵法生产l-亮氨酸中的应用 |
KR101796830B1 (ko) * | 2015-08-25 | 2017-11-13 | 씨제이제일제당 (주) | L-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 l-류신의 제조방법 |
-
2015
- 2015-08-25 KR KR1020150119785A patent/KR101796830B1/ko active IP Right Grant
-
2016
- 2016-08-25 JP JP2018510395A patent/JP6578056B2/ja active Active
- 2016-08-25 EP EP16839631.5A patent/EP3342871B1/en active Active
- 2016-08-25 MY MYPI2018700683A patent/MY188870A/en unknown
- 2016-08-25 RU RU2018108115A patent/RU2693663C1/ru active
- 2016-08-25 ES ES16839631T patent/ES2805320T3/es active Active
- 2016-08-25 HU HUE16839631A patent/HUE049715T2/hu unknown
- 2016-08-25 WO PCT/KR2016/009438 patent/WO2017034343A1/ko active Application Filing
- 2016-08-25 BR BR112018003636-6A patent/BR112018003636A2/pt unknown
- 2016-08-25 RU RU2019108587A patent/RU2751495C1/ru active
- 2016-08-25 CN CN201680055932.3A patent/CN108138192A/zh active Pending
- 2016-08-25 CA CA2996446A patent/CA2996446C/en active Active
- 2016-08-25 US US15/754,903 patent/US10351859B2/en active Active
-
2018
- 2018-02-26 PH PH12018500426A patent/PH12018500426A1/en unknown
- 2018-07-17 HK HK18109214.1A patent/HK1249764A1/zh unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0271838A2 (en) * | 1986-12-13 | 1988-06-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel microorganisms capable of assimilating lactose |
RU2059726C1 (ru) * | 1993-03-17 | 1996-05-10 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм бактерий corynebacterium sp. - продуцент l-лейцина |
US5763231A (en) * | 1995-03-30 | 1998-06-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing L-leucine |
US20070231259A1 (en) * | 1999-06-25 | 2007-10-04 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1249764A1 (zh) | 2018-11-09 |
JP6578056B2 (ja) | 2019-09-18 |
EP3342871A1 (en) | 2018-07-04 |
RU2693663C1 (ru) | 2019-07-03 |
US20180251772A1 (en) | 2018-09-06 |
EP3342871A4 (en) | 2019-04-10 |
JP2018525012A (ja) | 2018-09-06 |
PH12018500426A1 (en) | 2018-08-29 |
BR112018003636A2 (pt) | 2018-09-25 |
EP3342871B1 (en) | 2020-04-22 |
WO2017034343A1 (ko) | 2017-03-02 |
KR101796830B1 (ko) | 2017-11-13 |
ES2805320T3 (es) | 2021-02-11 |
CA2996446C (en) | 2019-03-12 |
US10351859B2 (en) | 2019-07-16 |
HUE049715T2 (hu) | 2020-10-28 |
CA2996446A1 (en) | 2017-03-02 |
CN108138192A (zh) | 2018-06-08 |
MY188870A (en) | 2022-01-11 |
KR20170024653A (ko) | 2017-03-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2751495C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма | |
KR101117022B1 (ko) | L-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-발린 제조방법 | |
EP3009504B1 (en) | Microorganism producing l-isoleucine and method for preparing l-isoleucine using the same | |
KR101335789B1 (ko) | L-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 제조방법 | |
KR101851898B1 (ko) | L-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 l-류신의 제조방법 | |
TWI627278B (zh) | 生產l-組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌變異株與使用其生產l-組胺酸之方法 | |
RU2665830C1 (ru) | Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина | |
KR102141210B1 (ko) | L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-트립토판의 생산 방법 |