RU2665830C1 - Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина - Google Patents

Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина Download PDF

Info

Publication number
RU2665830C1
RU2665830C1 RU2017109400A RU2017109400A RU2665830C1 RU 2665830 C1 RU2665830 C1 RU 2665830C1 RU 2017109400 A RU2017109400 A RU 2017109400A RU 2017109400 A RU2017109400 A RU 2017109400A RU 2665830 C1 RU2665830 C1 RU 2665830C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
glutamine
corynebacterium glutamicum
producing
mutant
culture
Prior art date
Application number
RU2017109400A
Other languages
English (en)
Inventor
Джин Нам ЛИ
Сын Хи БЭК
Джин Сок СУН
Тэ Хо СОН
Ха Дон ВУ
Кён Чан ЛИ
Джае Ву ДЖАНГ
Original Assignee
Сиджей Чейлджеданг Корп.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сиджей Чейлджеданг Корп. filed Critical Сиджей Чейлджеданг Корп.
Application granted granted Critical
Publication of RU2665830C1 publication Critical patent/RU2665830C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Предложена группа изобретений: мутантные штаммы Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р, Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р, продуцирующие L-глутамин и способ получения L-глутамина. Способ получения L-глутамина предусматривает культивирование мутантного штамма Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р или Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р на питательной среде с последующим выделением L-глутамина из мутантного штамма или среды. Группа изобретений позволяет повысить выход L-глутамина. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему L-глутамин, и к способу получения L-глутамина с использованием этого микроорганизма.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
L-глутамин как аминокислоту, которую широко применяют в лекарственных средствах, косметических средствах и продуктах здорового питания, получали главным образом с использованием микроорганизмов, устойчивых к соединениям или чувствительных к соединениям. Для этих целей применяли, например, штамм, устойчивый к сульфагуанидину (JP 1978-017675), микроорганизм, устойчивый к азасерину (JP 1980-148094), микроорганизм, чувствительный к пенициллину (JP 1992-088994), и штамм, устойчивый к тирозину/глутаминовой кислоте (tyr-glu) (JP 1990-186994).
В этих обстоятельствах в исследовании по разработке штаммов с улучшенной продуктивностью по L-глутамину авторы настоящего изобретения обнаружили мутанты, обладающие устойчивостью к высоким концентрациям L-глутамина, и способ продуцирования L-глутамина с высоким выходом путем использования этих мутантов, тем самым создав настоящее изобретение.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
В настоящем изобретении предложен мутант Corynebacterium glutamicum с улучшенной продуктивностью по L-глутамину.
В настоящем изобретении предложен способ продуцирования L-глутамина путем использования этого мутанта Corynebacterium glutamicum.
Техническое решение
В одном аспекте настоящего изобретения предложен L-глутамин-продуцирующий мутант Corynebactehum glutamicum, который является устойчивым к L-глутамину.
Как его используют здесь, термин "L-глутамин" относится к моноамиду глутаминовой кислоты, который является аминокислотой, входящей в состав белков, и L-аминокислотой, имеющей формулу H2NCO-CH2CH2CH(NH2)COOH.
Как его используют здесь, выражение "устойчивый к L-глутамину" относится к микроорганизму, обладающему свойствами, которые заключаются в способности расти или способности поддерживать или повышать активность по продуцированию L-глутамина в окружающей среде, имеющей высокую концентрацию L-глутамина.
Когда L-глутамин накапливается в клетках в определенной концентрации или в более высокой концентрации, это может вызывать ингибирование путем регуляции по типу обратной связи, приводить к ингибированию или подавлению активности глутаминсинтетазы и, следовательно, ингибировать биосинтез L-глутамина. Регуляция по типу обратной связи L-глутамином размыкается, и ингибирование синтеза L-глутамина не происходит в штамме, устойчивом к L-глутамину, таким образом штамм, устойчивый к L-глутамину, может продуцировать L-глутамин в условиях высоких концентраций L-глутамина.
Мутант может представлять собой Corynebacterium glutamicum КССМ 11553Р или Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р.
Мутант может обладать устойчивостью к высоким концентрациям L-глутамина. Например, мутант может обладать устойчивостью к L-глутамину в концентрации от примерно 5 г/л до примерно 30 г/л L-глутамина и, в некоторых воплощениях, от примерно 15 г/л до примерно 30 г/л L-глутамина, и в некоторых других воплощениях от примерно 20 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина.
Этот мутант может выживать в минимальной среде, содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина в течение примерно 6 суток или дольше. Например, мутант может выживать в течение примерно 6 суток или дольше в минимальной среде (рН 7,0), содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, 0,1% глюкозы, 0,04% сульфата магния (MgSO4⋅7H2O), 0,1% дигидрофосфата калия (KH2PO4), 0,0001% тиамин⋅HCl, 200 мкг/л биотина и агар, при инкубации при примерно 30°С.
Как его используют здесь, термин "L-глутамин-продуцирующий микроорганизм" может относиться к микроорганизму, обладающему способностью по своей природе продуцировать L-глутамин, или к микроорганизму с приобретенной продуктивностью по глутамину несмотря на то, что его родительский штамм не обладает способностью продуцировать L-глутамин.
В некоторых воплощениях мутант Corynebacterium glutamicum с улучшенной способностью продуцировать L-глутамин может представлять собой мутант, полученный путем мутагенеза родительского штамма. Мутацию у микроорганизмов можно получить любым из разнообразных способов, широко известных в данной области техники, например, физическим мутагенезом или химическим мутагенезом. Например, в настоящем изобретении подходящие химические факторы, индуцирующие мутации, могут включать N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), диэпоксибутан, этилметансульфонат, соединения иприта, гидразин и нитрит. Однако воплощения не ограничиваются этим. Неограничивающие примеры физических факторов, индуцирующих мутации, могут включать ультрафиолетовые лучи и гамма-радиоактивные лучи.
В некоторых воплощениях для создания мутанта с улучшенной способностью продуцировать L-глутамин может быть использован традиционный глутамин-продуцирующий штамм Corynebacterium glutamicum KFCC 10680 (раскрыт в KR 10-0048440) в качестве родительского штамма. После введения случайной мутации в родительский штамм Corynebacterium glutamicum KFCC 10680 с помощью NTG, полученный в результате штамм культивировали в среде, содержащей L-глутамин, и различные штаммы сравнивали друг с другом по их способности продуцировать L-глутамин для отбора двух мутантов, обладающих устойчивостью к L-глутамину. Эти два мутанта получили названия Gln096 (КССМ 11553Р) и Gln265 (КССМ 11554Р), соответственно. Было обнаружено, что эти мутанты Corynebacterium glutamicum Gln096 и Gln265 обладают улучшенной способностью продуцировать L-глутамин с выходом более высоким примерно на 10% или больше, чем таковой у родительского штамма.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ продуцирования L-глутамина, включающий культивирование мутанта Corynebacterium glutamicum в среде в соответствии с любым из вышеописанных воплощений.
Мутант Corynebacterium glutamicum может быть тем же, как описано выше, и не будет описан здесь.
Культивирование может быть выполнено с использованием подходящей культуральной среды в подходящих условиях культивирования, которые хорошо известны в данной области техники. Культуральная среда и условия культивирования могут варьироваться специалистом в данной области техники. Например, культуральная среда может представлять собой жидкую среду. Однако воплощения не ограничены этим. Примеры способов культивирования могут включать периодическую культуру, непрерывную культуру, периодическую культуру с подпиткой или их комбинацию. Однако воплощения не ограничены ими.
Культуральная среда необходима для создания подходящих условий для конкретного выбранного штамма и также может быть соответствующим образом изменена специалистом в данной области техники. Например, культуральная среда может быть выбрана из различных культуральных сред для штаммов Corynebacterium, раскрытых, например, в "Manual of Methods for General Bacteriology" (Американское Бактериологическое Общество, Washington D.C., USA, 1981). Однако воплощения не ограничены этим. Культуральная среда может включать различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Неограничивающие примеры источников углерода, доступные для использования в культуральной среде, могут включать сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как гликоль и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота, причем эти источники углерода могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Неограничивающие примеры источников азота, доступных для использования в культуральной среде, представляют собой органические соединения, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, экстракт из мяса, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт (CSL), соевую муку и мочевину; и неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, причем эти источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Неограничивающие примеры источников фосфора, доступных для использования в культуральной среде, могут включать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия и соответствующие натрий-содержащие соли. В некоторых воплощениях, культуральная среда может включать соли металлов, необходимые для роста, такие как сульфат магния или сульфат железа. Однако воплощения не ограничены этим. В некоторых воплощениях культуральная среда может дополнительно содержать аминокислоты и витамины, которые необходимы для роста, в дополнение к перечисленным выше компонентам. В некоторых воплощениях культуральная среда также может включать подходящие предшественники. Культуральная среда или отдельные компоненты могут быть добавлены в культуральный раствор подходящим способом, например периодически или непрерывно. Однако воплощения не ограничены этим.
В некоторых воплощениях во время культивирования значение рН культурального раствора может быть подведено путем добавления соединения, например гидроксида аммония, гидроксида калия, аммиака, фосфорной кислоты или серной кислоты, в культуральный раствор для выбранного микроорганизма подходящим способом. В некоторых воплощениях во время культивирования образование пены в культуральном растворе можно подавить с помощью пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. Для поддержания аэробных условий в культуральном растворе в культуральный раствор может быть введен кислород или газ, содержащий кислород (например воздух). Например, температуру культурального раствора можно поддерживать в диапазоне от примерно 20°С до примерно 45°С, и в некоторых воплощениях температура может составлять от примерно 25°С до примерно 40°С. Например, культивирование можно осуществлять до тех пор, пока не будет получено целевое количество L-глутамина, например, при продолжительности культивирования от примерно 10 часов до 160 часов.
Культивирование может быть осуществлено в культуральной среде, содержащей L-глутамин в высокой концентрации, например, от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, и в некоторых воплощениях, от примерно 20 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина.
Способ получения L-глутамина может включать выделение L-глутамина из культивируемого микроорганизма или из культуральной среды. Выделение L-глутамина из микроорганизма или из среды можно проводить с использованием подходящего способа, известного в данной области техники, в соответствии с используемым способом культивирования, тем самым собирая или выделяя продуцированный L-глутамин из среды. Неограничивающие примеры способа выделения продуцированного L-глутамина могут включать центрифугирование, фильтрование, анионообменную хроматографию, кристаллизацию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как описано выше, согласно одному или более чем одному воплощению мутант Corynebacterium glutamicum может продуцировать L-глутамин даже в среде, содержащей L-глутамин в высокой концентрации. Следовательно, L-глутамин может быть получен с высоким выходом с высокой эффективностью в промышленном масштабе.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одно или более чем одно воплощение настоящего изобретения далее будет описано подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако эти примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем одного или более чем одного воплощения настоящего изобретения.
Пример 1: Скрининг мутантов, продуцирующих L-глутамин
Для получения мутантов микроорганизма с улучшенной способностью продуцировать глутамин мутацию индуцировали в микроорганизме следующим образом.
В частности, Corynebacterium glutamicum KFCC 10680 (Corynebacterium glutamicum KFCC 10680, см. KR10-0048440) в качестве родительского штамма культивировали в активирующей среде в течение примерно 16 часов (активирующая среда содержала 1% экстракта из говядины, 1% полипептона, 0,5% хлорида натрия (NaCl), 0,5% дрожжевого экстракта и 2% агара и имела рН 7,2, причем каждая активирующая среда, используемая в примерах, имела такой же состав, как используемая в этом примере, и процентная единица (%) представляет собой масс./об. %, что применимо ко всем примерам). Полученный в результате активированный штамм культивировали в течение примерно 14 часов в посевной культуре, предварительно стерилизованной при примерно 121°С в течение 15 минут, где посевная культура (рН 7,0) содержала 5,0% глюкозы, 1% бактопептона, 0,25% хлорида натрия (NaCl), 1% дрожжевого экстракта, 3 мкг/л биотина и 0,4% мочевины, причем каждая "посевная культура", используемая в этих примерах, имела такой же состав, как используемая в этом примере. 5 мл культурального раствора добавляли в культуру в пробирке и центрифугировали при примерно 8000 об/мин в течение примерно 5 минут и супернатант удаляли. Затем добавляли 100-мМ цитратный буфер в культуру в пробирке для ресуспендирования клеточного осадка и затем культуру в пробирке центрифугировали в тех же условиях, как описано выше, и супернатант удаляли из нее, с тем чтобы таким образом отмыть клетки. 5 мл 100-мМ цитратного буфера добавляли в культуру в пробирке для ресуспендирования клеточного осадка и затем туда добавляли N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) до конечной концентрации примерно 200 мг/л и оставляли при комнатной температуре примерно на 20 минут.Затем клетки, обработанные NTG, центрифугировали при примерно 8000 об/мин в течение примерно 5 минут, супернатант удаляли, добавляли 100-мМ фосфатный буфер для ресуспендирования клеточного осадка, затем проводили центрифугирование в тех же условиях, как описано выше, и супернатант удаляли, с тем чтобы таким образом отмыть клетки. Затем 5 мл посевной культуры добавляли к полученному осадку клеток, обработанных NTG, для их ресуспендирования. Эту суспензию наносили на чашку Петри, содержащую минимальную среду (рН 7,0), содержащую 0,1% глюкозы, 0,04% сульфата магния (MgSO4⋅7H2O), 0,1% дигидрофосфата калия (KH2PO4), 0,0001% тиамин-HCI, 200 мкг/л биотина и 1,5% агара, причем каждая "минимальная среда", используемая в примерах, имела такой же состав, как используемая в этом примере, и культивировали при примерно 30°С в течение примерно 6 суток. Затем определяли значение оптической плотности ОП600 жизнеспособных клеток. В результате подсчета числа клеток было обнаружено, что показатель клеточной гибели составил примерно 85%.
Промытый штамм, обработанный NTG, наносили на чашку Петри, содержащую минимальную среду, содержащую L-глутамин (конечная концентрация 15 г/л), и культивировали при примерно 30°С в течение примерно 6 суток. Колонии жизнеспособных клеток отбирали для скрининга мутантов, устойчивых к L-глутамину. Отобранные мутанты, устойчивые к L-глутамину, инокулировали с помощью инокуляционной петли в 25 мл среды для продуцирования глутамина (рН 6,8) (содержащей 4,0% глюкозы, 3,0% хлорида аммония (NH4Cl), 0,3% кислотного гидролизата соевого белка, 5% карбоната кальция (СаСО3), 0,1% хлорида кальция (CaCl2), 0,05% сульфата магния (MgSO4⋅7H2O), 0,15% дигидрофосфата калия (KH2PO4), 0,15% гидроортофосфата калия (K2HPO4), 0,3% мочевины, 2 мг/л тиамина (тиамин⋅HCl), 5 мкг/л биотина, 20 мг/л сульфата железа (FeSO4⋅7H2O), 20 мг/л сульфата марганца (MnSO4⋅H2O) и 12 мг/л сульфата цинка (ZnSO4⋅7H2O), причем каждая "среда для продуцирования глутамина", используемая в этих примерах, имела указанный один и тот же состав) в колбе Эрленмейера для встряхивания и затем культивировали при примерно 30°С в течение примерно 48 часов при встряхивании примерно при 200 об/мин. В качестве контрольной группы родительский штамм культивировали в таких же условиях. Два типа мутантов, устойчивых к L-глутамину, которые продуцировали глутамин с выходом на 10% или больше по сравнению с таковым родительского штамма Corynebacterium glutamicum KFCC-10680, были выбраны исходя из культивированного продукта.
Выбранные мутанты получили названия Corynebacterium glutamicum Gln096 и Corynebacterium glutamicum Gln265, соответственно, и были депонированы в Корейском Центре Культур Микроорганизмов (КССМ) 3 июля 2014 года с номерами доступа КССМ11553Р и КССМ11554Р.
Пример 2: Сравнение устойчивости к L-глутамину среди мутантов, продуцирующих L-глутамин
Для сравнения устойчивости к L-глутамину среди мутантов, выбранных в Примере 1, каждый из родительского штамма (KFCC 10680), Corynebacterium glutamicum Gln096 (KCCM11553P) и Corynebacterium glutamicum Gln265 (KCCM11554P) наносили на чашки Петри, содержащие минимальную среду, содержащую соответственно 2,5 г/л, 10 г/л, 15 г/л, 20 г/л и 25 г/л L-глутамина (на основании конечной концентрации) и инкубировали при примерно 30°С в течение примерно 6 суток.
В результате, как показано в Таблице 1, родительский штамм демонстрировал слабый рост при концентрации L-глутамина 15 г/л и отсутствие роста при концентрации L-глутамина 20 г/л или больше, в то время как мутанты Corynebacterium glutamicum Gln096 (КССМ11553Р) и Corynebacterium glutamicum Gln265 (KCCM11554P) все еще демонстрировали быстрый рост при концентрации L-глутамина 15 г/л и росли даже при концентрации L-глутамина 20 г/л или выше, указывая на устойчивость этих мутантов к высоким концентрациям L-глутамина.
Figure 00000001
+ был рост/ - не было роста; после инкубирования при примерно 30°С в течение 6 суток
Пример 3: Оценка продуктивности по L-глутамину мутантов, продуцирующих L-глутамин
Для оценки продуктивности по L-глутамину мутантов Corynebacterium glutamicum Gln265 (КССМ11554Р) и Corynebacterium glutamicum Gln096 (KCCM11553P), полученных в Примере 1, этих мутантов культивировали следующим образом для продуцирования L-глутамина.
20 мл ферментационной среды (рН 6,8) (содержащей 10% глюкозы, 4,5% хлорида аммония (NH4Cl), 0,5% кислотного гидролизата соевого белка, 5% карбоната кальция (СаСО3), 0,1% хлорида кальция (CaCl2), 0,05% сульфата магния (MgSO4⋅7H2O), 0,15% дигидрофосфата калия (KH2PO4), 0,15% гидроортофосфата калия (K2HPO4), 0,3% мочевины, 2 мг/л тиамина (тиамин⋅HCl), 5 мкг/л биотина, 20 мг/л сульфата железа (FeSO4⋅7H2O), 20 мг/л сульфата марганца (MnSO4⋅H2O) и 12 мг/л сульфата цинка (ZnSO4⋅7H2O), причем каждая "ферментационная среда", используемая в примерах, имела такой же состав) добавляли в колбу Эрленмейера на 250 мл для встряхивания и стерилизовали при примерно 121°С в течение 15 минут. Родительский штамм Corynebacterium glutamicum KFCC10680 и мутанты Corynebacterium glutamicum Gln265 (KCCM11554P) и Corynebacterium glutamicum Gln096 (KCCM11553P) культивировали в активирующей среде при примерно 30°С в течение примерно 16 часов, соответственно. Каждый из полученных в результате активированных штаммов (KFCC10680, Gln096 и Gln265) инокулировали в ферментационную среду при помощи инокуляционной петли и культивировали при примерно 30°С в течение примерно 48 часов при встряхивании примерно при 200 об/мин. После завершения культивирования концентрацию L-глутамина, присутствующего в супернатанте каждой из сред, из которых клетки были удалены, измеряли с использованием YSI 7100 Мультипараметрической Биоаналитической Системы (доступной от YSI Inc.). Результаты представлены в Таблице 2.
Figure 00000002
Если обратиться к Таблице 2 видно, что родительский штамм Corynebacterium glutamicum KFCC10680 продуцировал примерно 12,6 г/л L-глутамина, в то время как мутант Corynebacterium glutamicum Gln096 продуцировал примерно 13,8 г/л L-глутамина, согласно одному воплощению, с продуктивностью по L-глутамину, увеличенной примерно на 9,5% или больше по сравнению с таковой родительского штамма. Мутант Corynebacterium glutamicum Gln265 продуцировал примерно 14,1 г/л L-глутамина согласно одному воплощению с продуктивностью по L-глутамину, увеличенной примерно на 11% или больше по сравнению с таковой родительского штамма.
Орган депонирования: Корейский Центр Культур Микроорганизмов (КССМ) (Международный Орган по Депонированию)
Номер доступа: КССМ11553Р
Дата депонирования: 20140703
Орган депонирования: Корейский Центр Культур Микроорганизмов (КССМ) (Международный Орган по Депонированию)
Номер доступа: КССМ11554Р
Дата депонирования: 20140703
Следует понимать, что описанные здесь воплощения следует рассматривать исключительно в описательном смысле, а не с целью ограничения. Описания признаков или аспектов в рамках каждого воплощения обычно следует рассматривать как доступные для других подобных признаков или аспектов в других воплощениях.
В то время как одно или более чем одно воплощение было описано со ссылкой на графические материалы, специалист в данной области техники поймет, что в них можно делать различные изменения в форме и деталях, не отклоняясь от идеи и не выходя за пределы объема, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Claims (5)

1. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р, продуцирующий L-глутамин и обладающий устойчивостью к L-глутамину.
2. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11553Р по п. 1, обладающий способностью выживать в культуральной среде, содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, в течение примерно 6 суток или дольше.
3. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р, продуцирующий L-глутамин и обладающий устойчивостью к L-глутамину.
4. Мутант Corynebacterium glutamicum КССМ11554Р по п. 3, обладающий способностью выживать в культуральной среде, содержащей от примерно 15 г/л до примерно 25 г/л L-глутамина, в течение примерно 6 суток или дольше.
5. Способ продуцирования L-глутамина, включающий культивирование мутанта Corynebacterium glutamicum по любому из пп. 1-4 в среде и выделение L-глутамина из указанного мутанта или указанной среды.
RU2017109400A 2014-10-08 2015-09-22 Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина RU2665830C1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2014-0135959 2014-10-08
KR1020140135959A KR101694850B1 (ko) 2014-10-08 2014-10-08 L-글루타민을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산방법
PCT/KR2015/009909 WO2016056773A2 (ko) 2014-10-08 2015-09-22 L-글루타민을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2665830C1 true RU2665830C1 (ru) 2018-09-04

Family

ID=55653921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017109400A RU2665830C1 (ru) 2014-10-08 2015-09-22 Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина

Country Status (12)

Country Link
US (1) US10023888B2 (ru)
EP (1) EP3205714B1 (ru)
JP (1) JP6483253B2 (ru)
KR (1) KR101694850B1 (ru)
CN (1) CN107208038A (ru)
AU (1) AU2015328946B2 (ru)
CA (1) CA2963926C (ru)
ES (1) ES2817933T3 (ru)
HU (1) HUE051762T2 (ru)
MY (1) MY182673A (ru)
RU (1) RU2665830C1 (ru)
WO (1) WO2016056773A2 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2021384593A1 (en) * 2020-11-20 2023-06-08 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism having enhanced l-glutamine producing ability, and l-glutamine producing method using same
CN117512029B (zh) * 2024-01-03 2024-03-29 地奥集团成都药业股份有限公司 一种提升谷氨酰胺产量的培养基、方法及代谢组学分析方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2230114C2 (ru) * 2001-11-30 2004-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот
CN1710066A (zh) * 2005-06-07 2005-12-21 山东大学 一株可高产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌
US20100184163A1 (en) * 2005-12-27 2010-07-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for production of l-glutamine

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5317675B2 (ru) 1972-12-16 1978-06-09
JPS5317675A (en) 1976-08-03 1978-02-17 Tsunetarou Matsuyama Method of processing disposed polyvinyl chloride
JPS55148094A (en) 1979-05-07 1980-11-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-glutamine by fermentation
KR830001259B1 (ko) * 1981-08-12 1983-06-30 서울미원 주식회사 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법
JP2817157B2 (ja) 1989-01-13 1998-10-27 味の素株式会社 発酵法によるｌ‐アミノ酸の製造法
JPH0488994A (ja) 1990-07-30 1992-03-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
KR20070087094A (ko) 1999-06-25 2007-08-27 바스프 악티엔게젤샤프트 스트레스 저항성 및 내성 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
SK18912001A3 (sk) * 1999-06-25 2002-10-08 Basf Aktiengesellschaft Gény corynebacterium glutamicum kódujúce proteíny zapojené do membránovej syntézy a membránového transportu
CN1181190C (zh) * 2000-11-17 2004-12-22 第一制糖株式会社 产生l-谷氨酰胺的微生物和使用该微生物产生l-谷氨酰胺的方法
KR20050018797A (ko) 2001-08-06 2005-02-28 데구사 아게 유전자 변형된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 의한ｌ-리신의 생산
US8187843B2 (en) 2006-09-01 2012-05-29 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for production of L-glutamine
WO2011083859A1 (ja) 2010-01-08 2011-07-14 協和発酵バイオ株式会社 Ｌ－グルタミンまたはｌ－グルタミン酸の製造法
KR101048440B1 (ko) 2010-04-29 2011-07-11 금호전기주식회사 Ｌｅｄ모듈 가변 장착형 방열판 및 이를 이용한 조명 장치
KR101001544B1 (ko) 2010-10-26 2010-12-17 최점미 전기 기구용 전기장 및 자기장의 발생을 방지하는 발열선
US9200300B2 (en) 2012-01-10 2015-12-01 Cj Cheiljedang Corporation Microorganisms of Corynebacterium which can utilize xylose and method for producing L-lysine using same
KR101481782B1 (ko) * 2012-12-28 2015-01-13 대상 주식회사 Gogat의 불활성화에 의한 아미노산 고생산능 변이 균주

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2230114C2 (ru) * 2001-11-30 2004-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот
CN1710066A (zh) * 2005-06-07 2005-12-21 山东大学 一株可高产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌
US20100184163A1 (en) * 2005-12-27 2010-07-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for production of l-glutamine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIRASAWA TAKASHI et.al., L-glutamate production by lysozyme-sensitive Corynebacterium glutamicum itsA mutant strains, BMC Biotechnology, 2001, N6, p. 1-9. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015328946A1 (en) 2017-05-25
HUE051762T2 (hu) 2021-03-29
EP3205714A4 (en) 2018-03-07
WO2016056773A2 (ko) 2016-04-14
EP3205714A2 (en) 2017-08-16
CA2963926C (en) 2018-07-24
CA2963926A1 (en) 2016-04-14
JP2017529858A (ja) 2017-10-12
US10023888B2 (en) 2018-07-17
KR20160041624A (ko) 2016-04-18
KR101694850B1 (ko) 2017-01-10
JP6483253B2 (ja) 2019-03-13
US20170292135A1 (en) 2017-10-12
AU2015328946B2 (en) 2018-10-18
WO2016056773A3 (ko) 2017-04-27
EP3205714B1 (en) 2020-08-05
MY182673A (en) 2021-01-29
ES2817933T3 (es) 2021-04-08
CN107208038A (zh) 2017-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2751495C1 (ru) Микроорганизм, продуцирующий L-лейцин, и способ получения L-лейцина с использованием этого микроорганизма
KR101117022B1 (ko) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
CN105378059B (zh) 产l-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产l-异亮氨酸的方法
KR101335789B1 (ko) Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법
RU2665830C1 (ru) Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина
JPH08322583A (ja) 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
KR101851898B1 (ko) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
TWI627278B (zh) 生產l-組胺酸之麩胺酸棒狀桿菌變異株與使用其生產l-組胺酸之方法
KR20200077343A (ko) L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-트립토판의 생산 방법
HU215248B (hu) Eljárás L-lizin előállítására
JPS61274691A (ja) Ｌ−グルタミン酸の製造法
JPH0346114B2 (ru)
JPS6374487A (ja) 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法