CN105378059B - 产l-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产l-异亮氨酸的方法 - Google Patents

产l-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产l-异亮氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有生产L‑异亮氨酸的增强能力的微生物和使用该微生物生产L‑异亮氨酸的方法。更具体地，本发明涉及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变菌株，其耐受L‑异亮氨酸和L‑苏氨酸衍生物并具有生产L‑异亮氨酸的增强的能力，并且涉及使用突变菌株生产L‑异亮氨酸的方法。

Description

产L-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产L-异亮氨酸的方法
技术领域
本发明涉及具有生产L-异亮氨酸的增强能力的微生物，并且涉及使用该微生物生产L-异亮氨酸的方法。
背景技术
L-氨基酸是蛋白质的基本单元，并且被广泛地用作动物的功能性食品添加剂和营养源，并且被广泛地用于制药工业。在20种氨基酸中，支链氨基酸由3个结构单元(member)——L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸——组成，并且其工业价值正逐步增加。据报道，支链氨基酸在维持和形成人骨骼肌、和行使调节胰岛素的功能、以及维持和增加肌肉质量方面起到重要作用(Andrea tom等，(2006)The journal of nutrition,136,324s-330s)。特别地，L-异亮氨酸在肌肉中代谢以产生能量，并且参与血红蛋白生产，并且减轻疲劳和促进生长。因而，它用于多种应用，其包括可注射流体和营养物，并且它在运动营养食品中的应用也正与日俱增。
为了工业化生产L-异亮氨酸，谷氨酸棒状杆菌被用作代表性微生物。此微生物从作为前体的丙酮酸和2-丁酮酸经由三种中间代谢物生产L-异亮氨酸(见图1)。从两种前体合成2-乙酰基-2-羟基丁酸，并且由此合成2,3-二羟基-3-甲基戊酸酯和2-酮基-3-甲基戊酸酯，并且最终产生L-异亮氨酸。使用酶——乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶(isomeroreductase)、二羟酸脱水酶和转氨酶——来生产每一个代谢物(Jin Hwan Park等，Appl microbial biotechnol,(2010)85:491-506)。
在谷氨酸棒状杆菌菌株中，在L-异亮氨酸生物合成步骤中重要的乙酰羟酸合酶是由ilvBN基因编码的，并且经受最终产物L-异亮氨酸的反馈抑制，使得基因的表达和酶的活性被抑制。另外，产生2-丁酮酸的苏氨酸脱氢酶也经受L-异亮氨酸的反馈抑制。因而，已知的是，参与L-异亮氨酸生物合成的基因表达和酶活性的调控对生成以高产量生产L-异亮氨酸的菌株是关键的(Jin hwan park等，Biotechnology journal,(2010)560-577)。另外，如图1中可见，通过相同的生物合成途径生产L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸。因而，为了大量生产L-异亮氨酸，应该充分地供应用作2-丁酮酸前体的L-苏氨酸，使得可以减少其它支链氨基酸的产生，并且可以持续地产生L-异亮氨酸。在解决此问题的尝试中，据报道，α-氨基-β-羟基正缬氨酸和L-苏氨酸衍生物可以用于增加L-苏氨酸的生产(Cayo Ramos等，Applied and environmental microbiology,(1992)1677-1682)。进一步，报道了将L-异亮氨酸生产能力赋予至具有生产L-苏氨酸的能力的微生物的方法(韩国专利特开公布号2011-0058731)，同时至生产L-苏氨酸和L-异亮氨酸的微生物的方法(韩国专利特开公布号2002-0013777)等等。同样，据报道，4-硫杂异亮氨酸(thiaisoleucine)——一种异亮氨酸衍生物的使用抑制了苏氨酸脱水酶的反馈(John J.Wasmuth,Journal of bacteriology,(1973)562-570)。而且，据报道，对异亮氨酸-异羟肟酸耐受的突变菌株具有生产L-异亮氨酸的增强的能力(M.Kisumi,Journal of general microbiology,(1971)69291-297)。另外，有AHAS的研究与开发方法的报道，所述方法包括使产L-异亮氨酸菌株突变以与L-缬氨酸的生产相比增加L-异亮氨酸的生产(韩国专利特开公布号2011-0061780)，并且有集中于通过改变发酵期间的氧供应或自然条件比如pH来增加L-异亮氨酸的产量的研究的报道(Zhihian Peng等，Bioprocess biosyst eng,(2010)33:339-345)。
然而，至今已经研究和开发的产L-异亮氨酸微生物对L-异亮氨酸生物合成途径中的一些物质单独地耐受。因而，仍存在开发对多种物质耐受的产L-异亮氨酸微生物的需要，所述物质参与L-异亮氨酸生物合成中的反馈的控制。
公开内容
技术问题
本发明人已经做了大量的努力来开发与现有菌株相比更好的产L-异亮氨酸微生物，并且已经发现对α-氨基-β-羟基正缬氨酸(L-苏氨酸衍生物)、4-硫杂异亮氨酸和异亮氨酸-异羟肟酸(异亮氨酸衍生物)耐受的突变菌株以高产量生产L-异亮氨酸，从而完成本发明。
技术方案
本发明的目的是提供以高产量生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株。
本发明的另一个目的是提供使用所述突变菌株生产L-异亮氨酸的方法。
本发明的仍另一个目的是提供从谷氨酸棒状杆菌产生用于L-异亮氨酸的高产量生产的突变菌株的方法。
有益效果
本发明的谷氨酸棒状杆菌突变菌株耐受L-异亮氨酸、L-苏氨酸和它们的衍生物，并且因而不经受L-异亮氨酸的反馈抑制，并且被充分地供应为L-异亮氨酸的前体的L-苏氨酸。因而，它具有生产L-异亮氨酸的增强的能力。因此，使用根据本发明的微生物生产L-异亮氨酸的方法可以高效率和高产量地生产L-异亮氨酸。
附图描述
图1显示了包括本发明的最终产物——L-异亮氨酸的支链氨基酸的生物合成途径。如图1中所示，支链氨基酸使用相同的酶通过所述生物合成途径生产。
最佳实施方式
在一方面，本发明提供了用于生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11248P。
如本文所使用，术语“L-异亮氨酸”指的是必需氨基酸中的一种和具有L-缬氨酸和L-亮氨酸的支链氨基酸中的一种，并且具有HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3的结构式。
如图1中所示，在微生物中，从作为前体的丙酮酸和2-丁酮酸通过4步生物合成过程生物合成L-异亮氨酸。然而，所述生物合成步骤通常也用于其它支链氨基酸(即L-缬氨酸和L-亮氨酸)的生物合成中，并且需要被充分地供应L-苏氨酸——L-异亮氨酸生物合成所需的前体。为此，通过发酵大量生产L-异亮氨酸是困难的。本发明的突变菌株耐受最终产物L-异亮氨酸、L-苏氨酸和它们的衍生物的反馈抑制，并且因而被充分地供应L-异亮氨酸的前体。本发明的突变菌株是具有生产L-异亮氨酸的增强能力的新型微生物。
具体地，本发明的突变菌株可以耐受L-异亮氨酸或其衍生物和L-苏氨酸或其衍生物。更具体地，它可以耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物。
如本文所使用，术语“衍生物”指的是可以在最终产物L-异亮氨酸或其前体L-苏氨酸的生物合成中引起反馈抑制的已知化合物，所述反馈抑制可以减少L-异亮氨酸或L-苏氨酸的产生。L-异亮氨酸衍生物的实例包括但不限于4-硫杂异亮氨酸(thiaile)和异亮氨酸-异羟肟酸(ileHx)，并且L-苏氨酸衍生物的实例包括但不限于α-氨基-β-羟基正缬氨酸(AHV)等等。具体地，突变菌株可以耐受选自4-硫杂异亮氨酸、异亮氨酸-异羟肟酸和α-氨基-β-羟基正缬氨酸中的一种或多种。更具体地，突变菌株可以耐受4-硫杂异亮氨酸、异亮氨酸-异羟肟酸和α-氨基-β-羟基正缬氨酸。
众所周知的是，当L-异亮氨酸累积超过特定的浓度或效价时，细胞中L-异亮氨酸的生物合成被抑制。相应地，耐受衍生物的菌株解除由L-异亮氨酸引起的反馈抑制，并且因而甚至在包含高浓度的L-异亮氨酸的条件下具有生产L-异亮氨酸的能力。在本发明的实例中，本发明人使用衍生物筛选生产高浓度的L-异亮氨酸的菌株。因为L-苏氨酸被用作生产L-异亮氨酸的2-丁酮酸的前体，耐受L-苏氨酸的菌株解除由L-苏氨酸引起的反馈抑制，使得L-苏氨酸充分地供应至其中。
根据本发明，通过使亲本菌株突变和筛选期望菌株而获得具有生产L-异亮氨酸的增强能力的突变菌株。在本文中，微生物的诱变可通过本领域广泛已知的多种方法进行，和使用物理或化学诱变方法中的一种进行。本发明中的化学诱变剂的实例包括但不限于N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二乙氧基丁烷、乙基甲磺酸、芥子化合物(mustardcompound)、肼、和亚硝酸盐。物理诱变剂的实例包括但不限于紫外光和γ-辐射。
在诱变中，在适当浓度下诱变剂影响亲本菌株，在该适当浓度下具有特定大小的存活种群保留。所述大小可能不同，这取决于诱变剂的种类，并且所述大小取决于在存活种群中的突变量，其由特定杀伤率下的突变剂引起。例如，当使用NTG时，可保留大约10-50％的原始种群。当由亚硝酸盐进行诱变时，可保留大约0.01-0.1％的原始种群，并且当由紫外光进行诱变时，可保留大约1.0％的原始种群。在本发明的实例中，为了构建具有生产L-异亮氨酸的增强能力的突变菌株，NTG被用于诱导亲本菌株中的突变。
在本发明的实例中，为了构建具有生产L-异亮氨酸的增强能力的突变菌株，产谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC 11040(谷氨酸棒状杆菌KFCC 11040)(韩国专利特开公布2000-0002407)被用作亲本菌株。在亲本菌株中进行随机诱变后，亲本菌株涂布在补充L-异亮氨酸衍生物——比如4-硫杂异亮氨酸(thiaile)和异亮氨酸-异羟肟酸(ileHx)——和L-苏氨酸衍生物——比如α-氨基-β-羟基正缬氨酸(AHV)——的基本培养基上。筛选分别耐受1mM、1mg/ml和25mg/ml的浓度下的所有衍生物的突变菌株并命名为“KCJI-38”。另外，表明了突变菌株中L-异亮氨酸的产生至少比在亲本菌株中高13倍(见表1)。突变谷氨酸棒状杆菌菌株(谷氨酸棒状杆菌，KCJI-38)在2012年1月9日以登录号KCCM11248P保藏于国际保藏机构——韩国微生物保藏中心(地址：Yurim Building,361-221,Hongje 1-dong,Seosaemun-gu，首尔，韩国)。
在另一方面，本发明提供了用于生产L-异亮氨酸的方法，所述方法包括培养突变菌株。
具体地，用于生产L-异亮氨酸的方法可进一步包括从突变菌株的培养基回收L-异亮氨酸。
如本文所使用，术语“培养”意为允许微生物在人为控制的合适环境条件下生长。在本发明中，培养突变谷氨酸棒状杆菌菌株以生产L-异亮氨酸的方法可以使用本领域已知的任何谷氨酸棒状杆菌培养方法进行。培养方法的实例包括但不限于分批培养、连续培养和补料分批培养。例如，这些培养方法已经在“Biochemical Engineering”(James M.Lee,Prentice-Hall International Editions,(1991)pp138-176)中公开。
用于培养的方法应当满足特定菌株的需要。用于谷氨酸棒状杆菌的培养基是已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Society forBacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。
可以在本发明中使用的碳源可包括糖类和碳水化合物，比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂，比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，比如软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇，比如甘油和乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些物质可以单独使用或两种或更多种混合使用，但其不限于此。可以在本发明中使用的氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浆、脱脂豆饼、和尿素与无机化合物——比如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独使用或两种或更多种混合使用，但其不限于此。可以在本发明中使用的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠的盐。同样，培养基可进一步包含金属盐，比如硫酸镁或硫酸铁。除上述物质之外，培养基还可包含必需生长因子，比如氨基酸和维生素。此外，培养基可包含合适的前体。这些物质可以在培养期间以分批或连续方式添加至培养基。
碱性化合物——比如氢氧化钠、氢氧化钾或氨——或酸性化合物——比如磷酸或硫酸——可以以合适的方式添加至培养基以调节培养基的pH。此外，在培养期间，消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于抑制泡沫的形成。进一步，为了保持培养基处于有氧状态中，可以将氧气或含氧气体(例如，空气)注入培养基。培养基通常可以保持在20℃至45℃的温度范围。微生物的培养过程可以持续直到获得期望水平的L-异亮氨酸。为了本发明的目的，培养周期通常可以为10-100小时。L-异亮氨酸可以释放入培养基或包含在细胞中。本发明的生产L-异亮氨酸的方法包括从培养基或细胞回收L-异亮氨酸。从培养基或细胞回收L-异亮氨酸可以使用本领域已知的任何方法进行，例如，离心、过滤、阴离子交换层析、结晶或HPLC，但不限制于此。在本发明的实例中，低速离心培养基以移除生物质，并且通过高效液相色谱分离上清液。
在一方面，本发明提供了产生用于生产L-异亮氨酸的突变谷氨酸棒状杆菌菌株的方法，该方法包括从谷氨酸棒状杆菌筛选耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物的突变菌株。
亲本菌株谷氨酸棒状杆菌可以是野生型或突变菌株。
具体地，突变菌株可以通过诱变方法获得。
在本文中，L-异亮氨酸衍生物、L-苏氨酸衍生物和诱变方法如上所述。
本发明的产生突变菌株的方法可以通过筛选突变谷氨酸棒状杆菌菌株进行，所述突变谷氨酸棒状杆菌菌株耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物，并且具有以比常规菌株更高的产量生产L-异亮氨酸的能力。
在仍另一方面，本发明提供了突变谷氨酸棒状杆菌菌株KCCM11248P用于生产L-异亮氨酸的用途。
发明实施例
在下文中，本发明将参照实施例进一步详细地描述本发明。然而，应当理解的是，这些实施例用于说明性目的而不意欲限制本发明的范围。
实施例1：通过人工诱变筛选突变菌株
为了获得具有生产L-异亮氨酸的增强能力的突变菌株，以下列方式诱导微生物中的突变。
具体地，亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC11040(韩国专利特开公布号2000-0002407)在活化培养基(activating medium)中培养16小时，并且将活化的菌株接种于在121℃灭菌15分钟的种子培养基(seed medium)中。接种的菌株培养14小时，并且收集5ml的培养基。使用100mM柠檬酸缓冲液洗涤收集的培养基，然后向其添加NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)至200mg/l的终浓度。接着，将培养基放置20分钟，然后使用100mM磷酸盐缓冲液洗涤。将NTG处理的菌株平板接种在基础培养基上，并且结果其杀伤率测定为85％。为了获得耐受4-硫杂异亮氨酸(thiaile)、异亮氨酸-异羟肟酸(ileHx)和α-氨基-β-羟基正缬氨酸(AHV)的突变菌株，NTG-处理的菌株平板接种在补充thiaile、ileHx和AHV至其终浓度分别为1mM、1mg/ml和25mg/ml的基本培养基上。然后，将菌株在30℃下培养5天，从而获得耐受thiaile、ileHx和AHV的突变菌株。
获得的菌株命名为“谷氨酸棒状杆菌，KCJI-38”，并且在2012年1月9日以登录号KCCM11248P保藏于韩国微生物保藏中心。
实施例1和2中使用的培养基组分如下。
活化培养基
1％肉膏，1％聚胨，0.5％氯化钠，1％酵母提取物，2％琼脂，pH 7.2。
种子培养基
5％葡萄糖，1％细菌蛋白胨，0.25％氯化钠，1％酵母提取物，0.4％尿素，pH 7.2。
基本培养基
1.0％葡萄糖，0.4％硫酸铵，0.04％硫酸镁，0.1％磷酸二氢钾，0.1％尿素，0.001％硫胺素，200μg/L生物素，2％琼脂，pH 7.2。
实施例2：检验产L-异亮氨酸突变菌株的L-异亮氨酸生产力
为了检验耐受thiaile、ileHx和AHV的在实施例1中获得的突变菌株谷氨酸棒状杆菌KCJI-38(KCCM11248P)的L-异亮氨酸生产力，以下列方式培养菌株。
将亲本菌株和突变菌株的每一种接种在包含25ml的生产培养基(productionmedium)的250ml三角烧瓶中，然后在30℃下200rpm振荡培养60小时，从而生产L-异亮氨酸。
实施例2中使用的生产培养基组分如下。
生产培养基
10％葡萄糖，0.2％酵母提取物，1.6％硫酸铵，0.1％磷酸二氢钙，0.1％七水硫酸镁，10mg/l七水硫酸亚铁，10mg/l一水硫酸锰，200μg/l生物素，pH 7.2。
在完成培养之后，通过高效液相色谱分析L-异亮氨酸的生产。L-异亮氨酸在每个菌株的培养产物中的浓度显示在下面的表1中。
表1：亲本菌株和KCJI-38(KCCM11248P)之间L-异亮氨酸生产力的比较
如上面的表1中可见，亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC11040(韩国专利特开公开号2000-0002407)产生0.1g/l的浓度的L-异亮氨酸，而突变菌株谷氨酸棒状杆菌KCJI-38(KCCM11248P)产生1.3g/l的浓度的L-异亮氨酸，这表明突变菌株的L-异亮氨酸生产力比亲本菌株大约高13倍。
上述结果表明耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物的突变菌株不经受L-异亮氨的反馈抑制，并且可以被充分地供应作为L-异亮氨酸的前体的L-苏氨酸，这表明突变菌株可以高效率和高产量地生产L-异亮氨酸。

Claims (5)

1.用于生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11248P。
2.根据权利要求1所述的突变菌株KCCM11248P，其中所述突变菌株耐受4-硫杂异亮氨酸(thiaile)、异亮氨酸-异羟肟酸(ileHx)和α-氨基-β-羟基正缬氨酸(AHV)。
3.用于生产L-异亮氨酸的方法，包括培养权利要求1或2所述的突变菌株KCCM11248P。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括从所述突变菌株KCCM11248P的培养基回收L-异亮氨酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养在有氧条件、20-45℃的温度下进行10-160小时。
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