KR101115284B1 - 이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법 - Google Patents

이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101115284B1
KR101115284B1 KR1020090118289A KR20090118289A KR101115284B1 KR 101115284 B1 KR101115284 B1 KR 101115284B1 KR 1020090118289 A KR1020090118289 A KR 1020090118289A KR 20090118289 A KR20090118289 A KR 20090118289A KR 101115284 B1 KR101115284 B1 KR 101115284B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
isoleucine
valine
strain
producing
production
Prior art date
Application number
KR1020090118289A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110061780A (ko
Inventor
김석수
장동욱
박세조
Original Assignee
대상 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대상 주식회사 filed Critical 대상 주식회사
Priority to KR1020090118289A priority Critical patent/KR101115284B1/ko
Publication of KR20110061780A publication Critical patent/KR20110061780A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101115284B1 publication Critical patent/KR101115284B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 이소로이신 생산능을 갖는 미생물에 변이원을 처리하고, 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxyacid synthase) 저해제; 및 발린을 처리하는 단계, 및 상기 아세토하이드록시산 합성효소 저해제 및 발린에 동시에 내성을 갖는 균주를 분리하는 단계를 포함하는, 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주의 제조방법; 및 상기 제조방법으로부터 얻어진 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는, 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)(KCTC 11602BP)을 제공한다. 또한 발명은 상기 제조방법에 의해 얻어진 균주를 배양하는 단계; 및 상기에서 얻어진 배양액으로부터 이소로이신을 회수하는 단계를 포함하는 이소로이신의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따라 이소로이신을 제조할 경우 부산물인 발린의 함량이 감소함에 따라 이소로이신을 높은 수율로 회수할 수 있으므로 이소로이신의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.
이소로이신, 발린

Description

이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법 {Microorganism having isoleucine-producing activity with low production of valine and process for producing isoleucine using the same}
본 발명은 이소로이신 생산능을 가지면서 부산물인 발린을 낮은 농도로 생산하는 신규의 변이주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮은 함량으로 생산하는 변이주의 제조방법, 상기 제조방법으로 얻어진 신규의 변이주, 및 상기 변이주를 이용한 이소로이신의 제조방법에 관한 것이다.
이소로이신은 같은 분지쇄 아미노산인 발린, 로이신과 주요 생합성 경로를 공유하며, 화학적인 구조와 등전점, 용해도 등의 화학적인 특성이 상호 유사한 특성을 갖는다. 이소로이신, 발린, 로이신 등의 생합성 과정에 있어서, 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxyacid synthase, AHAS)는 공통적으로 관여하는 첫번째 효소로 알려져 있다. 즉, AHAS는 피루베이트(pyryvate)와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 중합에 관여하여 이소로이신의 전구체인 2-아세토-2-히드록시- 부티레이트를 생산하거나, 혹은 피루베이트와 피루베이트의 중합에 관여하여 발린 및 로이신의 전구체인 2-아세토락테이트(2-acetolactate)를 생산하는 것으로 알려져 있다. AHAS는 AHAS I, II, 및 III의 3종의 동위효소(isoenzymes) 형태가 알려져 있으며(Umbarger, H. E. 1996. Biosynthesis of the branched-chain amino acids, p.442-457. In F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C.), AHAS I 및 III는 발린에 의해 피드백 저해되는 반면, AHAS II는 발린에 대하여 저항성(resistant)을 갖는다.
설포메투론메틸을 비롯한 설포닐우레아계 저해제는 AHAS의 저해제로서 기능하는 것으로 알려져 있으며, 이와 같은 특성을 이용해 제초제의 성분으로 널리 사용되고 있다. AHAS II 및 III는 설포닐우레아계 제해제에 의해 저해를 받는 반면, AHAS I은 설포닐우레아계 제해제에 대하여 저항성(resistant)을 갖는 것으로 알려져 있다.
한편, 균주 발효를 통하여 이소로이신을 단일 아미노산으로 높은 순도로 생산하기 위해서는, 상기한 바와 같이 이소로이신이 분지쇄 아미노산인 발린, 로이신과의 주요 생합성 경로를 공유하고 있고 또한 화학적인 구조 및 특성의 유사하기 때문에, 많은 공정 단계가 요구되어 고비용이 투입될 뿐만 아니라, 높은 수율로 제조하는데 많은 어려움이 따른다. 특히, 종래에 알려진 대부분의 이소로이신 생산능을 갖는 균주들은 주요 부산물로서 발린이 함께 생성되므로, 발린의 생산성이 낮고 이소로이신의 생산성이 높은 균주를 개발하는 것은 매우 중요하다.
산업적으로 유용한 이소로이신 생산 균주를 개발하기 위한 방법으로는, 중간 대사산물 또는 최종산물에 대한 내성 변이주 선별법이 적용될 수 있다. 즉, 이소로이신 생합성 과정의 주요 중간대사 산물인 쓰레오닌 및 이소로이신의 구조 유사체에 대한 내성을 가지는 변이주를 선별하는 방법이 적용될 수 있다. 그러나 상기한 바와 같이, 부산물로 생성되는 발린이 이소로이신과 주요 생합성 과정을 공유하고 있고, 또한 화학적인 구조 및 특성이 유사하기 때문에, 발린에 대한 이소로이신의 생산 선택성이 높은 균주를 개발하기가 매우 곤란하다. 따라서 이소로이신을 높은 수율로 회수, 생산하여 제조비용을 낮추기 위해서는, 이소로이신 생산능을 가지는 동시에 주요 부산물인 발린을 낮은 함량으로 생산하는 균주의 개발이 당업계에 요구되고 있다.
본 발명자들은 부산물인 발린의 생산성이 낮고 이소로이신의 생산성이 높은 균주를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 이소로이신, 발린, 로이신의 생합성 과정에서 공통적으로 관여하는 AHAS에 대한 저해 활성을 갖는 물질들을 조합하여 처리함으로써 다양한 균주개량을 시도하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 AHAS에 대한 화학적 저해제 및 발린을 이소로이신 생산능을 갖는 미생물에 처리하였을 때, 화학적 저해제 및 발린에 대하여 동시에 내성을 갖는 균주가 이소로이신의 생산성은 그대로 유지하면서 발린의 생성량이 크게 낮아진다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 제조방법에 따라 얻어진, 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 제조방법에 따라 얻어진 균주를 배양하고, 이소로이신을 회수하는 것을 포함하는, 이소로이신의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 이소로이신 생산능을 갖는 미생물에 변이원을 처리하고, 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxyacid synthase) 저해제; 및 발린을 처리하는 단계, 및 (b) 상기 아세토하이드록시산 합성효소 저해제 및 발린에 동시에 내성을 갖는 균주를 분리하는 단계를 포함하는, 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 균주의 제조방법에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소의 저해제는 설포메투론메틸(sulfometuron methyl), 벤조푸론 메틸(benzofuron methyl), 피라조설푸론(pyrazosulfuron), 아짐설푸론(azimsulfuron), 시노설푸론(cinosulfuron), 에톡시설푸론(ethoxysulfuron), 이마조설푸론(imazosulfuron), 클로리무론 에틸(chlorimuron ethyl), 클로로설푸론(chlorosulfuron), 메트설푸론 메틸(metsulfuron methyl), 및 트리베누론 메틸(trubenuron methyl)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계(a)는 이소로이신 생산능을 갖는 미생물에 변이원을 처리하고, 설포메투론메틸 및 발린을 처리함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 제조방법에 있어서, 상기 이소로이신 생산능을 갖는 미생물은 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325)일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)(KCTC 11602BP)가 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, (a') 상기 제조방법에 의해 얻어진 균주를 배양하는 단계; 및 (b') 단계 (a')에서 얻어진 배양액으로부터 이소로이신을 회수하는 단계를 포함하는 이소로이신의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 이소로이신 제조방법에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)(KCTC 11602BP)일 수 있다.
본 발명에 의해, 이소로이신 생산능을 갖는 미생물을 AHAS에 대한 화학적 저해제 및 발린으로 처리하고, 화학적 저해제 및 발린에 대하여 동시에 내성을 갖는 균주를 분리함으로써, 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이는 균주가 화학적 저해제 및 발린에 의해 내성을 가질 경우, 발린 및 이소로이신, 특히 발린의 생산량이 증가될 것이라는 예상과 상반된 것으로 매우 놀라운 것이다. 또한, 상기 처리에 의해 얻어진 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)(KCTC 11602BP)는 AHAS에 대한 화학적 저해제 및 발린에 대한 내성을 가지며, 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산한다. 따라서, 상기 균주를 이용하여 이소로이신을 제조할 경우 부산물인 발린의 함량이 낮아 이소로이신을 높은 순도 및 수율로 회수할 수 있으므로, 이소로이신의 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.
본 명세서에서 "발린을 낮게 생산하는 균주"라 함은 해당 균주의 배양액으로부터 회수한 아미노산의 조성 중, 발린의 생성량이 20 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 5 중량% 이하인 균주를 의미한다.
본 발명자들은 이소로이신, 발린, 로이신의 생합성 과정에서 공통적으로 관여하는 AHAS에 대한 저해 활성을 갖는 물질들을 조합하여 처리함으로써 균주개량을 시도하였으며, 놀랍게도, 이소로이신 생산능을 갖는 미생물을 AHAS에 대한 화학적 저해제 및 발린을 조합하여 처리하고, 화학적 저해제 및 발린에 대하여 동시에 내성을 갖는 균주를 분리함으로써, 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이는 균주가 화학적 저해제 및 발린에 의해 내성을 가질 경우, 발린 및 이소로이신, 특히 발린의 생산량이 증가될 것이라는 예상과 상반된 것으로 매우 놀라운 것이다.
아직 확실히 밝혀진 것은 아니나, 발린에 의해 동위효소인 AHAS I 및 III가 저해되고, 화학적 저해제 특히 설포닐우레아계 저해제에 의해 AHAS II 및 III가 저해되므로, 이들을 동시에 처리할 경우 동위효소인 AHAS I, II, 및 III 사이의 내성 정도가 상이하게 되고, 결과적으로 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린의 생합성은 낮아지는데 기인한 것으로 추정된다. 즉, 이소로이신 생산능을 갖는 미생물을 설포닐우레아계 저해제와 같은 화학적 AHAS 저해제와 함께 발린으로 처리하게 되면, 발린에 의해 AHAS Ⅰ이 피드백 저해를 받아 기능하지 못하게 되고, 화학적 AHAS 저해제에 의해 Ⅱ 및 Ⅲ가 저해를 받아 결과적으로 생육 저해 현상이 일어나게 되는데, 이들에 내성을 갖는 균주는 AHAS I, II, 및 III 사이의 내성 정도가 상이하게 되고, 결과적으로 발린의 생합성은 낮아지게 되는 것으로 추정된다.
따라서, 본 발명은 (a) 이소로이신 생산능을 갖는 미생물에 변이원을 처리하고, 아세토하이드록시산 합성효소(acetohydroxyacid synthase) 저해제; 및 발린을 처리하는 단계, 및 (b) 상기 아세토하이드록시산 합성효소 저해제 및 발린에 동시에 내성을 갖는 균주를 분리하는 단계를 포함하는, 이소로이신의 생산능을 가지면 서 발린을 낮게 생산하는 균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 균주의 제조방법에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 합성효소의 저해제는 아세토하이드록시산 합성효소의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있는 화학적 저해제(chemical inhibitor)를 제한없이 포함한다. 예를 들어, 아세토하이드록시산 합성효소의 저해제는 설포메투론메틸(sulfometuron methyl), 벤조푸론 메틸(benzofuron methyl), 피라조설푸론(pyrazosulfuron), 아짐설푸론(azimsulfuron), 시노설푸론(cinosulfuron), 에톡시설푸론(ethoxysulfuron), 이마조설푸론(imazosulfuron), 클로리무론 에틸(chlorimuron ethyl), 클로로설푸론(chlorosulfuron), 메트설푸론 메틸(metsulfuron methyl), 트리베누론 메틸(trubenuron methyl)로 등의 설포닐우레아계 저해제를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계(a)는 이소로이신 생산능을 갖는 미생물에 변이원을 처리하고, 설포메투론메틸 및 발린을 처리함으로써 수행될 수 있다. 상기 변이원은 N-메틸-N-니트로-N-니트로구아니딘, 니트로소구아니닌 등의 유전자 변이를 유발하기 위하여 미생물 분야에서 통상적으로 사용되는 물질일 수 있다. 또한, 상기 이소로이신 생산능을 갖는 미생물은 이소로이신 생산능을 갖는 것으로 알려진 공지의 균주, 재조합 균주를 제한없이 포함한다. 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325)일 수 있다.
상기 단계(b)는 단계(a)로부터 변이원, 화학적 AHAS 저해제, 및 발린을 처리하여 얻어진 균주들로부터, 단일군락을 형성하는 균주를 분리함으로써 수행할 수 있다. 상기와 같이 분리된 단일 군락을 형성하는 균주는 이소로이신 생산능을 갖는 균주로서, 아세토하이드록시산 합성효소 저해제; 및 발린에 동시에 내성을 갖는다.
일 예로서, 상기 단계(a) 및 (b)는 다음과 같이 수행할 수 있다: 이소로이신 생산능을 갖는 미생물, 예를 들어 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325)에 AHAS II를 P1 transduction 기법으로 발현시킨 재조합 균주를 포도당이 0.5% 포함되어 있는 LB 배지 등에서 배양한 후, 필요에 따라 세척한 다음, 균주를 분리하여 생리식염수 등의 매질 중에서 변이원, 예를 들어 니트로소구아니딘을 처리한다. 변이원으로 처리된 균주를 화학적 AHAS 저해제 및 발린을 포함하는 배지(예를 들어, 버퍼56 최소 평판배지) 중에서 배양한 다음, 단일 군락을 형성하는 균주들을 분리한다. 필요할 경우, 단일 군락을 형성하는 균주들은 다시 화학적 AHAS 저해제 및 발린을 포함하는 배지에서 계대배양한다.
본 발명은 또한 상기 균주의 제조방법에 따라 얻어진 개량 균주를 제공한다. 특히 본 발명자들은 상기 균주의 제조방법에 따라 다양한 변이주를 분리하였으며, 이중, 이소로이신 생산능을 갖는 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325)로부터 개량된 변이주로서 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주들을 분리하였다. 상기 변이주들 중 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 가장 낮게 생산하는 균주를 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)로 명명하였으며, 이를 2009년 11월 20일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁 하였으며, KCTC 11602BP의 수탁번호를 부여받았다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 즉, 에스케리치아 콜라이 DS44(Escherichia coli. DS44)(Schizochytrium sp. CC44)(KCTC 11602BP)를 제공한다.
본 발명은 또한 (a') 상기 제조방법에 의해 얻어진 균주를 배양하는 단계; 및 (b') 단계 (a')에서 얻어진 배양액으로부터 이소로이신을 회수하는 단계를 포함하는 이소로이신의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이소로이신 제조방법에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)(KCTC 11602BP)일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 탄소원, 질소원, 및 인산원을 포함하는 배지 중에서 수행할 수 있으며, 상기 탄소원으로는 포도당, 과당, 젖당, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 황산암모늄, 염화암모늄, 글루타민산나트륨 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 탄소원은 총 배지 중에 2～30 %(w/v), 바람직하게는 8～20 %(w/v)의 농도로 함유될 수 있으며, 상기 질소원은 총 배지 중에 0.1～5 %(w/v), 바람직하게는 0.5～2.5 %(w/v)의 농도로 함유될 수 있다. 또한, 인산원으로는 인산(H3PO4), 인산이수소칼륨(KH2PO4), 이인산수소칼륨(K2HPO4), 인산이수소나트륨(NaH2PO4), 인산일수소나트륨(Na2HPO4) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 총 배지중 에 0.01～0.5%(w/v), 바람직하게는 0.02～0.25%(w/v)의 농도로 함유될 수 있다. 상기 배지는 또한 탄소원, 질소원, 및 인산원 이외에, 푸마르산, 구연산 나트륨(sodium citrate) 등의 유기산; 콜린-HCl(choline-HCl), 티아민-HCl(Thiamine-HCl), 피리독신-HCl(pyrydoxine-HCl), 니코틴산(nicotinic acid), 비오틴(Biotin) 등의 비타민류; 및 마그네슘, 칼슘, 철, 구리, 코발트, 망간, 아연 등의 금속원소를 함유할 수 있다.
상기 배양액으로부터 이소로이신의 회수는 통상의 회수방법, 예를 들어, 등전점을 이용한 직접 결정법, 온도에 따른 용해도 차이에 따른 결정법, 이온교환수지법, 액체 크로마토그래피법, 소수성 지표(Hydropathy index)를 이용하는 방법 등을 단독 또는 병행하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Thomas Hermann. Industrial production of amino acids by coryneform bacteria, Journal of Biotechnology 104 (2003) 155-172 에 개시된 방법에 따라, 이온교환수지를 이용한 분리 공정, 탈색 공정, 및 결정화 공정을 순차적으로 수행할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 아세토하이드록시산 합성효소 저해제 및 발린의 생육저해도
이소로이신 생산능을 갖는 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325) 에 AHAS II를 P1 transduction 기법으로 발현시킨 재조합 균주를 15ml 멸균된 튜브에 포도당이 0.5% 포함되어있는 LB배지 5 ml 상에서 30℃, 180rpm 조건으로 15시간 배양한 배양액을 13000 x g로 원심분리한 후, 0.05M TM 완충용액(0.2M 트리즈마 염기(Trizma base), 0.2M 말레익산(Maleic acid), 0.2M 수산화나트륨(NaOH), pH6.0)을 동일 부피로 첨가하여 2회 세척하였다. 세척 후, 얻어진 균주를 생리 식염수 5ml에 현탁하고, 아세토하이드록시산 저해제 및 발린을 다양한 농도로 첨가한 버퍼56 최소 평판배지에 5ul씩 점적하여 생육도를 측정하였다. 상기 버퍼56 최소 평판배지의 조성은 표 1과 같으며, 생육도를 측정한 결과는 표 2와 같다.
버퍼56 최소 평판배지의 조성
성분 농도
포도당 80g/L
인산일수소나트륨 6g/L
황산암모늄 2g/L
황산마그네슘 0.2g/L
질산칼슘 0.01g/L
황산철 10㎎/L
티아민-HCl 10㎎/L
아세토하이드록시산 합성효소 제해제 및 발린 처리에 대한 생육도
농도 생육도
아세토하이드록시산 합성효소 제해제 발린
무첨가 무첨가 (+++)
설포메투론메틸 20mM 0.1% (+)
50mM 1.0% (-)
200mM 무첨가 (-)
벤설푸론메틸 20mM 0.1% (++)
50mM 1.0% (+)
200mM 무첨가 (+)
피라조설푸론에틸 20mM 0.1% (+)
50mM 1.0% (-)
200mM 무첨가 (+)
설포메투론메틸 20mM 무첨가 (+)
벤설푸론메틸 20mM
설포메투론메틸 20mM 0.1% (-)
벤설푸론메틸 20mM
* (-) 생육부진, (+) 생육우수
상기 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325)에 AHAS II를 P1 transduction 기법으로 발현시킨 재조합 균주는 설포닐우레아 계열의 아세토하이드록시산 합성효소 제해제 및 발린이 동시에 첨가된 경우 생육저해현상이 일어났으며, 또한 발린의 첨가 없이 설포닐우레아 계열 저해제가 단독으로 첨가된 경우에도 생육저해가 나타났으며, 이때 요구되는 설포닐우레아 계열 저해제의 농도는 발린 미첨가시보다 높은 수준이었다. 또한 발린의 첨가없이 설포닐우레아 계열의 아세토하이드록시산 합성효소 제해제만으로 나타나는 생육 억제현상은 한가지의 저해제를 사용하였을 때보다 두가지 이상의 저해제를 사용하였을 때 생육억제 현상이 크게 나타났다. 이러한 결과는 상기 균주가 아세토하이드록시산 합성효소 I, II, III의 세가지 동위효소가 존재하며, 또한 이소로이신을 생산할 뿐만 아니라 높은 농도의 발린도 동시에 생산하고 있기 때문인 것으로 판단된다.
실시예 2. 변이주의 선별 및 내성도 비교
이소로이신 생산능을 갖는 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325) 에 AHAS II를 P1 transduction 기법으로 발현시킨 재조합 균주를 15ml 멸균된 튜브에 포도당이 0.5% 포함되어있는 LB배지 5 ml 상에서 30℃, 180rpm 조건으로 15시간 배양한 배양액을 다시 동일한 조건, 동일한 배지에 10% 접종한 뒤 5시간을 다시 배양하였다. 배양액은 13000 x g로 원심분리한 후, 0.05M TM 완충용액을 동일 부피로 첨가하여 2회 세척하였다. 세척후 최종적으로 식염수 3ml에 현탁하고, 100㎍/㎖ 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine, NTG) 용액을 30℃, 180rpm 조건으로 30분간 처리하였다. 처리된 균체를 생리 식염수로 2회 수세한 후, 설포메투론메틸 50mM 및 발린 1.0%가 첨가된 버퍼56 최소 평판배지에 도말하여 30℃에서 5일간 정치 배양하였다.
단일 군락을 형성하는 균주들을 분리하여, 다시 동일한 농도의 설포메투론메틸 및 발린이 첨가된 평판 배지에서 2차례 계대 배양하고, 변이주들(DS10, DS20, DS44, DS56 등)을 얻었다. 친주인 에스케리치아 콜라이 K12 계열 W3110 균주(Escherichia coli str. K12 substr. W3110)(ATCC 27325) 에 AHAS II를 P1 transduction 기법으로 발현시킨 재조합 균주 및 대표적인 변이주(에스케리치아 콜라이 K12 DS44)의 내성도를 비교하였으며, 상기 내성도 비교는 다양한 농도의 설포메투론메틸 및 발린을 포함한 버퍼56 최소 평판배지 중에서 생육도를 비교함으로써 수행하였다. 그 결과는 다음 표 3과 같다.
에스케리치아 콜라이 K12 W3110(친주) 및 K12 DS44(변이주)의 내성도 비교
농도 생육도
설포메투론메틸 발린 친주
(W3110 재조합균주)		 변이주
(DS44)
무첨가 무첨가 (+++) (+++)
20mM 0.1% (+) (+++)
50mM 1.0% (-) (+++)
100mM 1.0% (-) (++)
200mM 무첨가 (-) (++)
* (-) 생육부진, (+) 생육우수
표 3의 결과로부터, 설포메투론메틸 및 발린의 다양한 농도 조합에서 친주에 비해 변이주들의 내성도가 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있다.
실시예 3. 친주와 변이주의 이소로이신 및 발린 생성량 평가
실시예 2에서 선별된 변이주들을 대상으로 플라스크 생산배지인 IF-1배지를 이용하여, 친주와 변이주의 이소로이신 및 발린의 생성량을 비교하였다. 상기 IF-1배지의 조성은 표 4와 같다.
플라스크 생산배지(IF-1 배지)의 조성
성분 농도
포도당 80g/L
효모 추출물 2g/L
황산암모늄 10g/L
인산이수소칼륨 2g/L
황산마그네슘 0.25g/L
티아민 10㎎/L
니코틴산 10㎎/L
친주 및 변이주들을 100ml 삼각플라스크에 IF배지 10ml을 넣고 접종하고 32℃, 220rpm에서 72시간동안 진탕 배양하였다. 배양 종료후 배양액에 있는 이소로이신 및 발린을 분석하기 위해서 배양액을 13,000 X g로 10분간 원심분리후 상등액을 증류수로 100배 희석하고 0.45um 여과막으로 여과한 다음 희석액을 OPA(Ortho-phthalaldehyde) 시약과 반응시킨 후 칼럼(Apollo C18 5u, Alltech, Part No 36515)과 형광검출기가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용해 분석하였다. 친주 및 주요 변이주들에 대한 이소로이신과 발린의 생성량을 분석한 결과는 다음 표 5와 같다.
플라스크 배양시 친주 및 주요 변이주들의 이소로이신과 발린의 생성량 비교
균주 이소로이신(중량%) 발린(중량%) V/I 비율(중량%) 비고
W3110 재조합균주 1.04 0.28 26.9 n=3
DS10 1.11 0.10 9.0 n=3
DS20 1.04 0.16 15.4 n=3
DS44 1.12 0.04 3.6 n=3
DS56 0.99 0.06 6.1 n=3
* V/I 비율 = 이소로이신에 대한 발린의 생성비율의 백분율
표 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 친주인 W3110 재조합균주가 상기 배양조건에서 이소로이신 1.04%, 발린 0.28%로 이소로이신에 대한 발린의 생성비율(V/I 비율)이 26.9%인데 비해 DS44 등의 변이주들은 친주가 가지고 있는 이소로이신의 생산능은 그대로 지니면서 발린의 생성 비율이 급격하게 감소하였다. 특히, DS44 균주의 경우 이소로이신이 1.12%, 발린이 0.04%로 이소로이신에 대한 발린의 생성비율이 3.6%로 친주대비 약 7.5배 감소하였다. 도 1은 친주인 W3110 재조합균주와 변이주인 DS44의 배양액을 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석한 이소로이신 및 발린의 분석 크로마토그램이다. W3110 재조합균주와 비교할 때 DS44는 이소로이신의 생성능은 그대로 가지면서 발린의 생성이 급격하게 줄어들었음을(점선타원으로 표기) 알 수 있다.
실시예 4. 50L 발효조에서의 친주와 변이주의 배양
친주인 W3110 재조합균주 및 변이주인 DS44를 각각 50L 발효조에서 발효조 생산배지인 IF-2배지에서 배양하여 발효양상 및 이소로이신, 발린의 생성양상을 비교하였다. IF-2배지의 조성은 표 6과 같다.
발효조 생산배지(IF-2배지)의 조성
성분 사입배지 농도 추가배지 농도
포도당 80g/L 550g/L
옥수수 침지액 20g/L -
황산암모늄 20g/L 10g/L
글루타민산나트륨 10g/L
인산 15g/L 10g/L
푸마르산 1g/L -
구연산 나트륨 1g/L -
황산마그네슘 20g/L -
콜린-HCl 1g/L -
티아민-HCl 10mg/L -
피리독신-HCl 10mg/L -
니코틴산 10mg/L -
비오틴 10mg/L -
니코틴산 10mg/L -
염화칼슘 10mg/L -
염화코발트 10mg/L -
황산철 30mg/L -
황산망간 10mg/L -
황산아연 10mg/L -
황산구리 10mg/L -
수산화나트륨 10g/L -
상기 배지조건으로 사입액량 20L 추가액량 6L의 액량으로, 배양조건으로는 온도 32℃, 교반속도 350rpm, 통기량 1vvm, 내압 0.5kg/m3의 조건으로 배지 중 포도당이 15g/L의 농도를 유지하게 하면서 추가당을 5회 첨가하여 배양하였다. 배양된 균체는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양액으로부터 이소로이신 및 발린을 분석하였다. 그 결과는 하기 표 7과 같으며, 친주인 W3110 재조합균주에 비해 변이주 DS44가 이소로이신의 생성량은 유사하나 이소로이신에 대한 발린의 생성비율이 약 4.5배 낮아진 것을 확인할 수 있었다.
50L 발효조 배양시 친주 및 변이주의 발효 지표 및 이소로이신과 발린의 생성 비교
균주 배양시간
(시간)		 이소로이신
(중량%)		 발린
(중량%)		 V/I 비율
(%)		 비고
W3110 재조합균주 52 2.835 0.616 21.7 n=3
DS44 60 2.912 0.140 4.8 n=3
실시예 5. 배양액으로부터 이소로이신의 회수
공지의 방법(Thomas Hermann. Industrial production of amino acids by coryneform bacteria, Journal of Biotechnology 104 (2003) 155-172)에 개시된 방법에 따라, 실시예 4에서 얻어진 W3110 재조합균주 및 DS44의 배양액에 대하여 이온교환수지를 이용한 분리 공정, 탈색 공정, 및 결정화 공정을 수행하여, 이소로이신을 회수하였다. 각각의 단계에서 얻어진 단계별 누적 수율을 측정하였으며, 최종적으로 순도 97%의 이소로이신을 제조하였을 경우 수율을 비교한 결과는 표 8과 같다.
친주 및 변이주의 배양액으로부터 얻어진 이소로이신의 수율
균주
 V/I비율
(%)		 단계별 누적 수율 최종순도 최종수율
이온교환수지 탈색 1차 결정화 2차 결정화
W3110
재조합균주		 21.7% 96% 95% 75% 65% 97.1% 65%
DS44 4.8% 96% 95% 87% 80% 97.1% 80%
표 8의 결과로부터, 동일한 97% 수준의 순도로 이소로이신을 회수할 경우 친주의 경우 최종수율 65% 수준인 반면 변이주인 DS44의 경우 80%의 수준으로 수율이 현저하게 향상되었음을 알 수 있다.
도 1은 친주인 에스케리치아 콜라이 W3110 재조합균주(DT17)와 변이주인 에스케리치아 콜라이 DS44의 배양액을 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석한 이소로이신 및 발린의 분석 크로마토그램이다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 이소로이신의 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는, 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)(KCTC 11602BP).
  6. (a') 에스케리치아 콜라이 DS44 (Escherichia coli. DS44)(KCTC 11602BP)를 배양하는 단계; 및 (b') 단계 (a')에서 얻어진 배양액으로부터 이소로이신을 회수하는 단계를 포함하는 이소로이신의 제조방법.
  7. 삭제
KR1020090118289A 2009-12-02 2009-12-02 이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법 KR101115284B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090118289A KR101115284B1 (ko) 2009-12-02 2009-12-02 이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090118289A KR101115284B1 (ko) 2009-12-02 2009-12-02 이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110061780A KR20110061780A (ko) 2011-06-10
KR101115284B1 true KR101115284B1 (ko) 2012-03-05

Family

ID=44396070

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090118289A KR101115284B1 (ko) 2009-12-02 2009-12-02 이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101115284B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101233666B1 (ko) * 2010-09-30 2013-02-15 대상 주식회사 박테리아 변이 균주를 이용한 이소루신 생산
EP3009504B1 (en) 2013-06-11 2020-12-02 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing l-isoleucine and method for preparing l-isoleucine using the same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5534421A (en) 1991-05-30 1996-07-09 Ajinomoto Co., Inc. Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5534421A (en) 1991-05-30 1996-07-09 Ajinomoto Co., Inc. Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110061780A (ko) 2011-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10351859B2 (en) Microorganism producing L-leucine and method for producing L-leucine using the same
KR101335789B1 (ko) Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법
EP3009504B1 (en) Microorganism producing l-isoleucine and method for preparing l-isoleucine using the same
JP6758703B2 (ja) エルゴチオネインの産生方法
DE112010004851T5 (de) Verfahren und rekombinante Mikroorganismen für die Herstellung von Cadaverin
WO2006116962A2 (de) Verfahren zur fermentativen herstellung von l-valin, l-isoleucin oder l-lysin unter verwendung coryneformer bakterien mit verminderter oder ausgeschalteter alanin aminotransferase aktivität
CN110494553A (zh) 茶氨酸的制造方法
KR101115284B1 (ko) 이소로이신 생산능을 가지면서 발린을 낮게 생산하는 균주 및 이를 이용한 이소로이신의 제조방법
EP1924694B1 (de) Verfahren zur produktion von aminosäuren mit mikroorganismen
EP1323831B1 (en) Corynebacteria overproducing 5'-xanthylic acid
KR20070047811A (ko) 효모 변이주, 글루타티온 고함유 효모의 제조방법, 그배양물, 그 분획물, 효모 엑기스 및 글루타티온 함유음식품
KR100761943B1 (ko) 코엔자임 ｑ10의 생산성이 우수한 변이주 및 코엔자임ｑ10의 생산방법
EP1038969A2 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
KR100422305B1 (ko) 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법
KR101851898B1 (ko) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
KR100344017B1 (ko) 5'-크산틸산을 생산하는 미생물
KR102141210B1 (ko) L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-트립토판의 생산 방법
JP4620404B2 (ja) 酵母変異株、グルタチオン高含有酵母の製造方法、その培養物、その分画物、酵母エキスおよびグルタチオン含有飲食品
KR100344016B1 (ko) 5'-크산틸산을 생산하는 미생물
KR101694850B1 (ko) L-글루타민을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산방법
KR100738681B1 (ko) 코엔자임 ｑ10의 생산성이 우수한 변이주 및 코엔자임ｑ10의 생산방법
EP3670526A1 (en) Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains with a mutated kup transporter
US20240034983A1 (en) Asporogenous bacteria and uses thereof as a feed ingredient
KR100338375B1 (ko) Ｌ-스레오닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용하는ｌ-스레오닌의 제조방법
Gupta et al. Induced mutation and selection of a high yielding strain of Micrococcus glutamicus for L-lysine production

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150130

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151228

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170102

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171220

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191212

Year of fee payment: 9