KR20140007504A - 발효에 의한 천연 ｌ-시스테인의 생성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물 균주가 발효 배지에서 배양되는 생산 발효기에서의 발효에 의한 천연 L-시스테인의 생성 방법으로서, 발효 배지 중 화합물 L-시스테인, L-시스틴 및 티아졸리딘의 분율이 발효 배지 중 최대 8 mg/l의 철 농도에 의해 표적화 방식으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 천연 Ｌ-시스테인의 생성 방법{METHOD FOR PRODUCTION OF NATURAL L-CYSTEINE BY FERMENTATION}
본 발명은 발효에 의한 천연 L-시스테인의 생성 방법에 관한 것이다.
아미노산 L-시스테인은 예를 들면 (특히 베이킹 산업에서) 식품 첨가제로서, 화장품 내 피드 스톡으로서, 또한 약학적 활성 성분(특히 N-아세틸시스테인 및 S-카르복시메틸시스테인)의 생성을 위한 출발 물질로서 사용되므로, 경제적으로 중요하다.
L-시스테인은 모든 유기체에서 황 대사에 있어 핵심적 역할을 하고, 단백질, 글루타티온, 비오틴, 리포산, 메티오닌 및 기타 함황 대사물의 합성에 사용된다. 또한, L-시스테인은 조효소 A의 생합성을 위한 전구체로서 작용한다. L-시스테인의 생합성은 세균, 특히 장내세균에 있어 연구되어 왔고, 문헌[Kredich (1996, Biosynthesis of cysteine, p. 514-527. In F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C.)]에 상세히 기재되어 있다.
모발, 짧은 털, 뿔, 발굽 및 깃털과 같은 케라틴 함유 물질로부터의 추출에 의한, 또는 전구체의 효소 전환에 의한 생체변환에 의한 L-시스테인의 종래 생성 외에도, 발효에 의한 L-시스테인의 생성 방법도 또한 몇 년 전에 개발되었다. 미생물을 이용한 발효에 의한 L-시스테인의 생성에 관한 종래 기술이 예를 들면 US6218168B1, US5972663A, US2004038352A2, CA2386539A2, EP1769080 및 EP2138585에 상세히 기재되어 있다. 여기에 사용되는 세균 숙주 생물은 특히 코리네박테리움(Corynebacterium) 속이고, 예를 들면 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과로부터의 대표 균주, 예컨대 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)이다.
돌연변이 및 선택에 의한 향상된 L-시스테인 생산물질에 도달하기 위한 종래 절차 외에, 효과적인 L-시스테인 과생성을 달성하기 위해 균주에의 표적화 유전 변형도 또한 수행되어왔다.
예를 들면, L-시스테인에 의한 감소된 피드백 억제를 가지는 세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 cysE 대립유전자를 삽입하면, 시스테인 생성의 증가가 초래된다(US6218168B1). 피드백 내성 CysE 효소의 결과, L-시스테인의 직접적 전구체인 O-아세틸-L-세린의 형성은 대체로 세포 내 L-시스테인 수준에서 분리된다.
O-아세틸-L-세린은 L-세린 및 아세틸-CoA로부터 형성된다. 궁극적으로, L-시스테인 생성을 위해 충분한 양의 L-세린의 제공이 매우 중요하다. 이는 L-세린에 의한 감소된 피드백 억제를 가지는 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제를 코딩하는 serA 대립유전자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 그 결과, L-세린의 전구체인 3-히드록시피루베이트의 형성은 대체로 세포 내 L-세린 수준으로부터 분리된다. 그러한 SerA 효소의 예가 EP0620853, US7582460B2 및 EP0931833에 기재되어 있다.
또한, 발효에서의 L-시스테인 수율이 예를 들면 트립토파나제 TnaA 또는 시스타티오닌-β-리아제 MalY 또는 MetC와 같은 L-시스테인 분해 효소를 코딩하는 유전자를 약화시키거나 파괴함으로써 증가할 수 있다는 것이 공지되어 있다(EP1571223).
세포로부터의 L-시스테인의 수송 증가가 배지에서의 생성물 수율을 증가시키는 또 다른 방법이다. 이는 소위 유출(efflux) 유전자의 과발현에 의해 달성될 수 있다. 이 유전자는 세포로부터 L-시스테인 배출(export)을 매개하는 막-결합 단백질을 코딩한다. L-시스테인 배출을 위한 각종 유출 유전자가 기재되었다(US5972663A, US2004038352A2, US2005221453, WO2004113373).
세포로부터 배양 배지로의 L-시스테인의 배출은 하기 이점들을 가진다:
1) L-시스테인은 세포내 반응 평형에서 연속 제거되며, 그 결과로서 세포 내 그 아미노산 수준이 낮게 유지되고, 궁극적으로 L-시스테인에 의한 감수성 효소의 피드백 억제가 일어나지 않는다는 것이다:
(1) L-시스테인(세포내) ↔ L-시스테인(배지)
2) 배지로 방출된 L-시스테인은 산소의 존재 하에 디술피드 L-시스틴으로 산화되고, 이는 배양 중에 배지 내로 도입된다(US5972663A):
(2) 2 L-시스테인 + 1/2 O2 ↔ L-시스틴 + H2O
중성 pH에서의 수용액 중 L-시스틴의 용해도가, 특히 L-시스테인에 비해 단지 매우 낮기 때문에, 디술피드가 낮은 농도에서도 석출되어 나와, 백색 석출물을 형성한다:
(3) L-시스틴(용해) ↔ L-시스틴(석출물)
L-시스틴의 석출로 인해, 배지에 용해된 생성물의 수준이 감소되고, 그 결과로서 각 경우에서의 (1) 및 (2)의 반응 평형은 또한 생성물 쪽으로 유도된다.
3) 생성물이 세포내 축적하고 세포 붕괴가 먼저 행해져야 하는 경우보다 아미노산이 배양 배지로부터 직접 수득될 수 있을 경우에, 생성물을 정제하기 위한 기술 복잡성이 상당히 더 낮다.
L-시스테인의 2개 분자의 산화 중에, 디술피드 L-시스틴이 형성된다. 이 반응은 가역적이고, 이는 L-시스틴이 환원에 의해 L-시스테인으로 다시 전환될 수 있음을 의미한다. L-시스틴은 (예를 들면, 데칸터를 이용하여) 세포로부터 분리된 후, 전기분해에 의해 L-시스테인으로 다시 환원될 경우, 이 화학적 전환은 그러한 L-시스테인은 향미료 규정에 따라 천연물로서 공표될 수 없음을 의미한다.
EU 향미료 규정(식품류 법 하의 라벨링 규정을 개혁하기 위한 규정의 1334/2008 제22 조항(1334/2008 Article 22 of the regulation for reforming the labeling regulations under the Foodstuff Law)에 따라, 천연 향미료는 이하와 같이 정의된다: "천연" 향미료는 천연 발생하고 자연에서 발견된 향미료 성질을 가지는, 화학적으로 정의된 물질이다. 이는 하나 이상의 통상적 식품 제조 공정(미생물학적 공정, 예컨대 발효 포함, 별첨 II 참조)에 의해 인간이 소비하기 위해 그대로 혹은 가공되어 사용되는, 식물, 동물 또는 미생물학적 출발 물질로부터 적당한 물리적, 효소적 또는 미생물학적 공정에 의해 수득된다.
용어 "천연"은 또한 이러한 의미로 본원에 사용된다. 향미료 제조에 있어 천연 원료의 사용에 큰 관심이 있다. 그러나, 발효에 의한 천연 시스테인의 생산 방법이 지금까지는 없었다.
SH 기의 산화를 촉매할 수 있는 일련의 화합물들이 있고; 예를 들면 철 염 또는 아연 염과 같은 중금속 염이 발효에 있어 필수적 첨가제이고, 이 성분들이 시스테인의 시스틴으로의 산화를 효과적으로 촉매할 수 있는 것임이 공지되어 있다(US2008190854A2).
US6218168B1는 L-시스테인 및 이의 유도체 생성용 발효 배지가 15 mg/l의 철 농도(75 mg/l 황화철 7수화물)를 포함한다는 것을 기재하고 있다. EP1389427A1은 철 농도가 14.9 mg/l(74 mg/l 황화철 7수화물)로 주어지는, L-시스테인, L-시스틴 및 티아졸리딘의 발효에 의한 생성용 배지를 개시한다
US2010/0093045A1은 단지 2 mg/l 철(10 mg/l 황화철 7수화물)만을 포함하는 L-시스테인의 생성을 위한 배지를 기재하고 있다. 그러나, 이 배지는 단지 실험실 규모(배지 체적 20 ml)의 진탕 플라스크에 사용하기 위한 것으로서, 생산 발효기에서의 발효를 위한 것이 아니다. EP2133429A1은 단지 0.34 mg/l 철(1.7 mg/l 황화철 7수화물)만을 포함하는, L-시스테인, L-시스틴, 이의 유도체, 또는 이들의 혼합물의 생성용 배양 배지를 언급한다. 이 배지는 또한 발효에서 사용하기 위한 것으로 기재된 것이 아니라, 작은 관(배지 체적 2 ml)에서 배양하기 위한 것으로 기재되어 있다. 통상, 이러한 배양 조건(배치 배양, 불량한 산소 공급, pH 비제어) 하에서는, 단지 매우 낮은 세포 농도(약 0.5 내지 2 g/l 건조 바이오매스) 및 작은 생성물 수율만이 달성된다. 이는 0.25 g/l(US2003/0077766A1), 0.3 g/l(EP2133429A1) 및 1.2 g/l(US2010/0093045A1)의 진탕 플라스크 또는 작은 관에서 달성되는 L-시스테인 수율을 참조해볼 때 분명하다.
그러나, 생산 발효기에서는, 바이오매스에 특이적인 생성물 형성 속도의 결과로서, 그에 따라 산업적 규모의 경제적 공정만을 허용하는 상응하게 높은 체적 수율을 달성하기 위해, 높은 세포 밀도가 요망된다. 미생물학적 물질 생성을 위한 산업적 공정의 품질은 일반적으로 생성율을 참조함으로써 평가된다. 이 매개변수는 발효 시간 당, 배지 리터 당 형성되는 생성물의 총량을 기술한다.
발효에 의한 L-시스테인의 생성을 위한 전술된 방법의 한 결점은, 아미노산이 각종 형태로 배양 브로쓰 내에 존재한다는 것이다. 석출물 내의 석출된 L-시스틴에 부가하여, 용해된 형태의 L-시스틴뿐만 아니라 가용성 L-시스테인, 및 티아졸리딘도 배양액 상등액에서 발견된다(US6218168B1, US5972663A, CA2386539A2). 이 티아졸리딘 (2-메틸티아졸리딘-2,4-디카르복실산)은 순수하게 화학적인 반응에서 형성되는, L-시스테인 및 피루베이트의 축합 생성물이다.
본 발명의 문맥 내에서, 용어 "총 시스테인"은 L-시스테인 및 L-시스틴, 및 이로부터 유도되고 발효 중에 형성되어 배양 상등액 및 석출물 내에 축적되는 티아졸리딘 화합물을 포함한다.
공지된 방법에서, 총 시스테인의 조성은 발효 말기에 가변한다: 석출된 L-시스틴의 분율은 40-66%(US5972663A, CA2386539A2)이고, 나머지 34-60%가 L-시스테인 및 티아졸리딘으로 주로 존재하는 가용성 생성물 형태의 배양 상등액 내에 존재한다. 이 생성물 이질성은 배양 브로쓰로부터의 표적 생성물 천연 L-시스테인의 회수 및 정제를 방해한다.
그러므로, 생성된 최종 생성물이 우세하게 가용성 L-시스테인인 방법이 바람직하다. 또한, 가능한 한, 티아졸리딘이 형성되어서는 안된다. 배양 상등액으로부터의 표적 생성물 L-시스테인의 정제는, 석출물로서 존재하는 L-시스틴이 단순 분리기 단계에 의해 세포와 함께 분리될 수 있고 가용성 L-시스테인이 이온 교환 흡착에 의해 단리될 수 있기 때문에, 상기와 같은 공정으로 상당히 더 용이할 것이다.
본 발명의 목적은, 미생물 균주가 발효 배지에서 배양되는 생산 발효기에서의 천연 L-시스테인의 생성 방법으로서, 최종 생성물이 배양 배지에서 우세하게 가용성 L-시스테인의 형태로 존재하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은 발효기 배양물에서의 제조 화합물 L-시스테인, L-시스틴 및 티아졸리딘의 분율이 배지 중에서 최대 8 mg/l의 철 농도에 의해 표적화 방식으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 달성된다.
발효 배지 중 철 농도는 바람직하게 최대 4 mg/l, 특히 바람직하게는 최대 2 mg/l 철이다. 이러한 낮은 철 농도에서는 티아졸리딘이 아닌 가용성인 L-시스테인 및 석출된 L-시스틴이 우세하게 생성물로서 형성되기 때무네, 유의적으로 더 동질적인 생성물 스펙트럼이 발효기 배양물에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 된다는 것이 밝혀졌다. 그러나 철 농도는 0.2 mg/l 미만으로 떨어져서는 안되며, 그 이유는 그 농도는 발효 말기에 존재하는 L-시스테인의 양 및 분율에 부정적 영향을 미치기 때문이다.
놀라운 발견 사실은, 이러한 낮은 철 농도를 가지는 배지에서, 총 시스테인 중의 L-시스테인 분율이 증가할 수 있고, 발효 말기에는 65% 이상이라는 것이었다. 이 발견 사실은, 발효 배지가 장내세균으로 아미노산류, 구체적으로 L-시스테인 및 이의 유도체를 생성하는 것으로 기재된 발효 배지가 14.9 mg/l 이상의 철을 함유하기 때문에 특히 놀랍다(US6218168B1).
본 발명의 다른 한 이점은, 공지된 방법(EP1389427)과 대조적으로, 본 발명에 따른 방법에서, 공정 중에 L-시스테인을 안정화하기 위해, 비타민 C, 비타민 E 또는 포름산, 및 이의 염과 같은 환원제를 첨가할 필요가 없다는 것이다.
본 발명에 따른 발효 방법의 시스테인 형성기(formation phase)는 L-시스테인이 처음으로 배양 브로쓰에서 검출될 수 있는 시점에서 시작하여, 배양 말기까지 계속된다. 전형적으로, 이 시기는 생산 발효기를 접종한 지 2시간 후에 시작된다.
종래 기술에 기재된 공정들(US2003/0077766A1, EP2133429A1, US2010/0093045A1)과 대조적으로, 본 발명에 따른 발효 방법으로는, 20 g/l 이상, 바람직하게는 30 g/l 이상, 특히 바람직하게는 40 g/l 이상 건조 바이오매스의 세포 밀도, 및 10 g/l 이상의 시스테인 체적 생성물 수율이 달성된다.
본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 미생물은 모두 종래 기술에 기재된 시스테인 생성 균주이다. 그러한 균주는 예를 들면 US6218168B1, US5972663A, US2004038352A2, CA2386539A2, US2009053778A2 및 EP2138585A1에 개시되어 있다.
미생물 균주로서, 엔테로박테리아세아에 과의 대표 균주가 바람직하고, 속 엔쉐리키아(Escherichia) 또는 판토에아(Pantoea)가 특히 바람직하며, 종 E. 콜라이 또는 P. 아나나티스의 균주가 매우 특히 바람직하다.
이 미생물 균주들 중, 상응하는 야생형 효소에 비해 2 인자 이상 감소된 L-시스테인에 의한 피드백 억제를 가지거나, 혹은 유출 유전자의 과발현의 결과로서, 야생형 세포에 비해 2 인자 이상 증가된 세포로부터의 시스테인 배출을 가지는 변형된 세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 가지는 균주가 궁극적으로 바람직하다. 특히 바람직한 미생물 균주는, 상응하는 야생형 효소에 비해 2 인자 이상 감소된 L-시스테인에 의한 피드백 억제를 가지고, 또한 유출 유전자의 과발현의 결과로서, 야생형 세포에 비해 2 인자 이상 증가된 세포로부터의 시스테인 배출을 가지는 세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 가지는 균주이다. 그러한 균주는 예를 들면 US6218168B1 및 US5972663A로부터 공지되어 있다. 매우 특히 바람직한 균주는 상응하는 야생형 효소에 비해 2 인자 이상 감소된 L-세린에 의한 피드백 억제를 가지는 변형된 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제를 추가적으로 가지고(US7582460B2), 1개 이상의 L-시스테인 분해 효소가 이 효소 활성의 단지 최대 50%만이 야생형 세포에 비해 세포 내에 여전히 존재하도록 약화되는 균주이다.
세린 O-아세틸 트랜스퍼라제의 바람직한 변이체는 상응하는 야생형 효소에 비해, 5 인자(factor) 이상, 특히 바람직하게는 10 인자 이상, 매우 특히 바람직하게는 50 인자 이상 감소된 L-시스테인에 의한 피드백 억제를 가진다.
유출 유전자는 바람직하게 E. 콜라이로부터의 군 ydeD(US5972663A), yfiK(US2004038352A2), cydDC(WO2004113373), bcr(US2005221453) 및 emrAB(US2005221453)으로부터, 또는 상이한 미생물로부터의 상응하는 상동성 유전자로부터 비롯된다. 상동성 유전자는 그 유전자의 서열이 상응하는 E. 콜라이 유전자의 DNA 서열과 80% 이상의 정도로 일치한다는 의미로서 이해하도록 한다.
야생형 세포에 비해, 유출 유전자의 과발현은 바람직하게 5 인자 이상, 특히 바람직하게는 10 인자 이상, 매우 특히 바람직하게는 20 인자 이상 증가한 세포로부터의 시스테인 배출을 초래한다.
3-포스포글리세레이트 데히드로게나제의 바람직한 변이체는 상응하는 야생형 효소에 비해 5 인자 이상, 특히 바람직하게는 10 인자 이상, 매우 특히 바람직하게는 50 인자 이상 감소된 L-세린에 의한 피드백 억제를 가진다.
L-시스테인 분해 효소는 바람직하게 군 트립토파나제(TnaA) 및 시스타티오닌-β-라이라제(MalY, MetC)로부터 비롯된다.
이 효소들 중 1개 이상이 야생형 효소에 비해 효소 활성의 단지 10% 이하만이 세포 내에 여전히 존재하도록 약화되는 균주들이 특히 바람직하다. 이 효소들 중 1개 이상이 완전히 불활성화된 균주가 매우 특히 바람직하다.
본 발명의 문맥 내에서, 생산 발효기는 바람직하게 명목 체적(nominal volume) ≥1 m3인 발효기를 의미하는 것으로 이해하도록 한다. 명목 체적 ≥5 m3인 발효기를 사용하는 것이 특히 바람직하고, 명목 체적 ≥50 m3인 발효기를 사용하는 것이 매우 특히 바람직하다.
호기성 성장 조건 하에, 즉 산소의 존재 하에 L-시스테인 생성 중의 세포 배양을 수행한다. L-시스테인 발효의 생성기(production phase) 중의 산소 함량은 30 내지 1% O2 포화도, 바람직하게는 10 내지 1% O2 포화도, 특히 바람직하게는 5 내지 1% O2 포화도여야 한다.
탄소원은 바람직하게 당, 당 알콜, 유기산 또는 당 함유 식물 가수분해물이다. 본 발명에 따른 방법에서 탄소원으로서 글루코스, 프룩토스, 락토스, 글리세롤 또는 이 화합물들 중 2종 이상을 포함하는 혼합물을 이용하는 것이 특히 바람직하다.
바람직하게, 탄소원은 시스테인 생성기 동안에 발효기 내 탄소원의 함량이 10 g/l를 초과하지 않도록 배양물 내로 계량 주입된다. 2 g/l의 최대 농도가 바람직하고, 0.5 g/l의 최대 농도가 특히 바람직하며, 0.1 g/l의 최대 농도가 매우 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 N원은 바람직하게 암모니아, 암모늄 염 또는 단백질 가수분해물이다. pH 안정화를 위한 보정 수단으로서 암모니아를 사용할 때, 이 N원은 발효 중에 규칙적으로 보충된다.
다른 배지 첨가물로서, 인, 염소, 나트륨, 마그네슘, 질소, 칼륨, 칼슘, 철 원소들 및 미량 원소(즉, μM 농도)의 염, 몰리브덴, 붕소, 코발트, 망간, 아연 및 니켈 원소들의 염이 첨가될 수 있다. 본 발명에 따라, L-시스테인 발효를 위해, 배지의 철 농도는 8 mg/l 미만, 바람직하게는 4 mg/l 미만, 특히 바람직하게는 2 mg/l 미만인 것이 중요하다. 철 농도는 0.2 mg/l 미만으로 떨어져서는 안된다.
또한, 유기 산류(예를 들면 아세트산염, 시트르산염), 아미노산류(예를 들면 이소루이신) 및 비타민류(예를 들면 B1, B6)이 배지에 첨가될 수 있다.
사용될 수 있는 복합 영양소 원은 예를 들면 효모 추출물, 옥수수 침지수, 대두분 또는 맥아 추출물이다.
예를 들면 E. 콜라이 또는 P. 아나나티스와 같은 중온성 미생물에 대한 항온배양 온도는 15-45℃, 특히 바람직하게는 30-37℃이다.
발효 중의 발효 배지의 pH는 바람직하게 5.0 내지 8.5의 pH 범위 내이고, pH 7.0이 특히 바람직하다.
L-시스테인 및 L-시스테인 유도체의 제조를 위해, 발효 중에 황원을 첨가할 필요가 있다. 이와 관련하여, 황산염 또는 티오황산염이 바람직하게 사용된다. L-시스테인 발효에 있어, 배지의 티오황산염 농도는 5 g/l 미만, 바람직하게는 3 g/l 미만, 특히 바람직하게는 1 g/l 미만, 매우 특히 바람직하게는 0.5 g/l 미만이어야 하나, 0.1 g/l 미만으로 떨어져서는 안된다.
전술된 방법에 의해 발효되는 미생물은 2 내지 30시간에 걸쳐, 초기 성장기 후에, 배치 또는 페드 배치 공정으로 상기로부터 유도된 L-시스테인 및 화합물을 고효율로 배양 배지 내로 분비한다.
표적 생성물을 더욱 정제하기 위해, 하기 단계들을 수행할 수 있다:
- 석출물로서 존재하는 L-시스틴 및 세포의 제거를 위한 분리 단계
- 이온 교환 흡착에 의한 L-시스테인의 단리
- 석출 결정화
이 유형의 공정들은 종래 기술로부터 공지되어 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 설명하기 위한 것이다.
실시예 1: 시스테인 생성 균주의 생성
야생형 균주 E. 콜라이 W3110(ATCC 27325) 및 P. 아나나티스(ATCC 11530)는 각 경우에 US5972663A에 기재된 바와 같은 전기영동에 의해 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306(US5972663A의 실시예 2에 개시됨)로 형질변환된다. 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306은, 복제 기원 및 테트라사이클린 내성 유전자 외에, L-시스테인에 의한 감소된 피드백 억제를 가지는 세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 cysEX 대립유전자, 및 구성 GAPDH 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유출 유전자 ydeD(ORF306)도 또한 함유한다.
플라스미드 보유 세포에 대한 선택을 15 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 수행하였다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, 키아프렙(QIAprep) 스핀 플라스미드 키트(키아젠 게엠바하(Qiagen GmbH)) 및 제한 분석을 이용한 추가적 플라스미드 단리 후, 요망되는 형질전환체, 즉 플라스미드 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306를 취한 세포를 단리하여, 발효에 사용하였다.
실시예 2: 황화철 칠수화물의 상이한 공급 하에서의 시스테인 생성 균주의 배양
시스테인 생성을 입증하기 위해, 실시예 1에 기재된 미생물을 연속적 글루코스 및 티오황산염 피드를 이용하여 페드 배치 방식으로 발효기에서 배양하였다. 사용한 생산 발효기는 명목 체적이 5 m3인 바이오리액터였다. 생산 발효기를 위한 접종 물질을 2단 전배양(preculture) 절차로 제조하였다.
전배양 1(진탕 플라스크):
각 경우에, 15 mg/l 테트라사이클린을 가지는 400 ml의 LB 배지에, 특정 균주(E. 콜라이 W3110 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 또는 P. 아나나티스 pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306)가 있는 10개의 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)(2000 ml)를 접종하여, 7일 동안 진탕기 상에 항온배양하였다(150 rpm, 30℃).
전배양 2(전발효기):
이어서, 10개의 엘렌마이어 플라스크로부터의 전배양 1을 조합하였다. 4 l의 전배양 1을 무균 접종 플라스크에 옮기고, 명목 체적이 500 l인 전발효기 내로 전부 펌핑하였다. 발효 배지(200 l)는 20 g/l 글루코스, 10 g/l 트립톤(trypton)(디프코(Difco)), 5 g/l 효모 추출물(디프코), 5 g/l(NH4)2SO4, 1.5 g/l KH2PO4, 0.5 g/l NaCl, 0.3 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.015 g/l CaCl2 x 2 H2O, 0.002 g/l FeSO4 x 7 H2O, 1 g/l Na3 시트르산염 x 2 H2O, 0.005 g/l 비타민 B1, 1 ml/l 미량의 원소 용액(0.15 g/l Na2MoO4 x 2H2O, 2.5 g/l H3BO3, 0.7 g/l CoCl2 x 6 H2O, 0.25 g/l CuSO4 x 5 H2O, 1.6 g/l MnCl2 x 4 H2O, 0.3 g/l ZnSO4 x 7 H2O로 구성됨) 및 15 mg/l 테트라사이클린을 함유하였다.
25% NH4OH 용액을 접종하기 전에 전발효기 내의 pH를 7.0으로 조정하였다. 발효 중에, pH를 25% NH4OH를 이용한 자동 보정에 의해 7.0으로 유지시켰다. 배양물을 개시 시에 200 rpm에서 교반하고, 무균 필터를 통해 무균화된 0.5 vvm의 압축 공기로 탈기하였다. 산소 프로브를 접종 전 상기 출발 조건 하에서 100% 포화도로 보정하였다. 발효 중에 O2 포화도에 대해 요망되는 값을 30±1%에 설정하였다. O2 포화도가 요망되는 값 미만으로 떨어진 후, O2 포화도를 요망되는 값으로 복원하기 위해, 제어 캐스케이드를 개시하였다. 여기서, 기체 도입을 최대 2 vvm로 연속적으로 증가시켰다.
15 시간 동안 30℃의 온도 및 50 kPa의 압력에서 배양을 수행하였다. 이 항온배양 후, 600 nm(OD600)에서의 광학 밀도는 18 내지 20였다.
주배양(생산 발효기):
발효를 명목 체적이 5 m3인 발효기에서 수행하였다. 발효 배지(2300 l)는 15 g/l 글루코스, 10 g/l 트립톤(디프코), 5 g/l 효모 추출물(디프코), 5 g/l(NH4)2SO4, 1.5 g/l KH2PO4, 0.5 g/l NaCl, 0.3 g/l MgSO4 x 7 H2O, 0.015 g/l CaCl2 x 2 H2O, 1 g/l Na3 시트르산염 x 2 H2O 및 1 ml 미량 원소 용액(상기 참조), 0.005 g/l 비타민 B1 및 15 mg/l 테트라사이클린을 포함한다. 실험 혼합물에 따라, 배지를 75 mg/l, 40 mg/l, 20 mg/l, 10 mg/l, 3 mg/l 또는 0.5 mg/l FeSO4 x 7 H2O로 보충하였다. 25% NH4OH 용액에서의 펌핑에 의해 점핑하기 전에, 생산 발효기 내의 pH를 7.0으로 조정하였다. 발효 중에, pH를 25% NH4OH를 이용한 자동 보정에 의해 7.0의 값으로 유지하였다. 접종을 위해, 200 l의 전배양 2를 발효기 용기에 펌핑하였다. 이에 따라, 출발 체적이 약 2500 l였다. 배양물을 개시 시에 120 rpm에서 교반하고, 무균 필터를 통해 무균화된 1.5 vvm의 압축 공기로 탈기하였다. 산소 프로브를 접종 전 상기 출발 조건 하에서 100% 포화도로 보정하였다. 발효 중에 O2 포화도에 대한 요망되는 값을 30±1%로 조정하였다. O2 포화도가 요망되는 값 미만으로 떨어진 후, O2 포화도를 요망되는 값으로 복원하기 위해, 제어 캐스케이드를 개시하였다. 여기서, 먼저 기체 도입을 (최대 2 vvm로) 연속적으로 증가시킨 후, 교반 속도를 (최대 300 rpm로) 연속적으로 증가시켰다.
발효를 30℃의 온도 및 50 내지 60 kPa의 압력에서 수행하였다. 2 h의 발효 시간 후, 무균 60% 티오황산나트륨 x 5 H2O 스톡 용액 형태의 황원의 연속 주입을 수행하였다. 배지 내 티오황산염 농도가 5 g/l를 절대 초과하지 않도록 피드 속도를 조정하였다. 발효기 내의 글루코스 함량이 초기 15 g/l에서 약 2 g/l로 급락하자마자, 56% 글루코스 용액을 연속 계량 주입하였다. 그 지점으로부터의 발효기 내의 글루코스 농도가 10 g/l를 초과하지 않도록 피드 속도를 조정하였다. YSI(미국 오하이오주 옐로우 스프링즈 소재) 사의 글루코스 분석기를 이용하여, 글루코스 결정을 수행하였다.
발효 시간은 24시간이었다. 이어서, 모든 발효기에서 40 내지 45 g/l 건조 바이오매스의 세포 밀도가 결정되었다.
발효 말기에, 샘플을 취하였고, 배양 상등액(L-시스틴 및 티아졸리딘) 및 석출물(L-시스틴) 내의 L-시스테인 및 이로부터 유래된 유도체의 함량을 상호 분리하여 각기 결정하였다(표 1 및 2 참조). 이러한 목적을 위해, 가이톤드(Gaitonde)로부터의 비색 닌히드린 시험을 원칙적으로 사용하였다(문헌[Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633]). 여기서, 시험의 강산 반응 조건 하에서, 유리 L-시스테인이 포함되고 정량화되는 것뿐만 아니라, L-시스테인이 티아졸리딘에 결합되도록 하는 것도 확실히 한다. 배양 상등액에 용해된 L-시스틴을, pH 8.0의 희석 용액 중 디티오트레이톨(DTT)로 환원한 후, L-시스테인과 마찬가지로 가이톤드로부터의 닌히드린 시험으로 검출한다. 석출물 내의 L-시스틴은 동일한 방식으로 정량화할 수 있기 전에, 8% 염산에 먼저 용해시켜야 했다.
배양 상등액에 용해된 성분 L-시스테인, L-시스틴 및 티아졸리딘의 미분 정량화를 위해, 2개의 추가 시험 방법을 부가적으로 사용하였다: 유리 SH 기가 특이적으로 검출될 수 있도록 하는 5,5'-디티오비스-2-니트로벤조산(DTNB)을 이용하여 Sang-Han Lee 등에 의해 기재된 시험(문헌[1995, Biochemical and Biophysical Research Communications 213, 837ff])에 의해, 유리 L-시스테인의 정량화를 수행하였다. Daβler 등(문헌[2000, Molecular Microbiology 36, 1101ff])에 기재된 바와 같이, HPLC 방법에 의해 L-시스테인 및 유도체 L-시스틴 및 티아졸리딘이 미분을 수행하였다.
배지 중의 철 농도와 함수 관계인, 24 h 후의 E. 콜라이의 배양 브로쓰 중의 L-시스테인 및 L-시스테인 유도체의 함량
E. 콜라이
FeSO 4 x7H 2 O [mg/l] Fe
[mg/l] 		24 h 후의 시스테인 함량 [g/l] L-시스테인의 분율
[%] 5
상등액 석출물 4
L-시스테인1 L-시스틴2 티아졸리딘3
75 15 8.8 1.2 1.2 11.6 38.6
40 8 14.6 1.2 0.2 6.4 65.2
20 4 17.6 1.0 0 5.8 72.1
10 2 19.6 1.0 0 4.0 79.7
3 0.6 19.8 0.8 0 4.4 79.2
0.5 0.1 7.2 0.8 0 9.4 41.4
1: 상등액 중의 L-시스테인(DTNB 시험)
2: 상등액 중의 용해된 L-시스틴(HPLC)
3: 상등액 중의 티아졸리딘(HPLC)
4: 석출물 중의 L-시스틴
5: 총 시스테인 중의 L-시스테인의 분율
배지 중 철 농도와 함수 관계인 24 h 후의 P. 아나나티스의 배양 브로쓰 중의 L-시스테인 및 L-시스테인 유도체의 함량
P. 아나나티스
FeSO 4 x7H 2 O [mg/l] Fe
[mg/l] 		24 h 후의 시스테인 함량 [g/l] L-시스테인의 분율
[%] 5
상등액 석출물 4
L-시스테인1 L-시스틴2 티아졸리딘3
75 15 5.8 1.4 1.2 7.6 36.3
40 8 10.4 1.2 0.2 4.8 62.7
20 4 12.6 1.2 0 4.4 69.2
10 2 14.6 1.0 0 3.8 75.3
3 0.6 14.8 1.0 0 4.0 74.7
0.5 0.1 5.2 0.8 0 7.6 38.2
1: 상등액 중의 L-시스테인(DTNB 시험)
2: 상등액 중의 용해된 L-시스틴(HPLC)
3: 상등액 중의 티아졸리딘(HPLC)
4: 석출물 중의 L-시스틴
5: 총 시스테인 중의 L-시스테인의 분율
발명의 효과
본 발명의 방법에서는, 미생물 균주가 발효 배지에서 배양되는 생산 발효기에서의 발효에 의한 천연 L-시스테인을 생성할 때, 그 발효 배지 중의 철 농도를 표적화 방식으로 제어함으로써 최종 생성물 중 총 시스테인 내의 L-시스테인 분율을 65% 이상 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

Claims (10)

  1. 미생물 균주가 발효 배지에서 배양되는 생산 발효기에서의 발효에 의한 천연 L-시스테인의 생성 방법으로서, 발효 배지 중 제조된 화합물인 L-시스테인, L-시스틴 및 티아졸리딘의 분율이 발효 배지 중 최대 8 mg/l의 철 농도에 의해 표적화 방식으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 발효 배지 중 철 농도가 최대 4 mg/l, 바람직하게는 최대 2 mg/l의 철인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발효 배지 중 철 농도가 0.2 mg/l 미만으로 떨어지지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민 C, 비타민 E 또는 포름산, 및 이의 염과 같은 환원제가 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 미생물 균주가 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과로부터 유래된 대표 균주, 바람직하게는 속 에쉐리키아( Escherichia ) 또는 판토에아(Pantoea)의 대표 균주, 특히 바람직하게는 종 E. 콜라이 (E. coli ) 또는 P. 아나나티스(P. ananatis)의 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 미생물 균주가 상응하는 야생형 효소에 비해 2 인자(factor) 이상 감소된 L-시스테인에 의한 피드백 억제를 가지거나, 또는 유출(efflux) 유전자의 과발현의 결과로서, 야생형 세포에 비해 2 인자 이상 증가된 세포로부터의 시스테인 배출(export)을 가지는 변형된 세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 미생물 균주가 상응하는 야생형 효소에 비해 2 인자 이상 감소된 L-시스테인에 의한 피드백 억제를 가지고, 또한 유출 유전자의 과발현의 결과로서, 야생형 세포에 비해 2 인자 이상 증가된 세포로부터의 시스테인 배출도 가지는 변형된 세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 미생물 균주가 상응하는 야생형 효소에 비해 2 인자 이상 감소된 L-세린에 의한 피드백 억제를 가지는 변형된 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제를 추가적으로 가지고, 하나 이상의 L-시스테인 분해 효소가, 이 효소 활성의 단지 최대 50%만이 야생형 세포에 비해 세포 내에 여전히 존재하도록 약화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양이 명목 체적(nominal volume) ≥1 m3인 발효기, 바람직하게는 명목 체적 ≥5 m3인 발효기, 매우 특히 바람직하게는 명목 체적 ≥50 m3인 발효기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배지 중에, 5 g/l 미만의 티오황산염 농도, 바람직하게는 3 g/l 미만의 티오황산염 농도, 특히 바람직하게는 1 g/l 미만의 티오황산염 농도, 매우 특히 바람직하게는 0.5 g/l 미만의 티오황산염 농도가 존재하나, 그 농도가 0.1 g/l 미만으로 떨어지지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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