WO2014200126A1 - Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법 - Google Patents

Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법 Download PDF

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threonine
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strain
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이지혜
김종현
이한형
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism having improved L-isoleucine production capacity and a method for producing L-isoleucine using the same.
  • L-amino acids are widely used in functional food additives, animal nutrition, and the pharmaceutical industry as the basic units of protein.
  • Branched-chain amino acid out of a total of 20 amino acids refers to the three kinds of L-valine, L- leucine, L-isoleucine, and is increasing in industrial value.
  • Branched chain amino acids play an important role in maintaining and forming skeletal livers in the human body, and have been reported to be functional in insulin regulation and muscle maintenance and gain (Andrea tom et al, (2006) The journal of nutrition, 136 , 324s-330s).
  • L-isoleucine is metabolized in the muscle to produce energy, and is involved in the production of hemoglobin to reduce fatigue and promote growth. Accordingly, it is widely used as a sap preparation and a nutritional supplement, and is increasingly used in sports nutrition.
  • Corynebacterium glutamicum is used as a representative microorganism for industrial production of L-isoleucine.
  • the microorganism synthesizes L-isoleucine via three intermediate metabolites using pyruvate and 2-ketobutyrate as precursors (see FIG. 1).
  • 2-aceto-2-hydroxybutyrate is synthesized from the two precursors, and 2,3-dihydroxy-3-methylvalerate (2,3-dihydroxy-3-methylvalerate ) And 2-keto-3-methylvalerate to finally produce L-isoleucine.
  • Acetohydroxy acid synthase acetohydroxy acid isomeroreductase, dihydroxy acid dehydratase, and An enzyme called aminotransferase is used (Jin hwan park et al, Appl microbial biotechnol, (2010) 85: 491-506).
  • Acetohydroxy acid synthase which is important in the biosynthesis of L-isoleucine in the Corynebacterium glutamicum strain, is encoded by the ilvBN gene, and is expressed by the final product L-isoleucine. It has a feedback inhibitory effect that inhibits the activity of the enzyme.
  • threonine dehydratase which produces 2-ketobutyrate, is also feedback-suppressed by L-isoleucine, thereby regulating the expression of genes involved in L-isoleucine biosynthesis and Modulating enzyme activity is known to be an important factor in producing high yield L-isoleucine producing strains (Jin hwan park et al, Biotechnology journal, (2010) 560-577).
  • L-isoleucine, L-valine, and L-leucine are produced through the same biosynthetic pathway, in order to mass-produce L-isoleucine, a precursor of 2-ketobutyrate is used.
  • a smooth supply of the L-threonine used should reduce production of other branched chain amino acids and allow for continued L-isoleucine synthesis.
  • L-isoleucine producing microorganisms studied so far have separate resistance to some substances of the L-isoleucine biosynthetic pathway, so that various substances related to feedback regulation of L-isoleucine biosynthesis are There remains a need for the development of L-isoleucine producing microorganisms that are resistant to.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop L-isoleucine-producing microorganisms with better yields than conventional strains.
  • the present invention was completed by confirming to produce.
  • One object of the present invention is to provide a high yield of Corynebacterium glutamicum mutants for L-isoleucine production.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing L-isoleucine using the mutant strain.
  • Corynebacterium glutamicum mutants of the present invention have a common resistance to L-isoleucine, L-threonine and derivatives thereof, without receiving feedback inhibition to L-isoleucine, and the precursor L-tsu Sufficient supply of leonin has been achieved to improve the production capacity of L-isoleucine. Therefore, according to the method for producing L-isoleucine of the present invention using the microorganism, L-isoleucine can be produced with high efficiency and high yield.
  • FIG. 1 is a diagram showing the biosynthetic pathway of the same branched chain amino acid with the biosynthesis process of L-isoleucine, the final product of the present invention. As shown in FIG. 1, branched chain amino acids are produced through biosynthesis by the same enzyme.
  • the present invention provides a Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11248P for L-isoleucine production.
  • L-isoleucine is one of the essential amino acids structurally corresponding to the branched chain amino acids along with L- valine, L- leucine, HO 2 CCH (NH 2 ) CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 Phosphorus L-amino acid.
  • the mutant of the present invention has a resistance to the final product L-isoleucine or a derivative thereof to release the feedback inhibition, and has a resistance to the L-threonine derivative to release the feedback inhibition to provide sufficient precursor supply It is a novel microorganism with improved L-isoleucine production capacity.
  • the mutant of the present invention may preferably be resistant to L-isoleucine or derivatives thereof, L-threonine or derivatives thereof, and most preferably resistant to derivatives of L-isoleucine and L-threonine derivatives.
  • the term “derivative” refers to the inhibition of L-isoleucine or L-threonine from microorganisms by causing feedback inhibition in relation to the biosynthesis of L-isoleucine or the precursor L-threonine, the final product of the present invention.
  • L-isoleucine derivatives are 4-thiaisoleucine (thiaile) or isoleucine-hydroxamate (isoleucine-hydroxamate, ileHx)
  • L- threonine derivatives include ⁇ -amino- ⁇ -hydroxynorvaline ( ⁇ -amino- ⁇ -hydroxynorvaline, AHV) and the like, but is not limited thereto.
  • the mutant may be resistant to one or more substances selected from the group consisting of 4-thiaisoleucine, isoleucine-hydroxyxamate and ⁇ -amino- ⁇ -hydroxynorvaline, most preferably 4- It may be resistant to both thiisoleucine, isoleucine-hydroxyxamate and ⁇ -amino- ⁇ -hydroxynorvaline.
  • the present invention According to one embodiment of the present inventors selected a high concentration of L-isoleucine producer using the derivative.
  • L-threonine is used as a precursor of 2-ketobutyric acid for mass production of L-isoleucine
  • strains resistant to L-threonine are released from the inhibition of L-threonine. Since a sufficient supply of the precursor L- threonine is made, L-threonine derivatives were also used to select high concentrations of L-isoleucine producers.
  • the microbial mutant strain with improved production capacity of L-isoleucine selects the desired mutant strain by mutating the parent strain.
  • the mutagenesis of the microorganism may be carried out by various means well known in the art, and may use either a physical or chemical mutagenesis.
  • suitable chemical mutagens for the present invention include N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), diepoxybutane, ethylmethane Sulfonates, mustard compounds, hydrazine and nitrous acid, including but not limited to these compounds.
  • NMG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • diepoxybutane diepoxybutane
  • ethylmethane Sulfonates mustard compounds
  • hydrazine and nitrous acid including but not limited to these compounds.
  • physical mutagens may include, but are not limited to, ultraviolet and gamma radiation.
  • the parent strain is affected by mutagenesis at a concentration sufficient to leave a certain size of surviving population.
  • the size varies with the type of mutagenesis and is dependent on the amount of mutation that the mutagenesis causes in the living population at a constant killing rate.
  • the desired killing rate should leave approximately 10% to 50% of the starting population.
  • Mutagenesis by nitrous acid should leave approximately 0.01% to 0.1% of the starting population and mutagenesis by ultraviolet light should leave approximately 1.0%.
  • NTG was used as a method for inducing mutations in the parent strain to produce microbial mutants with improved L-isoleucine production capacity.
  • Corynebacterium glutamicum KFCC 11040 Corynebacterium glutamicum KFCC 11040, Korean Patent Publication No. 2000-0002407) for producing glutamic acid in order to produce a mutant strain with improved production capacity of L-isoleucine Used as parent strain.
  • L-isoleucine derivative 4-thiaisoleucine thiaile
  • isoleucine-hydroxyxamate ileHx
  • selected common resistance mutants with resistance at concentrations of 1 mM, 1 mg / ml and 25 mg / ml for each were named KCJI-38.
  • the common resistance mutant strain was confirmed that the L- isoleucine production increased by more than 13 times compared to the parent strain (see Table 1).
  • Corynebacterium glutamicum mutant ( Corynebacterium glutamicum, KCJI-38) was sent to the Korea Microbiological Conservation Center, an international depository institution located at Yurim Building, 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, on January 9, 2012. The deposit was given accession number KCCM11248P.
  • the present invention provides a method for producing L-isoleucine comprising the step of culturing the mutant strain.
  • the method for preparing L-isoleucine may further include recovering L-isoleucine from the culture medium in which the mutant strain is cultured.
  • culture in the present invention means to grow microorganisms under appropriate artificial control of environmental conditions.
  • the method of culturing Corynebacterium glutamicum mutants to produce L-isoleucine can be carried out using a method of culturing Corynebacterium glutamicum, which is well known in the art.
  • examples of the culture method include, but are not limited to, batch culture, continuous culture, and fed-batch culture.
  • Various such methods are disclosed, for example, in “Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, (1991) pp138-176).
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner.
  • Culture media for Corynebacteria strains are known (e.g., Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981).
  • Sugar sources that may be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that may be used may include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture. Personnel that may be used may include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • the culture medium should contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth. In addition to these substances, essential growth substances such as amino acids and vitamins may be included.
  • precursors suitable for the culture medium may be used. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C. Incubation is continued until the desired amount of L-isoleucine production is achieved. For this purpose it is usually achieved in 10 to 160 hours.
  • L-isoleucine may be excreted in the culture medium or contained in the cells.
  • L-isoleucine production method of the present invention comprises the step of recovering L-isoleucine from cells or culture.
  • Methods for recovering L-isoleucine from cells or cultures may include, but are not limited to, methods known in the art, such as centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC.
  • the culture was centrifuged at low speed to remove the biomass and the obtained supernatant was separated by liquid high-speed chromatography.
  • the present invention comprises the step of selecting a variant strain resistant to L-isoleucine derivatives and L- threonine derivatives in Corynebacterium glutamicum, Coryne for L-isoleucine production
  • a method for producing bacterium glutamicum mutant strain Provided is a method for producing bacterium glutamicum mutant strain.
  • the parent strain Corynebacterium glutamicum may be a native or mutant strain.
  • the mutation can be made by performing a mutation method.
  • L-isoleucine derivatives, L-threonine derivatives and mutation methods are as described above.
  • the method of preparing a mutant strain can select a higher yield of Corynebacterium glutamicum mutants than the existing strains by selecting mutants having resistance at the same time both L-isoleucine derivatives and L-threonine derivatives.
  • the present invention provides the use of L-isoleucine production of Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11248P.
  • the microorganisms were induced using the following method.
  • the parent strain Corynebacterium glutamicum KFCC 11040 ( Corynebacterium glutamicum KFCC 11040, Republic of Korea Patent Publication No. 2000-0002407) was incubated for 16 hours in an activated medium and incubated for 14 hours by inoculating the activated strain in a sterilized seed medium at 121 °C for 15 minutes, and then recovered 5 ml of the culture solution It was.
  • the recovered culture was washed with 100 mM citric acid buffer, and then NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) was added to a final concentration of 200 mg / l, followed by 20 minutes of treatment. And washed with 100 mM phosphate buffer.
  • the mortality rate was 85% when NTG-treated strains were plated on the minimum medium.
  • the NTG-treated strains were converted to thiaile, ileHx to obtain common resistance mutants against 4-thiaisorusine (thiaile), isoleucine-hydroxyxamate (ileHx) and ⁇ -amino- ⁇ -hydroxynorvaline (AHV).
  • thiaile 4-thiaisorusine
  • ileHx isoleucine-hydroxyxamate
  • AHV ⁇ -amino- ⁇ -hydroxynorvaline
  • the final concentration of AHV 1 mM, 1 mg / ml, 25 mg / ml was added to a minimum medium added to each, and cultured at 30 °C for 5 days, to obtain a common resistance mutant strain of thiaile, ileHx and AHV.
  • the mutant strain obtained by the above method was named Corynebacterium glutamicum KCJI-38 ( Corynebacterium glutamicum, KCJI-38), and was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center on January 9, 2012 and was given accession number KCCM11248P.
  • composition of the medium used in Examples 1 and 2 is as follows.
  • Glucose 1.0%, Ammonium Sulfate 0.4%, Magnesium Sulfate 0.04%, Potassium Phosphate 0.1%, Urea 0.1%, Thiamine 0.001%, Biotin 200 ⁇ g / L, Agar 2%, pH 7.2
  • Example 1 The high concentration of thiaile, ileHx and AHV common resistance mutants obtained in Example 1 were cultured in the following manner to confirm the L-isoleucine productivity of Corynebacterium glutamicum KCJI-38 (KCCM11248P).
  • L-isoleucine was prepared by inoculating the mother strain and the mutant strain in a 250 ml corner-bottom flask containing 25 ml of the production medium, followed by shaking culture at 200 rpm for 30 hours at 30 ° C.
  • composition of the production medium used in Example 2 is as follows.
  • Glucose 10% Yeast Extract 0.2%, Ammonium Sulfate 1.6%, Potassium Monophosphate 0.1%, Magnesium Sulfate 0.1%, Ferrous Sulfate 10 mg / L, Manganese Sulfate Monohydrate 10 mg / L, Biotin 200 ⁇ g / l, pH 7.2
  • the parent strain Corynebacterium glutamicum KFCC 11040 (Korean Patent Publication No. 2000-0002407) produced L-isoleucine at a concentration of 0.1 g / L
  • Variation strain Corynebacterium glutamicum KCJI-38 (KCCM11248P) according to the present invention produces L-isoleucine at a concentration of 1.3 g / L, which increases the productivity of L-isoleucine by at least about 13 times that of the parent strain. Confirmed.
  • the results show that the mutant strains resistant to L-isoleucine derivatives are not subject to feedback inhibition as a result, and that the mutant strains resistant to L-threonine derivatives can supply L-isoleucine with high efficiency. And high yield.

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Abstract

본 발명은 L-이소루신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-이소루신의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 L-이소루신 및 L-쓰레오닌의 유도체에 대해 내성을 가지는 L-이소루신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 변이주 및 이를 이용한 L-이소루신 제조방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-이소루신 제조방법
본 발명은 L-이소루신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-이소루신의 제조방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 단위로써 기능성 식품 첨가제, 동물 영양 보급 및 약학 산업에 널리 이용되고 있다. 총 20가지의 아미노산 중 분지쇄 아미노산 (branched-chain amino acid)은 L-발린, L-루신, L-이소루신 3종을 지칭하는 것으로 산업적으로 가치가 점차 높아지고 있다. 분지쇄 아미노산은 인체 내 골격간을 유지하고 형성하는데 있어 중요한 기능을 하며, 인슐린 조절 및 근육의 유지와 증량에 기능성이 있다고 보고된 바 있다 (Andrea tom et al, (2006) The journal of nutrition, 136, 324s-330s). 특히, L-이소루신은 근육에서 대사되어 에너지를 생성하며, 헤모글로빈의 생성에 관여하여 피로 경감과 성장 촉진 기능을 한다. 이에 따라, 수액제제 및 영양제로 다양하게 이용되고 스포츠 영양식품에도 사용이 증가되고 있다.
L-이소루신을 산업적으로 생산하기 위해서는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum)이 대표적인 미생물로 이용되고 있다. 이 미생물은 피루브산 (pyruvate)과 2-케토부티르산 (2-ketobutyrate)을 전구체로 사용하여 3개의 중간대사물질을 거쳐 L-이소루신을 합성하게 된다 (도 1 참조). 상기 두 개의 전구체로부터 2-아세토-2-하이드록시부티르산 (2-aceto-2-hydroxybutyrate)을 합성하고, 2,3-디하이드록시-3-메틸발레르산 (2,3-dihydroxy-3-methylvalerate)과 2-케토-3-메틸발레르산 (2-keto-3-methylvalerate)을 거쳐 최종적으로 L-이소루신을 생산한다. 각각의 중간대사물질을 합성하기 위해서는 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase), 아세토하이드록시산 아이소머리덕타제 (acetohydroxy acid isomeroreductase), 디하이드록시산 디하이드라타제 (dihydroxy acid dehydratase), 그리고 아미노트랜스퍼라제 (aminotransferase)라는 효소가 이용된다 (Jin hwan park et al, Appl microbial biotechnol, (2010) 85:491-506).
코리네박테리움 글루타미컴 균주에서 L-이소루신의 생합성 단계에서 중요한 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase)는 ilvBN 유전자가 인코딩하고 있으며, 최종 산물인 L-이소루신에 의해서 유전자의 발현 및 효소의 활성이 저해되는 피드백 억제 작용을 받는다. 또한, 2-케토부티르산 (2-ketobutyrate)을 생성하는 쓰레오닌 디하이드라타제 (threonine dehydratase)도 L-이소루신에 의해 피드백 억제를 받고 있어, L-이소루신 생합성에 관련된 유전자의 발현조절 및 효소의 활성을 조절하는 것이 고수율의 L-이소루신 생산 균주를 만드는데 중요한 요소로 알려져 있다 (Jin hwan park et al, Biotechnology journal, (2010) 560-577). 이와 더불어 도 1에서 보듯이 L-이소루신, L-발린, L-루신은 동일한 생합성 경로를 통해 생성되기 때문에, L-이소루신을 대량 생산하기 위해서는 2-케토부티르산 (2-ketobutyrate)의 전구체로 사용되는 L-쓰레오닌의 원활한 공급이 이루어져야 다른 분지쇄 아미노산의 생산을 감소시키고, 지속적인 L-이소루신 합성이 가능하다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, L-쓰레오닌 유도체인 α-아미노-β-하이드록시노르발린 (α-amino-β-hydroxynorvaline)을 이용하여 L-쓰레오닌의 생산능을 높인 문헌이 있으며 (Cayo ramos et al, Applied and environmental microbiology, (1992) 1677-1682), L-쓰레오닌 생성능을 가진 미생물에 L-이소루신 생산능을 부여하는 방법 (대한민국특허 공개번호 제2011-0058731호), L-쓰레오닌 및 L-이소루신을 동시 생산하는 미생물 (대한민국특허 공개번호 제2002-0013777호)등의 선행특허 들이 있다. 그리고 이소루신 유도체인 4-티아이소루신 (4-thiaisoleucine)을 이용하여 쓰레오닌 디하이드라타제 (threonine dehydratase)의 피드백 억제 (John J. wasmuth, Journal of bacteriology, (1973) 562-570)를 확인한 문헌과 이소루신-하이드록사메이트 (isoleucine-hydroxamate)에 내성을 갖는 변이주를 얻어 L-이소루신 생성능을 향상시켰다는 보고가 있으며 (M. kisumi, Journal of general microbiology, (1971) 69 291-297), L-이소루신 생산 균주에 변이를 주어 L-발린의 생성보다는 L-이소루신 생성효율을 높인 AHAS개발 방법 (대한민국 공개번호 제2011-0061780호), L-이소루신의 생산 방법을 개선하기 위하여 산소의 공급, 또는 발효 시 pH와 같은 물리적 조건의 변화를 통해 수율을 향상시킨 연구가 발표되었다 (Zhihian peng et al, Bioprocess biosyst eng, (2010) 33:339-345).
그러나, 현재까지 연구 개발된 L-이소루신 생산 미생물들의 경우, L-이소루신 생합성 경로의 일부 물질들에 대해 각각 분리된 내성을 갖고 있어, L-이소루신 생합성의 피드백 조절에 관계하는 다양한 물질들에 내성을 갖는 L-이소루신 생산 미생물의 개발 필요성이 여전히 남아 있다.
본 발명자들은 종래의 균주들보다 수율이 우수한 L-이소루신 생산 미생물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, L-쓰레오닌 유도체인 α-아미노-β-하이드록시노르발린 (α-amino-β-hydroxynorvaline) 및 L-이소루신 유도체인 4-티아이소루신 (4-thiaisoleucine), 이소루신-하이드록사메이트 (isoleucine-hydroxamate)에 대해 공통내성을 부여한 결과, 이로부터 얻어진 변이주가 높은 수율로 L-이소루신을 생산하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 고수율의 L-이소루신 생산용 코리네박테리움 글루타미컴 변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 변이주를 이용하여 L-이소루신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 코리네박테리움 글루타미컴 중에서 고수율의 L-이소루신 생산용 변이주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는, L-이소루신, L-쓰레오닌 및 이의 유도체에 대한 공통 내성을 가짐으로써 L-이소루신에 대한 피드백 저해를 받지 않고, 전구체인 L-쓰레오닌의 충분한 공급이 이루어져, L-이소루신의 생산능이 향상되어 있다. 따라서, 상기 미생물을 이용하는 본 발명의 L-이소루신 제조방법에 의하면, L-이소루신을 고효율 및 고수율로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 최종산물인 L-이소루신의 생합성 과정과 함께 같은 분지쇄 아미노산의 생합성 경로를 나타내는 도이다. 도 1에 나타낸 것처럼 분지쇄 아미노산들은 동일한 효소에 의한 생합성 과정을 거쳐 생성되고 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 L-이소루신 생산용 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11248P를 제공한다.
본 발명에서 용어, "L-이소루신"은 필수 아미노산의 하나로 구조적으로 L-발린, L-루신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3인 L-아미노산을 의미한다.
한편, 미생물에 있어서, L-이소루신의 생합성은 도 1에 나타낸 바와 같이, 피루브산 (pyruvate) 과 2-케토부티르산 (2-ketobutyrate)을 전구체로 4단계의 생합성 과정을 거쳐 합성된다. 그러나, 상기 생합성 단계들은 나머지 분지쇄 아미노산, 즉 L-발린, L-루신의 생합성에도 공통적으로 사용되고, L-이소루신의 생합성에 필요한 전구체인 L-쓰레오닌의 충분한 공급도 이루어져야 하기 때문에 발효를 통해 L-이소루신을 대량 제조하는데 문제점이 있었다. 본 발명의 변이주는 최종 산물인 L-이소루신 또는 이의 유도체에 대한 내성을 가져 피드백 저해가 해제되고, L-쓰레오닌 유도체에 대한 내성을 가져 피드백 저해가 해제되어 충분한 전구체 공급이 이루어 짐으로 인하여, L-이소루신 생산능이 향상된 신규한 미생물이다.
본 발명의 상기 변이주는 바람직하게 L-이소루신 또는 이의 유도체, L-쓰레오닌 또는 이의 유도체에 내성을 가질 수 있으며, 가장 바람직하게는 L-이소루신의 유도체 및 L-쓰레오닌 유도체에 내성을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "유도체"는 본 발명의 최종산물인 L-이소루신 또는 전구체인 L-쓰레오닌의 생합성에 관련하여 피드백 저해를 유발하여 미생물로부터 L-이소루신 또는 L-쓰레오닌의 생산능을 저해시킬 수 있는 공지된 화합물들을 의미할 수 있으며, 그 예로 L-이소루신 유도체는 4-티아이소루신 (4-thiaisoleucine, thiaile) 또는 이소루신-하이드록사메이트 (isoleucine-hydroxamate, ileHx)이고, L-쓰레오닌 유도체는 α-아미노-β-하이드록시노르발린 (α-amino-β-hydroxynorvaline, AHV) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게 상기 변이주는 4-티아이소루신, 이소루신-하이드록사메이트 및 α-아미노-β-하이드록시노르발린으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 물질에 내성을 가질 수 있으며, 가장 바람직하게는 4-티아이소루신, 이소루신-하이드록사메이트 및 α-아미노-β-하이드록시노르발린 모두에 내성을 가질 수 있다.
일반적으로 세포 내에서 일정 농도 이상의 L-이소루신이 축적되면 L-이소루신 생합성이 저해된다고 알려져 있다. 따라서, 상기 유도체에 대해 내성을 갖는 균주는 L-이소루신에 의한 저해가 해제되어 고농도의 L-이소루신을 포함하는 조건에서도 L-이소루신을 생성할 수 있는 능력을 갖는 균주이기 때문에, 본 발명의 일 구현 예에 따르면 본 발명자들은 상기 유도체를 이용하여 고농도의 L-이소루신 생산주를 선별하였다. 또한, L-쓰레오닌은 L-이소루신을 대량 생산하기 위한 2-케토부티르산의 전구체로 사용되므로, L-쓰레오닌에 대해 내성을 갖는 균주는 L-쓰레오닌에 의한 저해가 해제되어 전구체인 L-쓰레오닌의 충분한 공급이 이루어지므로 L-쓰레오닌 유도체 역시 고농도의 L-이소루신 생산주를 선별하는 데 사용하였다.
본 발명에 의하면, L-이소루신의 생산능이 향상된 미생물 변이주는 모균주를 돌연변이시켜 원하는 변이주를 선택한다. 이때, 미생물의 돌연변이 유발은 해당 분야에서 널리 알려진 다양한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 혹은 화학적 돌연변이 발생 둘 중의 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적합한 화학적 돌연변이 유발 요인으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG), 디에폭시부탄, 에틸메탄 설폰에이트, 머스타드 화합물, 히드라진 및 아질산을 포함하는데, 이러한 화합물들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 물리적 돌연변이 유발 요인은 자외선 및 감마 방사선을 포함할 수 있는데, 이에 제한받는 것은 아니다.
돌연변이 유발 시에 모균주는 특정 크기의 생존 개체군을 남겨둘 정도의 농도에서 돌연변이 유발 인자에 의해 영향을 받는다. 상기 크기는 돌연변이 유발 인자들 종류에 따라 변화하며, 돌연변이 인자가 일정한 살생율로 생존 개체군내에 유발하는 돌연변이의 양에 의존한다. 예를 들어, NTG의 경우 바람직한 살생율은 출발 개체군의 10% 내지 50%를 대략적으로 남겨두어야 한다. 아질산에 의한 돌연변이 발생은 출발 개체군의 0.01% 내지 0.1%를 대략적으로 남겨두어야 하며, 자외선에 의한 돌연변이 발생은 대략 1.0%을 남겨두어야 한다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면, L-이소루신 생산능이 향상된 미생물 변이주를 제작하기 위해 모균주의 돌연변이를 유발하기 위한 방법으로 NTG를 사용하였다.
본 발명의 일 구현 예에서는 L-이소루신의 생산능이 향상된 변이주를 제작하기 위해서 글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11040 (Corynebacterium glutamicum KFCC 11040, 대한민국특허 공개번호 제2000-0002407호)를 모균주로 사용하였다. 상기 모균주에 무작위 돌연변이를 수행한 후, L-이소루신 유도체인 4-티아이소루신 (thiaile), 이소루신-하이드록사메이트 (ileHx)와 L-쓰레오닌 유도체인 α-아미노-β-하이드록시노르발린 (AHV)이 함께 첨가된 최소배지에 도말하여 각각에 대해 1 mM, 1 mg/㎖, 25 mg/㎖ 농도에 내성을 가지는 공통 내성 변이주를 선별하여 KCJI-38로 명명하였다. 아울러, 상기 공통 내성 변이주는 모균주에 비해 L-이소루신 생산량이 13배 이상 증가한 것을 확인하였다 (표 1 참조). 상기 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 (Corynebacterium glutamicum, KCJI-38)를 2012년 1월 9일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지의 유림빌딩에 소재하는 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11248P를 부여받았다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이주를 배양하는 단계를 포함하는 L-이소루신 제조방법을 제공한다.
바람직하게 L-이소루신 제조방법은 상기 변이주를 배양한 배양액으로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 L-이소루신을 생산하기 위해 코리네박테리움 글루타미컴 변이주를 배양하는 방법은 당업계에 널리진 알려져 있는 코리네박테리움 글루타미컴의 배양 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양 (batch culture), 연속식 배양 (continuous culture) 및 유가식 배양 (fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 방법은, 예를 들면, “Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, (1991) pp138-176) 등에 개시되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 그 외에, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 원하는 L-이소루신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-이소루신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 L-이소루신 제조방법은, 세포 또는 배양물로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양물로부터 L-이소루신을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 액체고속크로마토그래피를 통하여 분리하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴 중 L-이소루신 유도체 및 L-쓰레오닌 유도체에 내성을 가지는 변이주를 선별하는 단계를 포함하는, L-이소루신 생산용 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 제조방법을 제공한다.
상기 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴은 천연형 또는 돌연변이 균주일 수 있다.
바람직하게, 상기 변이주는 돌연변이 방법을 수행하여 이루어질 수 있다.
L-이소루신 유도체, L-쓰레오닌 유도체 및 돌연변이 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 변이주 제조방법은 L-이소루신 유도체 및 L-쓰레오닌 유도체 모두 동시에 내성을 가지는 변이주를 선별하여 기존 균주보다 고수율의 코리네박테리움 글루타미컴 변이주를 선별할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 KCCM11248P의 L-이소루신 생산 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인공변이법을 통한 변이주 선별
L-이소루신의 생산능이 향상된 미생물 변이주를 얻기 위해 하기와 같은 방법을 사용하여 미생물의 변이를 유도하였다.
구체적으로, 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11040 (Corynebacterium glutamicum KFCC 11040, 대한민국특허 공개번호 제2000-0002407호)을 활성화배지에서 16시간 동안 배양하여 활성화된 균주를 121℃에서 15분간 멸균한 종배지에 접종하여 14시간 동안 배양한 후, 배양액 5 ㎖을 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액 (citric buffer)으로 세척한 후, NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 200 mg/ℓ가 되게 첨가한 후, 20분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액 (phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG가 처리된 균주를 최소배지에 도말하여 사멸율을 구해본 결과 사멸율은 85%였다.
4-티아이소루신 (thiaile), 이소루신-하이드록사메이트 (ileHx) 및 α-아미노-β-하이드록시노르발린 (AHV)에 대한 공통 내성 변이주를 구하기 위해서 상기 NTG가 처리된 균주를 thiaile, ileHx, AHV의 최종농도가 각각 1 mM, 1 mg/㎖, 25 mg/㎖이 되게 첨가된 최소배지에 도말하고, 30℃에서 5일간 배양하여, thiaile, ileHx 및 AHV의 공통 내성 변이주를 획득하였다.
상기의 방법으로 얻어진 변이주는 코리네박테리움 글루타미컴 KCJI-38 (Corynebacterium glutamicum, KCJI-38)로 명명하였고, 2012년 1월 9일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11248P를 부여받았다.
실시예 1 및 2에서 사용한 배지의 조성은 하기와 같다.
<활성화배지>
육즙 1%, 폴리펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.5%, 효모추출물 1%, 한천 2%, pH 7.2
<종배지>
포도당 5%, 박토펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.25%, 효모추출물 1%, 요소 0.4%, pH 7.2
<최소배지>
포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.001%, 비오틴 200 ㎍/L, 한천 2%, pH 7.2
실시예 2: L-이소루신 생산용 변이주의 L-이소루신 생산성 조사
상기 실시예 1에서 얻어진 고농도 thiaile, ileHx 및 AHV 공통 내성 변이주인 코리네박테리움 글루타미컴 KCJI-38 (KCCM11248P)의 L-이소루신 생산성을 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양하였다.
생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 30℃에서 60시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소루신을 제조하였다.
본 실시예 2에서 사용한 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10 mg/ℓ, 황산망간1수염 10 mg/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH 7.2
배양종료 후, 액체고속크로마토그래피를 이용하여 L-이소루신의 생산량을 측정하였고, 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소루신 농도는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1 모균주와 KCJI-38 (KCCM11248P)의 L-이소루신 생산성 비교
코리네박테리움 글루타미컴KFCC 11040 (모균주) 코리네박테리움 글루타미컴KCJI-38 (변이주)
L-이소루신 농도(g/ℓ) 0.1 1.3
그 결과, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 11040 (대한민국특허 공개번호 제2000-0002407호)은 0.1 g/ℓ의 농도로 L-이소루신을 생산하였으나, 본 발명에 따른 변이주 코리네박테리움 글루타미컴 KCJI-38 (KCCM11248P)은 1.3 g/ℓ의 농도로 L-이소루신을 생산하여, 모균주에 비해 약 13배 이상 L-이소루신 생산성이 증가한 것을 확인하였다.
상기의 결과는 L-이소루신 유도체들에 대한 내성을 갖는 변이주가 결과적으로 피드백 저해를 받지 않으며, L-쓰레오닌 유도체에 대한 내성을 갖는 변이주가 전구체의 공급이 원활하여 L-이소루신을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 의미한다.
Figure PCTKR2013005145-appb-I000001

Claims (8)

  1. L-이소루신 생산용 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11248P.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이주는 L-이소루신, L-쓰레오닌, 및 이의 유도체에 대해 내성을 가지는 것인 변이주 KCCM11248P.
  3. 제2항에 있어서, 상기 L-이소루신 유도체는 4-티아이소루신 (4-thiaisoleucine, thiaile) 또는 이소루신-하이드록사메이트 (isoleucine-hydroxamate, ileHx)이며, L-쓰레오닌 유도체는 α-아미노-β-하이드록시노르발린 (α-amino-β-hydroxynorvaline, AHV)인 변이주 KCCM11248P.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이주 KCCM11248P를 배양하는 단계를 포함하는 L-이소루신 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 변이주 KCCM11248P의 배양액으로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 배양온도는 20 내지 45℃, 호기적 조건하에서 10 내지 160 시간 동안 배양되는 것인 제조방법.
  7. 코리네박테리움 글루타미컴 중 L-이소루신 유도체 및 L-쓰레오닌 유도체에 내성을 가지는 변이주를 선별하는 단계를 포함하는, L-이소루신 생산용 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 변이주 선별은 돌연변이 방법에 의한 것인 제조방법.
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