KR20020013777A

KR20020013777A - 트레오닌 및 이소류신의 제조방법

Info

Publication number: KR20020013777A
Application number: KR1020010048292A
Authority: KR
Inventors: 미야타유리; 나카이유타; 나카니시가즈오; 이토히사오; 고지마히로유키; 구라하시오사무
Original assignee: 에가시라 구니오; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2002-02-21
Also published as: EP1179597B1; DK1179597T3; CN1355295A; US20020110876A1; JP2002051787A; EP1179597A1; CA2354103A1; JP4265093B2; SK287403B6; CA2354103C; AU780300B2; CN1210397C; MXPA01008183A; DE60128754T2; SK11492001A3; KR100823044B1; AU5774101A; BR122012033754B1; BR0103319B1; DE60128754D1

Abstract

L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생산 능력을 가지며 세포내 포스포에놀피루베이트 카복실라제 활성 및 트랜스하이드로게나제 활성이 증진된 에스케리치아(Escherichia) 속에 속하는 세균을 배지에서 배양하여 배지에 트레오닌 또는 이소류신을 생성 및 축적한 다음 배지로부터 트레오닌 또는 이소류신을 수거함으로써 트레오닌 또는 이소류신을 제조한다.

Description

트레오닌 및 이소류신의 제조방법{Method for producing threonine and isoleucine}

본 발명은 발효 산업에 사용되는 기술에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생성하는 에스케리치아 속에 속하는 세균 및 이 세균을 사용하여 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-트레오닌 및 L-이소류신과 같은 L-아미노산의 산업적 생산은 통상적으로 L-아미노산의 생산 능력이 있는 코리네폼 세균 및 에스케리치아 속에 속하는 세균과 같은 미생물을 이용한 발효 방법에 의해 이루어져 왔다. 이들 아미노산 생산 세균으로서, 천연에서 분리된 균주, 이의 인위적인 돌연변이 균주 또는 향상된 생산성을 획득하기 위해 유전자 재조합에 의해 L-아미노산 생합성 효소를 강화시킨 그의 재조합 균주가 사용되고 있다.

특정적으로, L-트레오닌을 제조하는 방법으로서, 일본 특허공개공보 제5-304969호에는 에스케리치아 속에 속하는 돌연변이 세균 균주를 사용한 방법이 기술되어 있고, 일본 특허공고공보 제1-29559호, 제2-109985호, 제56-15696호 및 일본 국제 특허공개공보 제3-501682호에는 재조합 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주를 사용한 방법이 기술되어 있으며, 일본 특허공개공보 제62-239996호에는 코리네박테리움(Corynebacterium) 세균의 돌연변이 균주를 사용한 방법이 기술되어 있고, 일본 특허공개공보 제61-195695호에는 코리네박테리움 세균의 돌연변이 균주를 사용한 방법이 기술되어 있다. 또한, 일본 특허공개공보 제55-131397호,제59-31691호, 제56-15696호 및 일본 국제 특허공개공보 제3-501682호에는 트레오닌 오페론을 함유한 재조합 플라스미드로 형질전환된 균주를 사용하여 L-트레오닌을 제조하는 방법이 기술되어 있다.

또한, L-이소류신의 제조 방법으로서, 일본 특허공개공보 제5-130882호에는 에스케리치아 콜라이를 사용한 방법이 기술되어 있고, 일본 특허공개공보 제2-458호에는 에스케리치아 콜라이의 재조합 균주를 사용한 방법이 기술되어 있으며, 일본 특허공고공보 제3-62395호에는 코리네박테리움 세균의 돌연변이 균주를 사용한 방법이 기술되어 있고, 일본 특허공고공보 제5-47196호에는 코리네박테리움 세균의 재조합 균주를 사용한 방법이 기술되어 있다. 또한, L-이소류신 생성 능력은 감쇠(attenuation)에 필요한 영역이 제거되고 에스케리치아 콜라이로부터 유도된 아스파르토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제(L-트레오닌에 의한 억제가 실질적으로 탈감작됨)를 암호화하는 thrA 유전자 함유 thrABC 오페론을 도입하고 트레오닌 데아미나제(L-이소류신에 의한 억제가 실질적으로 탈감작됨)를 암호화하는 ilvA 유전자 함유 ilvGMEDA 오페론을 도입함으로써 부여될 수 있는 것으로 알려져 있다(참조: 일본 특허공개공보 제8-47397호).

한편, 에스케리치아 콜라이의 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자의 서열이 공지되어 있고(문헌 참조: Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki H. J. Biochem. 95, 909-916 (1984)) 아스파르트산에 의한 피드백 억제가 실질적으로 탈감작된 포스포에놀피루베이트 카복실라제 및 이의 유전자를 사용하는 방법이 공개되어 있다(문헌 참조: WO 95/06114). 또한, 코리네폼 세균의 L-글루탐산 생성 능력을 증진시키고자 하는 목적으로 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 강화하는 예가 공지되어 있다(일본 특허공개공보 제60-87788호). 또한, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 다른 효소 유전자와 함께 강화시킴으로써 아미노산 생성 능력을 향상시키는 기술이 공개된 바 있다. 예를 들면, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 유전자가 결실된 코리네폼 세균에서 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자, 시트레이트 신쎄타제 유전자 및 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 강화시킴으로써 L-글루탐산 생성 능력을 증가시킨 사례가 보고되었다(문헌 참조: WO 96/06181). 에스케리치아 콜라이의 경우, 야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자가 트레오닌 오페론을 함유한 재조합 플라스미드로 형질전환된 에스케리치아 콜라이 VKPM B-3996(=BKIIM B-3996)의 L-트레오닌 생성 균주내로 도입되었을지라도 L-트레오닌 생성 능력이 유의적으로 증가되지 않았다는 것이 공개되었다(문헌 참조: WO 95/06114).

또한, 아미노산과 같은 물질을 생성하는 능력이 미생물 세포에서 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제(또한 이하에서 "트랜스하이드로게나제"라고도 한다)의 효소 활성을 증가시키고 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트 생성 능력을 증대시킴으로써 향상될 수 있음이 공개된 바 있다(문헌 참조: WO 95/11985). 이 특허 문헌에는 또한 트레오닌 오페론을 함유한 재조합 플라스미드로 형질전환된 에스케리치아 콜라이에서 트랜스하이드로게나제 유전자를 강화함으로써 L-트레오닌 생성 능력을 개선한 예가 기술되어 있다. 트랜스하이드로게나제 활성의 증가로 인해 생산성이 향상된 아미노산으로서 L-이소류신이 언급되었다.

본 발명의 목적은 에스케리치아 속에 속하는 세균의 L-트레오닌 또는 L-이소류신 생성 능력을 향상시키는데 있다.

본 발명자들은 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생성 능력이 포스포에놀피루베이트 카복실라제 활성과 트랜스하이드로게나제 활성 둘 다를 증강시킴으로써 현저히 증가되었음을 발견하였고 또한 생성 능력이 아스파르타제 활성을 증강시킴으로써 추가로 향상되었음을 발견하였다. 이에 따라 본 발명자들은 본 발명을 달성하였다.

즉, 본 발명은 다음의 것을 제공한다.

(1) L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생성 능력을 갖고 세포내 포스포에놀피루베이트 카복실라제 활성과 트랜스하이드로게나제 활성이 증강된 에스케리치아 속에 속한 세균.

(2) 트레오닌 오페론 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 효소 또는 효소들의 활성이 증강되고 L-트레오닌 생성 능력을 가진, (1)에 따른 에스케리치아 속에 속한 세균.

(3) 트레오닌 오페론이 thrABC로 이루어진, (2)에 따른 에스케리치아 속에 속한 세균.

(4) ilv 오페론 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 효소 또는 효소들의 활성이 증강되고 L-이소류신 생성 능력을 가진, (1)에 따른 에스케리치아 속에 속한 세균.

(5) 아스파르타제 활성이 증강된, (1) 내지 (4)중 어느 하나에 따른 에스케리치아 속에 속한 세균.

(6) 각 효소의 활성이 각 효소를 암호화한 유전자 또는 오페론의 복제수를 증가시키거나 유전자 또는 오페론의 세포내 발현이 증가되도록 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 증강된, (1) 내지 (5)중 어느 하나에 따른 에스케리치아 속에 속한 세균.

(7) 유전자 에스케리치아 속에 속한 세균으로부터 유도된, (6)에 따른 에스케리치아 속에 속한 세균.

(8) (1) 내지 (7)중 어느 하나에 따른 에스케리치아 속에 속한 세균을 배지에서 배양하여 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 배지에 생성하고 축적하며 배지로부터 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 수거함을 포함하여 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 제조하는 방법.

본 발명에 따라, 에스케리치아 속에 속한 세균의 L-트레오닌 또는 L-이소류신 생성 능력이 향상될 수 있다.

도 1은 aspA 유전자를 함유한 플라스미드 pMW118::aspA의 작제도이다.

도 2는 pntAB 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pPTS)의 작제도이다.

도 3은 aspA 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pAPW)의 작제도이다.

도 4는 aspA 유전자, pntAB 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pAPT)의 작제도이다.

도 5는 플라스미드 pHSGSK의 작제도이다.

도 6은 플라스미드 pdGM1의 작제도이다.

도 7은 플라스미드 pMWGMA2의 작제도이다.

도 8은 플라스미드 pMWD5의 작제도이다.

도 9는 pMWD5-aspA, pMWD5-THY, pMWD5-ppc, pMWD5-PTS 및 pMWD5-APT의 작제도이다.

이하에서 본 발명은 상세히 설명될 것이다.

본 발명의 에스케리치아 속에 속하는 세균은 L-트레오닌 또는 L-이소류신의생성 능력을 가지며 세포내 포스포에놀피루베이트 카복실라제(이하 PEPC로 약칭) 활성 및 트랜스하이드로게나제(이하 THT로 약칭) 활성이 증강된 에스케리치아 속에 속한 세균이다.

에스케리치아 속에 속한 세균으로서, 특정적으로 문헌[참조: Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, 표 1]에 기술된 세균이 사용될 수 있다. 예를 들면, 에스케리치아 콜라이가 언급될 수 있다.

본원에 사용된 표현 "L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생성 능력을 갖는"은 해당 세균이 배지에서 배양될 때 배지에 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 축적하는 능력을 나타냄을 의미한다. 이러한 L-트레오닌 또는 L-이소류신 생성 능력은 야생 균주에 의해 보유된 특성이거나 균주 개량에 의해 부여된 또는 증강된 특성일 수 있다.

본 발명의 에스케리치아 속에 속한 세균에서 세포내 아스파르타제(L-아스파르테이트 암모니아-라이아제, 이하에서 AspA라고 언급됨) 활성이 또한 증강될 수 있다.

에스케리치아 속에 속한 세균에서 PEPC, THY 또는 AspA의 활성을 증강시키기 위해 PEPC, THY 또는 AspA를 암호화한 유전자를 적합한 플라스미드에 클로닝시키고 수득된 플라스미드로, 숙주로 역할을 하는 에스케리치아 속에 속한 세균을 형질전환시킬 수 있다. 이것은 형질전환체에서 PEPC, THY 또는 AspA를 암호화하는 유전자(이하에서 각각 "ppc 유전자", "pntAB 유전자" 및 "apsA 유전자"로서 약칭)의 복제수를 증가시키며, 결과로서 PEPC, THY 또는 AspA의 활성이 증강된다.

ppc 유전자, pntAB 유전자 및 apsA 유전자는 ppc 유전자와 pntAB 유전자의 조합으로서 또는 이들 유전자와 aspA 유전자의 조합으로서 에스케리치아 속에 속한 세균내로 도입된다. 이들 유전자는 2개 또는 3개의 유전자가 클로닝된 한 종류의 플라스미드로서 또는 개개의 유전자가 개개의 플라스미드내에 클로닝되어 공존할 수 있는 둘 또는 세 종류의 플라스미드로서 숙주내로 도입될 수 있다.

PEPC, THY 또는 AspA 활성의 증강은 또한 숙주로서 역할을 하는 최초 모 균주의 염색체 DNA상에 ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자의 다수의 복제물이 존재하게 함으로써 달성될 수 있다. 에스케리치아 속에 속한 세균의 염색체 DNA내로 ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자의 다수의 복제물을 도입하기 위해 다수의 복제물의 서열은 염색체 DNA에 존재하는 서열, 예를 들면 반복(repetitive) DNA, 전이성(transposable) 요소의 말단에 존재하는 역방향반복(inverted repeats) 서열 등에 존재할 수 있다. 다른 방도로서, 트랜스포손내로 ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자를 삽입시키고 이의 이동이 이루어지도록 하여 각 유전자의 다수의 복제물이 염색체 DNA내에 생성되도록 할 수 있다. 어느 방법에 의해서든 형질전환 균주의 세포내에 ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자의 복제수는 증가하며 결과로서 PEPC, THY 또는 AspA 활성이 증강된다.

또한, PEPC, THY 또는 AspA 활성의 증강은 상기 언급된 유전자 증폭을 기초로한 것 이외에 프로모터와 같은 ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자의 발현 조절 서열을 더욱 강력한 조절 서열로 치환시킴으로써 달성될 수 있다(참조: 일본 특허공개공보 제1-215280호). 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지의 P_R프로모터 및 P_L프로모터, tet 프로모터, amyE 프로모터, spac 프로모터 등이 강력한 프로모터로 공지되어 있다. 이들 프로모터로의 치환은 ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자의 발현을 증가시키며 이에 따라 PEPC, THY 또는 AspA 활성이 증강된다. 발현 조절 서열의 증강은 ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자의 복제수 증가와 결부될 수 있다.

ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자의 공급원으로서의 유기체는 PEPC, THY 또는 AspA 활성을 갖는 모든 유기체일 수 있다. 특히 바람직한 것은 원핵 세포인 세균, 예를 들면, 엔테로박터, 클렙시엘라, 에르위니아, 세라티아, 에스케리치아, 코리네박테리움, 브레비박테리움 또는 바실러스 속에 속한 세균이다. 특정 예로서, 에스케리치아 콜라이가 언급될 수 있다. ppc 유전자, pntAB 유전자 또는 apsA 유전자는 상기 언급된 미생물의 염색체 DNA로부터 수득될 수 있다.

에스케리치아 콜라이의 ppc 유전자는 이 유전자를 갖는 플라스미드, 플라스미드 pS2(문헌 참조: Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)) 또는 pT2로부터 수득될 수 있다. pS2를 AatII 및 Af1II로 분해시킴으로써 ppc 유전자를 함유한 DNA 단편을 수득할 수 있다. 또한 ppc 유전자를 갖는 DNA 단편은 pT2를 SmaI 및 ScaI으로 분해시킴으로써 수득될 수 있다. pT2를 보유한 이. 콜라이 F15 균주(AJ12873)는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본 이바라키켄 쯔쿠바시 하기시1-쵸메 1-3, 우편번호: 305-8566)(현재, 독립 행정 법인으로서, 국제 특허 유기체 기탁기관인 내셔날 인스티튜트 오브 어드번스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지로 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 하기시 1-쵸메 1-1, 츄모 다이-6, 우편번호: 305-5466에 소재)에 1993년 7월 15일에 기탁되었고 수탁번호 FERM P-13752를 부여받았다. 그 후, 본 균주는 1994년 7월 11일에 부타페스트 조약의 규정에 따라 국제 기탁물로 이관되어 수탁번호 FERM BP-4732를 부여받았다.

pntAB 유전자는 이 유전자를 함유한 플라스미드 pMW::THY(WO 95/11985)를 SmaI 및 HindIII으로 분해시켜 수득될 수 있다. pMW::THY를 보유한 에스케리치아 콜라이 AJ12929 균주는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 하기시 1-쵸메 1-3, 우편번호: 305-8566)에 1993년 10월 4일에 기탁되었고 수탁번호 FERM P-13890을 부여받았다. 그 후, 본 균주는 1994년 9월 14일에 부타페스트 조약의 규정에 따라 국제 기탁물로 이관되어 수탁번호 FERM BP-4798을 부여받았다. 에스케리치아 콜라이의 트랜스하이드로게나제는 pntA 및 pntB에 의해 각각 암호화된 두 개의 서브유니트로 구성되어 있다.

본 발명의 에스케리치아 속에 속한 세균이 L-트레오닌 또는 L-이소류신 생성 능력을 갖는 한 특별히 제한되지 않는 한편 이의 특정 예로는 트레오닌 오페론 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 효소의 활성을 증강시킴으로써 L-트레오닌 생성 능력이 부여된 에스케리치아 속에 속한 세균 및 ilv 오페론 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 효소의 활성을 증강시킴으로써 L-이소류신 생성 능력이 부여된 에스케리치아 속에 속한 세균이 포함된다.

트레오닌 오페론 또는 이의 일부분은 예를 들면 thrABC 또는 이의 일부분일 수 있다. ilv 오페론 또는 이의 일부분은 예를 들면 ilvGMEDA 또는 이의 일부분일 수 있다.

L-트레오닌 생성 능력을 갖는 에스케리치아 콜라이로서 특별히 언급될 수 있는 것은 에스케리치아 콜라이 VKPM B-3996(러시아 모스크바 113105 나가틴스카야 스트리트 3-A 소재 올-유니온 사이언티픽 센터 오브 앤티바이오틱스에 1987년 11월 19에 기탁되어 RIA 1867의 등록 번호를 부여받음, 참조: 미국특허 제5,175,107호), 에스케리치아 콜라이 AJ11335(일본 특허공개공보 제55-131397호) 등이다. VKPM B-3996 균주는 트레오닌 생합성 시스템 유전자(트레오닌 오페론: thrABC)를 스트렙토마이신 내성 마커를 갖는 야생형 숙주-범위 벡터 플라스미드 pAYC32(참조: Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167)내로 삽입시켜 수득된 플라스미드 pVIC40(국제특허 공개공보 WO/04636)을 보유한다. 이 오페론내 thrA에 의해 암호화된 아스파르토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I의 L-트레오닌에 의한 피드백 억제는 탈감작된다.

L-이소류신 생성 능력을 갖는 에스케리치아 속에 속한 세균으로서, 에스케리치아 콜라이 KX141(VKPM B-4781, 참조: 유럽 특허 공개공보 제519,113호) 및 에스케리치아 콜라이 AJ12919(일본 특허 공개공보 제8-47397호)이 언급될 수 있다. ilv 오페론이 증폭된 VKPM B-3996 균주는 또한 바람직한 L-이소류신 생성 세균이다.

트레오닌 오페론은 thrA, thrB 및 thrC 유전자를 포함하며 이들은 각각 아스파토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I, 호모세린 키나제 및 트레오닌 신타제를 암호화한다. 이들 효소의 경우, L-트레오닌에 의한 아스파토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제의 억제가 실질적으로 탈감작되는 것이 바람직하다.

ilvGMEDA 오페론은 ilvG, ilvM, ilvE, ilvD 및 ilvA 유전자를 포함하며 이들은 각각 아세토하이드록시-산 신타제의 이소자임 II의 대형 서브유니트, 소형 서브유니트, 트랜스아미나제, 디하이드록시-산 데하이드라타제 및 트레오닌 데아미나제를 암호화한다. ilvGMEDA 오페론은 L-발린 및/또는 L-이소류신 및/또는 L-루이신에 의한 오페론의 발현 조절(감쇠)하에 있기 때문에, 생성된 L-이소류신에 의한 발현의 억제를 탈감작화하기 위해 그 감쇠에 필요한 영역을 L-이소류신 생성 균주에서 제거하거나 변이시킬 수 있다. ilvGMEDA 오페론으로서, 에스케리치아 속에 속한 세균으로부터 유도된 것, 특히 이. 콜라이로부터 유도된 ilvGMEDA 오페론이 언급될 수 있다. ilvGMEDA 오페론은 WO 96/26289에 상세히 기술되어 있다. ilvGMEDA 오페론의 경우, 감쇠에 필요한 영역을 제거하고 이 오페론에 의해 암호화된 효소가운데 L-이소류신에 의한 트레오닌 데아미나제의 억제가 실질적으로 탈감작되는 것이 바람직하다(참조: 일본 특허 공개공보 제8-47397호).

트레오닌 오페론 또는 ilv 오페론 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 효소의 활성 증강은 PEPC, THY 및 AspA에 대한 것과 동일한 방식으로 달성할 수 있다.

본 발명에 사용된 미생물에서, 표적 아미노산의 생합성에 연루된 경로를 담당하는 효소에 대한 유전자를 증강시키거나 피드백 억제되는 효소 가운데 탈감작된 유형(억제 탈감작된 유형)의 효소를 암호화하는 유전자 또는 오페론을 도입하는 경우, L-아미노산 생성 능력은 추가로 향상될 수 있다.

트레오닌 또는 이소류신은 PEPC 및 THY뿐만 아니라 필요에 따라 AspA가 상기된 바와 같이 증강되어 있고 배지에서 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생성하는 능력을 갖는 에스케리치아 속에 속한 세균을 배지에 배양하여 트레오닌 또는 이소류신을 생성 및 축적시키고 배지로부터 트레오닌 또는 이소류신을 수거함으로써 생성될 수 있다.

배양에 사용된 배지는 탄소원, 질소원, 무기이온 및 기타 요구되는 유기 성분을 함유한 통상적인 배지일 수 있다.

탄소원으로서, 글루코즈, 락토즈, 갈락토즈, 프럭토즈 및 전분 가수분해물과 같은 당; 글리세롤 및 솔비톨과 같은 알코올 또는 푸마르산, 시트르산 및 석신산과 같은 유기산을 사용할 수 있다.

질소원으로서, 황산암모늄, 염화암모늄 또는 인산암모늄과 같은 무기암모늄 염; 대두 가수분해물과 같은 유기 질소; 암노니아 가스 또는 수성 암모니아를 사용할 수 있다.

유기 미량 영양성분의 경우, 비타민 B₁, 효모 추출물 등과 같이 필요한 물질을 적절한 양으로 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 이외에 소량의 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등이 첨가된다.

배양은 바람직하게는 호기 조건하에서 16 내지 72시간 실시한다. 배양 온도는 25℃ 내지 45℃로 조절하고 pH는 배양동안에 5 내지 8로 조절한다. pH 조절을 위해 무기 또는 유기 산성 또는 알카리성 물질뿐만 아니라 암모니아 가스 등이 사용될 수 있다.

발효액으로부터 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 수거는 보통 이온 교환 수지 기술, 침전 및 기타 다른 기술을 조합하여 실시한다.

본 발명은 추가로 하기 실시예를 참고로 하여 이하에서 보다 구체적으로 설명될 것이다.

실시예 1: 여러 유전자를 함유한 플라스미드의 제조

(1) aspA 유전자를 함유한 플라스미드의 제조(pMW118::aspA)

aspA 유전자를 함유한 DNA 단편을 주형으로서 에스케리치아 콜라이 W3110 균주의 염색체 DNA를 사용하고 하기의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다:

프라이머 1: 5'-TGATCAGCGAAACACTTTTA-3' (서열 1)

프라이머 2: 5'-CAGCAAACTATGATGAGAA-3' (서열 2)

수득된 증폭 단편을 pMW118(니폰 진)의 SmaI 절단 부위내로 삽입하여 pMW118::aspA를 수득한다(도 1).

(2) pntAB 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pPTS)의 제조

WO95/11985에 기술된 pntAB 유전자를 함유한 플라스미드 pMW::THY를 SmaI 및 HindIII로 분해시키고 pntAB를 함유한 DNA 단편을 수거한다. 그런 후 WO95/16042에 기술된 ppc 유전자를 함유한 플라스미드 pppc를 XbaI으로 분해한다. 양 말단을 평활 말단으로 만든 후 추가로 HindIII으로 분해시키고 절단 부위에 pntAB를 함유한 상기 DNA 단편과 함께 삽입시켜 플라스미드 pPTS를 수득한다(도 2).

(3) aspA 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pAPW)의 제조

pMWI18::aspA를 SacI로 분해시키고 양 말단을 평활 말단으로 만든다. 추가로 HindIII으로 분해시켜 aspA를 함유한 DNA 단편을 수득한다. 그런 후 상기된 pppc를 XbaI으로 분해시키고 양 말단을 평활 말단으로 만든다. 추가로 HindIII으로 분해시키고 절단 부위에 aspA를 함유한 상기 DNA 단편과 함께 삽입하여 pAPW를 수득한다(도 3).

(4) aspA 유전자, pntAB 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pAPT)의 제조

pMW::THY를 SmaI 및 HindIII으로 분해시켜 pntAB를 함유한 DNA 단편을 수득한다. 그런 후 상기된 pAPW를 XbaI으로 분해시키고 양 말단을 평활말단으로 만든다. 추가로 HindIII으로 분해시키고 절단 부위에서 상기된 pntAB와 함께 삽입하여 pAPT를 수득한다(도 4).

(5) ilvGMEDA 오페론을 함유한 플라스미드(pMWD5)의 제조

ilvGMEDA 오페론을 함유한 DNA 단편을 WO96/26289에 기술된 ilvGMED 오페론을 함유한 플라스미드 pMWD5로부터 제조한다. 플라스미드 pMWD5는 다음과 같이 작제한다.

염색체 DNA를 에스케리치아 콜라이 MI162로부터 추출한다. 염색체 DNA를 제한효소 HindIII으로 절단한다. ilvGM 유전자를 함유한 HindIII-HindIII DNA 단편의 길이는 4.8 kb인 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 약 4.8 kb의 HindIII-HindIII DNA 단편과 HindIII으로 플라스미드 벡터 pBR322(다카라 슈조 컴퍼니 리미티드로부터구입)를 분해시켜 수득한 DNA 단편을 연결한다.

생성된 DNA-연결된 혼합물을 아세토하이드록시-산 신타제-결손 균주인 에스케리치아 콜라이 MI162내로 도입한다. 아세토하이드록시-산 신타제의 결손이 형질전환에 의해 보충된 균주를 선별하고 이 선별된 균주로부터 플라스미드 구조물을 분리한다. 플라스미드의 분석 결과 ilvGM 유전자 및 ilvE 유전자의 5'-말단의 일부분을 함유한 4.8-kb DNA 단편이 pBR322의 HindIII 부위내로 삽입된 것으로 밝혀졌다. 이 플라스미드는 pBRGM7로 명명한다.

서열 3 및 4에 기술된 합성 올리고뉴클레오타이드는 문헌[참조: Gene, 97, 21, (1991), Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 922, (1981) and J. Bacteriol., 149, 294, (1982)]에 기술된 ilvGM 유전자의 DNA 서열을 기초로 합성한다. 프라이머로서 양 올리고뉴클레오타이드를, 주형으로서 KM162 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR 방법에 의해 DNA를 증폭한다. 증폭된 단편을 단편(A)로 명명한다

유사하게, 서열 5 및 6에 기술된 합성 올리고뉴클레오타이드는 문헌[참조: Gene, 97, 21, (1991), Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 922, (1981) and J. Bacteriol., 149, 294, (1982)]에 기술된 DNA 서열을 기초로 합성한다. 프라이머로서 양 합성된 DNA를, 주형으로서 MI162 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR 방법에 의해 DNA를 증폭한다. 증폭된 DNA 단편은 단편(B)로 명명한다.

단편(A)를 SmaI으로 분해시켜 얻은 대형 단편과 벡터 pUC18(다카라 슈조, 컴퍼니 리미티드)을 SmaI으로 분해시켜 수득한 DNA 단편을 연결시켜 플라스미드 pUCA를 제조한다. 단편(B)를 KpnI으로 분해시켜 얻은 대형 단편을 벡터 pHSG399(다카라슈조, 컴퍼니 리미티드)를 HincII 및 KpnI으로 분해시켜 얻은 DNA 단편과 연결시켜 플라스미드 pHSGB를 수득한다.

플라스미드 pUCA를 KpnI으로 분해시키고, 평활말단 단편을 DNA 폴리머라제 I의 대형 단편(클레노우 단편(Klenow fragment))으로 제조하며 PstI으로 분해시키고 마지막으로 단편(A)를 함유한 DNA 단편을 분리한다. 플라스미드 pHSGB를 HindIII으로 분해시키고, 평활말단 단편을 DNA 폴리머라제 I의 대형 단편(클레노우 단편)으로 제조하고 PstI으로 분해시킨 다음 마지막으로 단편(B)를 함유한 DNA 단편을 분리한다. 양 DNA 단편을 연결시켜 플라스미드 pHSGSK를 제조한다.

pHSGSK에서의 단편(A) 및 (B)로부터 유도된 SmaI-KpnI 단편을 단편(C)로 명명한다. 단편(C)는 4.8-kb HindIII-HindIII 단편을 SmaI 및 KpnI으로 분해시켜 얻은 단편에 상응하며 ilvG 유전자의 프로모터, SD 서열 및 업스트림 영역을 함유하지만 리더 서열에서 감쇠영역까지의 0.2 kb DNA 서열이 결실된다. pHSGSK의 작제 개요가 도 5에 요약되어 있다.

플라스미드 pHSGSK를 SmaI 및 KpnI으로 분해시켜 단편(C)를 수득하고, 플라스미드 pBRGM7을 SmaI 및 KpnI으로 분해시켜 대형 DNA 단편을 수득한 다음 양 단편을 연결한다. 수득된 플라스미드는 pdGM1이라 명명한다. pdGM1은 ilvGM 유전자를 포함하는 4.6-kb HindIII-HindIII 단편을 보유하지만 감쇠에 필요한 영역은 결실된다. 감쇠에 필요한 영역이 결실된 ilvGM 유전자는 "attGM"으로 나타낸다. pdGM1의 작제 개요가 도 6에 요약되어 있다.

일본 특허 공개공보 제2-458(1990)호에 기술된 플라스미드 pDRIA4는 에스케리치아 속에 속하는 미생물과 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 둘 다에서 자가 복제하는 셔틀 벡터 pDR1120을 이. 콜라이 K-12로부터 유도된 ilvD 유전자의 3'-말단의 일부분과 트레오닌 데아미나제를 암호화하는 ilvA 유전자를 포함한 BamHI-BamHI 단편과 조합하여 제조한다. 일본 특허 공개공보 제2-458호(1990)에는 BamHI-BamHI 단편의 길이가 2.3 kb인 것으로 기술되어 있으나 현재 밝혀진 바에 따르면 BamHI-BamHI 단편의 길이는 2.75 kb이다. 플라스미드 pDRIA4는 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) AJ12358(FERM P-9764) 또는 브레비박테리움 플라붐 AJ12359(FERM P-9765)의 염색체 DNA내에 존재하지 않는다. 이들 균주로부터 플라스미드 pDRIA4는 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.

플라스미드 pDRIA4내의 2.75-kb BamHI-BamHI DNA 단편으로부터, L-이소류신에 의한 억제가 해소된 트레오닌 데아미나제 암호화 ilvA 유전자를 포함한 HindIII-BamHI 단편을 제조하고 벡터 pMW119(니폰 진)를 HindIII 및 BamHI으로 절단시켜 얻은 DNA 단편에 연결한다. 생성된 플라스미드는 pMWA1으로 명명한다.

플라스미드 PMWA1을 HindIII으로 분해시켜 얻은 DNA 단편과 플라스미드 pdGM1을 HindIII으로 분해시켜 얻은 DNA 단편을 연결한다. 연결된 플라스미드의 제한 부위의 위치를 분석하여, ilvGM 및 ilvA 유전자의 전사 배향이 동일한 플라스미드를 선별하고 pMWGMA2로 명명한다. pMWGMA2는 어테누에이터가 결실된 ilvGM 유전자, ilvE 유전자의 5'-말단 부분 및 ilvD 유전자의 3'-말단 부분을 포함한다. pMWGMA2의 작제 개요는 도 7에 요약되어 있다.

에스케리치아 콜라이 MI162의 염색체 DNA를 준비하고 SalI 및 PstI으로 분해시켜 DNA 단편의 혼합물을 제조한다. 한편, 벡터 pUC19(다카라 슈조, 컴퍼니 리미티드)를 SalI 및 PstI으로 분해시켜 DNA 단편을 제조한다. DNA 단편의 혼합물을 pUC19를 절단하여 얻은 DNA 단편에 연결시키고 DNA 혼합물을 수득한다. DNA 혼합물을 트랜스아미나제 B-결손 균주인 AB2070(에스케리치아 콜라이 제네틱스 스톡 센터로부터 입수, J. Bacteriol., 109, 703, (1972), CGSC2070)내로 도입하고 측쇄화 아미노산 요구가 회복된 형질전환체를 선별한다. 균주로부터 플라스미드의 제조 결과로서, 플라스미드는 플라스미드 pUC19를 SalI 및 PstI으로 절단시켜 얻은 DNA 단편 및 ilvE 유전자를 포함하는 SalI-PstI DNA 단편을 보유한다. 이 플라스미드는 pUCE1으로 명명한다. pUCE1은 ilvM 유전자의 3'-말단 부분, ilvE 유전자 및 ilvD 유전자의 5'-말단 부분을 포함한다.

pMWGMA2를 HindIII으로 부분적으로 분해시켜 DNA-단편 혼합물을 제조한다. 한편, pUCE1을 HindIII으로 절단하여 ilvE 유전자의 일부분 및 ilvD 유전자의 5'-말단 부분을 함유한 1.7-kb HindIII-HindIII DNA 단편을 제조한다. 양 DNA 단편을 연결하여 얻은 DNA 혼합물을 사용하여 디하이드록시-산 데하이드라타제(ilvD 유전자 생성물)-결손 균주 AB1280을 형질전환시키고 형질전환체로부터 측쇄화 아미노산 요구를 회복한 균주를 선별한다. 생성된 형질전환체로부터 제조된 플라스미드에서, pMWGMA2의 attGM과 ilvA사이의 HindIII 부위만을 HindIII으로 분해시켜 얻은 DNA 단편과 pUCE1으로부터 유도된 ilvD 유전자의 일부분과 ilvE 유전자의 일부분을 포함한 1.7-kb HindIII-HindIII DNA 단편을 연결하고 ilvGMEDA 오페론을 다시 작제한다. 이 플라스미드는 pMWD5로 명명한다. pMWD5의 작제 개요는 도 8에 요약되어 있다.

벡터 pMW119로부터 유도된 플라스미드 pMWD5 생성물은 감쇠에 필요한 영역이 결실된 ilvGMEDA 오페론을 보유한다.

상기와 같이 수득된 플라스미드 pMWD5(Ap^r)은 pMW119를 벡터로서 함유하고 감쇠에 필요한 영역이 제거된 ilvGMEDA 오페론을 보유한 플라스미드이다.

(6) ilvGMEDA 오페론 및 aspA 유전자를 함유한 플라스미드(pMWD5-aspA)의 제조

pMW118::aspA를 SacI 및 HindIII으로 분해시키고 평활말단으로 만들어 aspA를 함유한 DNA 단편을 수득한다. pMWD5를 AflII로 분해시키고, 평활말단으로 만든 다음 aspA를 함유한 상기 DNA 단편과 함께 절단 부위에 삽입시켜 pMWD5-aspA를 수득한다(도 9).

(7) ilvGMEDA 오페론 및 pntAB 유전자를 함유한 플라스미드(pMWD5-THY)의 제조

pMW::THY를 SmaI 및 HindIII으로 분해시키고 평활말단으로 만들어 pntAB를 함유한 DNA 단편을 수득한다. pMWD5를 AflII으로 분해시키고, 평활말단으로 만든다음 pntAB를 함유한 상기 DNA 단편과 함께 절단 부위에 삽입시켜 pMWD5-THY를 수득한다(도 9).

(8) ilvGMEDA 오페론과 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pMWD5-ppc)의 제조

pppc를 SacI 및 XbaI으로 분해시키고 평활말단으로 만들어 ppc를 함유한 DNA단편을 수득한다. pMWD5를 AflII로 분해시키고 평활말단으로 만든다음 ppc를 함유한 상기 DNA 단편과 함께 절단 부위에 삽입시켜 pMWD5-ppc를 수득한다(도 9).

(9) ilvGMEDA 오페론, pntAB 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pMWD5-PTS)의 제조

pPTS를 SacI 및 HindIII으로 분해시키고 평활말단으로 만들어 ppc 및 pntAB를 함유한 DNA 단편을 수득한다. pMWD5를 AflII로 분해시키고, 평활말단으로 만든다음 ppc 및 pntAB를 함유한 상기 DNA 단편과 함께 절단 부위에 삽입시켜 pMWD5-PTS를 수득한다(도 9).

(10) ilvGMEDA 오페론, aspA 유전자, pntAB 유전자 및 ppc 유전자를 함유한 플라스미드(pMWD5-APT)의 제조

pAPT를 SacI 및 HindIII으로 분해시키고 평활말단으로 만들어 ppc, pntAB 및 aspA를 함유한 DNA 단편을 수득한다. pMWD5를 AflII으로 분해시키고, 평활말단으로 만든다음 ppc, pntAB 및 aspA를 함유한 상기 DNA 단편을 절단부위에 삽입시켜 pMWD5-APT를 수득한다(도 9).

실시예 2: 여러 플라스미드를 보유한 에스케리치아 콜라이에 의한 아미노산의 제조

(1) L-트레오닌의 제조

실시예 1에서 수득된 여러 플라스미드 각각을 에스케리치아 콜라이 VKPM B-3996내로 도입한다. 이들 균주를 다음의 조건하에서 배양한다.

표 1에 나타낸 조성물을 갖는 배지를 사용하고 114 내지 116 rpm으로 교반하면서 37℃에서 38시간동안 배양한다. 표 1에 언급된 성분 A, 성분 B 및 성분 C를 제조하고 별도로 멸균시킨 다음 이들을 냉각시키고 성분 A의 16/20 용량, 성분 B의 4/20 용량 및 성분 C의 30 g/L의 비율로 혼합한다. 배지중의 L-트레오닌의 축적된 양을 측정한 결과는 표 2에 나타낸다. 에스케리치아 속에 속한 L-트레오닌 생성 세균에서 L-트레오닌 생산성이 세포내 THY 활성 및 PEPC 활성을 증강시킴으로써 향상될 수 있음이 밝혀졌다. 게다가, L-트레오닌 생산성은 또한 AspA 활성을 증강시킴으로써 향상될 수 있음이 밝혀졌다.

트레오닌 생성 배지

A	(g/L)(NH₄)₂SO₄16KH₂PO₄1MgSO₄·7H₂O 1FeSO₄·7H₂O 0.01MnSo₄·4H₂O 0.01효모 추출물(Difco) 2L-메티오닌 0.5KOH로 pH를 7.0으로 조절하고 115℃에서 10분간 오토클레이브(16/20 용량)
B	115℃에서 10분간 오토클레이브된 20% 글루코즈(4/20 용량)
C	일본 약전에 따라 180℃에서 2일간 건식 멸균된 CaCO₃(30 g/L)항생물질(스트렙토마이신 100 ㎍/L 및 앰피실린 50 ㎍/L)

숙주	플라스미드	L-트레오닌의 축적된 양(g/L)
VKPM B-3996	pMW118	14.0
	pppc	14.5
	pMW:: THY	15.0
	pMW118:: aspA	14.0
	pPTS	16.8
	pAPT	17.2

(2) L-이소류신의 제조

배양은 37℃하에 L-이소류신 생성을 위한 배지(물 1 L중의 글로코즈 40 g, 황산암모늄 16 g, 인산일칼륨 1 g, 황산마그네슘 7수화물 1 g, 황산철 7수화물 0.01g, 염화망간 4수화물 0.01 g, 효모 추출물 2 g 및 탄산칼슘 40 g, pH=7.0)에서 24시간동안 실시한다. 배지에 함유된 L-이소류신을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정량한다. 이 결과는 표 3에 나타낸다.

에스케리치아 속에 속한 L-트레오닌 생성 세균에서, L-이소류신 생산성은 세포내 THY 활성 및 PEPC 활성을 증강시킴으로써 향상될 수 있음이 밝혀졌다. 게다가, L-이소류신 생산성은 AspA 활성을 증강시킴으로써 또한 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다.

숙주	플라스미드	L-이소류신의 축적된 양(g/L)
VKPM B-3996	pMWD5	10.0
	pMWD5-ppc	9.9
	pMWD5-THY	10.4
	pMWD5-aspA	10.0
	pMWD5-PTS	10.8
	pMWD5-APT	11.2

포스포에놀피루베이트 카복실라제 활성과 트랜스하이드로게나제 활성 둘다를 증강시켜 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생성능력이 향상될 수 있고 또한 아스파르타제 활성을 증강시킴으로써 생산능력이 추가로 향상될 수 있다.

Claims

L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생성 능력을 가지며 세포내 포스포에놀피루베이트 카복실라제 활성 및 트랜스하이드로게나제 활성이 증진된, 에스케리치아 속에 속하는 세균.
제1항에 있어서, 트레오닌 오페론 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 효소 또는 효소들의 활성이 증진되고 L-트레오닌 생성 능력을 가진, 에스케리치아 속에 속하는 세균.
제2항에 있어서, 트레오닌 오페론이 thrABC로 이루어진, 에스케리치아 속에 속하는 세균.
제1항에 있어서, ilv 오페론 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 효소 또는 효소들의 활성이 증진되고 L-이소류신 생성 능력을 가진, 에스케리치아 속에 속하는 세균.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 아스파르타제 활성이 증진된, 에스케리치아 속에 속하는 세균.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 각 효소의 활성이 각 효소를 암호화한 유전자 또는 오페론의 복제수를 증가시키거나 유전자 또는 오페론의 세포내 발현이 증진되도록 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 증진된, 에스케리치아 속에 속하는 세균.
제6항에 있어서, 유전자가 에스케리치아 속에 속한 세균으로부터 유도된, 에스케리치아 속에 속하는 세균.
제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 에스케리치아 속에 속하는 세균을 배지에서 배양하여 배지에 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생성하고 축적하며, 배지로부터 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 수거함을 포함하는, L-트레오닌 또는 L-이소류신의 제조방법.