DE60128754T2

DE60128754T2 - Verfahren zur Herstellung von Threonin und Isoleucin

Info

Publication number: DE60128754T2
Application number: DE60128754T
Authority: DE
Inventors: Yuri Kawasaki-shi Miyata; Yuta Kawasaki-shi Nakai; Kazuo Kawasaki-shi Nakanishi; Hisao Kawasaki-shi ITO; Hiroyuki Kawasaki-shi Kojima; Osamu Kawasaki-shi KURAHASHI
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: BR0103319B1; CA2354103A1; EP1179597A1; SK11492001A3; CN1355295A; CN1210397C; BR122012033754B1; US20020110876A1; DK1179597T3; KR20020013777A; SK287403B6; BR0103319A; JP4265093B2; MXPA01008183A; KR100823044B1; DE60128754D1; AU780300B2; CA2354103C; AU5774101A; EP1179597B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine in der Fermentationsindustrie eingesetzte Technik und betrifft ein Bakterium der Gattung Escherichia, das L-Threonin oder L-Isoleucin produziert, und ein Verfahren zum Herstellen von L-Threonin oder L-Isoleucin unter Verwendung des Bakteriums.
Beschreibung des Standes der Technik
Die industrielle Produktion von L-Aminosäuren, wie L-Threonin und L-Isoleucin, ist herkömmlich durch ein Fermentationsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen, die coryneforme Bakterien und Bakterien der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäuren, durchgeführt wurden. Als Aminosäure produzierende Bakterien werden Stämme eingesetzt, die aus der Natur isoliert wurden, künstliche mutierte Stämme davon oder rekombinante Stämme davon, worin L-Aminosäurebiosyntheseenzyme durch genetische Rekombination verstärkt sind, um eine erhöhte Produktivität zu erzielen.
Genauer gesagt sind als Verfahren zum Herstellen von L-Threonin ein Verfahren unter Verwendung eines mutierten Stammes eines Bakteriums der Gattung Escherichia in der offengelegten japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 5-304969 , Verfahren unter Einsatz rekombinanter Stämme von Escherichia coli in den japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 1-29559 , 2-109985 , 56-15696 und in der japanisch-sprachigen internationalen Patentveröffentlichung (Kogyo) 3-501682 , und ein Verfahren unter Einsatz eines mutierten Stammes eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 62-239996 , und ein Verfahren unter Verwendung eines mutierten Stammes eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 61-195695 offenbart worden. Außerdem sind Verfahren zum Herstellen von L-Threonin unter Verwendung von Stämmen, die mit rekombinanten Plasmiden transformiert worden sind, welche das Threoninoperon enthalten, in den offengelegten japanischen Patentanmeldungen Nr. 55-131397 , 59-31691 , 56-15696 und in der japanischsprachigen internationalen Patentveröffentlichung Nr. 3-501682 offenbart worden.
Außerdem sind als Verfahren zum Herstellen von L-Isoleucin ein Verfahren unter Einsatz von Escherichia coli in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 5-130882 , ein Verfahren unter Verwendung eines rekombinanten Stammes von Escherichia coli in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2-458 , ein Verfahren unter Verwendung eines mutierten Stammes eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 3-62395 und ein Verfahren unter Verwendung eines rekombinanten Stammes eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium in der japanischen Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 5-47196 offenbart worden. Es ist auch bekannt, daß die L-Isoleucin produzierende Fähigkeit durch Einführen des thrABC-Operons, welches das für Aspartokinase I-Homoserindehydrogenase I aus Escherichia coli, bei der die Inhibition durch L-Threonin im wesentlichen ausgeschaltet ist, codierende thrA-Gen enthält, und des ilvGMEDA-Operons, welches das für Threonindeaminase, bei der die Inhibition durch L-Isoleucin im wesentlichen ausgeschaltet ist codierende ilvA-Gen, bei dem eine für die Attenuation erforderliche Region entfernt ist, verliehen werden (vergl. das offengelegte japanische Patent Nr. 8-47397 ).
Die Sequenz des Phosphoenolpyruvatcarboxylasegens aus Escherichia coli ist bekannt (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. und Katsuki H. J. Biochem. 95, 909-916 (1984)), und es wird Phosphoenolpyruvatcarboxylase offenbart, bei der Rückkopplungshemmung durch Asparaginsäure im wesentlichen ausgeschaltet ist, und es wird ein Verfahren unter Verwendung eines dafür codierenden Gens offenbart ( WO95/06114 ). Außerdem ist auch ein Beispiel einer Verstärkung des Phosphoenolpyruvatcarboxylasegens mit dem Zweck bekannt, die L-Glutaminsäure produzierende Fähigkeit von coryneformen Bakterien zu verstärken (offengelegtes japanisches Patent 60-87788 ). Au ßerdem sind Techniken zum Verbessern der Aminosäure produzierenden Fähigkeit durch Verstärken eines Phophoenolpyruvatcarboxylasegens zusammen mit anderen Enzymgenen offenbart worden. Es wurde ein Beispiel berichtet, bei dem die L-Glutaminsäure produzierende Fähigkeit durch Verstärken des Glutamatdehydrogenasegens, Citratsynthetasegens und des Phosphoenolpyruvatcarboxylasegens in coryneformen Bakterien, worin das α-Ketoglutaratdehydrogenasegen deletiert war, erhöht wurde ( WO96/06180 ). Bezüglich Escherichia coli wurde offenbart, daß die L-Threonin produzierende Fähigkeit nicht signifikant erhöht wurde, selbst wenn ein Wildtyp Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen in einen L-Threonin produzierenden Stamm von Escherichia coli, B-3996, der mit einem rekombinanten Plasmid, welches das Threoninoperon enthält, transformiert war, eingeführt wurde ( WO95/06114 ).
Außerdem wurde offenbart, daß die Fähigkeit zur Produktion von Substanzen, wie Aminosäuren, durch Erhöhen der enzymatischen Aktivität von Nikotinamidnukleotidtranshydrogenase (im folgenden auch als "Transhydrogenase" bezeichnet) in mikrobiellen Zellen, und durch Erhöhen der Fähigkeit zur Produktion von reduziertem Nikotinamid-adenindinukleotidphosphat verstärkt werden kann ( WO95/11985 ). In diesem Dokument wird auch ein Beispiel einer Verbesserung der Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin durch Verstärken eines Transhydrogenasegens in Escherichia coli, das mit einem das Threoninoperon enthaltenen rekombinanten Plasmid transformiert ist, erwähnt. Als eine Aminosäure, deren Produktivität durch Erhöhen der Transhydrogenaseaktivität verbessert ist, wurde L-Isoleucin genannt.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin von Bakterien der Gattung Escherichia zu verbessern.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Iso leucin dadurch deutlich erhöht wurde, daß sowohl die Phosphoenolpyruvatcarboxylaseaktivität als auch die Transhydrogenaseaktivität verstärkt wurden, und sie haben außerdem gefunden, daß die Fähigkeit zur Produktion zudem durch Verstärken der Aspartaseaktivität erhöht wurde. Auf diese Weise haben sie die vorliegende Erfindung gemacht.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit.

(1) Ein Bakterium der Gattung Escherichia, welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin aufweist und worin die intrazelluläre Phosphoenolpyruvatcarboxylaseaktivität und die Transhydrogenaseaktivität verstärkt sind.
(2) Das Bakterium der Gattung Escherichia nach (1), worin die Aktivität eines Enzyms oder von Enzymen, die von dem Threoninoperon oder einem Teil davon codiert werden, verstärkt ist und welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin hat.
(3) Das Bakterium der Gattung Escherichia nach (2), wobei das Threoninoperon aus thrABC besteht.
(4) Das Bakterium der Gattung Escherichia nach (1), worin die Aktivität eines Enzyms oder von Enzymen, codiert durch das ilv-Operon oder einem Teil davon, verstärkt ist und welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Isoleucin hat.
(5) Das Bakterium der Gattung Escherichia nach einem der Punkte (1) bis (4), worin die Aspartaseaktivität erhöht ist.
(6) Das Bakterium der Gattung Escherichia nach einem der Punkte (1) bis (5), worin die Aktivität jedes Enzyms durch Erhöhen der Kopienzahl eines Gens oder eines für jedes Enzym codierenden Operons oder durch Modifizieren einer Expressionsregulationssequenz, so daß die intrazelluläre Expression des Gens oder des Operons verstärkt sein sollte, erhöht ist.
(7) Das Bakterium der Gattung Escherichia nach (6), wobei das Gen von einem Bakterium der Gattung Escherichia abgeleitet ist.
(8) Ein Verfahren zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin, welches das Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Escherichia nach einem der Punkte (1) bis (7) in einem Medium unter Produktion und Anhäufung von L-Threonin oder L-Isoleu cin in dem Medium und das Gewinnen des L-Threonins oder des L-Isoleucins aus dem Medium umfaßt.

Erfindungsgemäß kann die Fähigkeit eines Bakteriums der Gattung Escherichia zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin verstärkt werden.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt die Konstruktion des Plasmids pMW118::aspA, welches das aspA-Gen enthält.
2 zeigt die Konstruktion des Plasmids, welches das pntAB-Gen und das ppc-Gen enthält (pPTS).
3 zeigt die Konstruktion des Plasmids, welches das aspA-Gen und das ppc-Gen enthält (pAPW).
4 zeigt die Konstruktion des Plasmids, welches das aspA-Gen, das pntAB-Gen und das ppc-Gen enthält (pAPT).
5 zeigt die Konstruktion des Plasmids pHSGSK.
6 zeigt die Konstruktion des Plasmids pdGM1.
7 zeigt die Konstruktion des Plasmids pMWGMA2.
8 zeigt die Konstruktion des Plasmids pMWD5.
9 die Konstruktion von pMWD5-aspA, pMWD5-THY, pMWD5-ppc, pMWD5-PTS und pMWD5-APT.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Im folgenden wird die folgende Erfindung eingehender beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes Bakterium der Gattung Escherichia ist ein Bakterium der Gattung Escherichia, das die Fähigkeit hat, L-Threonin und L-Isoleucin zu produzieren, und das eine verstärkte intrazelluläre Aktivität von Phosphoenolpyruvatcarboxylase (im folgenden auch als "PEPC" bezeichnet) und eine verstärkte Aktivität von Transhydrogenase (im folgenden auch als "THY" abgekürzt) aufweist.
Als Bakterium der Gattung Escherichia können spezifisch solche eingesetzt werden, die Neidhardt et al. erwähnt sind (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1). Beispielsweise kann Escherichia coli genannt werden.
Der Ausdruck "mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin" bedeutet, daß wenn das interessierende Bakterium in einem Medium kultiviert wird, es die Fähigkeit zeigt, L-Threonin oder L-Isoleucin in dem Medium anzuhäufen. Diese Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin kann eine Eigenschaft sein, die ein Wildtyp zeigt, oder eine Eigenschaft, die durch Züchten verliehen oder erhöht wird.
In dem erfindungsgemäßen Bakterium der Gattung Escherichia kann die intrazelluläre Aktivität von Aspartase (L-Aspartatammoniaklyase, im folgenden auch als "AspA" bezeichnet) weiter erhöht sein.
Um die Aktivität von PEPC, THY oder AspA in Bakterien der Gattung Escherichia zu verstärken, kann ein für PEPC, THY oder AspA codierendes Gen in ein geeignetes Plasmid cloniert werden, und ein Bakterium der Gattung Escherichia, das als Wirt dient, kann mit dem erhaltenen Plasmid transformiert werden. Dies erhöht in der Transformante die Kopienzahl eines Gens, das für PEPC, THY oder AspA kodiert (im folgenden in dieser Reihenfolge als "ppc-Gen", "pntAB-Gen" bzw. "apsA-Gen" abgekürzt), und als Ergebnis wird die Aktivität von PEPC, THY oder AspA verstärkt.
Das ppc-Gen, das pntAB-Gen und das apsA-Gen werden in ein Bakterium der Gattung Escherichia als eine Kombination des ppc-Gens und des pntAB-Gens oder als eine Kombination dieser Gene und des aspA-Gens eingeführt. Diese Gene können in einen Wirt als eine Art von Plasmid, worin zwei oder drei der Gene einkloniert sind, eingeführt werden, oder es können zwei oder drei Arten von Plasmiden, worin die Gene jeweils eincloniert worden sind, coexistieren.
Die Verstärkung der Aktivität von PEPC, THY oder AspA kann auch dadurch erreicht werden, daß eine Vielzahl von Kopien des ppc-Gens, des pntAB-Gens oder des apsA-Gens auf der chromosomalen DNA des ursprünglichen Elternstammes, der als Wirt dient, vorhanden sind. Um eine Vielzahl von Kopien des ppc-Gens, des pntAB-Gens oder apsA-Gens in die chromosomale DNA eines Bakteriums der Gattung Escherichia einzuführen, kann eine Sequenz eingesetzt werden, von der auf der chromosomalen DNA eine Vielzahl von Kopien existieren, beispielsweise repetitive DNA, umgekehrte Wiederholungssequenzen, die am Ende eines transponierbaren Elements vorhanden sind, und dergleichen. Alternativ dazu ist es auch möglich, das ppc-Gen, das pntAB-Gen oder das apsA-Gen in ein Transposon einzuverleiben und dessen Transfer zu ermöglichen, so daß eine Vielzahl von Kopien jedes Gens in die chromosomale DNA eingeführt wird. Durch jedes dieser Verfahren wird die Anzahl der Kopien des ppc-Gens, des pntAB-Gens oder des apsA-Gens innerhalb der Zellen des transformierten Stammes erhöht, wodurch die Aktivität von PEPC, THY oder AspA verstärkt wird.
Die Verstärkung der Aktivität von PEPC, THY oder AspA kann neben der vorstehend beschriebenen Genamplifikation auch durch Ersetzen einer Expressionsregulationssequenz des ppc-Gens, des pntAB-Gens oder des apsA-Gens erreicht werden, beispielsweise durch Ersetzen eines Promotors durch einen stärkeren Promotor (vergl. die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 1-215280 ). Beispielsweise sind der lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor, tac-Promotor, P_R-Promotor und der P_L-Promotor des Phagen lambda, der tet-Promotor, der amyE-Promotor, der spac-Promotor und dergleichen als starke Promotoren bekannt. Das Ersetzen dieser Promotoren verstärkt die Expression des ppc-Gens, des pntAB-Gens oder des apsA-Gens, so daß die Aktivität von PEPC, THY oder AspA verstärkt wird. Die Verstärkung einer Expressionsregulationssequenz kann mit einer erhöhten Kopienzahl des ppc-Gens, des pntAB-Gens oder des apsA-Gens kombiniert werden.
Der Organismus als Quelle des ppc-Gens, des pntAB-Gens oder des aps-Gens kann ein beliebiger Organismus mit PEPC-, THY- oder apsA-Aktivität sein. Besonders bevorzugt sind Bakterien, welche Prokaryoten sind, beispielsweise Bakterien der Gattung Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium oder Bacillus. Als spe zifisches Beispiel kann Escherichia coli genannt werden. Das ppc-Gen, das pntAB-Gen oder das apsA-Gen kann aus chromosomaler DNA solcher Mikroorganismen wie vorstehend beschrieben erhalten werden.
Das ppc-Gen von Escherichia coli kann aus einem Plasmid mit diesem Gen, dem Plasmid pS2 (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)) oder pT2, erhalten werden. Durch Verdauen von pS2 mit AatII und AflII kann ein das ppc-Gen enthaltendes DNA-Fragment erhalten werden. Ein DNA-Fragment mit dem ppc-Gen kann auch durch Verdauen von pT2 mit SmaI und ScaI erhalten werden. Der Stamm E. coli F15 (AJ12873), der pT2 enthält, wurde am 15. Juli 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, PLZ: 305-8566) (derzeit die unabhängige Verwaltungseinheit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, PLZ: 305-5466) unter der Hinterlegungsnummer FERM P-13752 hinterlegt. Dann wurde er am 11. Juli 1994 nach den Vorgaben des Budapester Abkommens unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4732 in eine internationale Hinterlegung überführt.
Das pntAB-Gen kann durch Verdauen des Plasmids pMW::THY ( WO95/11985 ), welches das Gen enthält, mit SmaI und HindIII erhalten werden. Der Stamm Escherichia coli AJ12929, welcher pMW::THY enthält, wurde am 4. Oktober 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (PLZ 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERN P-13890 hinterlegt. Dann wurde der Stamm aus der ursprünglichen Hinterlegung am 14. September 1994 in eine internationale Hinterlegung gemäß den Vorgaben des Budapester Abkommens unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4798 hinterlegt. Die Transhydrogenase von Escherichia coli besteht aus zwei Untereinheiten, die von pntA bzw. pntB codiert werden.
Während das erfindungsgemäße Bakterium der Gattung Escherichia nicht besonders eingeschränkt ist, solange es die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin hat, umfassen spezifische Beispiele davon Bakterien der Gattung Escherichia, denen die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin verliehen worden ist, indem die Aktivität eines durch das Threoninoperon oder einem Teil davon codierten Enzyms verstärkt wurde, und zu den Bakterien der Gattung Escherichia, denen die Fähigkeit zur Produktion von L-Isoleucin verliehen worden ist, indem die Aktivität eines durch das ilv-Operon oder einen Teil davon codierten Enzyms verstärkt wurde.
Das Threoninoperon oder ein Teil davon kann beispielsweise thrABC oder ein Teil davon sein. Das ilv-Operon oder ein Teil davon kann beispielsweise ilvGMEDA oder ein Teil davon sein.
Als Escherichia coli mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin können Escherichia coli VKPM B-3996 (hinterlegt am 19. November 1987 bei All-Union Scientific Center of Antibiotics, Nagatinskaya Street 3-A, 113105, Moskau, Russische Föderation mit der Hinterlegungsnummer RIA 1867, vergl. das US-Patent Nr. 5,175,107 ), Escherichia coli AJ11335 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 55-131397 ) und dergleichen genannt werden. Der Stamm VKPM B-3996 trägt das Plasmid pVIC40 (Internationale Offenlegungsschrift WO90/04636 ), das durch Einführen eines Threoninbiosynthesesystemgens (Threoninoperon: thrABC) in ein Vektorplasmid mit breitem Wirtsbereich und einem Streptomycinresistenzmarker, nämlich pAYC32, erhalten wird (vergl. Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161-167). Die Rückkopplungshemmung der Aspartokinase I-Homoserindehydrogenase I, die durch thrA in diesem Operon codiert wird, durch L-Threonin ist entkoppelt.
Als Bakterien der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Isoleucin können Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781, vergl. die offengelegte europäische Patentanmeldung Nr. 519,113 ) und Escherichia coli AJ12919 (offengelegtes japanisches Patent Nr. 8-47397 ) genannt werden. Der Stamm VKPM B-3996, worin das ilv-Operon amplifiziert ist, ist ebenfalls ein bevorzugtes L-Isoleucin produzierendes Bakterium.
Das Threoninoperon enthält die thrA-, thrB- und thrC-Gene, die für Aspartokinase I-Homoserindehydrogenase I, Homoserinkinase bzw. Threoninsynthase codieren. Bezüglich dieser Enzyme ist es bevorzugt, daß die Inhibition der Aspartokinase I-Homoserindehydrogenase I durch L-Threonin im wesentlichen ausgeschaltet sein sollte.
Das ilvGMEDA-Operon enthält die ilvG-, ilvM-, ilvE-, ilvD- und die ilvA-Gene und sie codieren für die große Untereinheit, die kleine Untereinheit, Transaminase, Di-hydroxysäuredehydratase bzw. Threonindeaminase des Isozyms II von Acetohydroxysäuresynthase. Da das ilvGMEDA-Operon unter der Kontrolle (Attenuation) der Expression des Operons durch L-Valin und/oder L-Isoleucin und/oder L-Leucin ist, kann eine für die Attenuation erforderliche Region in einem Isoleucin produzierenden Bakterium entfernt oder mutiert werden, um die Suppression der Expression durch das hergestellte L-Isoleucin auszuschalten. Als ilvGMEDA-Operon können solche genannt werden, die von Bakterien der Gattung Escherichia abgeleitet sind, insbesondere das ilvGMEDA-Operon von E. coli. Das ilvGMEDA-Operon ist in WO96/26289 eingehend beschrieben. Bezüglich des ilvGMEDA-Operons ist es bevorzugt, daß die für die Attenuation erforderliche Region entfernt wird und daß unter den Enzymen, die durch dieses Operon codiert werden, die Inhibition der Threonindeaminase durch L-Isoleucin im wesentlichen ausgeschaltet sein sollte (vergl. die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 8-47397 ).
Die Verstärkung der Aktivitäten der Enzyme, die durch das Threoninoperon oder das ilv-Operon oder einen Teil davon codiert werden, kann auf dieselbe Weise wie für PEPC, THY und AspA erzielt werden.
In einem für die vorliegende Erfindung eingesetzten Mikroorganismus kann, wenn ein Gen für ein Enzym, das für einen Teil der Biosynthese der Zielaminosäure verantwortlich ist, verstärkt ist, oder ein Gen oder ein Operon, das für einen entkoppelten Typ (inhibitionsentkoppelten Typ) eines der Rückkopplungshemmung unterliegenden Enzyms codiert, eingeführt wird, die Fähigkeit zur Produktion der L-Aminosäure weiter verbessert werden.
Threonin oder Isoleucin kann durch Kultivieren eines Bacteriums der Gattung Escherichia, worin PEPC und THY sowie AspA bei Bedarf wie vorstehend beschrieben verstärkt sind und welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin in einem Medium zur Produktion und Anhäufung von Threonin oder Isoleucin in dem Medium hat, und durch Gewinnen des Threonins oder Isoleucins aus dem Medium hergestellt werden.
Das für die Kultivierung eingesetzte Medium kann ein übliches Medium sein, das nach Bedarf eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Komponenten enthält.
Als Kohlenstoffquelle ist es möglich, Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysat, Alkohole, wie Glycerin und Sorbitol, oder organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure, einzusetzen.
Als Stickstoffquelle ist es möglich, anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumphosphat, organischen Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas oder wäßriges Ammoniak einzusetzen.
Bezüglich der organischen Spurennährstoffe ist es wünschenswert, erforderliche Substanzen, wie Vitamin B₁, Hefeextrakt und dergleichen, in einer geeigneten Menge zuzugeben. Zusätzlich zu diesen werden kleinen Mengen Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zugegeben.
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16 bis 72 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird auf 25 bis 45°C kontrolliert, und der pH-Wert wird während der Kultivierung auf 5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen, sowie Ammoniakgas und dergleichen können für die pH-Einstellung eingesetzt werden.
Die Gewinnung von L-Threonin oder L-Isoleucin aus der Fermentationsflüssigkeit wird üblicherweise durch eine Kombination eines Ionenaustauscherharzverfahrens, einer Ausfällung und anderen bekannten Techniken durchgeführt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele eingehender beschrieben.
Beispiel 1: Produktion von Plasmiden, die verschiedene Gene enthalten.
(1) Produktion eines Plasmids, welches ein aspA-Gen enthält (pMW118::aspA)
Ein DNA-Fragment, welches das aspA-Gen enthält, wurde unter Einsatz chromosomaler DNA des Stammes Escherichia coli W3110 als Matrize und den folgenden Primern durch PCR amplifiziert.
Primer 1: 5'-TGATCAGCGAAACACTTTTA-3' (SEQ ID NO: 1)
Primer 2: 5'-CAGCAAACTATGATGAGAA-3' (SEQ ID NO: 2)
Das erhaltene amplifizierte Fragment wurde in die SmaI-Schnittstelle von pMW118 (Nippon Gene) eingeführt, wobei pMW118::aspA erhalten wurde (1).
(2) Produktion eines Plasmids, welches das pntAB-Gen und das ppc-Gen enthält (pPTS).
Das Plasmid pMW::THY, welches das in WO95/11985 beschriebene pntAB-Gen enthält, wurde mit SmaI und HindIII verdaut, und ein pntAB-enthaltendes DNA-Fragment wurde gewonnen. Dann wurde das in WO95/16042 beschriebene Plasmid pppc, welches das ppc-Gen enthält, mit XbaI verdaut. Nachdem die beiden Enden abgestumpft worden waren, wurde es mit HindIII weiter verdaut, und es wurde das vorstehend beschriebene DNA-Fragment, welches pntAB enthält, in die Schnittstelle eingeführt, wobei das Plasmid pPTS erhalten wurde (2).
(3) Produktion eines Plasmids, welches das aspA-Gen und das ppc-Gen enthält (pAPW)
Das Plasmid pMW118::aspA wurde mit SacI verdaut, und die beiden Enden wurden abgestumpft. Das Plasmid wurde weiter mit HindIII verdaut, wobei ein aspA-enthaltendes DNA-Fragment erhalten wurde. Dann wurde das vorstehend beschriebene pppc mit XbaI verdaut, und beide Enden wurden abgestumpft. Es wurde weiterhin mit HindIII verdaut, und das vorstehend beschriebene DNA-Fragment, welches aspA enthält, wurde in die Schnittstelle eingeführt, wobei pAPW erhalten wurde (3).
(4) Produktion eines Plasmids, welches das aspA-Gen, das pntAB-Gen und das ppc-Gen enthält (pAPT)
Ein pntAB-enthaltendes DNA-Fragment wurde durch Verdauen von pMW::THY mit SmaI und HindIII erhalten. Dann wurde das vorstehend beschriebene Plasmid pAPW mit XbaI verdaut, und beide Enden wurden abgestumpft. Es wurde weiterhin mit HindIII verdaut, und das vorstehend beschriebene pntAB-Gen wurde in die Schnittstelle eingeführt, wobei pAPT erhalten wurde (4).
(5) Produktion eines Plasmids, welches das ilvGMEDA-Operon enthält (pMWD5)
Ein das ilvGMEDA-Operon enthaltendes DNA-Fragment wurde aus dem Plasmid pMWD5 hergestellt, welches das in WO96/26289 offenbarte ilvGMED-Operon enthält. Das Plasmid pMWD5 wurde wie folgt konstruiert.
Die chromosomale DNA wurde aus Escherichia coli MI162 extrahiert. Die chromosomale DNA wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII geschnitten. Die Länge eines HindIII-HindIII-DNA-Fragments, einschließlich der ilvGM-Gene, war 4,8 kb. Deshalb wurden das HindIII-HindIII-DNA-Fragment mit etwa 4,8 kb und das DNA-Fragment, das durch Verdauen des Plasmidvektors pBR322 (erworben von Takara Shuzo, Co., Ltd.) mit HindIII erhalten wurde, ligiert.
Das erhaltene DNA-ligierte Gemisch wurde in Escherichia coli MI162, welcher ein Acetohydroxysäuresynthase-defizienter Stamm ist, eingeführt. Die Stämme, worin die Defizienz der Acetohydroxysäuresynthase durch die Transformation komplementiert wurde, wurden selektiert, und die Plasmidstruktur wurde aus den selektierten Stämmen isoliert. Die Ergebnisse der Analyse des Plasmids zeigen, daß ein 4,8-kb DNA-Fragment, welches das ilvGM-Gen und einen Teil des 5'-terminalen Endes des ilv-Gens enthält, in die HindIII-Stelle von pBR322 eingeführt wurde. Das Plasmid wurde pBRGM7 genannt.
Die synthetischen Oligonucleotide, die in SEQ ID NO: 3 und NO: 4 gezeigt sind, wurden unter Bezugnahme auf die DNA-Sequenz des in Gene, 97, 21, (1991), Pro. Natl. Acad. Sic. U.S.A., 78, 922, (1981) und J. Bacteriol., 149, 294, (1982) beschriebene ilvGM-Gen synthetisiert. DNA wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung beider Oligonucleotide als Primer und der chromosomalen DNA des Stammes MI162 als Matrize amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde Fragment (A) genannt.
Auf ähnliche Weise wurden die in SEQ ID NO: 5 und NO: 6 gezeigten synthetischen Oligonucleotide unter Bezugnahme auf die in Gene, 97, 21, (1991), Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 922, (1981) und J. Bacteriol., 149, 294, (1982)) beschriebene DNA-Sequenz synthetisiert. DNA wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung der beiden synthetisierten DNA als Primer und der chromosomalen DNA des Stammes MI162 als Matrize amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde Fragment (B) genannt.
Das Plasmid pUCA wurde durch Ligieren des großen Fragments, das durch Verdauen des Fragments (A) mit SmaI erhalten wurde, und das DNA-Fragments, das durch Verdauen des Vektors pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit SmaI erhalten wurde, erhalten. Das Plasmid pHSGB wurde durch Ligieren des großen Fragments, das durch Verdauen des Fragments (B) mit KpnI erhalten wurde, und des DNA-Fragments hergestellt, das durch Verdauen des Vektors pHSG399 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) mit HincII und KpnI erhalten wurde.
Das Plasmid pUCA wurde mit KpnI verdaut, das Fragment mit abgestumpften Enden wurde mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) hergestellt und mit PstI verdaut, und schließlich wurde ein Fragment (A) enthaltendes DNA-Fragment isoliert. Das Plasmid pHSGB wurde mit HindIII verdaut, das Fragment mit abgestumpften Enden wurde mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) hergestellt und mit PstI verdaut, und schließlich wurde ein Fragment (B)-enthaltendes DNA-Fragment isoliert. Das Plasmid pHSGSK wurde durch Ligieren beider DNA-Fragmente hergestellt.
Das SmaI-KpnI-Fragment, das von den Fragmenten (A) und (B) in pHSGSK abgeleitet wurde, wurde Fragment (C) genannt. Fragment (C) entsprach einem Fragment, das durch Verdauen eines 4,8-kb HindIII-HindIII-Fragments mit SmaI und KpnI erhalten wurde, es enthielt einen Promotor, die SD-Sequenz und eine stromaufwärtige Region des ilvG-Gens, es hatte jedoch die DNA-Sequenz von 0,2 kb von der Leader-Sequenz bis zu dem Attenuator verloren. Das Schema für die Konstruktion von pHSGSK ist in 5 zusammengefaßt.
Fragment (C) wurde durch Verdauen des Plasmids pHSGSK mit SmaI und KpnI erhalten, das große DNA-Fragment wurde durch Verdauen des Plasmids pBRGM7 mit SmaI und KpnI erhalten, und die beiden Fragmente ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde pdGM1 genannt. Das Plasmid pdGM1 enthielt ein 4,6-kb HindIII-HindIII-Fragment, einschließlich dem ilvGM-Gen, welches die für die Attenuation erforderliche Region verloren hat. Dieses ilvGM-Gen, das die für die Attenuation erforderliche Region verloren hat, stellt "attGM" dar. Das Schema für die Konstruktion von pdGM1 ist in 6 zusammengefaßt.
Das in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2-458(1990) beschriebene Plasmid pDRIA4 wird durch Kombinieren des Shuttle-Vektors pDR1120, welcher die autonome Replikation sowohl in einem Mikroorganismus der Gattung Escherichia als auch in einem Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium erlaubt, mit einem BamHI-BamHI-Fragment hergestellt, welches das ilvA-Gen, das für Threonindeaminase codiert, und einen Teil des 3'-terminalen Bereichs des ilvD-Gens, abgeleitet von E. coli K-12, enthält. Die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2-458 (1990) beschreibt, daß die Länge des BamHI-BamHI-Fragments 2,3 kb ist. Es wurde jedoch gefunden, daß die Länge dieses Fragments 2,75 kb ist. Das Plasmid pDRIA4 ist in der chromosomalen DNA von Brevibacterium flavum AJ12358 (FERN P-9764) oder Brevibacterium flavum AJ12359 (FERN P-9765) nicht vorhanden. Aus diesen Stämmen kann das Plasmid pDRIA4 nach dem üblichen Verfahren hergestellt werden.
Aus einem 2,75-kb BamHI-BamHI-DNA-Fragment in den Plasmid pDRIA4 wurde ein HindIII-BamH1-Fragment, welches das für Threonindeaminase codierende ilvA-Gen enthält, worin die Inhibition durch L-Isoleucin ausgeschaltet ist, hergestellt und an ein DNA-Fragment ligiert, das durch Schneiden des Vektors pMW119 (Nippon Gene) mit HindIII und BamHI erhalten wurde. Das erhaltene Plasmid wurde pNWA1 genannt.
Ein DNA-Fragment, das durch Schneiden des Plasmids pMWA1 mit HindIII erhalten wurde, und ein DNA-Fragment, das durch Schneiden des Plasmids pdGM1 mit HindIII erhalten wurde, wurden ligiert. Anhand der Analyse der Position der Restriktionsstellen der ligierten Plasmide wurde das Plasmid, worin die Transskriptionsrichtungen des ilvGM-Gens und des ilvA-Gens dieselben waren, selektiert wurde pMWGMA2 genannt. Das Plasmid pMWGMA2 umfaßt das ilvGM-Gen, worin der Attenuator deletiert ist, einen 5'-terminalen Teil des ilvE-Gens und einen 3'-terminalen Teil des ilvD-Gens. Das Schema der Konstruktion von pMWGMA2 ist in 7 zusammengefaßt.
Die chromosomale DNA von Escherichia coli MI162 wurde hergestellt und mit SalI und PsTI verdaut, wobei ein Gemisch von DNA-Fragmenten erhalten wurde. Andererseits wurde ein DNA-Fragment durch Schneiden des Vektors pUC19 (Takara Shuzo, Co., Ltd.) mit SalI und PsTI hergestellt. Das Gemisch der DNA-Fragmente wurde an das durch Schneiden von pUC19 erhaltene DNA-Fragment ligiert, und es wurde ein DNA-Gemisch erhalten. Das DNA-Gemisch wurde in AB2070, einen Transaminase B-defizienten Stamm (bereitgestellt vom Escherichia coli Genetics Stock Center J. Bacteriol., 109, 703, (1972), CGSC2070), eingeführt, und eine Transformante wurde selektiert, worin das Erfordernis verzweigtkettiger Aminosäuren wieder aufgehoben war. Als Ergebnis der Herstellung eines Plasmids aus dem Stamm enthielt das Plasmid ein DNA-Fragment, das durch Schneiden des Plasmids pUC19 mit SalI und PstI erhalten wurde, und ein SalI-PstI DNA-Fragment, einschließlich eines ilvE-Gens, welche ligiert wurden. Das Plasmid wurde pUCE1 genannt. Das Plasmid pUCE1 umfaßt einen 3'-terminalen Bereich des ilvM-Gens, das ilvE-Gen und einen 5'-terminalen Bereich des ilvD-Gens.
Ein DNA-Fragmentgemisch wurde durch teilweises Verdauen von pMWGMA2 mit HindIII hergestellt. Andererseits wurde ein 1,7 kb HindIII-HindIII-DNA-Fragment, das einen Bereich des ilvE-Gens und einen 5'-terminalen Bereich des ilvD-Gens enthält, durch Schneiden von pucE1 mit HindIII hergestellt. Unter Verwendung eines DNA-Gemisches, das durch Ligieren der beiden DNA-Fragmente erhalten wurde, wurde AB1280, ein Dihydroxysäuredehydratase (ilvD-Genprodukt)-defizienter Stamm transformiert, und der Stamm, worin das Erfordernis verzweigtkettiger Aminosäuren aufgehoben war, wurde unter den Transformanten selektiert. In dem Plasmid, das aus der erhaltenen Transformante hergestellt wurde, wurden ein Fragment, das durch alleiniges Schneiden der HindIII-Stelle zwischen attGM und ilvA von pMWGMA2 mit HindIII erhalten wurde, und ein 1,7 kb HindIII-HindIII-DNA-Fragment, einschließlich einem Bereich des ilvE-Gens und einem Bereich des ilvD-Gens aus pUCE1, ligiert, und das ilvGMEDA-Operon wurde rekonstruiert. Das Plasmid wurde pMWD5 genannt. Das Schema der Konstruktion von pMWD5 ist in 8 zusammengefaßt.
Das erhaltene Plasmid pMWD5, das von dem Vektor pMW119 abgeleitet ist, trägt das ilvGMEDA-Operon, worin die für die Attenuation erforderliche Region deletiert ist.
Das Plasmid pMWD5 (Ap^r), das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, ist ein Plasmid, das pMW 119 als Vektor enthält und das ilvGMEDA-Operon trägt, von dem die für die Attenuation erforderliche Region entfernt worden ist.
(6) Produktion eines Plasmids, welches das ilvGMEDA-Operon und das aspA-Gen enthält (pMWD5-aspA)
Das Plasmid pMW118::aspA wurde mit SacI und HindIII verdaut, und die Enden wurden abgestumpft, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, welches aspA enthält. Das Plasmid pMWD5 wurde mit AflII verdaut, die Enden wurden abgestumpft, und das Plasmid wurde in die Schnittstelle des vorstehend genannten DNA-Fragments, welches aspA enthält, eingeführt, wobei pMWD5-aspA erhalten wurde (9).
(7) Produktion eines Plasmids, das das ilvGMEDA-Operon und das pntAB-Gen enthält (pMWD5-THY)
Das Plasmid pMW::THY wurde mit SmaI und HindIII verdaut, und die Enden wurden abgestumpft, wobei ein pntAB enthaltendes DNA-Fragment erhalten wurde. Das Plasmid pMWD5 wurde mit AflII verdaut, die Enden wurden abgestumpft, und das Plasmid wurde in die Schnittstelle des vorstehend beschriebenen DNA-Fragments, welches pntAB enthält, unter Erhalt von pMWD5-THY eingeführt (9).
(8) Produktion eines Plasmids, welches das ilvGMEDA-Operon und das ppc-Gen enthält (pMWD5-ppc)
Das Plasmid ppc wurde mit SacI und XbaI verdaut, und die Enden wurden abgestumpft, wobei ein ppc-enthaltendes DNA-Fragment erhalten wurde. Das Plasmid pMWD5 wurde mit AflII verdaut, die Enden wurden abgestumpft, und das Plasmid wurde in die Schnittstelle des vorstehend beschriebenen DNA-Fragments, das ppc enthält, eingeführt, wobei pMWD5-ppc erhalten wurde (9).
(9) Herstellung eines Plasmids, welches das ilvGMEDA-Operon, das pntAB-Gen und das ppc-Gen enthält (pMWD5-PTS)
Das Plasmid pPTS wurde mit SacI und HindIII verdaut, und die Enden wurden abgestumpft, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, welches ppc und pntAB enthält. Das Plasmid pMWD5 wurde mit AflII verdaut, die Enden wurden abgestumpft, und das Plasmid wurde in die Schnittstelle des vorstehend beschriebenen DNA-Fragments, welches ppc und pntAB enthält, eingeführt, wobei pMWD5-PTS erhalten wurde (9).
(10) Herstellung eines Plasmids, welches das ilvGMEDA-Operon, das aspA-Gen, pntAB-Gen und das ppc-Gen enthält (pMWD5-APT)
Das Plasmid pAPT wurde mit SacI und HindIII verdaut, und die Enden wurden abgestumpft, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, das ppc, pntAB und aspA enthält. Das Plasmid pMWD5 wurde mit AflII verdaut, die Enden wurden abgestumpft, und das Plasmid wurde in die Schnittstelle des vorstehend beschriebenen DNA-Fragments, welches ppc, pntAB und aspA enthält, eingeführt, wobei pMWD5-APT erhalten wurde (9).
Beispiel 2: Produktion von Aminosäuren durch Escherichia coli, welche verschiedene Plasmide enthalten
(1) Produktion von L-Threonin
Die verschiedenen, in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide wurden jeweils in Escherichia coli VKPM 8-3996 eingeführt. Diese Stämme wurden unter den folgenden Stämmen kultiviert.

Die Kultivierung wurde 38 Stunden bei 37°C unter Rühren bei 114-116 UpM unter Verwendung eines Mediums der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung durchgeführt. Komponente A, Komponente B und Komponente C, die in Tabelle 1 genannt sind, wurden getrennt hergestellt und sterilisiert, und dann wurden sie gekühlt und in einem Verhältnis von 16/20 Volumina Komponente A, 4/20 Volumina Komponente B und 30 g/l Komponente C gemischt. Die Ergebnisse der Messungen der angehäuften Mengen von L-Threonin in dem Medium sind in Tabelle 2 gezeigt. Es wurde gefunden, daß in L-Threonin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia die L-Threoninproduktion der intrazellulären THY-Aktivität und der PEPC-Aktivität verbessert werden konnte. Es wurde ebenfalls gefunden, daß die Threoninproduktion durch verstärkte AspA-Aktivität weiter verbessert werden konnte. Tabelle 1: Threoninproduktionsmedium

A		(g/L)
	(NH₄)₂SO₄	16
	KH₂PO₄	1
	MgSO₄·7H₂O	1
	FeSO₄·7H₂O	0,01
	MnSO₄·4H₂O	0,01
	Hefeextrakt (Difco)	2
	L-Methionin	0,5
	eingestellt auf pH 7,0 mit KOH und autoklaviert bei 115°C während 10 Minuten (16/20 Volumina)
B	20% Glucose, autoklaviert bei 115°C während 10 Minuten (4/20 Volumina)
C	CaCO₃ gemäß der japanischen Pharmacopeia, trockensterilisiert bei 180°C während 2 Tagen (30 g/L) Antibiotika (100 μ/l Streptomycin und 50 μg/l Ampicillin

Tabelle 2

Wirt	Plasmid	Angehäufte Menge L-Threonin (g/L)
B-3996	pMW118	14,0
	pppc	14,5
	pMW::THY	15,0
	PMW118::aspA	14,0
	pPTS	16,8
	pAPT	17,2

(2) Produktion von L-Isoleucin
Die verschiedenen, in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide wurden jeweils in Escherichia coli VKPM B-3996 eingeführt. Diese Stämme wurden unter den folgenden Bedingungen kultiviert.
Die Kultivierung wurde in einem Medium für die L-Isoleucinproduktion (enthaltend 40 g Glucose, 16 g Ammoniumsulfat, 1 g Monokaliumphosphat, 1 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 Eisen(II)-Sulfatheptahydrat, 0,01 g Manganchlorid tetrahydrat, 2 g Hefeextrakt und 40 g Calciumcarbonat in 1 L Wasser, pH = 7,0) 24 Stunden bei 37°C durchgeführt. Das in dem Medium enthaltende L-Isoleucin wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Es wurde gefunden, daß in L-Threonin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia die L-Isoleucinproduktion durch Verstärken der intrazellulären THY-Aktivität und PEPC-Aktivität verbessert werde konnten. Außerdem wurde gefunden, daß die L-Isoleucinproduktion durch verstärkte AspA-Aktivität weiter verbessert werden konnte. Tabelle 3

Wirt Plasmid Angehäufte Menge L-Threonin (g/L)

B-3996 pMWD5 10,0

pMWD5-ppc 9,9

pMWD5-THY 10,4

pMWD5-aspA 10,0

pMWD5-PTS 10,8

pMWD5-APT 11,2
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bakterium der Gattung Escherichia, das die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin aufweist und worin die intrazelluläre Phosphoenolpyruvatcarboxylaseaktivität und die Transhydrogenaseaktivität dadurch verstärkt sind, dass die Kopienzahl eines Gens oder Operons, das für das jeweilige Enzym kodiert, erhöht ist oder die Expressionsregulationssequenz so modifiziert ist, dass die intrazelluläre Expression des Gens oder Operons verstärkt sein sollte.
Bakterium der Gattung Escherichia nach Anspruch 1, worin die Aktivität eines Enzyms oder von Enzymen, kodiert von dem Threoninoperon oder einem Teil davon, dadurch verstärkt ist, dass die Kopienzahl eines Gens oder Operons, das für das jeweilige Enzym kodiert, erhöht ist oder die Expressionsregulationssequenz so modifiziert ist, dass die intrazelluläre Expression des Gens oder Operons verstärkt sein sollte, und welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin aufweist.
Bakterium der Gattung Escherichia nach Anspruch 2, wobei das Threoninoperon aus thrABC besteht.
Bakterium der Gattung Escherichia nach Anspruch 1, worin die Aktivität eines Enzyms oder von Enzymen, kodiert durch das ilv-Operon oder einem Teil davon, dadurch verstärkt ist, dass die Kopienzahl eines Gens oder Operons, das für das jeweilige Enzym kodiert, erhöht ist oder eine Expressionsregulationssequenz so modifiziert ist, dass die intrazelluläre Expression des Gens oder Operons verstärkt sein sollte, und welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Isoleucin aufweist.
Bakterium der Gattung Escherichia nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aspartaseaktivität dadurch verstärkt ist, dass die Kopienzahl eines Gens oder Operons, das für das je weilige Enzym kodiert, erhöht ist oder die Expressionsregulationssequenz so modifiziert ist, dass die intrazelluläre Expression des Gens oder Operons verstärkt sein sollte.
Bakterium der Gattung Escherichia nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei jedes der Gene oder Operons von einem Bakterium der Gattung Escherichia abgeleitet ist.
Verfahren zur Produktion von L-Threonin oder L-Isoleucin, welches das Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Escherichia nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem Medium umfasst.