DE60205955T3

DE60205955T3 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren

Info

Publication number: DE60205955T3
Application number: DE60205955T
Authority: DE
Inventors: Shintaro Iwatani; Masaki Kobayashi
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2013-11-07
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: EP1225230A1; EP1225230B1; US20020173011A1; US20030138918A1; JP2002209596A; DE60205955T2; EP1225230B2; DE60205955D1; US7045320B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation. L-Aminosäuren werden verbreitet als Ausgangsmaterialien für Arzneimittel, Gewürze, Nahrungsmittel und dergleichen eingesetzt.
Beschreibung des Standes der Technik
Herkömmlicherweise werden L-Aminosäuren durch Fermentation unter Verwendung coryneformer Bakterien der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium industriell hergestellt. In den letzten Jahren sind auch Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien der Gattung Escherichia, wie Escherichia coli, entwickelt worden. Überdies werden verschiedene Techniken zum Erhöhen der L-Aminosäureproduktionsfähigkeit durch Genrekombinationstechniken offenbart (veröffentlichtes japanisches Patent (Kokai) Nr. 57-71397 ; U.S. Patent Nr. 4,371,614 ).
Es wurde berichtet, daß wenn Fructose als Kohlenstoffquelle bei der Massenproduktion von Proteinen eingesetzt wird, die Produktion von Essigsäure verringert ist und die mikrobielle Zellausbeute erhöht ist (A. Aristos et al., Biotechnol. Prog., 15, S. 140–145, 1999). Die Beziehung zwischen Fructose und deren L-Aminosäureproduktion bleibt jedoch ungeklärt.
Offenbarung der Erfindung
Wie vorstehend beschrieben wurde, wurde die Produktivität von L-Aminosäuren durch Kultivieren von Mikroorganismen und Verbesserung der Produktionsverfahren deutlich erhöht. Um jedoch einem erhöhten Bedarf in der Zukunft gerecht zu werden, ist die Entwicklung weiterer kostengünstiger und effizienter Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren wünschenswert.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Verbessern der L-Aminosäureproduktivität von Bakterien der Gattung Escherichia bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehende Untersuchungen durchgeführt, um das vorstehend genannte Ziel zu erreichen. Als Ergebnis haben sie gefunden, daß wenn Fructose als Kohlenstoffquelle eines Mediums, das für die Kultivierung eines Bakteriums der Gattung Escherichia eingesetzt wird, verwendet wird, die L-Aminosäureproduktionsfähigkeit verbessert wurde, was zur vorliegenden Erfindung geführt hat.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit.

(1) Ein Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure, welches das Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Eschericha mit der Fähigkeit zur Produktion der Aminosäure in einem Medium, wobei die Aminosäure in dem Medium produziert und angehäuft wird, und das Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium umfaßt, wobei die Kohlenstoffquelle in dem Medium ein Gemisch ist, das aus 30 bis 70 Gew.-% Fructose und 70 Gew.-% oder weniger Glucose besteht.
(2) Das Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure gemäß (1), wobei das Bakterium der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.
(3) Das Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure gemäß (1) oder (2), wobei die L-Aminosäure L-Tryptophan ist.

In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck ”L-Aminosäureproduktionsfähigkeit” oder ”Fähigkeit zur Herstellung einer Aminosäure” auf die Fähigkeit, eine signifikante Menge einer L-Aminosäure in einem Medium anzuhäufen oder den L-Aminosäuregehalt in mikrobiellen Zellen zu erhöhen, wenn ein Bakterium der Gattung Escherichia in dem Medium kultiviert wird.
In der vorliegenden Erfindung können als die L-Aminosäure L-Tryptophan, L-Phenylalanin, L-Lysin, L-Threonin, L-Valin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Homoserin, L-Glutaminsäure und dergleichen genannt werden.
Bakterien, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie Bakterien der Gattung Escherichia sind und L-Aminosäureproduktionsfähigkeit haben. Spezifische Beispiele der Bakterien der Gattung Escherichia umfassen solche, die in den Arbeiten von Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 2. Auflage, 1208, 1996, Tabelle 1) genannt sind, und Derivate, die von diesen Bakterien abgeleitet sind.
Escherichia coli mit L-Aminosäureproduktionsfähigkeit kann ein mutierter oder rekombinanter Stamm sein. Als Mutante können Mutanten mit einer Mutation, welche die Aktivität eines intrazellulären Enzyms erhöht, das an der Biosynthese einer L-Aminosäure beteiligt ist, insbesondere eine Mutation, welche die Expressionsmenge des Enzyms erhöht, oder eine Mutation, welche die Rückkopplungshemmung ausschaltet, genannt werden. Außerdem kann als der rekombinante Stamm ein Stamm mit erhöhter Kopienzahl eines Gens, das für ein an der L-Aminosäurebiosynthese beteiligtes Enzym kodiert, ein Stamm, dessen Expressionskontrollsequenz modifiziert ist, um die Expressionsmenge des Gens zu erhöhen, ein Stamm, in dem ein für ein Enzym, dessen Rückkopplungshemmung ausgeschaltet ist, kodierendes Gen eingeführt ist, und dergleichen genannt werden.
Die Mutanten können durch Behandeln von Wildtypstämmen von Bakterien der Gattung Escherichia und Derivaten davon durch UV-Bestrahlung oder mit Mutagenisierungsmitteln, die üblicherweise für eine Mutagenesebehandlung eingesetzt werden, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und salpetrige Säure, erhalten werden.
Um die Kopienzahl eines Gens zu erhöhen, können das Zielgen und ein Vektor, der in einem Bakterium der Gattung Escherichia funktioniert, unter Herstellung einer rekombinanten DNA ligiert werden, und das Bakterium der Gattung Escherichia kann mit der rekombinanten DNA transformiert werden. Außerdem kann die Transformation durch ein Verfahren von D. A. Morrison (Methods in Enzymology, 68, S. 326, 1979), durch ein Verfahren, bei dem Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität von DNA zu erhöhen (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, S. 159, 1970), und dergleichen durchgeführt werden. Als der vorstehend genannte Vektor können pUC 19, pUC19, pUC118, pUC119, pBR322, pHSG299, PHSG298, PHSG399, PHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pSTV28, pSTV29 und dergleichen genannt werden, wobei zusätzlich dazu auch Phagenvektoren eingesetzt werden können.
Die Kopienzahl eines Gens kann auch durch die Anwesenheit von mehreren Kopien des Zielgens auf der chromosomalen DNA eines Bakteriums der Gattung Escherichia erhöht werden. Um mehrere Kopien des Zielgens in die chromosomale DNA des Bakteriums der Gattung Escherichia einzuführen, kann die homologe Rekombination unter Verwendung einer Sequenz, die auf der chromosomalen DNA in einer Anzahl von mehreren Kopien vorhanden ist, als Zielsequenz durchgeführt werden. Als eine Sequenz, die auf der chromosomalen DNA in einer Anzahl von mehreren Kopien vorhanden ist, können repetitive DNA oder umgekehrte Wiederholungen eingesetzt werden, die an den Enden von transponierbaren Elementen vorhanden sind. Alternativ dazu können, wie in der offengelegten japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 2-109985 beschrieben wurde, mehrere Kopien des Zielgens in chromosomale DNA eingeführt werden, indem jede auf einem Transposon angebracht wird, um sie zu überführen.
Die Aktivität eines Zielenzyms kann durch Ersetzen einer Expressionskontrollsequenz, wie einem Promotor eines Gens, das für das Zielenzym kodiert, mit einem stärkeren Promotor erhöht werden (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 1-215280 ). Als starke Promotoren sind beispielsweise der lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor, tac-Promotor, P_R-Promotor und P_L-Promotor des Phagen Lamda, der tet-Promotor, amyE-Promotor und dergleichen bekannt.
Im folgenden wird ein Verfahren zum Kultivieren von L-Tryptophan reduzierenden Bakterien als L-Aminosäure produzierende Bakterien der Gattung Escherichia und die spezifischen Bakterienstämme beispielhaft genannt.
Beispiele von Enzymen, die an der L-Tryptophan-Biosynthese beteiligt sind, umfassen die 3-Deoxy-D-arabino-heptulonat-7-phosphatsynthase des L-Tryptophan-Biosynthesesystems (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 5-236947 ), Transketolase ( U.S. Patent Nr. 5,906,925 ), Anthranilatsynthase ( WO 94/08031 (ungeprüfte offengelegte internationale Patentanmeldung in Japanisch (Kohyo) Nr. 7-507693 )), Phosphoglyceratdehydrogenase ( WO 94/08031 ) und dergleichen. Unter diesen Enzymen unterliegt die Anthranilatsynthase bekanntlich einer Rückkopplungshemmung durch L-Tryptophan, und Phosphoglyceratdehydrogenase unterliegt bekanntlich einer Rückkopplungshemmung durch L-Serin.
Als L-Tryptophan produzierende Bakterien der Gattung Escherichia, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind Bakterien der Gattung Escherichia bevorzugt, welche unempfindlich gemachte Anthranilatsynthase, unempfindlich gemachte Phosphoglyceratdehydrogenase oder beide tragen. Ein Bakterium der Gattung Escherichia mit einer solchen Fähigkeit kann beispielsweise durch Mutieren des Anthranilatsynthasegens (trpE) und/oder des Phosphoglyceratdehydrogenasegens (serA), so daß sie keiner Rückkopplungshemmung mehr unterliegen, und durch Einführen des erhaltenen mutierten Gens in das Bakterium der Gattung Escherichia erhalten werden. Genauer gesagt kann als solches Bakterium der Gattung Escherichia ein Transformantenstamm erwähnt werden, der durch Einführen eines Plasmids pGH5 ( WO 94/08031 ), der mutiertes serA enthält, das für unempfindlich gemachte Phosphoglyceratdehydrogenase kodiert, in Escherichia coli SV164, das unempfindlich gemacht Anthranilatsynthase enthält, erwähnt werden.
Außerdem ist ein Bakterium der Gattung Escherichia, in das rekombinante DNA, die ein Tryptophanoperon enthält, auch ein bevorzugtes L-Tryptophan produzierendes Bakterium. Genauer gesagt kann Escherichia coli, in das ein Tryptophanoperon eingeführt ist und das ein für unempfindlich gemachte Anthranilatsynthase kodierendes Gen enthält, erwähnt werden (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 57-71397 und 62-244382 ; U.S. Nr. 4,371,614 ).
Außerdem können als L-Tryptophan produzierende Bakterien Escherichia coli AGX17 (pGX44) [NRRL-B-12263], welches ein Bakterienstamm mit einem Phänotyp der Auxotrophie für L-Phenylalanin und L-Tyrosin ist, und der Stamm AGX6(pGX50)aroP [NRRL B-12264], der ein Plasmid pGX50 mit einem Tryptophanoperon enthält, genannt werden (siehe das U.S. Patent Nr. 4,371,614 für beide).
Außerdem kann die Fähigkeit zur Produktion von L-Tryptophan durch Erhöhen der Fähigkeit zur Produktion von Phosphoenolpyruvat in einer Zelle eines Bakteriums der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Tryptophan erhöht werden ( WO 97/08333 ).
Die vorstehend genannten Gene oder Operons von Enzymen können durch ein übliches Genisolationsverfahren, das dem Fachmann gut bekannt ist, erhalten werden. Beispielsweise kann ein Zielgen durch Synthetisieren von Primern auf der Grundlage einer bekannten Sequenz und Durchführen der PCR unter Verwendung chromosomaler DNA eines Bakteriums der Gattung Escherichia, wie Escherichia coli K-12, als Matrize erhalten werden.
Als Verfahren zum Klonieren eines Gens und Einführen von DNA in eine Wirtszelle, einschließlich Herstellen der chromosomalen DNA, Herstellen einer chromosomalen DNA-Bibliothek, Hybridisierung, PCR, Präparation von Plasmid-DNA, Verdauung und Ligation von DNA, Transformation, Konstruktion von Oligonucleotiden, die als Primer eingesetzt werden, und dergleichen, können Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Solche Verfahren sind in Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., ”Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und dergleichen offenbart.
Im folgenden werden andere L-Aminosäure produzierende Bakterien beispielhaft genannt.
Als ein L-Phenylalanin produzierendes Bakterium kann Escherichia coli AJ12604 (FERN BP-3579) genannt werden ( Europäische Patentveröffentlichung Nr. 488,424 ).
Als L-Lysin produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia kann eine Mutante mit einer Resistenz gegenüber einem L-Lysin-Analogon beispielhaft genannt werden. Das L-Lysin-Analogon ist ein solches, das das Wachstum von Bakterien der Gattung Escherichia inhibiert, wobei jedoch die Inhibition vollständig oder teilweise ausgeschaltet wird, wenn L-Lysin in einem Medium gleichzeitig vorhanden ist. Beispiele davon umfassen Oxalysin, Lysinhydroxamat, (S)-2-Aminoethyl-L-cystein (AEC), γ-Methyllysin, α-Chlorcaprolactam und dergleichen. Mutanten mit einer Resistenz gegenüber diesen Lysinanaloga können dadurch erhalten werden, daß ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia einer üblichen künstlichen Mutationsbehandlung unterworfen wird. Spezifische Beispiele für Bakterienstämme, die für die Herstellung von L-Lysin eingesetzt werden, umfassen Escherichia coli AJ11442 (FERN BP-1543, NRRL B-12185; vergl. die offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 56-18596 und das U.S. Patent Nr. 4,346,170 ) und Escherichia coli VL611. Der Stamm AJ11442 wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Ministry of International Trade and Industry (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, 1–3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305–8566, Japan) am 1. Mai 1981 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERN P-5084. Dann wurde er unter den Vorgaben des Budapester Abkommens am 29. Oktober 1987 von der vorstehend genannten ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung überführt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERN BP-1543. Die Rückkopplungshemmung von Aspartokinase durch L-Lysin ist in den vorstehend genannten Mikroorganismen unempfindlich gemacht worden.
Zusätzlich können auch L-Threonin produzierende Bakterien genannt werden. Dies liegt daran, daß in L-Threonin produzierenden Bakterien die Inhibition von Aspartokinase durch L-Lysin im allgemeinen eliminiert ist. Als L-Threonin produzierende Bakterien von Escherichia coli kann Escherichia coli MG442 genannt werden (vergl. Gusyatiner et al., Genetika (auf russisch), 14, S. 947–956, 1978).
Ein Gen, das für ein L-Lysin Biosyntheseenzym kodiert, kann in dem vorstehend genannten L-Lysin produzierenden Bakterium verstärkt sein. Beispiele eines solchen Gens umfassen ein Gen, das für Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert und eine Mutation zur Aufhebung der Rückkopplungshemmung durch Asparaginsäure hat ( japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 7-83714 ).
Als spezifisches Beispiel für L-Valin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia kann Escherichia voli VL1970 (VKPM B-4411) genannt werden ( Europäische Patentveröffentlichung Nr. 519,113 ).
Andere Bakterien als die vorstehend genannten sind Bakterien der Gattung Escherichia, die ein L-Valin-Biosynthesegen enthalten, dessen Kontrollmechanismus im wesentlichen eliminiert ist. Solche Bakterien der Gattung Escherichia können beispielsweise durch Einführen eines ilvGMEDA-Operons, vorzugsweise eines ilvGMEDA-Operons, das keine Threonindeaminaseaktivität exprimiert und worin die Attenuation eliminiert ist, in ein Bakterium der Gattung Escherichia erhalten werden (vergl. die offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 8-47397 ).
Da die gesamte Nucleotidsequenz des ilvGMEDA-Operons bekannt ist (R. P. Lawther et al., Nucleic Acid Res., 15(5), S. 2137, 1987), kann es aus der chromosmalen DNA von Escherichia coli durch Koloniehybridisierung oder PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, die auf der Grundlage der Sequenz hergestellt wurden, erhalten werden. Ein DNA-Fragment, welches das ilvGMEDA-Operon enthält, kann in Escherichia coli durch das vorstehend genannte Verfahren unter Verwendung eines Plasmids, eines Phagen oder Transposons eingeführt werden.
Beispiele von L-Leucin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia umfassen einen Stamm mit β-2-Thienylalaninresistenz, einen Stamm mit β-2-Thienylalaninresistenz und β-Hydroxyleucinresistenz ( japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 62-34397 ) und einen Stamm mit 4-Azaleucinresistenz oder 5,5,5-Trifluorleucinresistenz (offengelegte japanische Patentanmeldung (Kokai) NR. 8-70879 ).
Als L-Isoleucin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia kann Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781) genannt werden ( europäische Patentveröffentlichung Nr. 519,113 ).
Als L-Threonin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia können Escherichia coli VKPM B-3996 (RIA 1867) ( U.S. Patent Nr. 5,175,107 ) und der Stamm MG442 genannt werden.
Als L-Homoserin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia können der Stamm NZ10 genannt werden, der eine Leu⁺-Revertante des Stammes C600 ist (Appleyard R. K., Genetics, 39, S. 440–452, 1954).
Als L-Glutaminsäure produzierende Bakterien der Gattung Escherichia können L-Valin resistente Stämme genannt werden, wie Escherichia coli B11, Escherichia coli K-12 (ATCC 10798), Escherichia coli B (ATCC 11303) und Escherichia coli W (ATCC 9637).
In der vorliegenden Erfindung wird ein Medium, das 30 bis 70 Gew.-% Fructose als Hauptkohlenstoffquelle enthält, eingesetzt, wenn ein Bakterium der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure kultiviert wird. Die auf Zucker bezogene Ausbeute und die Produktionsrate der L-Aminosäuren werden durch die Verwendung dieser Hauptkohlenstoffquelle verbessert.
Die Kohlenstoffquelle, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist ein wie in Patentanspruch 1 definiertes Gemisch.
Andere Mediumkomponenten als die Kohlenstoffquelle sind übliche Mediumkomponenten, wie eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und organische Spurennährstoffe, die nach Bedarf eingesetzt werden.
Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas, wäßriges Ammoniak und dergleichen eingesetzt werden.
Als anorganische Ionen oder Quelle dafür können kleine Mengen Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zugegeben werden. Als organische Spurennährstoffe sind erforderliche Substanzen, wie Vitamin B₁, Hefeextrakt und dergleichen, in geeigneten Mengen nach Bedarf enthalten.
Die Kultur kann unter einer Bedingung durchgeführt werden, die in Abhängigkeit von dem eingesetzten Bakterienstamm ausgewählt wird, die Kultivierung wird jedoch vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16–72 Stunden durchgeführt. Die Kulturtemperatur wird auf 30–45°C reguliert, und der pH-Wert wird während der Kultivierung auf 5–7 reguliert. Eine anorganische oder organische, saure oder basische Substanz und außerdem Ammoniakgas oder dergleichen können für die pH-Wert-Einstellung eingesetzt werden.
Das Gewinnen der L-Aminosäuren aus der Fermenterflüssigkeit kann durch geeignetes Kombinieren bekannter Verfahren, wie den Einsatz eines Ionenaustauscherharzes, Ausfällung und dergleichen, erreicht werden.
Erfindungsgemäß kann die auf Zucker bezogene Ausbeute und/oder die Produktionsrate in Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren, wie L-Tryptophan, unter Verwendung von Bakterien der Gattung Escherichia verbessert werden.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Beispiele eingehender erklärt.
[1] Konstruktion eines L-Tryptophan produzierenden Stammes von Escherichia coli
Gemäß der Beschreibung in WO 94/08031 (offengelegte internationale Patentanmeldung in Japanisch (Kohyo) NR. 7-507693 ) wurde der trpE-defiziente Stamm Escherichia coli KB862 (DSM7196) mit einem mutierten Gen, das für Anthranilatsynthase kodiert, dessen Rückkopplungshemmung unempfindlich gemacht wurde (im folgenden auch als ”unempfindlich gemachte AS” bezeichnet), versehen, um Escherichia coli SV164 (trpE8) zu erhalten. In diesen Stamm SV164 wurde das Plasmid PGH5 (beschrieben in WO 94/08031 ) eingeführt, das ein für Phosphoglyceratdehydrogenase kodierendes Gen enthält, dessen Rückkopplungshemmung unempfindlich gemacht wurde (im folgenden auch als ”unempfindlich gemachte PGD” bezeichnet). Diesen Stamm SV164/PGH5 hatte die Fähigkeit, Tryptophan und Serin zu produzieren.
Escherichia coli KB862 wurde als AJ13828 bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, 1–3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305–8566, Japan) als internationale Hinterlegung am 21. Dezember 2000 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERN BP-7405.
Das Verfahren zur Konstruktion von SV164/PGH5 wird im folgenden erklärt.

(1) Screening eines mutierten Gens, das für unempfindlich gemachte AS kodiert, und Einverleiben dieses mutierten Gens in das Chromosom.

Ein mutierter Stamm, der gegen Inhibition unempfindlich gemachte AS enthielt, wurde unter Verwendung von 5-Methyltryptophan, ein Tryptophananalogon, gescreent.
E. coli K12 YMC9 (ATCC 33927) wurde einer Mutagenesebehandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NG) gemäß dem Verfahren von Miller unterworfen (Miller J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., S. 125–129, 1972). Das heißt, etwa 2 × 10⁹ YMC9-Zellen wurden in 4 ml 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 5,5), enthaltend 50 μg/ml NG bei 37°C während 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, und die Zellen wurden in einer Menge von 0,1 ml über Nacht bei 37°C in LB-Medium unter Rühren kultiviert. Danach wurde die Kulturbrühe mit 0,9% NaCl aus Verdünnungen von 10^–3, 10^–4 und 10^–5 verdünnt, und 0,1 ml jeder verdünnten Lösung wurde auf eine Minimalmediumplatte, die 100 μg/ml 5-Methyltryptophan enthielt, aufgetragen. Die Zusammensetzung des Minimalmediums enthielt 5 g/l Glucose, 5 mg/l Vitamin B₁, 3 g/l KH₂PO₄, 12 g/l K₂HPO₄, 0,3 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,1 g/l NaCl, 5 g/l (NH₄)₂SO₄, 14,7 mg/l CaCl₂·2H₂O, 2 mg/l FeSO₄·7H₂O, 1 g/l Trinatriumcitrat und 15 g/l Agar.
Nach der Kultivierung bei 37°C während 24–48 Stunden wurden 5-Methyltryptophan-resistente Klone auf das vorstehend genannte Agarmedium geimpft. Um die Eigenschaften des erhaltenen Stammes zu untersuchen, wurde der K_i-Wert von AS zu L-Tryptophan gemessen (Bauerle R. et al., Methods in Enzymology, 142, S. 366–386, 1987). Dadurch konnten die mutierten Stämme in zwei Klassen klassifiziert werden. Die mutierten Stämme der Klasse 1 hatten eine gegen Rückkopplungshemmung resistente Anthranilatsynthase. Die mutierten Stämme der Klasse 2 hatten eine hohe Anthranilatsynthaseaktivität, obwohl ihr K_i-Wert unverändert war. Die AS-Gene dieser mutierten Stämme wurden kloniert, und deren Nucleotidsequenzen wurden bestimmt. Die chromosomale DNA jedes mutierten Stammes wurde isoliert und mit den Restriktionsenzymen NheI und ClaI verdaut, wobei ein Fragment mit etwa 5 kb isoliert wurde, und dieses Fragment wurde mit dem NheI/ClaI-Fragment (4158 bp) von pBR322 ligiert.
E. coli KB 862 (trpE) (DSM7196) wurde mit dem Ligationsprodukt transformiert. Ein Klon, der auf einem Minimalmedium wachsen konnte, das kein L-Tryptophan enthielt, wurde selektiert. Alle Plasmide, welche die trpE-Mutation komplementierten, enthielten das NheI/ClaI-Fragment von 5 kb. Außerdem enthielt dieses 5 kb NheI/ClaI-Fragment trpE, trpD, eine Sequenz etwa 0,8 kb stromaufwärts von trpE, und eine Sequenz etwa 1 kb stromabwärts von trpD. Die Unterschiede in den Aminosäuresequenzen der mutierten AS, die von den in den mutierten Stämmen enthaltenen Plasmiden (pE0, pE5, pE6, pE8) kodiert wurden, und deren K_i-Werte sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die Sequenzanalyse der mutierten Enzyme der Klasse 2 zeigte, daß die Mutation sowohl in der Operatorregion des trp-Promotors als auch in der DNA-Region vorhanden war, die für das trp-Leaderpeptid kodiert. Die Mutationen, die ΔtrpL1 und ΔtrpL2 genannt wurden, hatten eine Deletion in einer Größe von 136 bp oder 110 pb in der DNA-Region, die für das Leaderpeptid kodiert. In der Sequenz, die in der EMBL-Datenbank mit der Nr. V00372 registriert war, wurde die Deletion der Region der Positionen 33–168 in die ΔtrpL1-Mutation eingeführt, während die Deletion der Region der Positionen 11–120 in die ΔtrpL2-Mutation eingeführt wurde.
Die zwei Mutantenklassen wurden kombiniert, um das für die unempfindlich gemachte AS kodierende Gen stark zu exprimieren. Für den Stamm der Klasse 2 wurde die ΔtrpL1-Mutation verwendet. Ein 1,6 kb NruI-Fragment mit der ΔtrpL1-Mutation wurde aus dem Plasmid pΔtrpL isoliert und durch ein korrespondierendes NruI-Fragment in dem Plasmid pE0, pE5, pE6 oder pE8 ersetzt. Die erhaltenen Plasmide wurden als pIE0, pIE5, pIE6 und pIE8 bezeichnet und für die Einverleibung in das Chromosom durch homologe Rekombination eingesetzt.
Ein etwa 5 kb großes NheI/ClaI-Fragment wurde aus jedem Plasmid unter Verwendung einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert und in einem linearen Zustand eingesetzt, um dem recD-Stamm PD106 [ΔtrpLD102] zu transformieren. Als Transformationsverfahren wurde das CaCl₂-Verfahren nach Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2, S. 110–2114, 1972, eingesetzt. Ein Klon, der auf einem Minimalmedium wachsen konnte, das L-Tryptophan nicht enthielt, und der empfindlich gegen Ampicillin war, d. h. der das Plasmid nicht enthielt, wurde selektiert. Das mutierte trpE-Gen, das für die unempfindlich gemachte AS kodierte und die ΔtrpL1-Mutation hatte, wurde aus jedem bakteriellen Stamm in den Stamm KB861 durch P1-Transduktion überführt (Miller J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N. Y., S. 201–205, 1972) und in einem Minimalmedium, das kein Tryptophan enthielt, selektiert. Die erhaltenen Bakterienstämme wurden PD103 (trpE0), KB862 (trpE5), SV164 (trpE8) und SV163 (trpE6) genannt.

(2) Präparation eines serA-Gens, das unempfindlich gemachte PGD kodiert.

Ein für PGD kodierendes serA-Gen wurde aus dem Stamm E. coli B (ATCC 23226) in den Plasmidvektor pUC18 kloniert. Der B-Stamm wurde bei 37°C über Nacht in LB kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4000 × g) gewonnen, und chromosomale DNA wurde durch das in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 2.4.1–2.4.2, 1987, hergestellt. Die chromosomale DNA wurde in einer Menge von 10 μg mit SphI verdaut. Etwa 3 μg des verdauten Produkts wurden mit 0,2 μg des Plasmids pUC18, das ebenfalls mit SphI verdaut worden war, ligiert. Die serA-Mutante PC1523 (CGSC Nr. 5411) (CGSC: E. coli Genetic Stock Center, Department of Biology 255 OML, Yale University, Postbox 6666, New Haven, CT, USA) wurde mit dem Ligationsreaktionsgemisch durch das vorstehend genannte Verfahren von Cohen et al. transformiert.
Die transformierten Stämme wurden auf ein Minimalmedium, das kein L-Serin enthielt, aufgetragen. Die gewachsenen Klone enthielten das E. coli serA-Gen in einem 3,5 kb großen SpHI-Fragment. Die Sequenz des Wildtyp serA-Gens ist in WO 94/08031 beschrieben. Der rekombinante Vektor mit dem serA-Gen wurde pGC3 genannt.
Durch Verwendung des Wildtyp serA-Gens wie vorstehend beschrieben wurde ein serA-Gen hergestellt, das für unempfindlich gemachte PGD kodiert, deren C-terminale Aminosäure deletiert war. Das Plasmid pGC3 wurde mit SalI und KpnI verdaut, und das erhaltene Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt. Ein 2,0 kb SalI-KpnI-Fragment, welches das serA-Gen in vollständiger Länge enthielt, wurde aus dem Gel gereinigt. Dieses Fragment wurde in einer Menge von 0,2 μg zusammen mit einer äquimolaren Menge des mit HindIII/SalI-verdauten Plasmids pUC18 und einem doppelsträngigen Oligonucleotid ligiert, das durch Verbinden der Oligonucleotide der Nucleotidsequenzen der SEQ ID Nr.: 2 und 3 erhalten wurde. Dieses Oligonucleotid komplimentierte 7 der letzten 8 C-terminalen Codons des serA-Gens und führte anstelle des B. Codons ein Terminationscodon TAA ein. Deshalb wurde PGD, die von diesem mutierten serA-Gen kodiert wurde, um einen Aminosäurerest am C-Terminus verkürzt. Das Plasmid, das dieses mutierte serA-Gen enthielt, wurde als pGH5 bezeichnet. Die unempfindlich gemachte PGD, die von diesem Gen kodiert wird, hatte einen Ki-Wert von 0,1–50 μM gegenüber Serin, und ihre Rückkopplungshemmung durch Serin war ausgeschaltet worden.
[2] Produktion von L-Tryptophan
Das vorstehend genannte Tryptophan produzierende Bakterium Escherichia coli SV164/pGH5 wurde in 50 ml LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid) in einem konischen Kolben mit einem Volumen von 500 ml geimpft und unter Rühren (150 UpM) bei 30°C während 7–8 Stunden vorkultiviert.

Etwa 1 ml der vorstehend genannten Vorkultur wurde in 300 ml des Impfkulturmediums mit der nachstehend gezeigten Zusammensetzung geimpft. Die Kultivierung wurde bei 30°C während 11–15 Stunden bei 800 UpM unter Verwendung eines Fermenters mit 1 l Volumen durchgeführt. Zusammensetzung des Impfkulturmediums

Glucose	5 g/l
KH₂PO₄	12 g/l
(NH₄)₂SO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7H₂O	0,3 g/l
CaCl₂·2H₂O	15 mg/l
FeSO₄·7H₂O	2 mg/l
Na₂ Citrat·2H₂O	1 g/l
Spurenelementlösung	1 mg/l
L-Phenylalanin	40 mg/l
L-Tyrosin	40 mg/l
Vitamin B₁	5 mg/l
Tetracyclin	15 mg/l

Spurenelementlösung

Na₃MoO₄	0,15 g/l
H₃BO₃	2,5 g/l
CoCl₂·6H₂O	0,7 g/l
CuSO₄·5H₂O	0,25 g/l
MnCl₂·4H₂O	1,5 g/l
ZnSO₄·7H₂O	0,3 g/l

30 ml der vorstehend genannten Impfkulturbrühe wurden in 300 ml eines Hauptkulturmediums mit der nachstehend gezeigten Zusammensetzung geimpft. Unter Verwendung eines Fermenters mit 1 l Volumen wurde das Medium bei 30°C unter Rühren bei 800 UpM und einer Belüftung von 1 vvm mit Druckluft, die mit einem Sterilisationsfilter sterilisiert war, kultiviert. Außerdem wurde während der Kultivierung die Temperatur bei 31°C gehalten, und der pH-Wert wurde mit Ammoniakgas bei 6,7 gehalten. Zusammensetzung des Hauptkulturmediums

Glucose	17,5 g/l
KH₂PO₄	1,5 g/l
(NH₄)₂SO₄	5 g/l
NaCl	0,5 g/l
MgSO₄·7H₂O	0,3 g/l
CaCl₂·2H₂O	15 mg/l
FeSO₄·7H₂O	75 mg/l
Na₂ Citrat·2H₂O	1 g/l
Spurenelementlösung	1 mg/l
L-Phenylalanin	75 mg/l
L-Tyrosin	750 mg/l
Vitamin B₁	5 mg/l
Hefeextrakt	2,5 g/l
Trypton	2,5 g/l
Tetracyclin	20 mg/l

Spurenelementlösung

Na₃MoO₄	0,15 g/l
H₃BO₃	2,5 g/l
CoCl₂·6H₂O	0,7 g/l
CuSO₄·5H₂O	0,25 g/l
MnCl₂·4H₂O	1,5 g/l
ZnSO·7HO	0,3 g/l

Während der Kultivierung wurde die Zuckerkonzentration in dem Fermenter durch Einpumpen von 700 g/l (Gew./Vol.) einer Zuckerlösung mit einer in Tabelle 2 gezeigten Zusammensetzung (durch Autoclavieren sterilisiert) auf 5–20 g/l eingestellt. Nach 48 Stunden der Kultivierung wurde die L-Tryptophankonzentration in dem Medium gemessen. Die auf Zucker bezogene Ausbeute und die Produktionsrate sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 zeigt die Verhältnisse, wenn der Wert von G100 als 1 angenommen wird. Tabelle 2: Zusammensetzung der Kohlenstoffquelle

G100 G30F70 G50F50 G70F30 F100

Glucose (%) 100 30 50 70 0

Fructose (%) 0 70 50 30 100

Tabelle 3: Produktionsausbeute und Produktionsrate von L-Tryptophan

G100 G30F70 G50F50 G70F30 F100

Ausbeute 1 1,14 1,27 1,19 1,22

Produktionsrate 1 1,41 1,47 1,42 1,34

Der Wert für G100 wurde als 1 angenommen
Es wurde gefunden, daß wenn Glucose mit Fructose gemischt wird, sowohl die auf Zucker bezogene Ausbeute als auch die Produktionsrate im Vergleich zu dem Fall, wenn eine 100 Glucoselösung eingesetzt wurde, verbessert waren. Insbesondere wurde, wenn der Anteil an Fructose in der Kohlenstoffquelle etwa 50% war, die höchste Produktivität beobachtet.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, welches das Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion der L-Aminosäure in einem Medium zur Herstellung und Anhäufung der L-Aminosäure in dem Medium und das Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium umfasst, wobei die Kohlenstoffquelle in dem Medium ein Gemisch ist, das aus 30 bis 70 Gew.-% Fruktose und 70 Gew.-% oder weniger Glukose besteht.
Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 1, wobei das Bakterium der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.
Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei die L-Aminosäure L-Tryptophan ist.