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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Biotechnologie und genauer gesagt
ein Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren durch Fermentation unter
Verwendung eines Aminosäure
produzierenden Bakteriums der Gattung Escherichia, welches Saccharose
als alleinige Kohlenstoffquelle verwerten kann.
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Beschreibung des Standes der
Technik
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Saccharose
und Saccharose enthaltende Substrate (beispielsweise Melasse) werden
oft als Ausgangspunkt für
die mikrobielle Produktion von kommerziellen Produkten, wie Aminosäuren, Vitaminen
und organischen Säuren,
eingesetzt. Die Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren aus
Kohlenhydraten dienen der Maximierung der Effizienz, mit der das
Kohlenstoffskelett von Kohlenhydraten in ein gewünschtes Produkt umgewandelt
wird.
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Die
Mehrheit der Saccharose-positiven Bakterien bewerkstelligen die
Aufnahme und die Phosphorilierung von Saccharose durch ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Saccharose-6-Phosphotransferasesystem (Saccharose-PTS),
wobei intracelluläres
Saccharose-6-phosphat erhalten wird. Dieses Phosphat wird durch Saccharose-6-phosphathydrolase
(Invertase oder Sucrase) in D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose
hydrolysiert, welche ihrerseits durch eine ATP-D-Fructose-6-phosphatphosphotransferase
(Fructokinase) phosphoriliert wird. Solche Systeme und metabolischen
Wege sind auf molekularer Ebene für die Gramm-positiven Bakterien Bacillus subtilis
und Streptococcus mutans (Debarbouille et al., 1991, Res. Microbiol.,
142: 757–764; Sato
et al., 1989, J. Bacteriol., 171: 263–271) und für Gramm-negative Bakterien
beschrieben worden. Ein weiteres, Plasmid kodiertes pUR400-System
für Enterobacterien
ist berichtet worden (Aulkemeyer et al., (1991) Mol. Microbiol.,
5: 2913–2922;
Schmid et al., 1988. Mol. Microbiol., 2: 1–8; Schmid et al., 1991. Mol.
Microbiol., 5: 941–950).
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Obwohl
etwa 50 % der Wildtypisolate von Escherichia coli Saccharose-positiv
sind, können
die Laborstämme
von E. coli, wie E. coli K12, E. coli B, E. coli C, die derzeit
zum Züchten
der industriell wichtigen Produktionsstämme verwendet werden, Saccharose
nicht verwerten. Diese Eigenschaft kann jedoch auf einfache Weise
durch Einverleiben von Saccharosenutzungsgenen aus Saccharose-positiven
Stämmen
von E. coli oder Salmonella unter Einsatz der Konjugation, Transduktion
oder Klonierungsverfahren auf diese Stämme übertragen werden (Wohlhieter
et al., 1975, J. Bacteriol., 122:401–406; Parsell and Smith, 1975,
J. Gen. Microbiol., 87: 129–137;
Alaeddinoglu and Charles, 1979, J. Gen. Microbiol., 110:47–59; Livshits
et al., 1982, In: Metabolic plasmids. P.132–134; Garsia, 1985, Mol. Gen.
Genet., 201:575–577;
US Patent Nr. 5,175,107 ).
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Phosphoenolpyruvat
(PEP) ist einer der wesentlichen Bausteine in mehreren biosynthetischen
Wegen. PEP wird mit Kohlendioxid unter Bildung von Oxalessigsäure kombiniert.
Oxalessigsäure
dient als Kohlenstoffskelett für
Asparaginsäure,
Asparagin, Threonin, Isoleucin, Methionin und Lysin. Daneben wird
eine äquimolare
Menge PEP mit Erythrose-4-phosphat unter Bildung von 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat
(DAHP), dem ersten Intermediat des gemeinsamen Abschnittes des aromatischen
Biosyntheseweges, kondensiert. Aus dieser metabolischen Route können solche
kommerziell wichtigen Aminosäuren
wie Tryptophan, Phenylalanin und Tyrosin erhalten werden. Die Ausbeute
dieser Metaboliten kann durch die Verfügbarkeit von PEP limitiert
werden.
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Während der
Glycolyse werden vier Mol PEP aus zwei Mol Glucose produziert, und
die Hälfte
des PEP wird obligatorisch verbraucht, um Energie für die Glucoseaufnahme
bereitzustellen. Im Fall der Saccharoseaufnahme produzieren zwei
Mol Hexose (Glucose und Fructose), die sich aus einem Mol Saccharose
ergeben, auch vier Mol PEP, es wird jedoch nur ein Mol für den Saccharosetransport
verbraucht, so dass die Menge des verfügbaren PEP als Quelle für Kohlenstoffskelette
für die
Biosynthese 1,5-fach erhöht
wird. Deshalb ist es möglich,
die Aminosäureausbeute
durch Bereitstellen des Aminosäure
produzierenden Stammes von E. coli mit der Fähigkeit zur Verwertung von
Saccharose und durch Einsatz von Saccharose oder Saccharose enthaltenden
Substraten als Kohlenstoffquelle zu verbessern.
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Im
Stand der Technik ist der Threonin produzierende Stamm VKPM B-3996
auf der Grundlage von E. coli K-12, der Saccharose verwerten kann
(
US Patent Nr. 5,705,371 ),
bekannt. Die Restriktion und die Sequenzanalyse der klonierten Saccharosegene
aus dem Stamm VKPM B-3996 zeigte, dass sie fast identisch sind zu
denjenigen von pUR400 (Zugangsnummer: EMBL X61005; EMBL X67750,
GB M38416), welches PTS-Sucrose für den Transport und den Metabolismus
kodiert (Lengeler et al., 1982, J. Bacteriol., 151:468–471; Schmid
et al., 1988, Mol. Microbiol., 2:1–8; Schmid et al., 1991, Mol.
Microbiol., 5:941–950).
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Ein
chromosomal kodierter, nicht-PTS-Metabolismusweg für die Verwertung
von Saccharose wurde auch in Escherichia coli gefunden (Bockmann
et al., 1992, Mol. Gen. Genet., 235:22–32). Der Syntheseweg umfasst
ein Protonsymport-Transportsystem (Permease vom LacY-Typ), eine
Invertase, eine Fructokinase und einen Saccharose spezifischen Repressor.
Durch Verwendung dieses nicht-PTS-Metabolismusweges konnte der Ausstoß einer
Aminosäure,
die sich von einem PEP-Vorläufer
ableitet, weiter erhöht
werden, weil der Saccharosetransport in die Zellen nicht an PEP
gekoppelt ist. Dieser Ansatz wurde jedoch für die Verbesserung von Aminosäure produzierenden
Stämmen
bislang niemals versucht.
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Bockmann,
J. et al.: "Characterization
of a chromosomally encoded, non-PTS metabolic pathway for sucrose
utilization in Escherichia coli EC3132", Molecular and General Genetics, Springer
Verlag, Berlin, DE, vol. 235, Nr. 1, 1. Oktober 1992, Seiten 22–32, ISSN:
0026-8925 offenbart ein Bakterium der Gattung Escherichia, das von
einem Saccharose nicht assimilierenden Stamm der Gattung Escherichia
konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose nicht-PTS-Gene
enthält
und die Fähigkeit
hat, eine Aminosäure
inhärent zu
produzieren.
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Zusammenfassende Darstellung
der Erfindung
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum
Herstellen von Aminosäuren
unter Verwendung von Stämmen
von Escherichia coli bereit zu stellen, welche die für den metabolischen
Syntheseweg für
die Verwertung von Saccharose kodierenden Gene enthalten, insbesondere
für den nicht-PTS-Metabolismusweg
für die
Verwertung von Saccharose.
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Die
Erfinder haben gefunden, dass ein Bakterium der Gattung Escherichia
mit der Fähigkeit
zur Produktion einer Aminosäure
die Aminosäure
durch Einführen
von Saccharosegenen in das Bakterium effizient produziert. Auf diese
Weise wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
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Das
heißt,
die vorliegende Erfindung stellt Folgendes bereit:
- (1) Ein Verfahren zum Produzieren einer Aminosäure, welches
die Stufe umfasst, bei der ein Bakterium der Gattung Escherichia
in einem Kulturmedium, das Saccharose als Hauptkomponente enthält, kultiviert
wird und die Aminosäure
in dem Kulturmedium produziert und angehäuft wird, wobei das Bakterium
aus einem Saccharose nicht-assimilierenden Stamm der Gattung Escherichia
konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose-nicht-PTS-Gene
enthält,
die für
Permease, Invertase und Fructokinase kodieren, und die Fähigkeit
hat, die Aminosäure
in einem Kulturmedium zu produzieren und anzuhäufen und Saccharose als einzige
Kohlenstoffquelle zu verwerten.
- (2) Verfahren nach Punkt (1), wobei die Aminosäure aus
der aus Threonin, Homoserin, Isoleucin, Lysin, Valin und Tryptophan
bestehenden Gruppe ausgewählt
ist.
- (3) Verfahren nach Punkt (1) oder (2), wobei die Saccharose-nicht-PTS-Gene von
dem Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7914 abgeleitet
sind.
- (4) Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (3), wobei das Bakterium
der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.
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In
der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäure in der L-Konfiguration, wenn
nichts anderes angegeben ist.
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Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend beschrieben.
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Das
Bakterium der Gattung Escherichia, das in der vorliegenden Erfindung
eingesetzt wird, ist ein Bakterium, das aus einem Saccharose nicht
assimilierenden Stamm von Escherichia coli als Ausgangsstamm konstruiert
wird, wobei dieser Stamm Saccharose-nicht-PTS-Gene enthält, und
das die Fähigkeit
zur Produktion einer Aminosäure
hat.
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Ein
Saccharose nicht assimilierender Stamm von Escherichia coli ist
nicht besonders eingeschränkt, solange
er die Fähigkeit
hat, eine Aminosäure
zu produzieren, oder diese Fähigkeit übertragen
kann. Die Beispiele solcher Stämme
umfassen E. coli K-12, E. coli B und E. coli C, und deren Derivatstämme, genauer
gesagt die nachstehend erwähnten
Aminosäure
produzierenden Stämme.
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Das
in der vorliegende Erfindung eingesetzte Bakterium kann durch Einführen von
Saccharose-nicht-PTS-Genen in einen Aminosäure produzierenden Stamm, wie
die vorstehend beschriebenen Stämme,
erhalten werden. Alternativ dazu kann das in der vorliegenden Erfindung
eingesetzte Bakterium durch Übertragen
der Fähigkeit
zur Produktion einer Aminosäure
auf ein Bakterium der Gattung Escherichia, worin Saccharose-nicht-PTS-Gene
eingeführt
sind, erhalten werden.
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Saccharose-nicht-PTS-Gene
sind nicht besonders eingeschränkt,
solange sie in einem Bakterium der Gattung Escherichia funktionieren
können.
Die Gene sind beispielsweise die Saccharose-nicht-PTS-Gene (csc),
die in E. coli EC3132 (Bockmann et al., 1992. Mol. Gen. Genet.,
235:22–32).
Die csc-Gene können
aus E. coli K12 W3350csc präpariert
werden. Der Stamm W3350csc wurde bei der Russian National Collection
of Industrial Microorganisms (Russland 113545 Moskau, 1 Dorozhny
proezd, 1), nach den Vorgaben des Budapester Abkommens unter der
Hinterlegungsnummer VKPM B-7914 hinterlegt.
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Die
csc-Gene umfassen die Gene, die für ein Protonensymport-Transportsystem (Permease
vom LacY-Typ), Invertase, Fructokinase und einen Saccharose-spezifischen
Repressor kodieren. Unter diesen sind für die vorliegende Erfindung
zumindest die Gene erforderlich, die für Permease, Invertase und Fructokinase kodieren.
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Die
Saccharose-nicht-PTS-Genen können
in ein Bakterium der Gattung Escherichia beispielsweise durch Einführen eines
rekombinanten Plasmids, welches die gewünschten Gene enthält, in das
Bakterium einverleibt werden. Genauer gesagt können die gewünschten
Gene in ein Bakterium der Gattung Escherichia durch Einführen eines
Plasmids, eines Phagen oder eines Transposons (Berg, D. E. and Berg,
C.M., Bio/Tecnol., 1, 417 (1983)), welches die gewünschten
Gene trägt,
in eine Zelle des Bakteriums einverleibt werden.
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Der
Vektor ist beispielsweise ein Plasmidvektor, wie pBR322q, pMW118,
pUC19 oder dergleichen, oder ein Phagenvektor, einschließlich Phage
P1vir, mini-Mud, wie pMu4041 oder dergleichen. Das Transposon ist
beispielsweise Mu, Tn10, Tn5 oder dergleichen.
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Die
Einführung
einer DNA in ein Bakterium der Gattung Escherichia kann beispielsweise
durch das Verfahren von D. A. Morrison (Methods in Enzymology 68,
326 (1979)) oder durch ein Verfahren, bei dem die Empfängerzellen
mit Calciumchlorid behandelt werden, um ihre Permeabilität für DNA zu
erhöhen
(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) und dergleichen
durchgeführt
werden. Alternativ dazu kann die Einführung einer DNA auch durch
Transduktion unter Verwendung eines Phagenvektors durchgeführt werden.
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Die
Saccharose-nicht-PTS-Gene werden in ein Aminosäure produzierendes Bakterium
der Gattung Escherichia mit dem Ergebnis eingeführt, das die Aminosäure aus
Saccharose produziert wird. Als Bakterium der Gattung Escherichia,
in das die Saccharose-nicht-PTS-Gene eingeführt werden, können Stämme eingesetzt
werden, welche die gewünschte
Aminosäure
produzieren können.
Daneben kann die Fähigkeit
zur Produktion einer Aminosäure
auf ein Bakterium übertragen
werden, in das die Saccharose-nicht-PTS-Gene eingeführt werden.
Beispiele der Aminosäure
produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia coli werden nachstehend
beschrieben.
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(1) Threonin produzierende Bakterien
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Als
Threonin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia können MG442
(vgl. Gusyatiner, et al., Genetika (auf Russisch), 14, 947–956 (1978),
VL643 und VL2055 (s. Beispiele 2 und 3) beispielhaft genannt werden).
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(2) Homoserin produzierende Bakterien
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E.
coli NZ10 und NZ10rhtA23/pAL4 können
als Homoserin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia beispielhaft
genannt werden. Der Stamm NZ10 wurde als eine Leu+-Revertante
des bekannten Stammes C600 erhalten (Appleyard, R. K., Genetics,
39, 440–452
(1954)). Der Stamm NZ10 rhtA23/pAL4 wurde aus NZ10 konstruiert (vgl.
Beispiel 4).
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(3) Isoleucin produzierende Bakterien
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Als
Isoleucin produzierende Bakterien können E. coli 44-3-15, der Stamm
KX141 (VKPM B-4781) (
EP-A-519113 )
und TDH-6/pVIC40, pMWD5 (
WO 97/08333 )
beispielhaft genannt werden.
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(4) Lysin produzierende Bakterien
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Als
Lysin produzierende Bakterien sind E. coli VL612 bevorzugt (Beispiel
5). Zudem können
Lysin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia beispielhaft
genannt werden, genauer gesagt ein mutierter Stamm mit Resistenz
gegenüber
Lysinanaloga. Das Lysinanalogon inhibiert die Proliferation von
Bakterien der Gattung Escherichia, die Supression ist jedoch vollständig oder
teilweise aufgehoben, wenn Lysin in einem Medium koexistiert. Als
Beispiele seien Oxalysin, Lysinhydroxamat, (S)-2-Aminoethyl-L-cystein
(AEC), Gamma-Methyllysin, Chlorcaprolactam und dergleichen genannt.
Mutierte Stämme
mit Resistenz gegenüber
diesen Lysinanaloga werden erhalten, indem ein üblicher künstlicher Mutationsvorgang
auf Bakterien der Gattung Escherichia angewandt wird. Der für die Lysinproduktion
einzusetzende Bakterienstamm ist beispielsweise Escherichia coli
AJ11442 (hinterlegt als FERM BP-1543 und NRRL B-12185; vgl. die
offengelegte
Japanische Patentanmeldung
Nr. 56-18596 oder das
US
Patent Nr. 4,346,170 ) und Escherichia coli VL611. Escherichia coli
AJ11442 wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology,
Agency of Industrial Science and Technology (derzeit National Institute
of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology)(Postleitzahl: 305, 13, Higashi 1 chome,
Tsukubashi, Ibarakiken, Japan) am 5. Mai 1981 unter der Hinterlegungsnummer
FERM P-5084 hinterlegt und nach den Bestimmungen des Budapester
Abkommens aus der ursprünglichen
Hinterlegung am 29. Oktober 1987 in eine internationale Hinterlegung
unter der Nummer FERM BP-1543 überführt. In
der Aspartokinase der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen ist
die Rückkopplungshemmung
durch Lysin aufgehoben.
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Daneben
können
beispielsweise Threonin produzierende Bakterien genannt werden,
weil die Inhibition ihrer Aspartokinase durch Lysin im Allgemeinen
in Threonin produzierenden Bakterien ebenfalls aufgehoben ist. Als
Threonin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia coli kann
MG442 beispielhaft genannt werden (Gusyatiner, et al., Genetika
(auf Russisch), 14, 947–956
(1978).
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Ein
oder mehrere Gene, welche ein oder mehrere Enzyme im Lysinbiosyntheseweg
kodieren, können in
dem vorstehend genannten Bakterium verstärkt sein. Ein Beispiel eines
solchen Gens ist das Gen, das für Phosphoenolpyruvatcarboxylase
kodiert und so mutiert ist, dass die Rückkopplungshemmung durch Asparaginsäuren aufgehoben
ist (vgl. die
Japanische Patentveröffentlichung
Nr. 7-83714 ).
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(5) Valin produzierende Bakterien
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Valin
produzierende Bakterien sind beispielsweise E. coli VL1970 (VKPM
B-4411) (vgl.
EP-A-519113 ) und
VL1971 (vgl. Beispiel 6). Daneben können Bakterien der Gattung
Escherichia beispielhaft genannt werden, welche die Gene für die Biosynthese
von Valin, deren regulatorischer Mechanismus im Wesentlichen unterdrückt ist,
enthalten. Solche Bakterien können
durch Einführen
des ilvGMEDA-Operons, welches nicht vorzugsweise Threonindeaminase
exprimiert und dessen Attenuation unterdrückt ist, in Bakterien der Gattung Escherichia erhalten
werden (offengelegte
Japanische
Patentanmeldung Nr. 8-47397 ).
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Das
ilvGMEDA-Operon kann von der chromosomalen DNA von E. coli durch
Koloniehybridisierung oder PCR unter Verwendung eines Oligonucleotids
erhalten werden, das anhand der Nucleotidsequenz des Operons, dessen
gesamte Sequenz bekannt ist (Nucleic Acid Res., 15, 2137 (1987)),
präpariert
wird. Die Einführung
eines DNA-Fragments, welches das ilvGMEDA-Operon enthält, kann durch das Verfahren
unter Verwendung eines Plasmids, eines Phagen oder eines Transposons
wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden.
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(6) Tryptophan produzierende Bakterien
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Ein
Tryptophan produzierendes Bakterium ist beispielsweise E. coli SV164
(pGH5) (vgl. Beispiel 7), AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) und AGX6 (pGX50)aroP (NRRL B-12264)
(USP 4,371,614), AGX17/pGX50, pACKG4-pps (
WO97/08333 ).
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(7) Phenylalanin produzierende Bakterien
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Ein
Phenylalanin produzierendes Bakterium ist beispielsweise E. coli
AJ 12604 (FERM BP-3579)(
EP-A-488424 ).
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Eine
Aminosäure
kann effizient aus Saccharose hergestellt werden durch Kultivieren
des vorstehend beschriebenen Bakteriums, in das die Saccharose-nicht-PTS-Gene
eingeführt
sind und welches eine Aminosäure
produzieren kann, in einem Saccharose enthaltenden Kulturmedium,
wobei die Aminosäure
in dem Medium produziert und angehäuft wird, und durch Gewinnen
der Aminosäure
aus dem Medium. Die Aminosäure ist
beispielsweise vorzugsweise Threonin, Homoserin, Isoleucin, Lysin,
Valin, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin und Methionin, stärker bevorzugt
Threonin, Homoserin, Isoleucin, Lysin, Valin und Tryptophan.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Produktion von Aminosäuren
kann die Kultivierung des Bakteriums der Gattung Escherichia, die
Gewinnung und die Reinigung der Aminosäure aus dem flüssigen Medium
auf ähnliche
Weise wie bei herkömmlichen
Fermentationsverfahren durchgeführt
werden, wobei die Aminosäure
unter Verwendung eines Bakteriums produziert wird. Ein in der Kultur
eingesetztes Medium kann entweder ein synthetisches Medium oder
ein natürliches
Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle und eine
Stickstoffquelle und Mineralien sowie bei Bedarf eine mäßige Menge
an Nährstoffen
umfasst, welche das eingesetzte Bakterium zum Wachsen benötigt. Als
Hauptkohlenstoffquelle wird Saccharose eingesetzt. Eine kleine Menge
an Kohlenstoffquellen außer
Saccharose kann in dem Medium als Hilfskohlenstoffquelle enthalten
sein. Als Stickstoffquelle werden verschiedene Ammoniumsalze, wie
Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, eine natürliche Stickstoffquelle,
Pepton, Sojabohnenhydrolysat und verdaute fermentierte Mikroorganismen
eingesetzt. Als Mineralien werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid,
Eisen(II)-Sulfat, Mangansulfat oder Calciumcarbonat eingesetzt.
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Die
Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, beispielsweise
als Schüttelkultur,
unter Belüften
und Rühren
bei einer Temperatur von 20–40 °C, vorzugsweise
zwischen 30 und 38 °C,
durchgeführt.
Der pH-Wert der Kultur ist üblicherweise
zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH-Wert
der Kultur kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen
Basen und Puffern eingestellt werden. Üblicherweise führt eine
1- bis 3-tägige
Kultivierung zu einer Anhäufung
der gewünschten
Aminosäure
in dem flüssigen
Medium.
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Nach
der Kultivierung werden Feststoffe, wie Zellen, aus dem flüssigen Medium
durch Zentrifugation und Membranfiltration entfernt, und dann kann
die gewünschte
Aminosäure
durch Innenaustausch, Konzentration und Kristallfraktionierung gewonnen
und gereinigt werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
die Konstruktion der Plasmide pM1 und pM2, die von mini-Mud 4041
abgeleitet sind.
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2 zeigt
das Schema der Klonierung der scr-Gene in pM1.
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3 zeigt
die Konstruktion der Plasmide pMT1 und pMT2.
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4 zeigt
die Konformation des Plasmids pMH10, welches ein Km®-Gen,
Gene A und B des Mu-Phagen, welche für die Mu-Transposase kodieren, das ner-Gen, das
für einen
negativen Regulator kodiert, und das cts62-Gen enthält, das
für den
Mu-Repressor kodiert.
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Beste Ausführungsform der Erfindung
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele
eingehender erklärt.
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Beispiel 1: Präparation des Donors der Saccharose-nicht-PTS-Gene und der PTS-Gene
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(1) Saccharose-PTS-Gene
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Der
Stamm VD1 wurde als Donor der PTS-Gene für die Verwertung von Saccharose
(scr) eingesetzt. Dieser Stamm wurde wie folgt erhalten. Das Transposon
Tn2555 trägt
die scr-Gene (Doroshenko et al., 1988, Molec. Biol., 22:645–658). Die
Restriktionsanalyse und die Teilsequenzierung zeigten, dass die
scr-Gene von Tn2555 zu denjenigen aus pUR400 (Zugangsnummer: EMBL
X61005; EMBL X67750, GB M38416), welche den Saccharosetransport
und den Saccharosemetabolismus über
das PTS-System kontrollieren, identisch sind.
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Die
scr-Gene von Tn2555 wurden in pM1, einem mini-Mud-Vektor pMu4041-Derivat,
erhalten durch die Deletion der Mu-Phagen- Gene, welche für die Transposase und den Repressor
kodieren, kloniert (M. Faelen. Useful Mu and mini-Mu derivatives.
In: Phage Mu. Symonds et al., Herausgeber, Cold Spring Harbor Laboratory,
New York, 1987, Seiten 309–316).
Dies wurde in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde das
SspI-Fragment von
pBRS5.2 (pBR325::Tn2555) (Doroshenko et al., 1988, Molek. Biol.
22: 645–658),
welches scrYABR-Gene und nur einen Teil des scrK-Gens enthält, in das
mit PvuII geschnittene Plasmid pM1 unter Ersetzen des kan-Gens eingeführt.
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Das
vorstehend beschriebene Plasmid pM1 wurde wie folgt erhalten (1).
Das Plasmid pMu4041 wurde mit HindIII verdaut und unter Ausschneiden
des Gens A und des Gens B, die für
die Transposase des Phagen Mu kodieren, und des Nährgens,
das für
einen negativen Regulator kodiert, erneut in die Ringform überführt, wobei
das Plasmid pMD4041 erhalten wurde. Dann wurde pMD4041 mit AvaIII
und HindIII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase
abgestumpft, und danach wurde erneut ein Ringschluss durchgeführt, um
den cts62-Phage-Mu-Rrepressor zu entfernen.
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In
der zweiten Stufe wurde das BamHI-Fragment des erhaltenen Plasmids
gegen das BamHI-Fragment von pBRS5.2 ausgetauscht, wobei das scrK-Gen
wiederhergestellt wurde. Somit wurde der gesamte Saccharose-Cluster
von Tn2555 in das Plasmid kodiert, das auch einen amp®-Marker
und Enden von Phage Mu enthielt. Dieses Plasmid, das pMS1 genannt
wurde, enthält
ein transponierbares DNA-Fragment mini-Mu-scrKYABR (2).
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Um
mini-Mu-scrKYABR in das Bakteriumchromosom zu integrieren, wurde
ein Standardverfahren eingesetzt. Das Plasmid pMS1 wurde in die
Zellen MG1655(pMH10) eingeführt.
Die Mu-Transposase, kodiert durch pMH10 (pACYCl77-Derivat, welches
ein Km®-Gen, A- und B-Gene
des Mu-Phagen, die für
Mu-Transposase kodieren, das cts62-Gen, das für einen Mu-Repressor kodiert,
und das Repressor-Gen cI857 des Phagen lambda enthält), wurde
durch 15 minütige
Inkubation bei 42 °C
unmittelbar nach der Transformation induziert. Es wurden Saccharose-positive
(Scr+)-Klone auf M9 Agarplatten, enthaltend
0,2 % Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle bei 30 °C selektiert,
gewaschen und in LB-Brühe
(J. Miller. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor
laboratory, New York, 1972), welche keine Antibiotika enthielt,
während
48–72 Stunden
inkubiert. Dann wurden die geeigneten Verdünnungen der Kulturbrühe auf M9
Agarplatten, enthaltend 0,2 % Saccharose, plattiert. Es wurden mehrere
zehn Amps-, Kms-Klone
abgenommen und getestet. Es zeigte sich, dass sie kein Plasmid enthielten.
Unter diesen wurde der Stamm VD1 (MG1655::mini-Mu-scrKYABR) selektiert,
der ein prototropher, schnellwachsender Saccharose-positiver Stamm
ist.
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Daneben
wurde der Stamm VL478, der das Plasmid pVG478 enthält, welches
Saccharose-Gene in dem Transposon Tn2555 trägt (Molecular Genetics, Microbiology
and Virology, Nr. 6, 23–28
(1987)) auch als Donor von scr-Genen eingesetzt. Der Stamm VL478
wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms
(VKPM) unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-7915 hinterlegt.
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Die
vorstehend genannten Stämme
wurden als Donoren von scr-Genen
in den folgenden Beispielen eingesetzt.
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(2) Saccharose-nicht-PTS-Gene
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Als
Quelle der Gene für
die nicht-PTS-Saccharoseverwertung (csc) wurde der Stamm E. coli
K12 W3350csc eingesetzt. Dieser Stamm enthält csc-Gene von E. coli EC3132
(Bockmann et al., 1992, Mol. Gen. Genet., 235:22–32). Der Stamm W3350csc wurde
bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms
(VKPM) unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-7914 hinterlegt. Die csc-Gene enthalten
Gene, die für Permease,
Frucotkinase, Invertase und Repressor kodieren.
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Beispiel 2: Präparation des Threonin produzierenden
Stammes von E. coli, welcher Saccharose verwerten kann, und Threoninproduktion
unter Verwendung des Stammes (1) (nicht vom Umfang der vorliegenden
Erfindung umfasst)
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Als
Empfängerstamm,
in den die PTS-Gene eingeführt
wurden, wurde E. coli VL643 wie folgt neu konstruiert.
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Der
bekannte Stamm E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (auf Russisch),
14, 947–956
(1978), VKPM B-1628) wurde mit der rhtA23-Mutation aus dem Stamm
472T23/pYN7 (VKPM B-2307) transduziert, wobei der Stamm VL64 erhalten
wurde. Die Mutation rhtA23 überträgt eine
Resistenz gegenüber
hohen Konzentrationen von Threonin (> 40 mg/ml) oder Homoserin (> 5 mg/ml) und verbessert
die Threoninproduktion (ABSTRACTS of 17th International Congress
of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual
Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California, August 24–29, 1997, abstract No. 457).
-
Der
so erhaltene Threonin produzierende Stamm VL643 wurde mit dem Phagen
P1
vir, der auf dem Donorstamm VL478 gezüchtet worden
war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium,
enthaltend 0,2 % Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert.
Auf diese Weise wurde der Stamm VL644 erhalten. Dieser Stamm und
der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer
Kulturbrühe kultiviert,
und 0,3 ml jeder der erhaltenen Kulturen wurde in 3 ml eines Fermentationsmediums
mit der folgenden Zusammensetzung in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft
und 72 Stunden bei 37 °C
mit einem Rotationsschüttler
kultiviert. Zusammensetzung
des Fermentationsmediums (g/l):
Saccharose
(oder Glucose) | 50,0 |
(NH4)2SO4 | 10,0 |
K2HPO4 | 1,0 |
NaCl | 1,0 |
MgSO4·7H2O | 0,8 |
FeSO4·7H2O | 0,02 |
MnSO4·5H2O | 0,02 |
Thiaminhydrochlorid | 0,002 |
CaCO3 | 20 |
-
- (MgSO4·7H2O
und CaCO3 wurden jeweils getrennt sterilisiert).
-
Nach
der Kultivierung wurde die angehäufte
Menge Threonin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei
560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Stamm | Glucose | Saccharose |
OD560 | Threonin (g/l) | Ausbeute (%) | OD560 | Threonin (g/l) | Ausbeute (%) |
VL643 | 10,1 | 7,0 | 14,0 | | | |
VL644 | 9,9 | 7,2 | 14,4 | 10,5 | 9,7 | 19,4 |
-
Tabelle
1 zeigt, dass die beiden Stämme
VL643 und VL644 in einem Medium mit Glucose gleichermaßen wuchsen
und etwa die selbe Menge Threonin anhäuften. Daneben wuchs der Stamm
VL644 in einem Medium mit Saccharose gut und häufte unter dieser Bedingung
mehr Threonin mit höherer
Ausbeute an.
-
Beispiel 3: Präparation des Threonin produzierenden
Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Threoninproduktion
unter Verwendung des Stammes (2)
-
Als
Empfängerstamm,
in den die PTS-Gene eingeführt
wurden, wurde E. coli VL2055 konstruiert.
-
E.
coli VL2055 wurde von dem bekannten E. coli Stamm VKPM B-3996 abgeleitet (
US Patent Nr. 5,705,371 ).
Der Stamm B-3996, dessen Wirtsstamm E. coli TDH-6 ist, ist bezüglich des
thrC-Gens defizient und
assimiliert Saccharose, wobei das ilvA-Gen eine Leckmutation hat.
Der Stamm B-3996 enthält
das Plasmid pVIC40, das durch Einführen des thrA*BC Operons, einschließlich des
thrA*-Gens, das für
AKI-HDI kodiert, welche im Wesentlichen von der Inhibition durch
Threonin befreit war, in einen von RSF1010 abgeleiteten Vektor erhalten
worden war.
-
Aus
dem Stamm B-3996 wurde VL2055 in den folgenden zwei Stufen konstruiert.
-
Am
Anfang wurde das plasmidfreie Derivat des Stammes VKPM B-3996, nämlich TDH-6,
nach spontaner Eliminierung des Plasmids pVIC40 selektiert. Dann
wurde durch ein bekanntes Verfahren (NTG-Mutagenese) eine Mutation
erhalten, durch die das Kan-Gen
des Transposons Tn5, welches in das tdh-Gen von TDH-6 eingeführt war,
inaktiviert wurde. Dann wurde das Saccharose nicht verbrauchende
Derivat des erhaltenen Stammes nach der Eliminierung der genetischen
Determinanten der Saccharoseassimilation selektiert. Auf diese Weise
wurde der Stamm VL2053 erhalten.
-
Andererseits
wurde das Plasmid pPRT614 (
EP
0 593 792 ), das in E. coli VKPM B-5318 enthalten ist, mit
HindIII und BamHI verdaut, wobei das Fragment ausgeschnitten wurde,
welches das Threoninoperon unter den Promotor PR des Phagen lambda
enthielt. Das Threoninoperon enthält eine Mutation in dem thrA-Gen (thrA*) welche
die Unempfindlichkeit von Aspartokinasehomoserindehydrogenase I
gegenüber
der Rückkopplungshemmung
durch Threonin verleiht. Das erhaltene Fragment wurde in pM1, einem
mini-Mud-Vektor-pMU4041-Derivat, kloniert (M. Faelen. Useful Mu
and mini-Mu derivatives. In: Phage Mu. Symonds et al., Herausgeber
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987, Seiten 309–316), wobei
das Plasmid pMT2 erhalten wurde (
3).
-
Zudem
wurde das cat-Gen von Tn9 aus PACYC184, welches Resistenz gegenüber Chloramphenicol verleiht,
in pMT2 kloniert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pMT1 erhalten,
welches ein transponierbares Konstrukt von PR-thrA*BC und die von
Mu-Enden flankierten
cat-Gene (mini-Mu-thrA*BC-cat) enthielt (3).
-
Das
Plasmid wurde in die Zellen von E. coli C600 (pMH10) eingeführt. Die
Mu-Transposase, die von pMH10 kodiert wird (pACYC177-Derivat, welches
ein Km®-Gen,
die Gene A und B des Phagen Mu, die für Mu-Transposase kodieren,
das für
einen negativen Regulator kodierende ner-Gen und das für einen
Mu-Repressor kodierende
cts62-Gen enthält,
vgl. 4), wurde durch 15 minütige Inkubation bei 42 °C unmittelbar nach
der Transformation induziert.
-
Chloramphenicol
resistente (Cm®)
Klone wurden auf LB Agarplatten, die 15 mg/l Chloramphenicol enthielten,
bei 30 °C
selektiert. Mehrere zehn Kms-Klone wurden
aufgenommen und getestet. Es zeigte sich, dass die meisten dieser
Klone kein Plasmid enthielten. Dann wurden die PR-thrA*BC-cat-Gene
aus dem Chromosom eines der selektierten Stämme C600 Thr+,
Cm® unter
Verwendung von P1vir in den Stamm VL2053, erhalten in der ersten
Stufe, transduziert, wobei der neue plasmidfreie Threonin produzierende
Stamm VL2055 erhalten wurde.
-
Der
Threonin produzierende Stamm VL2055 wurde mit dem Phagen P1vir,
der auf den Donorstämmen VD1
oder W3350csc gezüchtet
worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium,
enthaltend 50 mg/l Isoleucin und 0,2 % Saccharose als alleinige
Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme VL2055
Scr bzw. VL2055 Csc erhalten. Diese Stämme und der Ausgangsstamm wurden jeweils
18 Stunden bei 37 °C
in einer Nährbrühe kultiviert,
und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums
mit der folgenden Zusammensetzung in ein 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft
und 72 Stunden bei 37 °C
mit einem Rotationsschüttler
kultiviert. Zusammensetzung
des Fermentationsmediums (g(l):
Saccharose
(oder Glucose) | 80 |
Isoleucin | 0,1 |
(NH4)2SO4 | 22 |
K2HPO4 | 2 |
NaCl | 0,8 |
MgSO4·7H2O | 0,8 |
FeSO4·7H2O | 0,02 |
MnSO4·5H2O | 0,02 |
Thiaminhydrochlorid | 0,2 |
Hefeextrakt | 1,0 |
CaCO3 | 30 |
-
- (MgSO4·7H2O
und CaCO3 wurden jeweils getrennt sterilisiert).
-
Nach
der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Threonin in dem
Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte
Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Stamm | Glucose | Saccharose |
OD560 | Threonin (g/l) | Ausbeute (%) | OD560 | Threonin (g/l) | Ausbeute (%) |
VL2055 | 12,0 | 18,9 | 23,6 | | | |
VL2055
scr | 11,7 | 19,5 | 24,4 | 11,4 | 23,3 | 29,1 |
VL2055
csc | 11,6 | 19,2 | 24,0 | 11,6 | 27,9 | 34,9 |
-
Tabelle
2 zeigt, dass beide Saccharose verbrauchenden Stämme, nämlich VL2055 scr und VL2055 csc,
dieselben Wachstumseigen schaften aufwiesen und etwa dieselbe Menge
Threonin wie ihr Ausgangsstamm VL2055 anhäuften, wenn sie in einem Glucose
enthaltenden Medium kultiviert wurden. Diese Stämme häuften jedoch mehr Threonin
bei höherer
Ausbeute an, wenn sie in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert
wurden. Daneben war der Stamm VL2055 csc (mit Saccharose-nicht-PTS-Genen)
unter dieser Bedingungen produktiver als der Stamm VL2055 scr (mit
Saccharose-PTS-Genen).
-
Beispiel 4 Präparation des Homoserin produzierenden
Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Homoserinproduktion
unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden
Erfindung umfasst)
-
Als
ein Empfängerstamm,
der Homoserin produziert, in den die PTS-Gene eingeführt wurden,
wurde E. coli NZ10 rhtA23/pAL4 durch Ableitung von dem Stamm NZ10
konstruiert. Der Stamm NZ10 (thrB) ist eine leuB+-Revertante,
die von dem E. coli-Stamm
C600 (thrB, leuB) erhalten wurde (Appleyard R. K., Genetics, 39, 440–452 (1954)).
Dann wurde die rhtA23-Mutation wie in Beispiel 2 beschrieben eingeführt, wobei
der Stamm NZ10 rhtA23 erhalten wurde. Dieser Stamm wurde mit dem
Plasmid pAL4 transformiert, welches ein pBR322-Vektor ist, in den
das thrA-Gen, das für
Aspartokinasehomoserindehydrogenase I kodiert, eingeführt war.
-
Der
Homoserin produzierende Stamm NZ10 rhtA23/pAL4 wurde mit dem Phagen
P1vir, der auf dem Donorstamm VD1 gezüchtet worden war, infiziert.
Die Transduktanten wurde auf M9 Minimalmedium, enthalten 0,2 % Saccharose
und 50 mg/l Threonin, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme NZ10
rhtA23 scr/pAL4 erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden
jeweils 18 Stunden bei 37 °C
in einer Nährbrühe kultiviert,
und 3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums
in einem 20 × 200 ml
Teströhrchen
eingeimpft und 48 Stunden bei 37 °C
auf einem Rotationsschüttler
kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte dieselbe Zusammensetzung
wie dasjenige in Beispiel 3, außer
dass 0,2 g/l Threonin anstelle von Isoleucin zugegeben wurde.
-
Nach
der Kultivierung wurde die angehäufte
Menge Homoserin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei
560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Stamm | Glucose | Saccharose |
OD560 | Homoserin (g/l) | Ausbeute (%) | OD560 | Homoserin (g/l) | Ausbeute (%) |
NZ10rhtA23/ pAL4 | 19,3 | 7,8 | 9,7 | | | |
NZ10rhtA23 Scr/pAL4 | 20,0 | 8,0 | 10,0 | 21,4 | 12,2 | 15,2 |
-
Tabelle
3 zeigt, dass der Stamm NZ10 rhtA23 scr/pAL4 und dessen Ausgangsstamm
NZ10 rhtA23/pAL4 etwa gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe
Menge Homoserin anhäuften,
wenn sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden.
Der Stamm NZ10 rhtA23 scr/pAL4 häufte
jedoch mehr Homoserin mit höherer
Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert
wurde.
-
Beispiel 5 Präparation des Isoleucin produzierenden
Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Isoleucinproduktion
unter Verwendung dieses Stammes
-
Als
Isoleucin produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia wurde
E. coli K-12 Stamm 44-3-15 eingesetzt. Dieser Stamm wurde wie folgt
konstruiert. Der Wildtypstamm E. coli K12 VKPM B-7 wurde als Ausgangsstamm
eingesetzt. Nach den aufeinander folgenden Vorgängen der NTG-Mutagenese und
der Selektion auf Resistenz gegenüber Valin, 4-Aza-DL-leucin
und 3-Hydroxy-DL-leucin wurde der Stamm 44 erhalten, der min destens
zwei Mutationen im ilvGMEDA-Operon enthält. Eine Mutation in dem ilvG-Gen
(ilvG*), der die Acetohydroxysäuresynthase-II-Aktivität wiederherstellt,
und eine Mutation in dem ilvA-Gen (ilvA*), die die Threonindeaminase-Unempfindlichkeit
gegenüber
der Rückkopplungshemmung
durch Isoleucin überträgt. Dieser Stamm
kann eine gewisse Menge Isoleucin produzieren.
-
Andererseits
wurde das Plasmid pVR72, ein Derivat des Plasmids pVR4 (Gavrilova
et al., 1988, Biotechnologiya (auf Russisch), 4: 600–608), das
die ilvG5MEDA7434YC-Gene
enthielt, durch die Einführung
der BamHI-Linker in die Schnittstellen von DraIII und XmaIII konstruiert.
Dann wurde das BamHI-Fragment
von pVR72, welches ilvG5MEDA7434YC-Gene
mit deletiertem Promotor und Attenuator enthielt, in pM2 kloniert,
einem Mini-Mud-Vektor pMu4041-Derivat, welches den PR-Promotor des Phagen
lambda enthält.
Das erhaltene Plasmid wurde für
die Einführung
des Mini-Mu-PR-ilvG*MEDPA*YC-Konstrukts in das
Plasmid des Stammes 44 (pMH10) wie vorstehend beschrieben eingesetzt.
Nach der Induktion der Mu-Transposase
wurden die Klone auf ihre Fähigkeit
zur Produktion von Isoleucin getestet. Unter ihnen wurde der produktivste
Stamm 44-3 selektiert. Schließlich
wurde das Mini-Mu-PR-thrA*BC-cat-Konstrukt
wie vorstehend beschrieben aus C600 THr+,
Cm® in
den Stamm 44-3 transduziert. Auf diese Weise wurde der Stamm 44-3-15
erhalten.
-
Der
Isoleucin produzierende Stamm 44-3-15 wurde mit dem Phagen P1vir,
der auf den Donorstämmen VD1
oder W3350csc gezüchtet
worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium,
enthaltend 0,2 % Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert.
Auf diese Weise wurden die Stämme 44-3-15
scr und 44-3-15 Csc erhalten.
-
Diese
Stämme
und der Ausgangsstamm wurden 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der
erhaltenen Kultur wurde in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 mm
Teströhrchen
eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C
auf einem Rotationsschüttler
kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte die selbe Zusammensetzung
wie dasjenige in Beispiel 3, außer
dass Isoleucin nicht zugegeben wurde. Nach der Kultivierung wurden
die zugegebene Menge Isoleucin in dem Medium und die Absorption
des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Stamm | Glucose | Saccharose |
CD560 | Isoleucin (g/l) | Ausbeute (%) | OD560 | Isoleucin (g/l) | Ausbeute (%) |
44-3-15 | 16,1 | 10,4 | 13,0 | | | |
44-3-15
Scr | 16,4 | 10,8 | 13,5 | 16,1 | 13,1 | 16,4 |
44-3-15
Csc | 15,3 | 10,5 | 13,1 | 16,0 | 13,6 | 17,0 |
-
Tabelle
4 zeigt, dass die beiden Saccharose verbrauchenden Stämme, nämlich 44-3-15
Scr und 44-3-15 Csc, dieselben Wachstumseigenschaften hatten und
etwa dieselbe Menge Isoleucin wie ihr Ausgangsstamm 44-3-15 anhäuften, wenn
er in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurde. Diese Stämme akkumulierten
jedoch mehr Isoleucin mit höherer
Ausbeute, wenn sie in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert
wurden. Daneben war der Stamm 44-3-15 Csc (mit dem Saccharose-nicht-PTS-Genen) unter
dieser Bedingung etwas produktiver als der Stamm 44-3-15 Scr (mit
Saccharose-PTS-Genen).
-
Beispiel 6: Präparation der Lysin produzierenden
Stämme
von E. coli, die Saccharose verwerten können, und Lysinproduktion unter
Verwendung dieser Stämme
(nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)
-
Als
Lysin produzierender Empfängerstamm
wurde der E. coli Stamm VL612 eingesetzt. Dieser Stamm wurde von
dem bekannten E. coli Stamm Gif102 (Theze, J. and Saint Girons.,
J. Bacteriol., 118, 990–998, 1974)
in zwei Stufen erhalten. In der ersten Stufe wurden die Mutanten
des Stammes, die gegenüber
2 mg/ml S-(2-Aminoethyl)-L-cystein resistent sind, selektiert, und
unter diesen wurde der Stamm VL611 gefunden, der Lysin produzieren
kann. In der zweiten Stufe wurde die Mutation rhtA23 in VL611 wie
vorstehend beschrieben eingeführt,
wobei der Stamm VL612 erhalten wurde.
-
Der
Stamm VL612 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf dem Donorstamm VL478
gezüchtet
worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium,
enthaltend 50 mg/l Homoserin und 0,2 % Saccharose als alleinige
Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurde der Stamm VL613
(VKPM B-3423) erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden
jeweils 18 Stunden bei 37 °C
in einer Nährbrühe kultiviert,
und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums
in einem 20 × 200
ml Teströhrchen
eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C
auf einem Rotationsschüttler
kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte dieselbe Zusammensetzung
wie dasjenige in Beispiel 2, außer
dass 0,2 g/l Homoserin zugegeben wurde. Nach der Kultivierung wurden
die angehäufte
Menge Lysin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560
nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
5 dargestellt. Tabelle 5
Stamm | Glucose | Saccharose |
CD560 | Leucin
(g/l) | Ausbeute (%) | OD560 | Leucin
(g/l) | Ausbeute (%) |
VL612 | 11,5 | 2,8 | 5,6 | | | |
VL613 | 11,2 | 2,7 | 5,4 | 11,4 | 4,2 | 8,4 |
-
Tabelle
5 zeigt, dass der Stamm VL612 und der Stamm VL613 in einem Glucose
enthaltenden Medium etwa gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe
Menge Lysin anhäuften.
Der Stamm VL613 häufte
jedoch mehr Lysin in einer höheren
Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert
wurde.
-
Beispiel 7: Präparation des Valin produzierenden
Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Valinproduktion
unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden
Erfindung umfasst)
-
Als
Valin produzierender Stamm der Gattung Escherichia wurde der Stamm
Escherichia coli VL1971 eingesetzt. Dieser Stamm ist ein Derivat
des bekannten Stamms VL1970 (VKPM B-4411,
US Patent Nr. 5,658,766 ), in den die
Mutation rhtA23 wie in Beispiel 1 beschrieben eingeführt wurde.
-
Der
E. coli Stamm VL1971 wurde mit dem Phagen P1vir infiziert, der auf
dem Donorstamm VL478 gezüchtet
wurde, und auf M9 Minimalmedium, enthaltend 0,2% Saccharose als
alleinige Kohlenstoffquelle, plattiert. Die nach 40 Stunden gewachsenen
Transduktanten wurden aufgenommen, gereinigt, und unter ihnen wurde
der Valin produzierende Stamm VL1972 (VKPM B-4413), der Saccharose
verwerten kann, selektiert.
-
VL1971
und VL1972 wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen
Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 mm
Teströhrchen
eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C
auf einem Rotationsschüttler
kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte die selbe Zusammensetzung
wie dasjenige in Beispiel 3. Nach der Kultivierung wurde die angehäufte Menge
Valin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch
bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
Stamm | Glucose | Saccharose |
OD560 | Valin
(g/l) | Ausbeute (%) | OD560 | Valin
(g/l) | Ausbeute (%) |
VL1971 | 12,4 | 8,0 | 10,0 | | | |
VL1972 | 12,6 | 8,2 | 10,2 | 14,4 | 11,2 | 14,0 |
-
Tabelle
6 zeigt, dass VL1971 und VL1972 gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe
Menge Valin anhäuften,
wenn sie in Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Der Stamm
VL1972 häufte
jedoch Valin in höherer
Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert
wurde.
-
Es
sei angemerkt, dass PTS-Saccharose-Gene die höhere Produktivität auf Valinproduzenten übertragen,
obwohl Phosphoenolpyruvat für
die Valinsynthese nicht erforderlich ist.
-
Beispiel 8: Präparation des Tryptophan produzierenden
Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und die Tryptophanproduktion
unter Verwendung dieses Stammes
-
Als
Empfängerstamm
des Bakteriums der Gattung Escherichia wurde der Stamm SV164(pGH5) (
WO94/08031 ) eingesetzt.
-
Der
Tryptophan überproduzierende
Stamm SV164 (pGH5) wurde mit dem Phagen P1vir, der auf den Donorstämmen VD1
oder W3350csc gezüchtet
worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium
selektiert, welches 50 mg/l Tyrosin, 50 mg/ml Phenylalanin, 0,2
% Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle und 15 mg/l Tetracyclin
enthielt. Auf diese Weise wurden die Stämme SV164scr (pGH5) bzw. SV164csc
(pGH5) erhalten.
-
Diese
Stämme
und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 29 °C in einer
Nährbrühe kultiviert,
und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums
der folgenden Zusammensetzung in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft
und 40 Stunden bei 29 °C
auf einem Rotationsschüttler
kultiviert. Zusammensetzung
des Fermentationsmediums (g/l):
Glucose
(oder Saccharose) | 40 |
Phenylalanin | 0,1 |
Tyrosin | 0,1 |
(NH4)2SO4 | 15 |
K2HPO4 | 1,5 |
NaCl | 0,5 |
MgSO4·7H2O | 0,3 |
CaCl2·2H2O | 0,015 |
FeSO4·7H2O | 0,075 |
Na3-Citrat | 1 |
Na2MoO4·2H2O | 0,00015 |
H3BO3 | 0,0025 |
CoCl2·6H2O | 0,0007 |
CuSO4·5H2O | 0,00025 |
MnCl2·4H2O | 0,0016 |
ZnSO4·7H2O | 0,0003 |
Thiamin
HCl | 0,005 |
Pyrodixin | 0,03 |
Feststoffe
der | 2 |
Maisquellflüssigkeit | |
(Ajinomoto) | |
CaCO3 | 30 |
Tetracyclin | 0,015 |
-
Nach
der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Tryptophan und die
Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Aus Tabelle 7 geht hervor,
dass beide Saccharose verwertenden Stämme, nämlich SV164scr (pGH5) und SV164csc
(pGH5), nahezu dieselben Wachstumseigenschaften und etwa dieselbe
angehäufte
Menge Tryptophan wie ihr Ausgangsstamm SV164 (pGH5) hatten, wenn
sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wur den. Diese
Stämme
häuften
jedoch mehr Tryptophan mit höherer
Ausbeute an, wenn sie in Saccharose enthaltendem Medium kultiviert
wurden. Der Stamm SV164csc (pGH5) (mit Saccharose-nicht-PTS-Genen)
war unter dieser Bedingung produktiver als der Stamm SV164scr (pGH5)
(mit Saccharose PTS-Genen). Tabelle 7
Stamm | Glucose | Saccharose |
OD560 | Tryptophan (g/l) | Ausbeute (%) | OD560 | Tryptophan (g/l) | Ausbeute (%) |
SV164 (pGH5) | 6,0 | 5,0 | 12,5 | | | |
SV164scr (pGH5) | 6,2 | 5,1 | 12,7 | 6,2 | 5,5 | 13,7 |
SV164csc (pGH5) | 6,0 | 5,0 | 12,5 | 6,2 | 5,6 | 14,0 |