CN109121422B - 使用过表达编码铁输出蛋白基因的肠杆菌科的细菌生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过使用属于肠杆菌科的细菌的发酵生产L‑氨基酸的方法，所述细菌已经以过表达编码铁输出蛋白的基因的方式进行了修饰，例如fetB基因、fetA基因、fieF基因，或这些基因的组合。

Description

使用过表达编码铁输出蛋白基因的肠杆菌科的细菌生产L-氨 基酸的方法

发明领域

本发明一般涉及微生物工业，具体涉及通过肠杆菌科的细菌的发酵生产L-氨基酸的方法，所述肠杆菌科的细菌已经以过表达编码铁输出蛋白的基因的方式进行了修饰，从而提高L-氨基酸的生产。

背景技术

常规地，在工业上通过利用从天然来源获得的微生物菌株或其突变体的发酵方法来生产L-氨基酸。通常，微生物经修饰以改进L-氨基酸的生产，从而提高L-氨基酸的产量。

已经报道了许多提高L-氨基酸生产产量的技术，包括用重组DNA转化微生物(参见例如美国专利号4,278,765A)和改变表达调控区域例如启动子、前导序列和/或弱化子，或本领域技术人员已知的其他技术(参加例如US20060216796 A1和WO9615246 A1)。用于提高生产产量的其他技术包括增加参与氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目标酶对产生的L-氨基酸的反馈抑制脱敏(参见例如WO9516042 A1、EP0685555 A1或美国专利号4,346,170A、5,661,012 A和6,040,160 A)。

提高L-氨基酸生产产量的另一种方法是减弱以下基因的表达：参与目标L-氨基酸的降解的一种或几种基因，从L-氨基酸生物合成途径转移目标L-氨基酸前体的基因，参与碳、氮和磷酸盐通量重新分布的基因，以及编码毒素的基因等。

铁对大多数生物体来说是一种必要的金属。铁离子对细胞的功能例如呼吸作用和DNA合成是必需的，但由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)的形成，所述铁离子可以对细胞有毒性(Andrews S.C.et al.,Bacterial iron homeostasis,FEMSMicrobiol.Rev.,2003,27(2-3):215-237)。因此，生物体必须平衡它们的需求以提供从环境中对铁离子的有效摄取和消除或输出过量的细胞游离铁离子以防止铁诱导的毒性。细菌分泌高亲和力细胞外铁螯合剂，称为铁载体，以在转运入细胞前溶解铁离子(Koester W.,ABC transporter-mediated uptake of iron,siderophores,heme and vitamin B12,Res.Microbiol.,2001,152(3-4):291-301)。革兰氏阴性菌在由细胞质膜(CM)电位驱动并由能量转导TonB-ExbB-ExbD系统介导的过程中使用特异性外膜(OM)受体摄取铁-铁载体复合物(Andrews S.C.et al.,2003)。OM铁载体受体是相关的(Koester W.,2001)，并且它们中一些(FepA、FecA和FhuA)的晶体结构是确定的(Buchanan S.K.et al.,Crystalstructure of the outer membrane active transporter FepA from Escherichiacoli,Nat.Struct.Biol.,1999,6:56-63；Ferguson A.D.et al.,Siderophore-mediatediron transport:crystal structure of FhuA with bound lipopolysaccharide,Science,1998,282:2215-2220；Ferguson A.D.et al.,Structural basis of gating bythe outer membrane transporter FecA,Science,2002,295:1715-1719)。过表达编码结合并转运铁肠杆菌素的OM蛋白质的fepA基因、编码柠檬酸铁摄取受体的fecA基因或编码将CM的质子动力势转换到OM主动转运蛋白的CM蛋白质的tonB基因的埃希氏菌属细菌用于通过细菌的发酵生产L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-赖氨酸的方法中(EP1979486B1)。

关于原核生物中铁离子的输出知之甚少(Sankari S.and O’Brian M.R.,Abacterial iron exporter for maintenance of iron homeostasis,J.Biol.Chem.,2014,289(23):16498-16507)。已经描述了埃希氏菌的两种铁输出蛋白，例如FetAB和FieF(Sankari S.et al.,2014；Nicolaou S.A.et al.,Overexpression of fetA(ybbL)andfetB(ybbM),encoding an iron exporter,enhances resistance to oxidative stressinEscherichia coli,Appl.Environ.Microbiol.,2013,79(23):7210-7219)。预测FetAB复合物是在大肠杆菌中参与铁稳态的ATP结合盒(ABC)型转运蛋白，其中FetA是ATP结合组分亚基，FetB是内膜金属抗性蛋白质，其分别由fetA和fetB基因编码。由fieF基因编码的FieF蛋白是金属阳离子转运蛋白的阳离子扩散促进剂(CDF)家族的成员，其作为二价金属阳离子特别是铁离子输出蛋白发挥作用(Grass G.et al.,FieF(YiiP)from Escherichia colimediates decreased cellular accumulation of iron and relieves iron stress,Arch.Microbiol.,2005,183:9-18)。

然而，以前没有报道过描述过表达编码铁输出蛋白的基因对通过肠杆菌科的L-氨基酸生产细菌的发酵生产L-氨基酸的作用的数据。

发明内容

本文描述了通过肠杆菌科细菌的发酵生产L-氨基酸的改进方法。根据本公开的主题，可以增加通过肠杆菌科细菌的发酵的L-氨基酸的生产。具体而言，可以通过在细菌中过表达编码铁输出蛋白的基因，从而增加修饰细菌的L-氨基酸的生产来改进通过肠杆菌科细菌的发酵的L-氨基酸的生产。

通过以下发现实现了该目标，即当在培养基中培养细菌时，在具有L-氨基酸生产能力的肠杆菌科细菌中过表达编码铁输出蛋白的基因赋予细菌更高的L-氨基酸生产力，所述肠杆菌科细菌可以属于埃希氏菌属并且，更具体地属于物种大肠杆菌。具体而言，通过以下发现实现了该目标，即当在培养基中培养细菌时，在具有L-氨基酸生产能力的肠杆菌科细菌中过表达编码铁输出蛋白的fetB基因或fieF基因赋予细菌更高的L-氨基酸生产力，所述肠杆菌科细菌可以属于埃希氏菌属并且，更具体地属于物种大肠杆菌。

本发明的一个方面是提供了生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：

(i)在培养基中培养肠杆菌科的L-氨基酸生产细菌以在所述培养基或细菌的细胞或所述培养基和细菌的细胞这两者中生产并积累所述L-氨基酸，和(ii)从所述培养基或细菌的细胞或所述培养基和细菌的细胞这两者中收集所述L-氨基酸，

其中所述细菌已经以过表达编码铁输出蛋白的基因的方式进行了修饰。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数，和/或修饰所述基因的表达调控区来过表达所述编码铁输出蛋白的基因，使得所述基因的表达与未修饰细菌相比提高。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述编码铁输出蛋白的基因选自下组：fetB基因、fetA基因、fieF基因，和它们的组合。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述编码铁输出蛋白的基因编码选自下组的蛋白质：

(A)包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质，其中所述蛋白质具有铁输出蛋白活性；和

(C)包含相对于SEQ ID NO:2、4或6的完整氨基酸序列具有不少于90％同源性的氨基酸序列的蛋白质，其中所述蛋白质具有铁输出蛋白活性。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述编码铁输出蛋白的基因是选自下组的DNA：

(A)包含SEQ ID NO:1、3或5的核苷酸序列的DNA；

(B)编码包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质的DNA，其中所述蛋白质具有铁输出蛋白活性；和

(C)包含起因于遗传密码的简并性的SEQ ID NO:1、3或5的变体核苷酸序列的DNA。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述细菌是菠萝泛菌。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自属于天冬氨酸家族的L-氨基酸。

本发明的另一方面是提供了如上所述的方法，其中所述属于天冬氨酸家族的L-氨基酸选自下组：L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。

发明详述

以下详细描述本发明。

1.细菌

可以使用任何属于肠杆菌科并经修饰以过表达编码铁输出蛋白的基因的L-氨基酸生产细菌。短语“L-氨基酸生产细菌”可以指当细菌在培养基中培养时，具有在培养基中和/或细菌的细胞中生产、排泄或分泌，和/或引起L-氨基酸积累的能力的肠杆菌科的细菌。

短语“L-氨基酸生产细菌”也可以指具有在培养基中以比野生型或亲本菌株例如大肠杆菌K-12更大的量生产、排泄或分泌，和/或引起L-氨基酸积累的能力的细菌。短语“L-氨基酸生产细菌”也可以指能够在培养基中引起一定量例如不少于0.5g/L或不少于1.0g/L的目标L-氨基酸的积累的细菌。

此外，也可以使用具有生产L-氨基酸能力的，属于肠杆菌科并经修饰以过表达编码铁输出蛋白的基因的细菌。细菌可以固有地具有生产L-氨基酸的能力，或者可以通过使用突变方法或DNA重组技术修饰成具有生产L-氨基酸的能力。可以通过在固有具有生产L-氨基酸能力的细菌中，或者在已经被赋予生产L-氨基酸能力的细菌中过表达编码铁输出蛋白的基因来获得所述细菌。或者，可以通过将生产L-氨基酸的能力赋予已经以过表达编码铁输出蛋白的基因的方式进行修饰的细菌来获得所述细菌。

短语“生产L-氨基酸的能力”可以指当细菌在培养基中培养时，肠杆菌科的细菌在培养基和/或细菌的细胞中生产、排泄或分泌，和/或引起L-氨基酸积累至使得可以从培养基和/或细菌的细胞中收集L-氨基酸的水平的能力。

细菌可以生产单独的L-氨基酸(即目标L-氨基酸)或者作为所述L-氨基酸(即目标L-氨基酸)和与目标L-氨基酸不同的一种或多种其他L-氨基酸的混合物。也就是说，细菌可以生产单独的一种L-氨基酸或者两种或更多种L-氨基酸的混合物。

短语“L-氨基酸”可以指L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。

短语“芳香族L-氨基酸”包括例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。由于L-组氨酸具有芳香族部分例如咪唑环，短语“芳香族L-氨基酸”除前述芳香族L-氨基酸外，也可以包括L-组氨酸。

短语“非芳香族L-氨基酸”包括例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸。由于芳香族氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸的生物合成途径与L-组氨酸的生物合成途径不同，短语“非芳香族L-氨基酸”除前述非芳香族的L-氨基酸外，也可以包括L-组氨酸。

L-氨基酸可以属于一个或多个L-氨基酸家族。例如，L-氨基酸可以属于包括L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸的谷氨酸家族；包括L-半胱氨酸、甘氨酸和L-丝氨酸的丝氨酸家族；包括L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸的天冬氨酸家族；包括L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的丙酮酸家族；以及包括L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸的芳香族家族。由于一些L-氨基酸可以是特定L-氨基酸的生物合成途径中的中间体氨基酸，前述氨基酸的家族也可以包括其他L-氨基酸例如非蛋白原L-氨基酸。例如，L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是来自L-精氨酸生物合成途径的氨基酸。因此，谷氨酸家族可以包括L-瓜氨酸和L-鸟氨酸，以及L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸。

L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸是L-氨基酸的具体实例。天冬氨酸家族氨基酸如L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸是L-氨基酸的优选实例。L-苏氨酸是L-氨基酸的更优选实例。

短语“L-氨基酸”不仅包括游离形式的L-氨基酸，还可以包括L-氨基酸的盐或水合物，或者由L-氨基酸和另一种有机或无机化合物形成的加合物。

属于肠杆菌科的细菌可以来自肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、泛菌属(Pantoea)、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)等，并且可以具有生产L-氨基酸的能力。具体而言，可以使用根据NCBI(国家生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝543)中使用的分类法分类为肠杆菌科的那些。可以修饰的来自肠杆菌科的菌株的实例包括埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。

可以经修饰以获得根据本公开的主题的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌的菌株没有特别限制，并且具体而言，可以使用Neidhardt等人的工作中描述的那些(Bachmann,B.J.,Derivations and genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coliK-12,p.2460-2488.In F.C.Neidhardt et al.(ed.),Escherichia coli andSalmonella:cellular and molecular biology,2nd ed.ASM Press,Washington,D.C.,1996)。物种大肠杆菌是一个具体实例。大肠杆菌的具体实例包括源自原型野生型菌株大肠杆菌K-12菌株的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United Statesof America)获得。也就是说，将登录号分配给每个菌株，并且可以通过使用这些登录号来购买菌株(参见atcc.org)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了菌株的登录号。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌属细菌的实例包括例如菠萝泛菌(Pantoea ananatis)等。最近基于16S rRNA的核苷酸序列分析等将一些成团肠杆菌的菌株重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、菠萝泛菌或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。可以使用属于肠杆菌属或泛菌属的细菌，只要它是分类为肠杆菌科的细菌即可。当通过基因工程技术培育菠萝泛菌时，可以使用菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)和其衍生物。这些菌株当它们分离时被鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌保藏。然而，最近基于如上所述的16SrRNA的核苷酸序列分析等将它们重新分类为菠萝泛菌。

以下，将具体例示L-氨基酸生产细菌。可以独立地或以任何适当的组合使用L-氨基酸生产细菌的任何特性以及赋予或提高L-氨基酸生产能力的修饰，例如以下例示的那些。

L-精氨酸生产细菌

L-精氨酸生产细菌和可以用于衍生L-精氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)(美国专利申请号2002058315 A1)以及它的含有突变体N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄罗斯专利号2215783 C2)、源自菌株237并具有改进的乙酸同化能力的菌株大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926,EP1170358 A1)、通过将来自大肠杆菌K-12菌株的ilvA基因的野生型等位基因导入到其中的菌株382获得的菌株大肠杆菌菌株382 ilvA+等。突变体N-乙酰谷氨酸合酶的实例包括例如通过取代对应野生型酶的位置15至19的氨基酸残基对L-精氨酸的反馈抑制脱敏的突变体N-乙酰谷氨酸合酶(EP1170361 A1)。

L-精氨酸生产细菌和可以用于衍生L-精氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类基因的实例除编码N-乙酰谷氨酸合酶的基因(argA)外，包括编码N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂解酶(argH)和氨甲酰磷酸合成酶(carAB)的基因。

L-精氨酸生产细菌和可以用于衍生L-精氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括对氨基酸类似物具有抗性等的菌株。此类菌株的实例包括对α-甲基甲硫氨酸、对氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸异羟肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍具有抗性的大肠杆菌突变体菌株(参见日本专利公开(Kokai)号56-106598)。

L-瓜氨酸-生产细菌

L-瓜氨酸生产细菌和可以用于衍生L-瓜氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如含有突变体N-乙酰谷氨酸合酶的大肠杆菌菌株237/pMADS11、237/pMADS12和237/pMADS13(RU2215783 C2、欧洲专利号1170361 B1、美国专利号6,790,647 B2)、两者都含有突变体反馈抗性氨甲酰磷酸合成酶的大肠杆菌菌株333(VKPMB-8084)和374(VKPM B-8086)(俄罗斯专利号2264459 C2)、其中α-酮戊二酸合酶活性增加并且铁氧还蛋白NADP⁺还原酶、丙酮酸合酶和/或α-酮戊二酸脱氢酶活性额外修饰的大肠杆菌菌株(EP2133417 A1)，以及其中琥珀酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性减少的菠萝泛菌菌株NA1sucAsdhA(美国专利申请号2009286290 A1)等。

由于L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径中的中间体，L-瓜氨酸生产细菌和可以用于衍生L-瓜氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括其中编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类基因的实例包括但不限于，编码N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF/I)和氨甲酰磷酸合成酶(carAB)的基因，以及它们的组合。

也可以通过灭活由argG基因编码的精氨琥珀酸合酶容易地从任何L-精氨酸生产细菌例如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)获得L-瓜氨酸生产细菌。

L-半胱氨酸生产细菌

L-半胱氨酸生产细菌和可以用于衍生L-半胱氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利号6,218,168 B1、俄罗斯专利号2279477 C2)、具有过表达的编码适于分泌对细胞有毒物质的蛋白质的基因的大肠杆菌W3110(美国专利号5,972,663 A)、具有降低的半胱氨酸脱硫酶活性的大肠杆菌菌株(JP11155571 A2)、具有增加的由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的阳性转录调节蛋白的活性的大肠杆菌W3110(WO0127307 A1)等。L-半胱氨酸生产细菌和可以用于衍生L-半胱氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括大肠杆菌菌株JM15(ydeD)，其是大肠杆菌JM15的衍生物(美国专利号6,218,168 B1)，并已经用含有ydeD基因的DNA转化(美国专利号5,972,663)。

L-谷氨酸生产细菌

L-谷氨酸生产细菌和可以用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如大肠杆菌VL334thrC⁺(EP 1172433 A1)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是在thrC和ilvA基因中具有突变的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利号4,278,765)。通过使用在野生型大肠杆菌菌株K-12(VKPM B-7)细胞上生长的噬菌体P1的一般转导的方法转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得能够生产L-谷氨酸的L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC⁺(VKPM B-8961)。

L-谷氨酸生产细菌和可以用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，其中编码L-谷氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类基因的实例包括编码谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltBD)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA,acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF,lpdA)、丙酮酸激酶(pykA,pykF)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA,pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)的基因。

经修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达得到提高的菌株的实例包括在EP1078989 A2、EP955368 A2和EP952221 A2中公开的那些。

L-谷氨酸生产细菌和可以用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括具有降低或消除的酶活性的菌株，所述酶通过从L-谷氨酸生物合成途径分支而催化除L-谷氨酸以外的化合物的合成。此类酶的实例包括异柠檬酸裂解酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)和琥珀酸脱氢酶(sdhABCD)。在酶的名称之后的括号中显示的是编码酶的基因(同样适用于下文的相同情况)。属于埃希氏菌属的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的细菌以及获得它们的方法描述于美国专利号5,378,616和5,573,945。具体而言，这些菌株包括以下：

大肠杆菌W3110sucA::Km^R，

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)，

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)，

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)。

大肠杆菌W3110sucA::Km^R是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(以下称为“sucA基因”)获得的菌株。该菌株完全缺乏α-酮戊二酸脱氢酶。

L-谷氨酸生产细菌和可以用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株的其他实例包括属于埃希氏菌属并且对天冬氨酸抗代谢物(天冬氨酸类似物)具有抗性的菌株。这些菌株也可以缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性并且其实例包括例如，大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利号5,908,768)、另外具有降低的L-谷氨酸分解能力的大肠杆菌FFRM P-12379(美国专利号5,393,671)、大肠杆菌AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利号6,110,714)等。

L-谷氨酸生产细菌和可以用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括泛菌属细菌，例如菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、菠萝泛菌SC17菌株(FERM BP-11091)和菠萝泛菌SC17(0)菌株(VKPM B-9246)。AJ13355菌株是从日本静冈县岩田市土壤中分离的可以在含有L-谷氨酸和碳源的低pH培养基中增殖的菌株。SC17菌株是选自AJ13355菌株的作为低粘液生产突变体菌株的菌株(美国专利号6,596,517)。SC17菌株于2009年2月4日保藏在独立行政机构，国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(当前为独立行政机构，国家技术与评估研究所，国际专利生物保藏中心(NITE IPOD),#120,2-5-8 Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)，并分配了登录号FERM BP-11091。AJ13355菌株于1998年2月19日保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国家生物科学和人类技术研究所(当前为NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)，并分配了登录号FERM P-16644。然后根据布达佩斯条约的规定于1999年1月11日将保藏物转换为国际保藏物，并分配了登录号FERM BP-6614。

L-谷氨酸生产细菌和可以用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括属于泛菌属的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的突变体菌株，并且可以如上所述获得。此类菌株包括菠萝泛菌AJ13356(美国专利号6,331,419B1)。菠萝泛菌AJ13356于1998年2月19日以登录号FERM P-16645保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国家生物科学和人类技术研究所(当前为NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)。然后根据布达佩斯条约的规定于1999年1月11日将其转换为国际保藏物，并获得了登录号FERM BP-6615。由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏，菠萝泛菌AJ13356缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性。以上菌株当其分离时被鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌AJ13356保藏。然而，最近基于16S rRNA的核苷酸序列分析等将它重新分类为菠萝泛菌。虽然AJ13356作为成团肠杆菌保藏在前述保藏处，但为了本说明书的目的，将它们描述为菠萝泛菌。

L-谷氨酸生产细菌和可以用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括属于泛菌属的菌株，例如菠萝泛菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株、菠萝泛菌AJ13601菌株、菠萝泛菌NP106菌株和菠萝泛菌NA1菌株。通过将含有源自大肠杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG以及含有源自乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB导入SC17sucA菌株中获得SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。AJ13601菌株是选自SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株，作为在低pH下对高浓度L-谷氨酸具有抗性的菌株的菌株。通过清除RSFCPG和pSTVCB质粒从AJ13601菌株获得NP106菌株。AJ13601菌株于1999年8月18日，保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国家生物科学和人类技术研究所(当前为NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)并分配了登录号FERM P-17516。然后根据布达佩斯条约的规定于2000年7月6日将保藏物转换为国际保藏物，并分配了登录号FERM BP-7207。

L-组氨酸生产细菌

L-组氨酸生产细菌和可以用于衍生L-组氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如大肠杆菌菌株24(VKPM B-5945,RU2003677C1)、大肠杆菌菌株80(VKPM B-7270,RU2119536C1)、大肠杆菌NRRL B-12116至B-12121(美国专利号4,388,405)、大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利号6,344,347B1)、大肠杆菌H-9341(FERM BP-6674)(EP1085087 A2)、大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利号6,258,554 B1)等。

L-组氨酸生产细菌和可以用于衍生L-组氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中编码L-组氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类基因的实例包括编码以下的基因：ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、磷酸核糖-AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖-AMP环化水解酶/磷酸核糖-ATP焦磷酸酶(hisIE)、磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核糖核苷酸异构酶(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)等。

已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸抑制，因此也可以通过将赋予对反馈抑制的抗性的突变导入ATP磷酸核糖转移酶来有效地提高L-组氨酸生产能力(俄罗斯专利号2003677 C1和2119536 C1)。

具有L-组氨酸生产能力的菌株的具体实例包括已经用携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体转化的大肠杆菌FERM-P 5038和5048(JP 56-005099 A)、用氨基酸输出基因rht转化的大肠杆菌菌株(EP1016710 A2)、已经赋予磺胺胍、DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,RU2119536 C1)、大肠杆菌MG1655+hisGrhisL'_ΔΔpurR(RU2119536和Doroshenko V.G.et al.,The directed modification ofEscherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants,Prikl.Biochim.Mikrobiol.(Russian),2013,49(2):149-154)等。

L-异亮氨酸生产细菌

L-异亮氨酸生产细菌和可以用于衍生L-异亮氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，对6-二甲基氨基嘌呤具有抗性的突变体菌株(JP 5-304969 A)、对异亮氨酸类似物例如硫代异亮氨酸和异亮氨酸异羟肟酸具有抗性的突变体菌株以及对DL-乙硫氨酸和/或精氨酸异羟肟酸额外具有抗性的突变体菌株(JP 5-130882 A)。此外，用编码参与L-异亮氨酸生物合成的蛋白质例如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶的基因转化的重组菌株也可以用作L-异亮氨酸生产细菌或其亲本菌株(JP 2-458 A、EP0356739 A1和美国专利号5,998,178)。

L-亮氨酸生产细菌

L-亮氨酸生产细菌和可以用于衍生L-亮氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386,美国专利号6,124,121))；对亮氨酸类似物包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-重氮亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(JP 62-34397 B和JP 8-70879 A)；通过WO96/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(JP 8-70879 A)等。

L-亮氨酸生产细菌和可以用于衍生L-亮氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中参与L-亮氨酸生物合成的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类菌株的实例包括leuABCD操纵子的基因，其可以由编码不受L-亮氨酸的反馈抑制的α-异丙基苹果酸合酶的突变体leuA基因代表(美国专利号6,403,342 B1)。此外，L-亮氨酸生产细菌和可以用于衍生L-亮氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中编码从细菌的细胞中排泄L-氨基酸的蛋白质的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。

L-赖氨酸生产细菌

L-赖氨酸生产细菌和可以用于衍生L-赖氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括属于埃希氏菌属并对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是当L-赖氨酸存在于培养基中时，该抑制完全或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的实例包括但不限于，氧代赖氨酸、赖氨酸异羟肟酸、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺等。可以通过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理来获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。对生产L-赖氨酸有用的细菌菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543,NRRL B-12185；参见美国专利号4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些菌株中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制是脱敏的。

L-赖氨酸生产细菌和可以用于衍生L-赖氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中编码L-赖氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类基因的实例包括但不限于，编码二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶III(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利号6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)和天冬氨酸酶(aspA)(EP1253195 A1)的基因。此外，L-赖氨酸生产细菌或它们的亲本菌株可以具有增加水平表达的参与能量效率的基因(cyo)(EP1170376 A1)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利号5,830,716 A)、ybjE基因(WO2005/073390)或它们的组合。由于天冬氨酸激酶III受到L-赖氨酸的反馈抑制，编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因(美国专利号5,932,453)可以用于提高该酶的活性。此外，由于二氢吡啶二羧酸合酶受到L-赖氨酸的反馈抑制，编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的二氢吡啶二羧酸合酶的突变体dapA基因可以用于提高该酶的活性。

L-赖氨酸生产细菌或可以用于衍生L-赖氨酸生产细菌的亲本菌株可以具有降低的酶活性或者没有酶活性，所述酶催化引起从L-赖氨酸生物合成途径分支并导致另一种化合物的生产的反应。另外，L-赖氨酸生产细菌或可以用于衍生L-赖氨酸生产细菌的亲本菌株可以具有降低的酶活性或者没有酶活性，所述酶对L-赖氨酸的合成或积累起负面作用。此类参与L-赖氨酸生产的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA,ldcC)、苹果酸酶等，并且这些酶的活性降低或缺失的菌株公开于WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等。

可以降低编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因两者的表达以降低或缺失赖氨酸脱羧酶活性。可以通过例如WO2006/078039中描述的方法来降低两种基因的表达。

L-赖氨酸生产细菌和可以用于衍生L-赖氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括大肠杆菌WC196菌株(美国专利号5,827,698)、大肠杆菌WC196ΔcadAΔldc菌株和大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2菌株(WO2006/078039)。

通过赋予源自大肠杆菌K-12的W3110菌株AEC抗性从W3110菌株培育WC196菌株(美国专利号5,827,698)。WC196菌株命名为大肠杆菌AJ13069，于1994年12月6日保藏在工业科学和技术局，国家生物科学和人类技术研究所(当前为NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)并分配了登录号FERM P-14690。然后根据布达佩斯条约的规定于1995年9月29日将其转换为国际保藏物，并分配了登录号FERM BP-5252(美国专利号5,827,698)。

通过破坏编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因从WC196菌株构建WC196ΔcadAΔldc菌株。WC196ΔcadAΔldcC命名为AJ110692并作为国际保藏物于2008年10月7日以登录号FERM BP-11027保藏在独立行政机构，国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(当前为NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)。

通过将含有赖氨酸生物合成基因的质粒pCABD2(美国专利号6,040,160)导入WC196ΔcadAΔldcC菌株构建WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2菌株。质粒pCABD2含有源自大肠杆菌并编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变(H118Y)的二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)的突变体dapA基因、源自大肠杆菌并编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变(T352I)的天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因、源自大肠杆菌并编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因和源自乳糖发酵短杆菌并编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。

L-赖氨酸生产细菌和可以用于衍生L-赖氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括大肠杆菌AJIK01(NITE BP-01520)。AJIK01菌株命名为大肠杆菌AJ111046，并于2013年1月29日保藏在NITE IPOD(#120,2-5-8 Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)。然后根据布达佩斯条约的规定于2014年5月15日将其转换为国际保藏物，并分配了登录号NITE BP-01520。

L-甲硫氨酸生产细菌

L-甲硫氨酸生产细菌和可以用于衍生L-甲硫氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如大肠杆菌菌株AJ11539(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541(NRRL B-12401)、AJ 11542(NRRL B-12402)(专利GB2075055)；以及对正亮氨酸，L-甲硫氨酸类似物等有抗性的大肠杆菌菌株218(VKPM B-8125)(RU2209248C2)和73(VKPM B-8126)(RU2215782 C2)。菌株大肠杆菌73于2001年5月14日以登录号VKPMB-8126保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,RussianFederation,117545 Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)。然后根据布达佩斯条约的规定于2002年2月1日将其转换为国际保藏物。此外，甲硫氨酸阻遏物缺陷菌株和用编码参与L-甲硫氨酸生物合成的蛋白质例如高丝氨酸转琥珀酰化酶和胱硫醚γ-合酶的基因转化的重组菌株(JP 2000-139471 A)也可以用作L-甲硫氨酸生产菌株或其亲本菌株。

L-鸟氨酸生产细菌

由于L-鸟氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间体，L-鸟氨酸生产细菌和可以用于衍生L-鸟氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括其中编码如上文描述的那些L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。

可以通过灭活由argF和argI基因编码的鸟氨酸氨甲酰基转移酶，容易地从任何L-精氨酸生产细菌例如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)获得L-鸟氨酸生产细菌，。本文描述了灭活鸟氨酸氨甲酰基转移酶的方法。

L-苯丙氨酸生产细菌

L-苯丙氨酸生产细菌和可以用于衍生L-苯丙氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如大肠杆菌菌株AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPMB-8197)，含有突变体pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利号5,354,672)，大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)，大肠杆菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRLB-12146和NRRL B-12147(美国专利号4,407,952)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)，以及名为AJ12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB](FERM BP-3579)(EP488424 B1)。此外，L-苯丙氨酸生产细菌和可以用于衍生L-苯丙氨酸生产细菌的亲本菌株也包括属于埃希氏菌属细菌并具有提高的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(美国专利号7,259,003和7,666,655)。

L-脯氨酸生产细菌

L-脯氨酸生产细菌和可以用于衍生L-脯氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如ilvA基因缺陷并能够生产L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)(EP1172433 A1)。L-脯氨酸生产细菌和可以用于衍生L-脯氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中参与L-脯氨酸生物合成的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类可以用于L-脯氨酸生产细菌的基因的实例包括编码对L-脯氨酸的反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶的proB基因(DE3127361 A1)。此外，L-脯氨酸生产细菌和可以用于衍生L-脯氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中编码负责从细菌的细胞中排泄L-氨基酸的蛋白质的一种或多种基因的表达得到提高的菌株。此类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。

属于埃希氏菌属具有生产L-脯氨酸能力的细菌的实例包括以下大肠杆菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB专利2075056)、VKPM B-8012(俄罗斯专利号2207371C2)、DE3127361 A1中描述的质粒突变体、由Bloom F.R.等人在“The 15^th Miami wintersymposium”,1983,p.34,中描述的质粒突变体等。

L-苏氨酸生产细菌

L-苏氨酸生产细菌和可以用于衍生L-苏氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利号5,175,107和5,705,371)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC 98081)(美国专利号5,631,157)、大肠杆菌NRRL B-21593(美国专利号5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利号5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利号5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner M.et al.,Genetika(Russian),1978,14:947-956)、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911 A2)、大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792 A1)等。

菌株TDH-6缺乏thrC基因，并且是蔗糖同化的，并且其ilvA基因具有渗漏突变。该菌株在rhtA基因中也具有突变，所述突变赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。通过将质粒pVIC40导入TDH-6菌株中获得含有质粒pVIC40的菌株VKPM B-3996。通过将包括突变体thrA基因的thrA*BC操纵子插入至RSF1010衍生的载体中获得质粒pVIC40。该突变体thrA基因编码对苏氨酸的反馈抑制基本上脱敏的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。菌株VKPM B-3996于1987年11月19日以登录号RIA 1867保藏在All-Union Scientific Center ofAntibiotics(Russian Federation,117105Moscow,Nagatinskaya Street 3-A)。菌株VKPMB-3996也于1987年4月7日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545 Moscow,1^st Dorozhnyproezd,1)。

菌株B-5318对于异亮氨酸是原养型的；并且含有质粒pPRT614，所述质粒pPRT614对应于其中用温度敏感的λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子取代苏氨酸操纵子的调节区域的质粒pVIC40。菌株VKPM B-5318于1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)。

L-苏氨酸生产细菌或可以用于衍生L-苏氨酸生产细菌的亲本菌株可以经修饰以提高一种或多种以下基因的表达：

-编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变体thrA基因，

-编码高丝氨酸激酶的thrB基因，

-编码苏氨酸合酶的thrC基因，

-编码苏氨酸和高丝氨酸外排系统的推定跨膜蛋白的rhtA基因，

-编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的asd基因，和

-编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)的aspC基因。

已经阐明了编码大肠杆菌天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,entry No.b0002；GenBank,登录号NC_000913.2；核苷酸位置:337至2,799；Gene ID:945803)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrL和thrB基因之间。

已经阐明了编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因(KEGG,entry No.b0003；GenBank登录号NC_000913.2；核苷酸位置:2,801至3,733；Gene ID:947498)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。

已经阐明了编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因(KEGG,entry No.b0004；GenBank登录号NC_000913.2；核苷酸位置:3,734至5,020；Gene ID:945198)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrB和yaaX基因之间。所有三种基因作为单个苏氨酸操纵子thrABC发挥功能。为了提高苏氨酸操纵子的表达，期望从操纵子中除去影响转录的弱化子区域(WO2005049808 A1,WO2003097839 A1)。

可以从存在于L-苏氨酸生产大肠杆菌菌株VKPM B-3996的公知质粒pVIC40获得作为一个操纵子的编码对L-苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的突变体thrA基因以及thrB和thrC基因。美国专利号5,705,371中详细描述了质粒pVIC40。

已经阐明了编码大肠杆菌的苏氨酸和高丝氨酸外排系统的蛋白质(内膜转运蛋白)的rhtA基因(KEGG,entry No.b0813；GenBank登录号NC_000913.2；核苷酸位置:848,433至849,320,补充；Gene ID:947045)。rhtA基因位于接近编码谷氨酰胺转运系统组分的glnHPQ操纵子的大肠杆菌K-12染色体上dps和ompX基因之间。rhtA基因与ybiF基因相同(KEGG,entry No.b0813)。

已经阐明了编码大肠杆菌天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的asd基因(KEGG,entryNo.b3433；GenBank登录号NC_000913.2；核苷酸位置:3,571,798至3,572,901,补充；GeneID:947939)。asd基因位于大肠杆菌K-12染色体上相同链上(yhgN基因在相反链上)的glgB和gntU基因之间。

另外，已经阐明了编码大肠杆菌天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因(KEGG,entryNo.b0928；GenBank登录号NC_000913.2；核苷酸位置:983,742至984,932,补充；Gene ID:945553)。aspC基因位于大肠杆菌K-12染色体上相反链上的ycbL基因和相同链上的ompF基因之间。

L-色氨酸生产细菌

L-色氨酸生产细菌和可以用于衍生L-色氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株例如具有编码部分失活的色氨酰-tRNA合成酶的突变体trpS基因的大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美国专利号5,756,345)、具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因的大肠杆菌SV164(pGH5)(美国专利号6,180,373 B1)、酶色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利号4,371,614)、具有提高的磷酸烯醇式丙酮酸生产能力的大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps(WO97/08333,美国专利号6,319,696 B1)等。L-色氨酸生产细菌和可以用于衍生L-色氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括属于埃希氏菌属并具有提高的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质活性的菌株(美国专利申请号2003148473 A1和2003157667 A1)。

L-色氨酸生产细菌和可以用于衍生L-色氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括其中选自邻氨基苯甲酸合酶、磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合酶的一种或多种酶的活性得到提高的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以将对反馈抑制脱敏的突变导入这些酶中。具有此类突变的菌株的具体实例包括含有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164和通过将含有编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因的质粒pGH5(WO94/08031 A1)导入大肠杆菌SV164获得的转化株。

L-色氨酸生产细菌和可以用于衍生L-色氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括已经导入了含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(JP 57-71397 A、JP 62-244382 A、美国专利号4,371,614)。此外，可以通过提高色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由分别由trpA和trpB基因编码的α和β亚基组成。另外，可以通过提高异柠檬酸裂解酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。

L-缬氨酸生产细菌

L-缬氨酸生产细菌和可以用于衍生L-缬氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括但不限于已经以过表达ilvGMEDA操纵子的方式进行修饰的菌株(美国专利号5,998,178)。除去衰减所需的ilvGMEDA操纵子的区域是理想的，使得操纵子的表达不被生产的L-缬氨酸所减弱。此外，可以破坏操纵子中的ilvA基因，使得苏氨酸脱氨酶活性降低。

L-缬氨酸生产细菌和用于衍生L-缬氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括在氨酰基-tRNA合成酶中具有突变的突变体菌株(美国专利号5,658,766)。此类菌株的实例包括在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变的大肠杆菌VL1970。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日以登录号VKPM B-4411保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUPGosNII Genetika,Russian Federation,117545 Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)。

此外，需要硫辛酸用于生长和/或缺乏H⁺-ATP酶的突变体菌株也可以用作L-缬氨酸生产细菌或其亲本菌株(WO96/06926 A1)。

L-缬氨酸生产细菌和用于衍生L-缬氨酸生产细菌的亲本菌株的实例也包括大肠杆菌H81菌株(VKPM B-8066；参见例如EP1942183 B1)、大肠杆菌NRRL B-12287和NRRL B-12288(美国专利号4,391,907)、大肠杆菌VKPM B-4411(美国专利号5,658,766)、大肠杆菌VKPM B-7707(EP1016710 A2)等。

如本文所述的属于肠杆菌科的细菌已经以过表达编码铁输出蛋白的基因的方式进行了修饰。

短语“编码铁输出蛋白的基因”可以指编码具有输出铁的活性的蛋白质的基因。类似地，短语“铁输出蛋白”可以指具有输出铁的活性的蛋白质。铁输出蛋白也称为“铁离子输出蛋白”或“亚铁输出蛋白(ferrous exporter)”。也就是说，短语“铁输出蛋白”、“铁离子输出蛋白”和“亚铁输出蛋白”可以等同使用，并且它们在本领域技术人员的知识范围内。

编码铁输出蛋白的基因的具体实例包括fetB基因、fetA基因和fieF基因。编码铁输出蛋白的基因的具体实例包括fetB基因和fieF基因。细菌可以以过表达编码铁输出蛋白的一种基因或者编码铁输出蛋白的两种或更多种基因的方式进行修饰。因此，编码铁输出蛋白的基因的具体实例也包括fetB、fetA和fieF基因的组合，即它们中的任何两种或它们中的全部的组合。组合的具体实例包括fetB和fetA基因的组合，因为这些基因分别编码FetB和FetA蛋白，其构成作为铁输出蛋白发挥功能的FetAB复合物。fetB、fetA和fieF基因以及由此编码的蛋白质的更具体的描述在下文给出。

fetB基因(同义词：ybbM)编码ABC型转运蛋白FetAB的膜单位FetB(同义词：铁输出蛋白通透酶亚基)(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,entry No.b0491；Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot,登录号P77307)。fetB基因(GenBank登录号NC_000913.3；核苷酸位置:516583至517362；Gene ID:945137)位于大肠杆菌菌株K-12染色体上相同链上的fetA基因和ybbN基因之间。大肠杆菌菌株K-12的fetB基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和由大肠杆菌菌株K-12的fetB基因编码的FetB蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)是已知的。

fetA基因(同义词：ybbL)编码ABC型转运蛋白FetAB的ATP结合亚基FetA(KEGG,entry No.b0490；Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot,登录号P77279)。fetA基因(GenBank登录号NC_000913.3；核苷酸位置:515919至516596；Gene ID:946990)位于大肠杆菌菌株K-12染色体上相反链上的qmcA基因和相同链上的fetB基因之间。大肠杆菌菌株K-12的fetA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和由大肠杆菌菌株K-12的fetA基因编码的FetA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)是已知的。

fieF基因(同义词：yiiP)编码金属离子(Zn²⁺/Fe²⁺/Cd²⁺)外排转运蛋白FieF(同义词：铁离子外排泵)(KEGG,entry No.b3915；Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot,登录号P69380)。fieF基因(GenBank登录号NC_000913.3；核苷酸位置:4106469至4107371；Gene ID:948413)位于大肠杆菌菌株K-12染色体上相同链上的cpxP基因和pfkA基因之间。大肠杆菌菌株K-12的fieF基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)和由大肠杆菌菌株K-12的fieF基因编码的FieF蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)是已知的。

也就是说，编码铁输出蛋白的基因可以具有SEQ ID NO:1,3或5的核苷酸序列，并且铁输出蛋白可以具有SEQ ID NO:2,4或6的氨基酸序列。短语“基因或蛋白质具有核苷酸或氨基酸序列”涵盖基因或蛋白质包含核苷酸或氨基酸序列的情况，以及基因或蛋白质由核苷酸或氨基酸序列组成的情况。

由于FetB、FetA和FieF蛋白代表如本文所述的铁输出蛋白的实例，所以在此或下文给出的这些蛋白质的解释可以比照适用于其他铁输出蛋白。此外，由于fetB、fetA和fieF基因代表如本文所述的编码铁输出蛋白的基因的实例，所以在此或下文给出的这些基因的解释可以比照适用于编码铁输出蛋白的其他基因。

短语“细菌已经以过表达编码铁输出蛋白的基因的方式进行了修饰”可以指细菌已经以如下方式进行了修饰，使得与未修饰菌株例如上文或下文描述的野生型或亲本菌株相比，在经修饰的细菌中铁输出蛋白的总活性，即由编码铁输出蛋白的基因编码的蛋白质例如FetB、FetA或FieF蛋白的总活性增加，或者编码铁输出蛋白的基因的表达水平(表达量)较高。用作上述比较参考的未修饰菌株的实例可以包括属于埃希氏菌属细菌的野生型菌株例如大肠杆菌MG1655菌株(ATCC 47076)和W3110菌株(ATCC 27325)，属于泛菌属细菌的野生型菌株例如菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)等。

短语“过表达编码铁输出蛋白的基因”可以指与未修饰菌株相比，铁输出蛋白的总活性，即由编码铁输出蛋白的基因编码的蛋白质例如FetB、FetA或FieF蛋白的总活性增加。可以通过例如与未修饰菌株相比增加(提高)编码铁输出蛋白的基因的表达水平，或增加由所述基因编码的蛋白质的每分子活性(可以称为比活性)来增加铁输出蛋白的总活性。可以修饰细菌使得每细胞铁输出蛋白例如FetB、FetA或FieF蛋白的活性增加至未修饰菌株活性的150％或更多，200％或更多，或300％或更多。

短语“铁输出蛋白的活性”也可以称为“铁输出蛋白活性”。短语“铁输出蛋白的活性”可以指属于肠杆菌科的细菌输出铁离子的活性。短语“铁输出蛋白的活性”也可以指属于肠杆菌科的细菌从细菌的细胞通过细胞膜向外部培养基中转运铁离子的活性。短语“铁输出蛋白的活性”也可以指属于肠杆菌科的细菌利用能够从细菌的细胞通过细胞膜向外部培养基中转运铁离子的一种或多种蛋白质的输出铁离子的活性。短语“铁输出蛋白的活性”也可以指属于肠杆菌科的细菌利用具有SEQ ID NO:2,4或6的氨基酸序列的一种或多种蛋白质输出铁离子的活性。也就是说，铁输出蛋白的活性的具体实例包括具有SEQ ID NO:2,4或6的氨基酸序列的铁输出蛋白的活性。铁输出蛋白可以独自或者与其他亚基组合具有铁输出蛋白的活性。例如，FieF蛋白可以独自作为铁输出蛋白发挥作用，因此，用于FieF蛋白的短语“铁输出蛋白的活性”可以指如上所述独自的此类输出铁离子的活性。同时，FetA和FetB蛋白可以构成FetAB复合物以作为铁输出蛋白发挥作用，因此，用于FetA或FetB蛋白的短语“铁输出蛋白的活性”可以指如上所述与对应的配对组合的此类输出铁离子的活性，所述配对即对于FetA蛋白的FetB蛋白，或者对于FetB蛋白的FetA蛋白。短语“输出蛋白”、“输入蛋白”、“同向转运体”、“反向转运体”、“单转运体”、“外排”、“内流”、“摄取”等在本领域技术人员的知识范围内。

短语“具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的铁输出蛋白的活性”可以指具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的蛋白质的活性，并且可以具体指利用具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质从属于肠杆菌科的细菌的细胞中输出铁离子的活性。也可以接受的是短语“具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的铁输出蛋白的活性”可以指具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的FetB蛋白的活性，并且可以具体指利用具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的FetB蛋白从属于肠杆菌科的细菌的细胞中输出铁离子的活性。在此给出的短语“具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的铁输出蛋白的活性”的解释可以比照适用于短语“具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的铁输出蛋白的活性”和“具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的铁输出蛋白的活性”，其中FetB蛋白应该分别解读为FetA蛋白和FieF蛋白。

“铁离子”可以以还原的亚铁(Fe²⁺)形式或氧化的三价铁(Fe³⁺)形式输出，其形式可以代表游离铁离子或由一个或多个铁离子和另外一个或多个有机或无机化合物例如水形成的加合物。

可以通过评估输出铁离子的活性来确定铁输出蛋白的活性。可以具体地作为蛋白质的每单位重量例如mg或μg的比活性来确定铁输出蛋白的活性。例如，可以通过使用电子顺磁共振(EPR)光谱学评估细胞内的游离铁的量来确定铁输出蛋白的活性(NicolaouS.A.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2013,79(23):7210-7219；Woodmansee A.N.andImlay J.A.,Quantitation of intracellular free iron by electron paramagneticresonance spectroscopy,Methods Enzymol.,2002,349:3-9)。或者，如Grass G.等人(Arch.Microbiol.,2005,183:9-18)中所述，基于蛋白脂质体中荧光猝灭的方法也可以用于体外确定铁输出蛋白的活性。可以通过使用牛血清白蛋白作为标准的Bradford蛋白质测定法来确定蛋白质浓度(Bradford M.M.,Anal.Biochem.,1976,72:248-254)。

短语“过表达编码铁输出蛋白的基因”也可以指编码铁输出蛋白的基因的表达水平(表达量)比未修饰菌株中的水平高。因此，短语“过表达编码铁输出蛋白的基因”可以等同于短语“提高编码铁输出蛋白的基因的表达”。可以修饰细菌使得每细胞编码铁输出蛋白的基因例如fetB、fetA或fieF基因的表达量增加至未修饰菌株活性的150％或更多，200％或更多，或300％或更多。

可以用于提高编码铁输出蛋白的基因表达的方法包括但不限于，增加基因的拷贝数例如细菌的染色体中和/或细菌含有的自主复制质粒中基因的拷贝数。可以通过例如将基因导入细菌的染色体中和/或将含有基因的自主复制载体导入细菌中增加编码铁输出蛋白的基因的拷贝数。

载体的实例包括但不限于，广宿主范围的质粒例如pMW118/119、pBR322、pUC19等。可以通过例如同源重组、Mu驱动的整合等将编码铁输出蛋白的基因导入细菌的染色体DNA中。可以只导入一个拷贝，或者两个或更多个拷贝的编码铁输出蛋白的基因。例如，可以使用在染色体DNA中具有多个拷贝的序列实施同源重组，以将编码铁输出蛋白的基因的多个拷贝导入染色体DNA中。在染色体DNA中具有多个拷贝的序列包括但不限于，存在于转座因子末端的重复DNA或反向重复。此外，将编码铁输出蛋白的基因整合到转座子中并允许其转移以将编码铁输出蛋白的基因的多个拷贝导入染色体DNA中是可能的。通过使用Mu驱动的整合，在单一行动期间可以将超过3个拷贝的基因导入染色体DNA中(Akhverdyan V.Z.etal.,Biotechnol.(Russian),2007,3:3-20)。

可以用于增加编码铁输出蛋白的基因表达的其他方法包括通过修饰基因的表达调控区域来增加基因的表达水平。可以通过例如用天然的和/或修饰的外源调控区域取代基因的天然表达调控区域来修饰编码铁输出蛋白的基因的表达调控区域。表达调控区域也可以称为表达调控序列。由于编码铁输出蛋白的基因可以以操纵子结构组织，可以用于提高编码铁输出蛋白的基因表达的其他方法包括通过修饰操纵子的表达调控区域来增加包含编码铁输出蛋白的基因的操纵子的表达水平。可以通过例如用天然的和/或修饰的外源调控区域取代操纵子的天然表达调控区域来修饰含有编码铁输出蛋白的基因的操纵子的表达调控区域。在该方法中，可以同时提高编码铁输出蛋白的一种或多种基因的表达。

对于表达调控区域，可以例举启动子、增强子、弱化子和终止信号、抗终止信号、核糖体结合位点(RBS)和其他表达控制元件(例如，阻遏物或诱导物结合的区域和/或转录和翻译调控蛋白的结合位点，例如在转录的mRNA中)。此类调控区域描述于例如Sambrook J.,Fritsch E.F.和Maniatis T.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2^nd ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中。对控制基因表达的区域的修饰可以与增加基因的拷贝数相结合(参见例如Akhverdyan V.Z.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,91:857-871；Tyo K.E.J.et al.,Nature Biotechnol.,2009,27:760-765)。

适合于提高编码铁输出蛋白的基因表达的例示性启动子可以是比编码铁输出蛋白的基因的天然启动子更强的强效启动子。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的P_R或P_L启动子都是强效启动子。可以使用在属于肠杆菌科的细菌中提供高水平的基因表达的强效启动子。或者，可以通过例如将突变导入编码铁输出蛋白的基因的启动子区域以获得强启动子功能来提高启动子的作用，如此导致位于启动子下游的编码铁输出蛋白的基因的转录水平增加。此外，已知在Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或在SD序列和起始密码子之间的间隔区中，和/或在核糖体结合位点紧接起始密码子上游和/或下游的序列中几个核苷酸的取代极大地影响了mRNA的翻译效率。例如，发现取决于起始密码子之前的三个核苷酸的性质表达水平的20倍范围(Gold L.et al.,Annu.Rev.Microbiol.,1981,35:365-403；Hui A.et al.,EMBO J.,1984,3:623-629)。

可以通过例如对染色体DNA进行限制性酶切，随后进行使用基于基因序列的探针的Southern印迹法、荧光原位杂交(FISH)等测量基因的拷贝数，或者存在或缺乏。可以通过使用各种公知的方法包括Northern印迹法、定量RT-PCR等测量从基因转录的mRNA的量来确定基因表达的水平。可以通过已知方法包括SDS-PAGE随后进行免疫印迹法(Western印迹分析)，或蛋白质样品的质谱分析等测量由基因编码的蛋白质的量。

用于操作DNA的重组分子和分子克隆的方法例如制备质粒DNA、消化、连接和转化DNA、选择寡核苷酸作为引物、掺入突变等可以是本领域技术人员公知的普通方法。这些方法描述于例如Sambrook J.,Fritsch E.F.和Maniatis T.,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”,2^nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或GreenM.R.和Sambrook J.R.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,4^th ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(2012)；Bernard R.Glick,Jack J.Pasternak和CherylL.Patten,“Molecular Biotechnology:principles and applications of recombinantDNA”,4^th ed.,Washington,DC,ASM Press(2009)。

肠杆菌科的属、种或菌株之间的DNA序列可以存在一些差异。因此，编码铁输出蛋白的基因例如fetB、fetA和fieF基因不限于SEQ ID NO:1,3和5中显示的基因，而可以包括是SEQ ID NO:1,3和5的变体核苷酸序列的基因，只要所述基因编码铁输出蛋白，分别例如FetB、FetA和FieF蛋白。类似地，铁输出蛋白例如FetB、FetA和FieF蛋白不限于SEQ ID NO:2,4和6中显示的蛋白质，而可以包括是SEQ ID NO:2,4和6的变体蛋白质的蛋白质，只要所述蛋白质具有铁输出蛋白的活性。此类变体核苷酸序列或变体蛋白质的实例可以包括这些基因或蛋白质的同源物和人工修饰物，例如具有SEQ ID NO:1,3和5的核苷酸序列的基因或具有SEQ ID NO:2,4和6的氨基酸序列的蛋白质的同源物和人工修饰物。

短语“变体蛋白质”可以指与SEQ ID NO:2,4或6的氨基酸序列相比在序列中具有一个或多个突变的蛋白质，不论它们是一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，但其仍然保持分别与FetB、FetA和FieF蛋白类似的活性或功能，例如如上所述的铁输出蛋白的活性或其三维结构相对于野生型蛋白质没有显著变化。变体蛋白质的变化数量取决于蛋白质的三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。其可以是但不严格限于SEQ ID NO:2,4或6中的1至50、在另一个实例中1至30、在另一个实例中1至15、在另一个实例中1至10和在另一个实例中1至5。这是可能的，因为一些氨基酸彼此具有高度同源性，从而蛋白质的活性或功能不受此类氨基酸之间的变化的影响，或者通过此类氨基酸之间的变化，蛋白质的三维结构相对于野生型蛋白质没有显著变化。因此，由编码铁输出蛋白的基因编码的变体蛋白质可以具有相对于SEQ ID NO:2,4或6中显示的完整氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列，当使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”，所述同源性为不少于50％，不少于60％，不少于70％，不少于75％，不少于80％，不少于85％，不少于90％，不少于95％，不少于98％，或不少于99％，只要保持如上所述铁输出蛋白的活性或功能，或者如上所述铁输出蛋白的三维结构相对于野生型蛋白质没有显著变化。

例示性的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加可以是保守突变。代表性的保守突变是保守取代。保守取代可以是但不限于，其中如果取代位点是芳香族氨基酸，取代相互发生在Phe、Trp和Tyr之间；如果取代位点是疏水性氨基酸，在Ala、Leu、Ile和Val之间；如果取代位点是亲水性氨基酸，在Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、His和Thr之间；如果取代位点是极性氨基酸，在Gln和Asn之间；如果取代位点是碱性氨基酸，在Lys、Arg和His之间；如果取代位点是酸性氨基酸，在Asp和Glu之间；和如果取代位点是具有羟基的氨基酸，在Ser和Thr之间的取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr和用Met、Ile或Leu取代Val。

例示性的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加也可以是非保守突变，条件是通过氨基酸序列的不同位置中的一个或多个次级突变来补偿突变，使得保持与FetB、FetA和FieF蛋白类似的活性或功能，例如如上所述的铁输出蛋白的活性，或者FetB、FetA和FieF蛋白的三维结构相对于野生型蛋白质没有显著变化。

为了评估蛋白质或DNA同源性的程度，可以使用几种计算方法，例如BLAST搜索、FASTA搜索和ClustalW方法。BLAST(基本局部比对搜索工具，ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索是blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn和tblastx程序采用的启发式搜索算法；这些程序将意义归功于使用Karlin S.和Altschul S.F.的统计方法的他们的发现(“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequencefeatures by using general scoring schemes”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:2264-2268；“Applications and statistics for multiple high-scoring segments inmolecular sequences”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)。计算机程序BLAST计算三个参数：得分、同一性和相似性。FASTA搜索方法由Pearson W.R.描述(“Rapidand sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”,Methods Enzymol.,1990,183:63-98)。ClustalW方法由Thompson J.D.等人描述(“CLUSTAL W:improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice”,NucleicAcids Res.,1994,22:4673-4680)。

铁输出蛋白的实例可以包括FetB、FetA和FieF的蛋白质同源物。此类蛋白质同源物的实例包括各种生物体例如肠杆菌科细菌的那些。例如，已知来自肠杆菌科不同细菌的FetB、FetA和FieF的蛋白质同源物(Nicolaou S.A.et al.,2013)具有如上所述的铁输出蛋白的活性。下文(表1-3)用同源性值(作为同一性”，即氨基酸残基的同一性)、分类数据和NCBI数据库(国家生物技术信息中心，ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中氨基酸序列的登录号和序列记录号的指标描述此类来自肠杆菌科细菌的蛋白质同源物的实例。虽然此类FetB、FetA和FieF的蛋白质同源物是野生型铁输出蛋白(铁输出蛋白的野生型蛋白质)的实例，它们中的每一种也可以对应于另一种的变体蛋白质，例如SEQ ID NO:2,4或6的变体蛋白质。

此外，铁输出蛋白的实例也可以包括此类FetB、FetA和FieF的蛋白质同源物的进一步变体蛋白质。本文给出的关于SEQ ID NO:2,4或6的变体蛋白质的解释，例如关于突变和序列同一性的解释，可以比照适用于此类进一步变体蛋白质。

短语“FetB蛋白”、“FetA蛋白”或“FieF蛋白”不限于野生型FetB、FetA或FieF蛋白例如SEQ ID NO:2,4或6中显示的FetB、FetA或FieF蛋白和表1-3中显示的FetB、FetA和FieF的蛋白质同源物，但可以总地指野生型FetB、FetA或FieF蛋白及其各自的变体蛋白质。

表1：FetB的蛋白质同源物

*-在此表和之后的表2(FetA的蛋白质同源物)和表3(FieF的蛋白质同源物)中-NCBI数据库(国家生物技术信息中心，www.ncbi.nlm.nih.gov/)中

表2：FetA的蛋白质同源物

表3：FieF的蛋白质同源物

此外，编码铁输出蛋白的基因可以是任何基因，只要它编码铁输出蛋白。例如，编码铁输出蛋白的基因也可以是变体核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1,3或5的变体核苷酸序列。短语“变体核苷酸序列”可以指编码铁输出蛋白的变体蛋白质的核苷酸序列，或者使用根据标准遗传密码表(参见例如Lewin B.,“Genes VIII”,2004,Pearson Education,Inc.,Upper Saddle River,NJ 07458)的任何同义氨基酸密码子编码野生型铁输出蛋白的核苷酸序列。因此，编码铁输出蛋白的基因可以是由于遗传密码的简并性的变体核苷酸序列，例如由于遗传密码的简并性的SEQ ID NO:1,3或5的变体核苷酸序列。

短语“变体核苷酸序列”也可以指但不限于，在严格条件下与SEQ ID NO:1,3,5中显示的序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或者可以在严格条件下从核苷酸序列制备的探针，条件是它编码活性或功能性蛋白质。“严格条件”包括形成特定杂合物例如具有当使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”的同源性的杂合物，所述同源性不少于50％、不少于60％、不少于70％、不少于75％、不少于80％、不少于85％、不少于90％、不少于95％、不少于96％、不少于97％、不少于98％或不少于99％，并且没有形成非特定杂合物例如具有低于以上同源性的杂合物的条件。例如，可以通过在60℃或65℃在1×SSC(标准柠檬酸钠或标准氯化钠)、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)，或者在另一个实例中0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下清洗一次或更多次，或者在另一个实例中两次或三次来例示严格条件。清洗的持续时间取决于用于印迹的膜的类型，并且通常应该是制造商推荐的。例如，在严格条件下，Amersham Hybond^TM-N+带正电荷的尼龙膜(GE Healthcare)的推荐清洗持续时间为15分钟。清洗步骤可以实施2至3次。作为探针，也可以使用与SEQ ID NO:1,3或5中显示的序列互补的序列的一部分。可以通过使用基于SEQ ID NO:1,3或5中显示的序列制备的寡核苷酸作为引物以及含有核苷酸序列的DNA片段作为模板的PCR生产此类探针。建议探针长度>50bp；它可以根据杂交条件适当选择，并且通常为100bp至1kbp。例如，当使用长度为约300bp的DNA片段作为探针时，杂交后的清洗条件可以通过2×SSC、0.1％SDS在50℃、60℃或65℃来例示。

由于已经阐明了编码物种大肠杆菌的FetB、FetA和FieF蛋白的基因(参见上文)，可以通过例如利用基于fetB、fetA和fieF基因的核苷酸序列制备的引物的PCR(聚合酶链式反应；参考White T.J.et al.,The polymerase chain reaction,Trends Genet.,1989,5:185-189)从含有野生型fetB、fetA和/或fieF基因的微生物例如属于肠杆菌科的细菌中；或者通过在体外用例如羟胺处理含有野生型fetB、fetA和fieF基因的DNA的定点诱变方法，或者用紫外线(UV)照射或突变剂例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和通常用于此类处理的亚硝酸处理含有野生型fetB、fetA和/或fieF基因的微生物例如属于肠杆菌科的细菌；或者化学合成为全长基因结构来获得编码铁输出蛋白的基因例如编码野生型FetB、FetA或FieF蛋白或它们的变体蛋白质的基因。可以以类似的方式获得来自任何其他生物体的编码FetB、FetA和FieF蛋白或它们的变体蛋白质的基因。

短语“野生型蛋白质”可以指由生物体，具体地肠杆菌科的野生型或亲本细菌的菌株例如野生型大肠杆菌MG1655菌株天然生产的天然蛋白质。野生型蛋白质可以由“野生型基因”编码，所述野生型基因可以存在于生物体，具体地野生型或亲本细菌的菌株的基因组中。

短语“fetB基因”、“fetA基因”或“fieF基因”不限于野生型fetB、fetA或fieF基因例如SEQ ID NO:1,3或5中显示的fetB、fetA或fieF基因和编码表1-3中显示的FetB、FetA和FieF的蛋白质同源物的基因，但可以总地指野生型fetB、fetA或fieF基因及其各自的变体核苷酸序列。

本文给出的关于铁输出蛋白的基因和蛋白质的变体的解释也可以比照适用于任意基因和蛋白质，例如L-氨基酸生物合成酶和编码它们的基因。

除了已经提到的性质之外，细菌可以具有其他特定性质，例如各种营养需求、药物抗性、药物敏感性和药物依赖性，而不脱离本发明的范围。

2.方法

本发明的方法包括生产L-氨基酸的方法。在所述方法中，可以单独生产一种L-氨基酸，或者可以生产两种或更多种L-氨基酸的混合物。生产L-氨基酸的方法可以包括在培养基中培养上述细菌以在所述培养基中或在细菌的细胞中或所述培养基和细菌的细胞这两者中允许生产、排泄或分泌，和/或积累L-氨基酸，并从所述培养基和/或细菌的细胞中收集L-氨基酸的步骤。可以以游离形式或作为其盐或作为其混合物生产L-氨基酸。也就是说，短语“L-氨基酸”可以指游离形式、其盐形式或其混合物的L-氨基酸。例如，可以通过所述方法生产钠、钾、铵等盐或内盐例如L-氨基酸的两性离子。这是可能的因为氨基酸可以在发酵条件下彼此反应或者在典型的酸碱中和反应中与中和剂例如无机或有机酸性或碱性物质反应形成作为氨基酸的化学特性的盐，其对于本领域技术人员来说是显而易见的。另外，可以以其与例如另一种有机或无机化合物的加合物形式来生产L-氨基酸。具体而言，可以通过所述方法生产L-氨基酸的单盐酸盐例如L-赖氨酸的单盐酸盐(L-赖氨酸×HCl)或L-精氨酸的单盐酸盐(L-精氨酸×HCl)。

可以以与常规发酵方法类似的方式实施培养细菌和从培养基中收集和纯化L-氨基酸，其中使用微生物生产L-氨基酸。使用的培养基没有特别限制，只要所述培养基至少含有碳源，并且本文描述的细菌可以在其中增殖并生产L-氨基酸。用于L-氨基酸生产的培养基可以是合成的或天然的培养基例如根据需要含有碳源、氮源、硫源、磷源、无机离子以及其他有机和无机组分的典型培养基。作为碳源，可以使用糖类例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，麦芽糖，木糖，海藻糖，核糖和淀粉的水解产物；醇类例如乙醇，甘油，甘露醇和山梨糖醇；有机酸例如葡萄糖酸，富马酸，柠檬酸，苹果酸和琥珀酸；脂肪酸等。作为氮源，可以使用无机铵盐例如硫酸铵，氯化铵和磷酸铵；有机氮例如大豆水解产物；氨气；氨水；等。此外，也可以利用蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆等。培养基可以含有一种或多种这些氮源。硫源可以包括硫酸铵、硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸锰等。除碳源，氮源和硫源外，培养基可以含有磷源。作为磷源，可以利用磷酸二氢钾，磷酸氢二钾、磷酸盐聚合物如焦磷酸等。培养基可以含有其他各种有机和无机组分包括例如维生素如维生素B1，维生素B2，维生素B6，维生素B12，烟酸和烟酰胺；所需的物质例如核酸如RNA和氨基酸；含有这些的有机组分例如蛋白胨，胰蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物和大豆蛋白质分解产物；等，其可以以适当的，即使是痕量的量存在。除了这些，如果必要的话，可以添加少量的磷酸钙、铁离子、锰离子等。作为其他各种有机和无机组分，可以使用一种组分，或者可以组合使用两种或更多种组分。此外，当使用需要氨基酸等用于其生长的营养缺陷型突变株时，优选向培养基补充所需的营养物。

培养可以在有氧条件下实施16至72小时，或32至68小时；培养期间的培养温度可以控制在30至45℃之间，或30至37℃之间；pH可以调节在5至8之间，或6至7.5之间。可以通过使用无机或有机酸性或碱性物质以及氨气调节pH。

培养后，可以从培养基中收集目标L-氨基酸。另外，培养后，可以从细菌的细胞中收集目标L-氨基酸，具体地，可以用例如超声波等破坏细胞，可以通过例如离心或膜过滤除去固体例如细胞和细胞破坏悬液(也称为细胞碎片)来获得上清液，然后可以从上清液中收集目标L-氨基酸。可以通过常规技术的任何组合例如浓缩、结晶、膜处理、离子交换色谱、快速色谱、薄层色谱、高效液相色谱等实施从培养基或上清液等中收集L-氨基酸。这些方法可以单独使用，或者可以以适当的组合使用。

除了目标L-氨基酸之外，收集的目标L-氨基酸组合物可以含有微生物细胞、培养基组分、水分和微生物的副产物代谢物。收集的目标L-氨基酸的纯度可以是50％或更高，85％或更高，或者95％或更高(美国专利号5,431,933、日本专利号1214636、美国专利号4,956,471、4,777,051、4,946,654、5,840,358、6,238,714、美国专利公开申请号2005/0025878)。

实施例

下面将参考以下非限制性实施例更具体地解释本发明。

实施例1：具有修饰的fieF和fetB基因的调控区域的大肠杆菌MG1655菌株的构建

使用Datsenko K.A.和Wanner B.L.开发的称为“λRed/ET介导的整合”的方法(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)过表达大肠杆菌中的fieF和fetB基因。根据该规程，构建了用于fieF的PCR引物对P1(SEQ IDNO:7)/P2(SEQ ID NO:8)和用于fetB的P3(SEQ ID NO:9)/P4(SEQ ID NO:10)，其每一个与相应基因相邻的区域和与赋予卡那霉素抗性(Km^R,kan)的基因相邻的区域或模板pMW-Km-Pnlp8质粒中的

启动子(SEQ ID NO:11)同源。pMW-Km-Pnlp8质粒(WO2014027702)在PCR反应中用作模板。PCR的条件如下：95℃变性3分钟；25个循环的概况：95℃1分钟，57℃1分钟，72℃2分钟；72℃最终延伸10分钟。获得的称为kan-

-fieF的DNA片段1(1951bp,SEQ ID NO:12)和称为kan-

-fetB的DNA片段2(1951bp,SEQ ID NO:13)在琼脂糖凝胶中纯化并用于含有具有温度敏感性复制起点的质粒pKD46的菌株大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)的电穿孔。大肠杆菌MG1655菌株可从美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)获得。质粒pKD46(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)包括噬菌体λ(GenBank登录号J02459)的2,154nt(31088-33241)的DNA片段以及含有在阿拉伯糖诱导的P_araB启动子控制下的λRed同源重组系统(β、γ和exo基因)的基因。质粒pKD46是将DNA片段整合到大肠杆菌MG1655菌株的染色体中所必需的。

如下制备电感受态细胞：大肠杆菌MG1655细胞在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB-培养基(Sambrook,J.and Russell,D.W.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))中于30℃过夜生长，并用5mL含有氨苄青霉素(100mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培养基(Sambrook J.,Fritsch E.F.andManiatis T.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))稀释培养物100倍。使稀释的培养物于30℃通气(250rpm)生长至OD₆₀₀为约0.6，然后通过浓缩100倍并用冰冷的去离子水清洗三次使其电感受态。使用50μL细胞和约100ng DNA片段1或DNA片段2实施电穿孔。然后，细胞与1mL SOC培养基(Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))于37℃温育2.5小时，放置在含有LB培养基、琼脂(1.5％)和卡那霉素(20mg/L)的平板上，并于37℃生长以选择Km^R重组体。为了消除pKD46质粒，于42℃在具有卡那霉素(20mg/L)的L-琼脂上实施一次传代，并测试所获得的菌落对氨苄青霉素的敏感性。如此，获得大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株。

通过以下规程验证经修饰的大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株中的fieF和fetB基因的调控区域。

通过分别使用基因座特异性引物对P5(SEQ ID NO:14)/P6(SEQ ID NO:15)和P7(SEQ ID NO:16)/P8(SEQ ID NO:17)以及亲本菌株大肠杆菌MG1655的染色体作为对照模板的PCR验证Km^R基因(kan)标记的含有fieF和fetB基因的

启动子区域的细胞。PCR的条件如下：95℃变性2分钟；25个循环的概况：95℃30秒，57℃30秒，72℃2分钟；72℃最终延伸10分钟。结果，分别从对照模板获得DNA片段3(333bp,SEQ ID NO:18)和DNA片段4(1036bp,SEQ ID NO:19)。当大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655kan-

-fetB菌株的染色体用作模板时，分别获得DNA片段5(2145bp,SEQ ID NO:20)和DNA片段6(2148bp,SEQ ID NO:21)。

实施例2：大肠杆菌L-苏氨酸生产菌株的构建

将分别含有在

控制下的fieF和fetB基因的DNA片段1和2(实施例1)以与实施例1中描述相同的方式各自导入L-苏氨酸生产大肠杆菌B-3996Δtdh菌株中。通过使用“λRed/ET介导的整合”方法(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)删除大肠杆菌VKPM B-3996染色体上的tdh基因(美国专利号5,175,107和5,705,371)获得菌株B-3996Δtdh。菌株VKPM B-3996于1987年11月19日以登录号RIA 1867保藏在All-Union Scientific Center of Antibiotics(RussianFederation,117105 Moscow,Nagatinskaya Street 3-A)。所述菌株也于2002年12月19日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNIIGenetika,Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)。

在含有LB培养基、琼脂(1.5％)和卡那霉素(20mg/L)的平板上选择含有kan-

-fieF和kan-

-fetB盒的大肠杆菌B-3996Δtdh的细胞。如此，获得L-苏氨酸生产大肠杆菌B-3996Δtdh-kan-

-fieF和B-3996Δtdh-kan-

-fetB菌株。使用如上所述的PCR验证fieF和fetB基因的启动子区域的替换。

实施例3：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-苏氨酸的生产

经修饰的大肠杆菌B-3996Δtdh-kan-

-fieF和B-3996Δtdh-kan-

-fetB菌株以及对照大肠杆菌B-3996Δtdh菌株各自在含有2mL补充有4％(w/w)葡萄糖的L-培养液的20×200-mm试管中于32℃培养18小时。然后，将0.2mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并于32℃在旋转振荡器上以250rpm培养65小时。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃通过于180℃干热灭菌2小时。pH调节至7.0。抗生素在灭菌后导入培养基。

培养后，可以通过使用如下流动相的纸色谱法来确定在培养基中积累的L-苏氨酸的量：丁醇-乙酸-水＝4：1：1(v/v)。茚三酮(2％)的丙酮溶液用作显色试剂。显影后，干燥平板并用Camag TLC Scanner 3以吸光度模式扫描，使用winCATS软件(版本1.4.2)在520nm处检测。

每种菌株的五次独立试管发酵的结果显示在表4中。从表4可以看出，与亲本大肠杆菌B-3996Δtdh相比，经修饰的大肠杆菌B-3996Δtdh-kan-

-fieF和大肠杆菌B-3996Δtdh-kan-

-fetB菌株能够生产更高量的L-苏氨酸。

表4：

实施例4：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-精氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-精氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至精氨酸生产大肠杆菌菌株382以获得菌株大肠杆菌382-kan-

-fieF和382-kan-

-fetB。菌株382于2000年4月10日以登录号VKPM B-7926保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,RussianFederation,117545 Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)，然后根据布达佩斯条约的规定于2001年5月18日转化为国际保藏物。

大肠杆菌菌株382、382-kan-

-fieF和382-kan-

-fetB分别在3mL营养培养液中于37℃振荡(220rpm)培养18小时。然后，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并于32℃在旋转振荡器(220rpm)上培养48小时。

培养后，通过使用由正丁醇：乙酸：水＝4：1：1(v/v)组成的流动相的纸色谱法来确定在培养基中积累的L-精氨酸的量。茚三酮(2％)的丙酮溶液用作显色试剂。切出含有L-精氨酸的点，用CdCl₂的0.5％水溶液洗脱L-精氨酸，并在540nm处用分光光度法估算L-精氨酸的量。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃于180℃干热灭菌2小时。pH调节至7.0。

实施例5：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-瓜氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-瓜氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至瓜氨酸生产大肠杆菌菌株382ΔargG以获得菌株大肠杆菌382ΔargG-kan-

-fieF和382ΔargG-kan-

-fetB。通过使用最初由DatsenkoK.A.和Wanner B.L.开发的称为“λRed/ET介导的整合”的方法(Datsenko K.A.and WannerB.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)删除精氨酸生产大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926,EP1170358 A1)的染色体上的argG基因获得菌株382ΔargG。根据该规程，构建了各自与argG基因相邻的区域和与在模板质粒中赋予抗生素抗性的基因相邻的区域两者同源的PCR引物。质粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)在PCR中用作模板。

大肠杆菌菌株382ΔargG、382ΔargG-kan-

-fieF和382ΔargG-kan-

-fetB分别在3mL营养培养液中于37℃振荡培养18小时。然后，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并于32℃在旋转振荡器上培养48小时。

培养后，通过使用由丁-1-醇：乙酸：水＝4：1：1(v/v)组成的流动相的纸色谱法来确定在培养基中积累的L-瓜氨酸的量。茚三酮(2％)的丙酮溶液用作显色试剂。切出含有L-瓜氨酸的点，用CdCl₂的0.5％水溶液洗脱L-瓜氨酸，并在540nm处用分光光度法估算L-瓜氨酸的量。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃于180℃干热灭菌2小时。pH调节至7.0。

实施例6：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-半胱氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-半胱氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至半胱氨酸生产大肠杆菌菌株JM15(ydeD)以获得菌株大肠杆菌JM15(ydeD)-kan-

-fieF和JM15(ydeD)-kan-

-fetB。菌株JM15(ydeD)是大肠杆菌JM15的衍生物(美国专利号6,218,168B1)，其是用含有ydeD基因的DNA转化(美国专利号5,972,663)。大肠杆菌JM15菌株(CGSC#5042)可从大肠杆菌遗传库中心(YaleUniversity,New Haven,USA)获得。ydeD基因编码膜蛋白，并且它不参与任何L-氨基酸的生物合成途径。

发酵条件和评估L-半胱氨酸生产的规程详细描述于美国专利号6,218,168 B1的实施例6中。

实施例7：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-谷氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-谷氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至谷氨酸生产大肠杆菌菌株VL334thrC⁺(EP1172433 A1)以获得菌株大肠杆菌VL334thrC⁺-kan-

-fieF和VL334thrC⁺-kan-

-fetB。菌株VL334thrC⁺于2004年12月6日以登录号VKPM B-8961保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545 Moscow,1^st Dorozhnyproezd,1)，然后根据布达佩斯条约的规定于2004年12月8日转换为国际保藏物。

大肠杆菌菌株VL334thrC⁺、VL334thrC⁺-kan-

-fieF和VL334thrC⁺-kan-

-fetB分别在L-琼脂平板上于37℃培养18-24小时。然后，将一环细胞转移到含有2mL发酵培养基的20×200-mm试管中。于30℃振荡3天实施培养。

培养后，通过使用由丁-1-醇：乙酸：水＝4：1：1(v/v)组成的流动相的纸色谱法来确定在培养基中积累的L-谷氨酸的量，随后用茚三酮(1％丙酮溶液)染色，在具有0.5％CdCl₂的50％乙醇中洗脱L-谷氨酸，并进一步在540nm处估算L-谷氨酸的量。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖和CaCO₃分开灭菌。pH调节至7.2。

实施例8：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-组氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-组氨酸生产的作用，使用P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至L-组氨酸生产大肠杆菌菌株80以获得菌株大肠杆菌80-kan-

-fieF和80-kan-

-fetB。菌株80描述于俄罗斯专利号2119536C1中并于1999年10月15日以登录号VKPM B-7270保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUPGosNII Genetika,Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)，然后根据布达佩斯条约的规定于2004年7月12日转换为国际保藏物。

大肠杆菌菌株80、80-kan-

-fieF和80-kan-

-fetB分别在2mLL-培养液(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rded.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中于29℃培养6小时。然后，将0.1mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并于29℃在旋转振荡器(350rpm)上培养65小时。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

*Mameno是豆粕水解产物(Ajinomoto Co.,Inc.)。

葡萄糖、硫酸镁、甜菜碱和CaCO₃分开灭菌。灭菌前通过6M KOH溶液将pH调节至6.0。

培养后，通过薄层色谱(TLC)确定培养基中积累的L-组氨酸的量。使用0.11-mm层含有非荧光指示剂的Sorbfil硅胶(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,RussianFederation)包被的10×15-cm TLC平板。Sorbfil平板用由丙-2-醇：丙酮：25％氨水：水＝6：6：1.5：1(v/v)组成的流动相展开。溶于丙酮的茚三酮溶液(2％,w/v)用作显色试剂。显影后，干燥平板并用Camag TLC Scanner 3以吸光度模式扫描，使用winCATS软件(版本1.4.2)在520nm处检测。

实施例9：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-亮氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-亮氨酸生产的作用，使用P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至L-亮氨酸生产大肠杆菌菌株57(VKPM B-7386,美国专利号6,124,121)以获得菌株大肠杆菌57-kan-

-fieF和57-kan-

-fetB。菌株57于1997年5月19日以登录号VKPM B-7386保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUPGosNII Genetika,Russian Federation,117545 Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)。

大肠杆菌菌株57、57-kan-

-fieF和57-kan-

-fetB分别在L-琼脂平板上于37℃培养18-24小时。为了获得种子培养物，使菌株各自在含有补充蔗糖(4％)的2mL L-培养液(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)的20×200-mm试管中于32℃在旋转振荡器(250rpm)上生长18小时。然后，用0.2mL种子材料(10％)接种发酵培养基。在20×200-mm试管中以2mL最小发酵培养基实施发酵。细胞于32℃以250rpm振荡生长48-72小时。

培养后，通过使用由丁-1-醇：乙酸：水＝4：1：1(v/v)组成的流动相的纸色谱法来确定在培养基中积累的L-亮氨酸的量。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖分开灭菌。CaCO₃于180℃干热灭菌2小时。pH调节至7.2。

实施例10：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-赖氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-赖氨酸生产的作用，使用P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至赖氨酸生产大肠杆菌菌株AJ11442以获得菌株大肠杆菌AJ11442-kan-

-fieF和AJ11442-kan-

-fetB。菌株AJ11442于1981年5月1日以保藏号FERM P-5084保藏在工业科学和技术局，发酵研究所(当前为NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,Japan)，并接受了登录号FERM BP-1543。pCABD2质粒包括编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因、编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的天冬氨酸激酶III的lysC基因、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因以及编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(美国专利号6,040,160)。

大肠杆菌菌株AJ11442、AJ11442-kan-

-fieF和AJ11442-kan-

-fetB分别在含有链霉素(20mg/L)的L-培养基中于37℃培养。然后，将0.3mL获得的培养物各自接种到500-mL烧杯中的20mL含有所需药物的发酵培养基中。通过使用往复振荡器以115rpm的搅拌速度于37℃实施培养16小时。

培养后，通过已知方法(Biotech-analyzer AS210,Sakura Seiki Co.)来确定培养基中积累的L-赖氨酸和残留的葡萄糖的量。然后，对于每个菌株相对于消耗的葡萄糖计算L-赖氨酸的产量。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

用KOH将pH调节至7.0，并且培养基于115℃高压灭菌10分钟。葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃于180℃干热灭菌2小时并添加到培养基中至终浓度为30g/L。

实施例11：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-鸟氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-鸟氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至鸟氨酸生产大肠杆菌菌株382ΔargFΔargI以获得菌株大肠杆菌382ΔargFΔargI-kan-

-fieF和382ΔargFΔargI-kan-

-fetB。通过使用最初由Datsenko K.A.和Wanner B.L.开发的称为“λRed/ET介导的整合”的方法(DatsenkoK.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)对精氨酸生产大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926,EP1170358 A1)的染色体上的argF和argI基因进行连续缺失获得菌株382ΔargFΔargI。根据该规程，构建了与argF或argI基因和在模板质粒中赋予抗生素抗性的基因相邻的区域两者同源的两对PCR引物。质粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)在PCR中用作模板。

大肠杆菌菌株382ΔargFΔargI、382ΔargFΔargI-kan-

-fieF和382ΔargFΔargI-kan-

-fetB分别在3mL营养培养液中于37℃振荡培养18小时。然后，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并于32℃在旋转振荡器上培养48小时。

培养后，通过使用由丁-1-醇：乙酸：水＝4：1：1(v/v)组成的流动相的纸色谱法来确定在培养基中积累的L-鸟氨酸的量。茚三酮(2％)的丙酮溶液用作显色试剂。切出含有L-鸟氨酸的点，用CdCl₂的0.5％水溶液洗脱鸟氨酸，并在540nm处用分光光度法估算鸟氨酸的量。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃于180℃干热灭菌2小时。pH调节至7.0。

实施例12：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-苯丙氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-苯丙氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至苯丙氨酸生产大肠杆菌菌株AJ12739以获得菌株大肠杆菌AJ12739-kan-

-fieF和AJ12739-kan-

-fetB。菌株AJ12739于2001年11月6日以登录号VKPM B-8197保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUPGosNIIGenetika,Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)，然后根据布达佩斯条约的规定于2002年8月23日转换为国际保藏物。

大肠杆菌菌株AJ12739、AJ12739-kan-

-fieF和AJ12739-kan-

-fetB分别在营养培养液中于37℃培养18小时。然后，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的3mL发酵培养基中并于37℃在旋转振荡器上振荡培养48小时。

培养后，通过薄层色谱(TLC)确定培养基中积累的L-苯丙氨酸的量。使用0.11-mm层含有非荧光指示剂的Sorbfil硅胶(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,RussianFederation)包被的10×15-cm TLC平板。Sorbfil平板用由丙-2-醇：乙酸乙酯：25％氨水：水＝40：40：7：16(v/v)组成的流动相展开。溶于丙酮的茚三酮溶液(2％,w/v)用作显色试剂。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁分开灭菌。CaCO₃于180℃干热灭菌2小时。pH调节至7.0。

实施例13：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-脯氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-脯氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至脯氨酸生产大肠杆菌菌株702ilvA以获得菌株大肠杆菌702ilvA-kan-

-fieF和702ilvA-kan-

-fetB。菌株702ilvA于2000年7月18日以登录号VKPM B-8012保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545 Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)，然后根据布达佩斯条约的规定于2001年5月18日转换为国际保藏物。

大肠杆菌菌株702ilvA、702ilvA-kan-

-fieF和702ilvA-kan-

-fetB分别在L-琼脂平板上于37℃培养18-24小时。然后，在与实施例7(L-谷氨酸的生产)相同的条件下各自培养这些菌株。

实施例14：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-色氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-色氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至色氨酸生产大肠杆菌菌株SV164(pGH5)以获得菌株大肠杆菌SV164(pGH5)-kan-

-fieF和SV164(pGH5)-kan-

-fetB。菌株SV164(pGH5)是通过将质粒pGH5导入到大肠杆菌菌株SV164中获得的菌株。菌株SV164(JP 3032013B)具有编码不受色氨酸的反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因。菌株SV164是通过将突变导入到大肠杆菌菌株YMC9(ATCC 33927)中的trpE基因获得的菌株。菌株YMC9可从美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)获得。质粒pGH5含有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因。菌株SV164(pGH5)详细描述于美国专利号6,180,373 B1或EP0662143 B1。

大肠杆菌菌株SV164(pGH5)、SV164(pGH5)-kan-

-fieF和SV164(pGH5)-kan-

-fetB分别在3mL补充四环素(20mg/L,pGH5质粒的标志物)的营养培养液中于37℃振荡培养18小时。然后，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的3mL含有四环素(20mg/L)的发酵培养基中并于37℃在旋转振荡器上以250rpm培养48小时。

培养后，通过实施例12(L-苯丙氨酸的生产)中描述的TLC确定培养基中积累的L-色氨酸的量。发酵培养基组分列于表5中，但应如所示的在分开的组(A、B、C、D、E、F、G和H)中灭菌，以避免灭菌过程中的不良相互作用。

表5

用NH₄OH将溶液A的pH调节至7.1。

*Mameno是豆粕水解产物(Ajinomoto Co.,Inc.)

实施例15：使用经修饰的大肠杆菌菌株的L-缬氨酸的生产

为了测试过表达fieF和fetB基因对L-缬氨酸生产的作用，通过P1转导将来自上述大肠杆菌MG1655 kan-

-fieF和大肠杆菌MG1655 kan-

-fetB菌株的染色体的DNA片段转移至缬氨酸生产大肠杆菌菌株H81以获得菌株大肠杆菌H81-kan-

-fieF和H81-kan-

-fetB。菌株H81于2001年1月30日以登录号VKPM B-8066保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,RussianFederation,117545 Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)，然后根据布达佩斯条约的规定于2002年2月1日转换为国际保藏物。

大肠杆菌菌株H81、H81-kan-

-fieF和H81-kan-

-fetB分别在营养培养液中于37℃培养18小时。然后，将获得的培养物(每个0.1mL)接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并于32℃在旋转振荡器上以250rpm培养72小时。

培养后，通过TLC测量培养基中积累的L-缬氨酸的量。使用0.11-mm层含有非荧光指示剂的Sorbfil硅胶(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,Russian Federation)包被的10×15-cm TLC平板。Sorbfil平板用由丙-2-醇：乙酸乙酯：25％氨水：水＝40：40：7：16(v/v)组成的流动相展开。溶于丙酮的茚三酮溶液(2％,w/v)用作显色试剂。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

CaCO₃于180℃干热灭菌2小时。pH调节至7.0。

虽然已经参考其优选实施方案详细地描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种变化和采用等同物。本文引用的所有参考文献通过引用作为本申请的一部分并入。

工业适用性

根据本发明，可以改进通过具有L-氨基酸生产能力的肠杆菌科细菌的发酵的L-氨基酸的生产，并且从而可以通过所述细菌有效地生产L-氨基酸。

序列表

<110> 味之素株式会社

<120> 使用过表达编码铁输出蛋白基因的肠杆菌科的细菌生产L-氨基酸的方法

<130> D734-16474

<150> RU2016106614

<151> 2016-02-25

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

atgaactcgc ataatattac taacgaatca ttagcactgg cattaatgct ggtggtggtg 60

gcaatcttaa ttagccataa agaaaaactg gcgctggaga aagatattct ctggagcgtc 120

gggcgagcga taattcagct gattattgtc ggctatgtgc tgaagtatat tttcagcgtg 180

gatgatgcca gcctgacatt attgatggtg ttatttatct gctttaatgc ggcgtggaac 240

gcgcaaaaac gcagtaaata tattgctaaa gcttttatct catcgtttat tgccattacg 300

gtcggggcgg gaattaccct ggcggtgctg attctctcag ggtcgattga atttatcccg 360

atgcaggtga tccctatcgc cgggatgatt gccggtaacg ccatggtagc ggtggggttg 420

tgttacaaca atttagggca acgggtcatt agcgaacagc aacagattca ggagaaactg 480

agtcttggtg cgacgccgaa gcaggcttca gcgatattga ttcgcgacag tattcgcgcg 540

gctttaattc cgacggtcga ttcagcaaaa acggttggct tagtgagttt accaggaatg 600

atgtccgggc tgatatttgc cgggattgat ccggtgaagg cgattaaata tcagattatg 660

gtgaccttta tgctgctctc aaccgccagc ttgtcgacca ttattgcctg ctatttaacc 720

tatcgtaagt tttataattc gcgccaccag ttggtggtga cgcaattgaa gaagaaatga 780

<210> 2

<211> 259

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Asn Ser His Asn Ile Thr Asn Glu Ser Leu Ala Leu Ala Leu Met

1 5 10 15

Leu Val Val Val Ala Ile Leu Ile Ser His Lys Glu Lys Leu Ala Leu

20 25 30

Glu Lys Asp Ile Leu Trp Ser Val Gly Arg Ala Ile Ile Gln Leu Ile

35 40 45

Ile Val Gly Tyr Val Leu Lys Tyr Ile Phe Ser Val Asp Asp Ala Ser

50 55 60

Leu Thr Leu Leu Met Val Leu Phe Ile Cys Phe Asn Ala Ala Trp Asn

65 70 75 80

Ala Gln Lys Arg Ser Lys Tyr Ile Ala Lys Ala Phe Ile Ser Ser Phe

85 90 95

Ile Ala Ile Thr Val Gly Ala Gly Ile Thr Leu Ala Val Leu Ile Leu

100 105 110

Ser Gly Ser Ile Glu Phe Ile Pro Met Gln Val Ile Pro Ile Ala Gly

115 120 125

Met Ile Ala Gly Asn Ala Met Val Ala Val Gly Leu Cys Tyr Asn Asn

130 135 140

Leu Gly Gln Arg Val Ile Ser Glu Gln Gln Gln Ile Gln Glu Lys Leu

145 150 155 160

Ser Leu Gly Ala Thr Pro Lys Gln Ala Ser Ala Ile Leu Ile Arg Asp

165 170 175

Ser Ile Arg Ala Ala Leu Ile Pro Thr Val Asp Ser Ala Lys Thr Val

180 185 190

Gly Leu Val Ser Leu Pro Gly Met Met Ser Gly Leu Ile Phe Ala Gly

195 200 205

Ile Asp Pro Val Lys Ala Ile Lys Tyr Gln Ile Met Val Thr Phe Met

210 215 220

Leu Leu Ser Thr Ala Ser Leu Ser Thr Ile Ile Ala Cys Tyr Leu Thr

225 230 235 240

Tyr Arg Lys Phe Tyr Asn Ser Arg His Gln Leu Val Val Thr Gln Leu

245 250 255

Lys Lys Lys

<210> 3

<211> 678

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 3

atgcaggaaa atagtccttt gcttcagcta caaaacgtag gatatctggc gggtgatgcg 60

aagattctta ataacatcaa tttttcgctg cgtgctggcg aatttaagtt aattaccggt 120

ccttctggtt gtggcaaaag tacgctgcta aaaatagttg cttcattgat cagcccaacc 180

agcggaacgt tactgtttga aggtgaggat gtcagcacac taaagccaga aatctaccgc 240

caacaagtct cttactgcgc ccagacaccg acgctgtttg gcgatacggt atacgataat 300

ctgatctttc cctggcagat ccgtaaccgg cagcctgacc cagccatttt tctcgatttt 360

ctcgaacgct tcgccttgcc ggacagcatt ttgacgaaga atatcgccga gctatctggt 420

ggtgaaaaac aacgcatctc attgattcgt aacctgcaat ttatgccgaa ggttttattg 480

ctggatgaaa taaccagtgc gctggatgaa agtaataaac ataacgtcaa tgagatgatc 540

catcgttatg tgcgcgagca aaatattgcc gtgctgtggg tgacacacga taaagacgaa 600

attaatcatg cggataaagt gattacactg caaccgcatg ccggagaaat gcaggaagca 660

cgctatgaac tcgcataa 678

<210> 4

<211> 225

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Met Gln Glu Asn Ser Pro Leu Leu Gln Leu Gln Asn Val Gly Tyr Leu

1 5 10 15

Ala Gly Asp Ala Lys Ile Leu Asn Asn Ile Asn Phe Ser Leu Arg Ala

20 25 30

Gly Glu Phe Lys Leu Ile Thr Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr

35 40 45

Leu Leu Lys Ile Val Ala Ser Leu Ile Ser Pro Thr Ser Gly Thr Leu

50 55 60

Leu Phe Glu Gly Glu Asp Val Ser Thr Leu Lys Pro Glu Ile Tyr Arg

65 70 75 80

Gln Gln Val Ser Tyr Cys Ala Gln Thr Pro Thr Leu Phe Gly Asp Thr

85 90 95

Val Tyr Asp Asn Leu Ile Phe Pro Trp Gln Ile Arg Asn Arg Gln Pro

100 105 110

Asp Pro Ala Ile Phe Leu Asp Phe Leu Glu Arg Phe Ala Leu Pro Asp

115 120 125

Ser Ile Leu Thr Lys Asn Ile Ala Glu Leu Ser Gly Gly Glu Lys Gln

130 135 140

Arg Ile Ser Leu Ile Arg Asn Leu Gln Phe Met Pro Lys Val Leu Leu

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ile Thr Ser Ala Leu Asp Glu Ser Asn Lys His Asn Val

165 170 175

Asn Glu Met Ile His Arg Tyr Val Arg Glu Gln Asn Ile Ala Val Leu

180 185 190

Trp Val Thr His Asp Lys Asp Glu Ile Asn His Ala Asp Lys Val Ile

195 200 205

Thr Leu Gln Pro His Ala Gly Glu Met Gln Glu Ala Arg Tyr Glu Leu

210 215 220

Ala

225

<210> 5

<211> 903

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 5

atgaatcaat cttatggacg gctggtcagt cgggcggcga ttgctgcgac ggcgatggct 60

tcgctgctat tgctgattaa aatttttgca tggtggtata ccgggtcggt gagtattctc 120

gccgcgctgg tggattcgct ggtggatatc ggcgcgtcgt tgacgaattt attggtggtg 180

cgatattccc tgcaacctgc cgacgataat cactcgtttg gtcacggtaa agctgagtcc 240

ctcgcggcgc tggcgcaaag tatgtttatc tccggttcgg cactattcct gtttttgacg 300

ggtattcaac atctgatatc tccaacaccg atgacagatc caggcgtcgg ggttatcgtg 360

acaattgtgg cgctaatttg tacgattatc cttgtctcgt ttcagcgttg ggtggtgcgg 420

cggacgcaaa gccaggcggt gcgggctgat atgctacatt accagtctga tgttatgatg 480

aacggcgcaa ttctgctggc gctggggttg tcctggtacg gctggcatcg cgccgatgct 540

ctgtttgcat tgggaatcgg catctatatt ttatatagcg cgttacgcat gggatatgag 600

gcggtacagt cattactgga tcgcgcattg cctgatgagg aacggcaaga aattattgat 660

atcgtgactt cctggccggg tgttagcggc gctcacgatc ttcgcacgcg gcagtcaggg 720

ccgacccgct ttattcagat tcatttggaa atggaagact ctctgccttt ggttcaggca 780

catatggtgg cggatcaggt agagcaggct attttacggc gttttccggg atcggatgta 840

attatccatc aggacccctg ttccgtcgta cccagggagg gtaaacggtc tatgctttca 900

taa 903

<210> 6

<211> 300

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 6

Met Asn Gln Ser Tyr Gly Arg Leu Val Ser Arg Ala Ala Ile Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Met Ala Ser Leu Leu Leu Leu Ile Lys Ile Phe Ala Trp Trp

20 25 30

Tyr Thr Gly Ser Val Ser Ile Leu Ala Ala Leu Val Asp Ser Leu Val

35 40 45

Asp Ile Gly Ala Ser Leu Thr Asn Leu Leu Val Val Arg Tyr Ser Leu

50 55 60

Gln Pro Ala Asp Asp Asn His Ser Phe Gly His Gly Lys Ala Glu Ser

65 70 75 80

Leu Ala Ala Leu Ala Gln Ser Met Phe Ile Ser Gly Ser Ala Leu Phe

85 90 95

Leu Phe Leu Thr Gly Ile Gln His Leu Ile Ser Pro Thr Pro Met Thr

100 105 110

Asp Pro Gly Val Gly Val Ile Val Thr Ile Val Ala Leu Ile Cys Thr

115 120 125

Ile Ile Leu Val Ser Phe Gln Arg Trp Val Val Arg Arg Thr Gln Ser

130 135 140

Gln Ala Val Arg Ala Asp Met Leu His Tyr Gln Ser Asp Val Met Met

145 150 155 160

Asn Gly Ala Ile Leu Leu Ala Leu Gly Leu Ser Trp Tyr Gly Trp His

165 170 175

Arg Ala Asp Ala Leu Phe Ala Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Ile Leu Tyr

180 185 190

Ser Ala Leu Arg Met Gly Tyr Glu Ala Val Gln Ser Leu Leu Asp Arg

195 200 205

Ala Leu Pro Asp Glu Glu Arg Gln Glu Ile Ile Asp Ile Val Thr Ser

210 215 220

Trp Pro Gly Val Ser Gly Ala His Asp Leu Arg Thr Arg Gln Ser Gly

225 230 235 240

Pro Thr Arg Phe Ile Gln Ile His Leu Glu Met Glu Asp Ser Leu Pro

245 250 255

Leu Val Gln Ala His Met Val Ala Asp Gln Val Glu Gln Ala Ile Leu

260 265 270

Arg Arg Phe Pro Gly Ser Asp Val Ile Ile His Gln Asp Pro Cys Ser

275 280 285

Val Val Pro Arg Glu Gly Lys Arg Ser Met Leu Ser

290 295 300

<210> 7

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P1

<400> 7

tgctgtgggg gtttttttta tcctcaattt gcctgctgaa gcctgctttt ttatactaag 60

ttgg 64

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P2

<400> 8

cgccgcccga ctgaccagcc gtccataaga ttgattcatt atatctcctt cttaaagtta 60

aacaaaatta ttagg 75

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P3

<400> 9

ctcctgttgt accgtccata atcagcaaaa ttgctgtgaa gcctgctttt ttatactaag 60

ttgg 64

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P4

<400> 10

cagtgctaat gattcgttag taatattatg cgagttcatt atatctcctt cttaaagtta 60

aacaaaatta ttagg 75

<210> 11

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Promoter Pnlp8phi10

<400> 11

ttgacaaggg tccttgcacg gttataatgt cactggttat taaccaattt ttcctaataa 60

ttttgtttaa ctttaagaag gagatata 88

<210> 12

<211> 1951

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA-片段 1

<400> 12

tgctgtgggg gtttttttta tcctcaattt gcctgctgaa gcctgctttt ttatactaag 60

ttggcattat aaaaaagcat tgcttatcaa tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc 120

aaaataaaat cattatttga tttcgaattc cccggatccg tcgacctgca gggggggggg 180

ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc 240

catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc 300

agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg 360

tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca 420

agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc 480

atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg 540

aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag 600

atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc 660

ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga 720

gaatggcaaa agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc 780

gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag 840

acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg 900

caggaacact gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac 960

ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg 1020

gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat 1080

ctcatctgta acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc 1140

atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc 1200

ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgagcaaga 1260

cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag 1320

ttttattgtt catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga 1380

cacaacgtgg ctttcccccc cccccctgca gtctgttaca ggtcactaat accatctaag 1440

tagttgattc atagtgactg catatgttgt gttttacagt attatgtagt ctgtttttta 1500

tacaaaatct aatttaatat attgatattt atatcatttt acgtttctcg ttcagctttt 1560

ttatactaac ttgagcgtct agcttccaac tgcgctaatg acgcagctgg acgaaggcgg 1620

gattctcgtc ttacccgtag gggaggagca ccagtatttg aaacgggtgt gtcgtcgggg 1680

aggcgaattt attatcgata ccgtggaggc cgtgcgcttt gtccctttag tgaagggtga 1740

gctggcttaa aacgtgagga aatacctgga tttttcctgg ttattttgcc gcaggtcagc 1800

gtataatgaa gatcttttcc agtgttgaca agggtccttg cacggttata atgtcactgg 1860

ttattaacca atttttccta ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taatgaatca 1920

atcttatgga cggctggtca gtcgggcggc g 1951

<210> 13

<211> 1951

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA-片段 2

<400> 13

ctcctgttgt accgtccata atcagcaaaa ttgctgtgaa gcctgctttt ttatactaag 60

ttggcattat aaaaaagcat tgcttatcaa tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc 120

aaaataaaat cattatttga tttcgaattc cccggatccg tcgacctgca gggggggggg 180

ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc 240

catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc 300

agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg 360

tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca 420

agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc 480

atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg 540

aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag 600

atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc 660

ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga 720

gaatggcaaa agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc 780

gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag 840

acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg 900

caggaacact gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac 960

ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg 1020

gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat 1080

ctcatctgta acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc 1140

atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc 1200

ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgagcaaga 1260

cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag 1320

ttttattgtt catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga 1380

cacaacgtgg ctttcccccc cccccctgca gtctgttaca ggtcactaat accatctaag 1440

tagttgattc atagtgactg catatgttgt gttttacagt attatgtagt ctgtttttta 1500

tacaaaatct aatttaatat attgatattt atatcatttt acgtttctcg ttcagctttt 1560

ttatactaac ttgagcgtct agcttccaac tgcgctaatg acgcagctgg acgaaggcgg 1620

gattctcgtc ttacccgtag gggaggagca ccagtatttg aaacgggtgt gtcgtcgggg 1680

aggcgaattt attatcgata ccgtggaggc cgtgcgcttt gtccctttag tgaagggtga 1740

gctggcttaa aacgtgagga aatacctgga tttttcctgg ttattttgcc gcaggtcagc 1800

gtataatgaa gatcttttcc agtgttgaca agggtccttg cacggttata atgtcactgg 1860

ttattaacca atttttccta ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taatgaactc 1920

gcataatatt actaacgaat cattagcact g 1951

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P5

<400> 14

gcaaaaaagt tcatcgttga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P6

<400> 15

ccagcgcggc gagaatactc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P7

<400> 16

ctgtccactg atagccctgc 20

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 P8

<400> 17

gaattatcgc tcgcccga 18

<210> 18

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA-片段 3

<400> 18

gcaaaaaagt tcatcgttga agctattgag tagtagcaac tcacgttccc agtagtaaac 60

cctgttttcc ttgccataga caccatccct gtcttccccc acatgctgtg ggggtttttt 120

ttatcctcaa tttgcctgct gcttaatgca ttgcagatga tttgcttccg ttatactagc 180

gtcagttgat agcgggagta tttatgaatc aatcttatgg acggctggtc agtcgggcgg 240

cgattgctgc gacggcgatg gcttcgctgc tattgctgat taaaattttt gcatggtggt 300

ataccgggtc ggtgagtatt ctcgccgcgc tgg 333

<210> 19

<211> 1036

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA-片段 4

<400> 19

ctgtccactg atagccctgc ggtacgattt tgacacccgc gccgacaatg accagcgcga 60

caaaaatgag aatcgggata aagataagca tcggaaaaac ctcctgttgt accgtccata 120

atcagcaaaa ttgctgcttg attaaacaaa ttatacctga ttactgaaag agagttcccc 180

cttattcctg cgaaggataa actgttttta gtaaaaatca gaaaaaggga acagcgatgc 240

aggaaaatag tcctttgctt cagctacaaa acgtaggata tctggcgggt gatgcgaaga 300

ttcttaataa catcaatttt tcgctgcgtg ctggcgaatt taagttaatt accggtcctt 360

ctggttgtgg caaaagtacg ctgctaaaaa tagttgcttc attgatcagc ccaaccagcg 420

gaacgttact gtttgaaggt gaggatgtca gcacactaaa gccagaaatc taccgccaac 480

aagtctctta ctgcgcccag acaccgacgc tgtttggcga tacggtatac gataatctga 540

tctttccctg gcagatccgt aaccggcagc ctgacccagc catttttctc gattttctcg 600

aacgcttcgc cttgccggac agcattttga cgaagaatat cgccgagcta tctggtggtg 660

aaaaacaacg catctcattg attcgtaacc tgcaatttat gccgaaggtt ttattgctgg 720

atgaaataac cagtgcgctg gatgaaagta ataaacataa cgtcaatgag atgatccatc 780

gttatgtgcg cgagcaaaat attgccgtgc tgtgggtgac acacgataaa gacgaaatta 840

atcatgcgga taaagtgatt acactgcaac cgcatgccgg agaaatgcag gaagcacgct 900

atgaactcgc ataatattac taacgaatca ttagcactgg cattaatgct ggtggtggtg 960

gcaatcttaa ttagccataa agaaaaactg gcgctggaga aagatattct ctggagcgtc 1020

gggcgagcga taattc 1036

<210> 20

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA-片段 5

<400> 20

gcaaaaaagt tcatcgttga agctattgag tagtagcaac tcacgttccc agtagtaaac 60

cctgttttcc ttgccataga caccatccct gtcttccccc acatgctgtg ggggtttttt 120

ttatcctcaa tttgcctgct gaagcctgct tttttatact aagttggcat tataaaaaag 180

cattgcttat caatttgttg caacgaacag gtcactatca gtcaaaataa aatcattatt 240

tgatttcgaa ttccccggat ccgtcgacct gcaggggggg gggggcgctg aggtctgcct 300

cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa 360

gtgagggagc cacggttgat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac 420

ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac 480

tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct 540

gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 600

actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 660

atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 720

cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 780

tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 840

gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 900

catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc 960

tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 1020

catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 1080

cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 1140

tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 1200

tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 1260

atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 1320

aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat 1380

ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg 1440

atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttccc 1500

ccccccccct gcagtctgtt acaggtcact aataccatct aagtagttga ttcatagtga 1560

ctgcatatgt tgtgttttac agtattatgt agtctgtttt ttatacaaaa tctaatttaa 1620

tatattgata tttatatcat tttacgtttc tcgttcagct tttttatact aacttgagcg 1680

tctagcttcc aactgcgcta atgacgcagc tggacgaagg cgggattctc gtcttacccg 1740

taggggagga gcaccagtat ttgaaacggg tgtgtcgtcg gggaggcgaa tttattatcg 1800

ataccgtgga ggccgtgcgc tttgtccctt tagtgaaggg tgagctggct taaaacgtga 1860

ggaaatacct ggatttttcc tggttatttt gccgcaggtc agcgtataat gaagatcttt 1920

tccagtgttg acaagggtcc ttgcacggtt ataatgtcac tggttattaa ccaatttttc 1980

ctaataattt tgtttaactt taagaaggag atataatgaa tcaatcttat ggacggctgg 2040

tcagtcgggc ggcgattgct gcgacggcga tggcttcgct gctattgctg attaaaattt 2100

ttgcatggtg gtataccggg tcggtgagta ttctcgccgc gctgg 2145

<210> 21

<211> 2148

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA-片段 6

<400> 21

ctgtccactg atagccctgc ggtacgattt tgacacccgc gccgacaatg accagcgcga 60

caaaaatgag aatcgggata aagataagca tcggaaaaac ctcctgttgt accgtccata 120

atcagcaaaa ttgctgtgaa gcctgctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagcat 180

tgcttatcaa tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttga 240

tttcgaattc cccggatccg tcgacctgca gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt 300

gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg 360

agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt 420

tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca 480

gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc 540

agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact 600

gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg 660

aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga 720

ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat 780

caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agcttatgca 840

tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat 900

caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctgt 960

taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat 1020

caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gttttcccgg 1080

ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg 1140

gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg 1200

caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc 1260

gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat 1320

cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc 1380

tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgatgata 1440

tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacaacgtgg ctttcccccc 1500

cccccctgca gtctgttaca ggtcactaat accatctaag tagttgattc atagtgactg 1560

catatgttgt gttttacagt attatgtagt ctgtttttta tacaaaatct aatttaatat 1620

attgatattt atatcatttt acgtttctcg ttcagctttt ttatactaac ttgagcgtct 1680

agcttccaac tgcgctaatg acgcagctgg acgaaggcgg gattctcgtc ttacccgtag 1740

gggaggagca ccagtatttg aaacgggtgt gtcgtcgggg aggcgaattt attatcgata 1800

ccgtggaggc cgtgcgcttt gtccctttag tgaagggtga gctggcttaa aacgtgagga 1860

aatacctgga tttttcctgg ttattttgcc gcaggtcagc gtataatgaa gatcttttcc 1920

agtgttgaca agggtccttg cacggttata atgtcactgg ttattaacca atttttccta 1980

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taatgaactc gcataatatt actaacgaat 2040

cattagcact ggcattaatg ctggtggtgg tggcaatctt aattagccat aaagaaaaac 2100

tggcgctgga gaaagatatt ctctggagcg tcgggcgagc gataattc 2148

Claims (8)

1.生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：

(i)在培养基中培养肠杆菌科的L-氨基酸生产细菌以在所述培养基或细菌的细胞或所述培养基和细菌的细胞这两者中生产并积累所述L-氨基酸，和

(ii)从所述培养基或细菌的细胞或所述培养基和细菌的细胞这两者中收集所述L-氨基酸，

其中所述细菌已经以过表达编码铁输出蛋白(iron exporter)的基因的方式进行了修饰，

其中所述编码铁输出蛋白的基因选自下组：fetB基因、fetA基因、fieF基因，和它们的组合，和

其中所述L-氨基酸选自下组：L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。

2.根据权利要求1的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数，和/或修饰所述基因的表达调控区来过表达所述编码铁输出蛋白的基因，使得所述基因的表达与未修饰细菌相比提高。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述编码铁输出蛋白的基因编码选自下组的蛋白质：

(A)由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列组成的蛋白质；和

(B)由相对于SEQ ID NO:2、4或6的完整氨基酸序列具有不少于90％同源性的氨基酸序列组成的蛋白质，其中所述蛋白质具有铁输出蛋白活性。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述编码铁输出蛋白的基因是选自下组的DNA：

(A)由SEQ ID NO:1、3或5的核苷酸序列组成的DNA；和

(B)由起因于遗传密码的简并性的SEQ ID NO:1、3或5的变体核苷酸序列组成的DNA。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。

6.根据权利要求5的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。

7.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述细菌属于泛菌属。

8.根据权利要求7的方法，其中所述细菌是菠萝泛菌。