CN103642863A

CN103642863A - L-氨基酸的生产方法

Info

Publication number: CN103642863A
Application number: CN201310367411.XA
Authority: CN
Inventors: 长井由利; 林和之; 植田拓嗣; 臼田佳弘; 松井和彦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2007-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2014-03-19
Also published as: US20130288313A1; WO2008102861A1; CN101631871B; BRPI0807756B1; CN101631871A; RU2009135235A; RU2515044C2; MX2009009025A; CA2689046A1; US20100047878A1; EP2113570A1; BRPI0807756A2; EP2113570A4; US8512987B2; KR20100014538A; JP2010110217A

Abstract

本发明涉及L-氨基酸的生产方法，具体的涉及在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力、且经过修饰使得甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性增强的属于肠杆菌科的微生物，来生产L-氨基酸。

Description

L-氨基酸的生产方法

本申请是申请日为2008年02月22日，申请号为200880005958.2（国际申请号为PCT/JP2008/053020），发明名称为“L-氨基酸的生产方法”的发明专利申请的分案申请。

背景技术

L-氨基酸是通过使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)等的微生物的发酵方法来进行工业生产的。在这些生产方法中，使用从自然界分离的菌株或该菌株的人工突变株，并且还使用通过重组DNA技术进行修饰从而增加了碱性L-氨基酸生物合成酶的活性的微生物等。(专利文献1～9)

通常，在使用微生物进行氨基酸生产时，在基质中使用糖类作为主成分，但甘油也可以与糖类一样用作基质。(专利文献10、11)

已知大肠杆菌(Escherichia coli)中存在多个甘油代谢相关基因。然而，缺损甘油激酶的编码基因glpK、或甘油3磷酸脱氢酶的编码基因glpD中的任一个的突变株在以甘油为单一碳源的培养基中不能生长，由此可知：甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶担负着大肠杆菌的主要甘油同化途径。(非专利文献1)

大肠杆菌的甘油脱氢酶也是甘油代谢相关的酶之一，已知在使用缺损了glpR(glpK、glpD、glp调节子的阻遏物)的3个基因的突变株进行的筛选中，它可使在以甘油为单一碳源的培养基中的致死性得以回复。(非专利文献2)

目前为止，如上述，经由甘油-3-磷酸的甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶被认为是属于肠杆菌科的微生物的主要同化途径，而经由二羟基丙酮的甘油同化途径被认为是属于肠杆菌科的微生物的甘油同化的非必要途径。

专利文献1EP0643135B

专利文献2EP0733712B

专利文献3EP1477565A

专利文献4EP0796912A

专利文献5EP0837134A

专利文献6WO01/53459

专利文献7EP1170376A

专利文献8WO2005/010175

专利文献9WO96/17930

专利文献10EP1715055A

专利文献11EP1715056A

非专利文献1J.Bacteriol.23(2006)8259-8271

非专利文献2J.Bacteriol.131(1977)1026-1028

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的问题是提供一种与传统方法相比进一步有所改良的、通过使用含有甘油的基质的发酵方法进行的L-氨基酸生产方法。

解决问题的方法

本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：虽然单独增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶这两种经由二羟基丙酮的甘油同化途径中的酶没有效果，但通过同时增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶，可以大幅提高从甘油生产L-氨基酸的能力，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种生产L-氨基酸的方法，包括在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性的属于肠杆菌科的微生物，从而在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且从该培养基或菌体收集L-氨基酸。

(2)(1)所述的方法，其中，所述酶的活性是通过提高编码所述甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因的拷贝数或者通过修饰所述基因的表达调节序列来增强的。

(3)(1)～(2)所述的方法，其特征在于，所述二羟基丙酮激酶以ATP为磷酸供体。

(4)(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了甘油的摄入活性。

(5)(1)～(4)中所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了选自由丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛缩酶组成的群组中的1种以上的酶活性。

(6)(1)～(5)中所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而降低了甘油激酶和/或膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活性。

(7)(1)～(6)中所述的方法，其中，所述属于肠杆菌的微生物为埃希氏菌属细菌或泛菌属(Pantoea)细菌。

(8)(1)～(7)中所述的方法，其中，所述L-氨基酸为选自由L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-组氨酸组成的群组中的1种或2种以上的L-氨基酸。

本发明还涉及如下方面：

1.一种生产L-氨基酸的方法，包括在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性的属于肠杆菌科的微生物，从而在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且从该培养基或菌体收集L-氨基酸。

2.项1所述的方法，其中，所述酶的活性是通过提高编码所述甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因的拷贝数或者通过修饰所述基因的表达调节序列而增强的。

3.项1或2所述的方法，其特征在于，所述二羟基丙酮激酶以ATP为磷酸供体。

4.项1～3中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了甘油的摄入活性。

5.项1～4中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了选自由丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛缩酶组成的群组中的1种以上的酶活性。

6.项1～5中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而降低了甘油激酶和/或膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活性。

7.项1～6中任一项所述的方法，其中，所述属于肠杆菌科的微生物为埃希氏菌属细菌或泛菌属细菌。

8.项1～7中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸为选自由L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-组氨酸组成的群组中的1种或2种以上的L-氨基酸。

实施本发明的最佳模式

以下，对本发明进行详细说明。

<1>本发明的微生物

本发明的微生物是具有L-氨基酸生产能力，且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性增强的属于肠杆菌科的微生物。这里，L-氨基酸生产能力是指：当在培养基中培养本发明的微生物时，在培养基中或菌体内生成并蓄积L-氨基酸的能力。而且，本发明的微生物可以是具有多种L-氨基酸的生产能力的微生物。作为具有L-氨基酸生产能力的微生物，可以是本身具有L-氨基酸生产能力的微生物，也可以是采用突变方法或重组DNA技术对如下所述的微生物进行修饰而具有了L-氨基酸生产能力的微生物。

对于L-氨基酸的种类没有特殊限制，可以列举：L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-苏氨酸、L-丝氨酸等作为羟基单氨基羧酸的氨基酸，L-脯氨酸等环式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸，L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等侧链具有酰胺基的氨基酸。本发明的微生物可以是具有2种以上氨基酸的生产能力的微生物。

作为本发明的属于肠杆菌科的微生物，可以使用以埃希氏菌属细菌、泛菌属细菌为代表的属于肠杆菌科的微生物。作为其它的属于肠杆菌科的微生物，可以列举：肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等属于γ-变形细菌的属于肠杆菌科的微生物。

在本发明中，“甘油脱氢酶”是指：以NAD为辅酶，可逆地催化将甘油转变为二羟基丙酮的以下氧化反应的酶(EC：1.1.1.6)。

甘油(glycerol)+NAD=二羟基丙酮(dihydroxyacetone)+NADH+H⁺

在本发明中，“经过修饰而升高了甘油脱氢酶的活性”对应于下列情形：相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的甘油脱氢酶分子数增加，或者甘油脱氢酶的平均每个分子的活性提高。此外，当在野生株中不能检出的酶活性提高到能够检出的程度时，这种情况也包含在所述的“活性升高”中。这里，在本发明中，甘油脱氢酶的活性只要能够检出即可，优选经过修饰从而具有0.05U/mg以上、优选0.25U/mg以上、更优选0.5U/mg以上的酶活性。这里，作为属于肠杆菌科的微生物中的作为对照的野生株，可以列举大肠杆菌MG1655株(ATCC No.47076)、和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoea ananatisAJ13335株(FERM BP-6615)等。甘油脱氢酶活性可以参考Ansis,R.E等的方法来测定((1953)J.Biol.Chem.2-3，153-159)。

在本发明中，“二羟基丙酮激酶”是指：可逆地催化将二羟基丙酮转变为磷酸二羟基丙酮的以下反应的酶，该酶中有的以ATP为磷酸供体(EC2.7.1.29)，有的以PEP为磷酸供体(EC2.7.1.29)(Cell.Mol.Life Sci.63(2006)890-900，Biochemistry.43(2004)1337-13045)。

ATP+二羟基丙酮(dihydroxyacetone)=ADP+磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone phosphate)(EC2.7.1.29)

磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)+二羟基丙酮(dihydroxyacetone)=丙酮酸(pyruvate)+磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone phosphate)(EC2.7.1.29)

在本发明中，特别优选使用以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶。

“经过修饰而升高了二羟基丙酮激酶活性”对应于这样的情况：与野生株或非修饰株相比，每个细胞平均的二羟基丙酮激酶分子数增加，或者二羟基丙酮激酶的平均每个分子的活性提高。此外，当在野生株中不能检出的酶活性提高到能够检出的程度时，这种情况也包含在所述的“活性升高”中。优选经过修饰使得二羟基丙酮激酶的活性与野生株或非修饰株相比，平均每个菌体提高150%以上、优选200%以上，更希望平均每个菌体提高300%以上。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCC No.47076)和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoea ananatisAJ13335株(FERM BP-6615)等。二羟基丙酮激酶活性可以参考Johnson EA等的方法来测定(J Bacteriol.1984Oct；160(1)：55-60)。

编码甘油脱氢酶的基因包括例如gldA基因，这其中希望使用属于肠杆菌科的微生物来源的gldA基因。作为属于肠杆菌科的微生物，可以列举大肠杆菌。这里，作为大肠杆菌的基因，可以列举例如SEQ ID NO：1的gldA基因(GenBank登录号NC_000913的碱基序号4135955..4137058的互补链)。

而且，编码甘油脱氢酶的基因的同源物可以是基于与上述示例的基因的同源性，从埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属、弧菌属(vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、棒状杆菌属细菌等克隆得到的基因。表1示出了与大肠杆菌gldA基因具有高同源性、可以在本发明中作为编码甘油脱氢酶的基因利用的基因的例子。

[表1]

与大肠杆菌gldA基因的同源性高的、编码甘油脱氢酶的基因

氨基酸序列和碱基序列的同源性(同一性等)可以使用例如Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或Pearson的FASTA(Methods Enzymol.，183，63(1990))来确定。基于该算法BLAST，开发了称为BLASTN、BLASTX的程序(参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

本发明的编码二羟基丙酮激酶的基因可以利用命名为dhaKLM基因、dak1基因、dhaK基因、dhbK基因的基因。这里，作为以PEP为磷酸供体的基因，可以列举大肠杆菌来源的基因，例如可以列举SEQ ID NO：34的dhaK基因(GenBank登录号NC_000913的碱基序号1248991..1250061的互补链)、SEQ ID NO：36的dhaL基因(GenBank登录号NC_000913的碱基序号1248348..1248980的互补链)、SEQ ID NO：38的dhaM基因(GenBank登录号NC_000913的碱基序号1246919..1248337的互补链)。

在本发明中，更优选使用编码以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶的基因，作为以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶的基因，优选使用酵母来源的dak1基因、土壤杆菌属来源的dhbK基因、柠檬酸杆菌属来源的dhaK基因。作为酵母来源的dak1基因，可以列举酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)来源的SEQ ID NO：3的dak1基因(GenBank Accession NoNP_013641.1GI：6323570)，作为土壤杆菌的dhbK基因，可以列举根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)来源的SEQ ID NO：5的dhbK基因(GenBank登录号NP_357070.1GI：15891398)，作为柠檬酸杆菌基因的dhaK基因，可以列举弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)来源的SEQ ID NO：7的dhaK基因(GenBank登录号U09771)。

而且，编码二羟基丙酮激酶的基因的同源物，可以是基于与以上示例的基因的同源性，从埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、梭菌属、土壤杆菌属、柠檬酸杆菌属、分枝杆菌属(Mycobacterium)等的细菌、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)等酵母等中克隆得到的基因。

特别是以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶，可以使用以下序列。表2示出了与酿酒酵母来源的dak1基因高同源性的编码二羟基丙酮激酶基因，表3示出了与根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)来源的dhbK基因同源性高的二羟基丙酮激酶基因，表4示出了与弗氏柠檬酸杆菌来源的dhaK基因同源性高的二羟基丙酮激酶基因。

[表2]

与酿酒酵母dak1基因的同源性高的、编码二羟基丙酮激酶的基因

[表3]

与根瘤土壤杆菌dhbK基因的同源性高的、编码二羟基丙酮激酶的基因

[表4]

与弗氏柠檬酸杆菌dhaK基因同源性高的、编码二羟基丙酮激酶的基因

上述基因的同源物是指：其它微生物来源的、或者天然或人工的突变型基因，显示与选自上述基因群的基因高度的结构类似性，在导入宿主或使其在宿主中扩增时具有提高甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性的功能。甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶基因的同源物是指：编码分别相对于SEQ ID NO：2、4、6或8、表1～4所述的序列的氨基酸序列全长具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同源性，且具有作为甘油脱氢酶或二羟基丙酮激酶的功能的蛋白的基因。而且，是否具有甘油脱氢酶或二羟基丙酮激酶活性，可以通过使这些基因在宿主细胞中表达，采用上述酶活性测定方法考察与非修饰株相比酶活性上升与否来确认。此外，是否为同源物可以通过制备对应野生型基因的破坏株，考察将其导入破坏株时是否与野生型基因的功能互补来确定，例如通过考察因基因破坏而降低的酶活性是否恢复来确定。

此外，就本发明中使用的编码甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因而言，不仅限于野生型基因，只要所编码的甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的功能不受到破坏即可，可以是编码下述蛋白的突变体或人工修饰体，所述蛋白具有在SEQ ID NO：2，4，6或8的氨基酸序列、表1～4所述的氨基酸序列中包含1个或多个位置上的1个或数个氨基酸取代、缺失、插入或添加的序列。这里，“1个或数个”因氨基酸残基的种类或在蛋白立体结构中的位置而异，但具体来说是1～20个、优选1～10个、更优选1～5个、更优选1～3个。上述取代优选是保守取代。关于保守突变，当取代位点是芳香族氨基酸时为Phe、Trp和Tyr之间、当取代位点是疏水氨基酸时为Leu、Ile和Val之间、是极性氨基酸时为Gln和Asn之间、当是碱性氨基酸时为Lys、Arg和His之间、当是酸性氨基酸时为Asp和Glu之间、当是具有羟基的氨基酸时为Ser和Thr之间的相互取代的突变。作为保守取代可列举：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于携带kdp操纵子的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。

此外，编码甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因还包括下述DNA，所述DNA与分别由SEQ ID NO：2、4、6或8所示的碱基序列、表1～4所述的碱基序列的互补碱基序列，或可从上述序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码具有作为甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的功能的蛋白。这里，“严格条件”是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。将该条件明确地数值化是困难的，举一实例，有这样的条件：在该条件下，具有高同源性的DNA，例如具有80%以上，优选90%以上，更优选95%以上，特别优选具有98%以上同源性的DNA相互杂交，而同源性较之为低的DNA则不互相杂交；或者是这样的条件：在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃，1×SSC、0.1%SDS，优选0.1×SSC、0.1%SDS，更优选68℃，0.1×SSC、0.1%SDS相当的盐浓度和温度下，洗涤一次，更优选两次至三次的条件。

在本发明中“各酶的细胞内活性增强”是指：与野生株(例如大肠杆菌W3110，MG1655株)或亲本株(本发明中指定的酶在所有细胞内活性均未增强的菌株)相比，细胞内的酶活性上升；也包括具有野生株或亲本株所不具有的酶活性。

作为增强细胞内活性的手段，可以列举下述手段及其组合，但不限于此。增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性的手段可以采用(1)～(5)中的任何一种，增强这两种酶的活性可以采用相同的手段，也可以采用不同的手段。

(1)通过使用包含编码各蛋白的基因的载体进行转化来增加拷贝数

(2)通过将编码各蛋白的基因整合在染色体上来增加拷贝数

(3)通过对编码各蛋白的基因的表达调节区域进行修饰来增加表达量

(4)通过对影响表达调节的因子进行修饰来增加表达量

(5)通过在编码各蛋白的基因的编码区域内导入突变来增加酶活性

(6)通过提高翻译效率来增大蛋白量

以下，有些情况下会将编码甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因称为目的基因。

例如，将包含目的基因的DNA片段与在宿主微生物中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体相连接，制作重组DNA，再将其导入微生物进行转化即可。目的基因可以以大肠杆菌、酵母、柠檬酸杆菌或土壤杆菌的染色体DNA为模板，采用PCR法(PCR：聚合酶链式反应；参照White，T.J.et al.，TrendsGenet.5，185(1989))来取得目的基因。其它微生物的目的基因，也可以分别采用以基于该微生物中公知的目的基因或其它种微生物的目的基因或相应的蛋白的序列信息制作的寡核苷酸为引物的PCR方法，或者以基于所述序列信息制作的寡核苷酸为探针的杂交方法，从微生物的染色体DNA或染色体DNA文库中获取。而且，染色体DNA可以采用例如斋藤、三浦的方法(参照H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；生物工学実験書，日本生物工学会编，97-98页，培风馆，1992年)等从作为DNA供体的微生物中制备。

然后，将通过PCR法扩增出的目的基因与能够在宿主微生物的细胞内发挥功能的载体DNA连接来制备重组DNA。作为能够在宿主微生物的细胞内发挥功能的载体，可以列举能够在宿主微生物的细胞内自主复制的载体。

作为能够在属于肠杆菌科的微生物的细胞内自主复制的载体，可以列举pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184、(pHSG、pACYC可以从Takara Bio公司获得)，RSF1010(Gene vol.75(2)，p271-288，1989)，pBR322、pMW219、pMW119(pMW可以从NIIPONGENE公司获得)、pSTV28、pSTV29(Takara Bio公司制造)等。此外，还可以利用噬菌体DNA载体。

为了将这些基因连接到上述载体上来制备重组DNA，需要用与包含目的基因的DNA片段的末端匹配的限制酶来切割载体。连接通常使用T4DNA连接酶等连接酶来进行。DNA的切割、连接以及染色体DNA的制备、PCR、质粒DNA的制备、转化、用作引物的寡核苷酸的设定等的方法，可以采用本领域技术人员熟知的常规方法。这些方法记载于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，"Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition"，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等。

为了将如上述制备的重组DNA导入微生物，可以按照目前为止已经报导的转化方法来进行。例如，可以列举电穿孔法(Canadian Journal ofMicrobiology，43.197(1997))。此外，还可以使用：用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法(如报道用于大肠杆菌K-12的(Mandel，M.andHiga，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，或者由处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方法(如报道用于枯草芽孢杆菌的(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。

(2)通过将编码各蛋白的基因整合在染色体上来增加拷贝数

另一方面，增强各酶的细胞内活性可以通过将目的基因导入到微生物的染色体DNA上从而增加拷贝数来实现。为了将目的基因导入到微生物的染色体DNA上，可以利用染色体DNA上多拷贝存在的序列作为靶标，通过同源重组来进行。作为染色体DNA上多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA(repetitive DNA)、存在于转座元件端部的反向重复序列。或者，如特开平2-109985号公报所公开的那样，可以将目的基因加载在转座子上，使其发生转移，从而将其导入染色体DNA上。此外，可以通过采用Red驱动整合法(WO2005/010175)将目的基因导入到染色体上。此外，还可以使用P1噬菌体等噬菌体进行转导，或者利用接合转移载体将目的基因导入到染色体上。这些基因转移到染色体上的事实的确认可以通过以这些基因的一部分为探针、进行Southern杂交来确认。拷贝数得到扩增这一事实的确认可以通过使用与目的基因互补的探针的Southern杂交来进行。拷贝数只要扩增1个拷贝以上可以是任何数目，但编码甘油脱氢酶的基因优选扩增2个拷贝以上、更优选3个拷贝以上、更优选5个拷贝以上；而编码二羟基丙酮激酶的基因优选扩增2个拷贝以上、更优选3个拷贝以上、更优选5个拷贝以上。此外，在导入宿主微生物本来没有的基因时，只要导入1个拷贝以上即可。

而且，除了上述的目的基因拷贝数的扩增以外，增强各酶的细胞内活性还可以通过采用国际公布00/18935号小册子中记载的方法、将染色体DNA上或质粒上的这些基因的启动子等表达调节序列更换成强力表达调节序列来实现。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、lpp启动子、T7启动子、tet启动子等是已知的强力启动子。特别是，在本发明中，甘油脱氢酶的扩增适合使用tacM启动子(SEQ ID NO：10)。此外，编码大肠杆菌的二羟基丙酮激酶的dhaK、dhaL、dhaM采取了操纵子结构，可以通过强化dhaK上游的启动子来同时提高3个基因的表达量。

此外，可以在目的基因的启动子区域导入碱基取代等，来将其修饰为更强力的启动子。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1,105-128)等中。而且，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列，特别是起始密码子紧邻上游的序列中数个核苷酸的取代对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对其进行修饰。通过这些启动子取代或修饰可以强化目的基因的表达。

将染色体上启动子更换成强启动子，可以通过用通过PCR等扩增出的包含强启动子的DNA转化属于肠杆菌科的微生物，使强启动子与基因组上的野生型启动子之间发生重组，来将基因组上的目的基因上游的启动子更换为强力启动子。利用了这样的同源重组的基因取代，可以利用下述方法：称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko，K.A，and Wanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))、组合使用Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner,J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(Datsenko，K.A，and Wanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000)；美国专利第6303383号；特开平05-007491号公报)。

(4)通过对影响表达调节的因子进行修饰来增加表达量

通过对影响表达调节的因子进行修饰来增加表达量，可以通过扩增编码使得编码甘油脱氢酶和编码二羟基丙酮激酶的基因的表达上升的激活物的基因，或者缺失或弱化编码使得这些基因的表达降低的调节物(regulator)的基因来实现。例如，作为编码二羟基丙酮激酶的dhaKLM的激活物，可以列举dhaR(SEQ ID NO：66、GenBank登录号NC_000913的碱基序号1250289..1252208)，编码二羟基丙酮激酶的dhaKLM的表达量因dhaR基因的突变而上升(1：EMBO J.2005Jan26；24(2)：283-93)。此外，ptsI基因(SEQID NO：86GenBank登录号NC_000913的碱基序号2532088..2533815)的破坏也可以导致编码二羟基丙酮激酶的dhaKLM的表达量上升(Microbiology147(2001)247-253)。

而且，增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性还可以通过将能够提高蛋白的比活性的突变、或者提高酶的底物特异性的突变导入目的基因的编码区域内来实现。

编码这样的酶的基因，例如可以通过采用定点突变法对SEQ ID NO：1、3、5或7的碱基序列、表1～4所述的碱基序列中的编码区域进行修饰来获得，所述定点突变使得被编码蛋白中特定位点处的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加。此外，还可以通过诸如以下的传统公知的突变处理来获得。作为突变处理，用羟胺等对SEQ ID NO：1、3、5或7的碱基序列、表1～4所述的碱基序列、或这些碱基序列中的编码区域的序列进行体外处理的方法，以及对保持该基因的微生物例如属于肠杆菌科的微生物采用紫外线或使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)等在常规突变处理中使用的突变剂来进行处理的方法、易错PCR(Cadwell，R.C.PCR Meth.Appl.2，28(1992))、DNA改组(Stemmer，W.P.Nature370，389(1994))和StEP-PCR(Zhao，H.Nature Biotechnol.16，258(1998))，利用上述方法通过基因重组人为地在编码甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因中导入突变，来获得编码高活性甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因。这些突变型酶是否编码甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶，例如可以通过下述方法来确定：将这些基因导入具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的微生物，在以甘油为碳源的培养基上进行培养，测定L-氨基酸的生产能力是否提高，或者按上述方法测定酶活性。

(6)通过提高翻译效率来增加蛋白量

为了提高目的蛋白的翻译效率，增加蛋白量，可以通过下述方法来实现：增加与宿主内使用频率低的密码子对应的tRNA、或者对目的基因进行修饰使得其具有与在宿主内使用的宿主的密码子使用频率相应的最适密码子((1989)Gene85，109-114，(1992)Biochemistry31，2598-2608.(1993)J.Bacteriol.175，716-722，Protein Expression and Purification50(2006)49-57)。与非修饰株、野生株相比目的蛋白量的上升，可以通过例如使用抗体通过Western印迹进行检测来确认(Molecular cloning(Cold spring HarborLaboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。

本发明的生产方法中使用的微生物，可以是在增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基础上，还经过修饰而增强了甘油的摄入活性的微生物。甘油的摄入活性是指：将甘油摄取到细胞质(Cytoplasm)的活性，其与一种膜蛋白——甘油易化蛋白(glycerol facilitator)有关。编码甘油易化蛋白的基因可以列举例如大肠杆菌的glpF基因(SEQ ID NO：16：GenBank登录号NC_000913的碱基序号4115268..4116113的互补链)。

编码甘油易化蛋白的基因可以是与SEQ ID NO：16的碱基序列的互补序列或与可从该互补序列制备的探针在严格条件下杂交、且编码具有甘油摄入活性的蛋白的DNA。此外，还可以列举编码SEQ ID NO：17的蛋白的DNA。此外，只要在导入到属于肠杆菌科的微生物中后使甘油摄入能力提高，还可以是相对于SEQ ID NO:17的氨基酸序列全长具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同源性的蛋白。

此外，只要不损害甘油摄入活性，还可以是编码具有在SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等的序列的蛋白的DNA。活性可以采用与上述的增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的方法相似的方法来增强。

甘油摄入的活性可以采用膜蛋白介导的转运测定法(Voegele，R.T.，Sweet，G.D.，and Boos，W.J.Bacteriol.175：1087-1094(1993))来测定。

本发明的生产方法中使用的微生物可以是除了增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶、增强甘油的摄入活性之外，还经过修饰而增强了选自丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶、果糖-6-磷酸-醛缩酶中的1种以上的酶活性的微生物。

丙糖磷酸异构酶是指催化将磷酸二羟基丙酮可逆地转化为甘油醛-3-磷酸的反应的酶。(EC：5.3.1.1)

磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone phosphate)=D-甘油醛-3-磷酸(D-glyceraldehyde3-phosphate)

“经过修饰而升高了丙糖磷酸异构酶的活性”对应于下述情形：相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的丙糖磷酸异构酶分子数增加、或者丙糖磷酸异构酶平均每个分子的活性提高。优选经过修饰使得丙糖磷酸异构酶的活性与野生株或非修饰株相比较，提高至平均每个菌体150%以上、优选200%以上、更希望为平均每个菌体300%以上。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株，包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCC No.47076)、和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoea ananatis AJ13335株(FERM BP-6615)等。

作为编码丙糖磷酸异构酶的基因，可以列举大肠杆菌来源的tpiA基因(SEQ ID NO：18：GenBank登录号NC_000913的碱基序号4108763..4109530的互补链)。

编码丙糖磷酸异构酶的基因可以是与SEQ ID NO：18的碱基序列的互补序列或与可从该互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有丙糖磷酸异构酶活性的蛋白的DNA。此外，还可以列举编码SEQ ID NO：19的蛋白的DNA。此外，只要在导入属于肠杆菌科的微生物后丙糖磷酸异构酶活性上升，还可以是相对于SEQ ID NO：19的氨基酸序列全长具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同源性的蛋白。

此外，只要不损害丙糖磷酸异构酶活性，还可以是编码具有在SEQ IDNO：19的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等的序列的蛋白的DNA。

丙糖磷酸异构酶的活性可以采用Andersen和Cooper的方法(FEBS Lett：419-20(1969))来测定。活性可以采用与上述的增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的方法相似的方法来增强。

在本发明中，“果糖二磷酸醛缩酶”是指：可逆地催化从磷酸二羟基丙酮和甘油醛-3-磷酸转化为D-果糖-1,6-二磷酸的以下反应的酶。(EC：4.1.2.13)

磷酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone phosphate)(磷酸甘油酮，glyceronephosphate)+D-甘油醛-3-磷酸(D-glyceraldehyde-3-phosphate)=D-果糖-1,6-二磷酸(D-fructose1,6-bisphosphate)

“经过修饰而升高了果糖二磷酸醛缩酶的活性”对应于下述情形：相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的果糖二磷酸醛缩酶分子数增加，或者果糖二磷酸醛缩酶的平均每个分子的活性提高。优选经过修饰使得果糖二磷酸醛缩酶的活性与野生株或非修饰株相比较，提高至平均每个菌体150%以上、优选200%以上、更希望为平均每个菌体300%以上。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCCNo.47076)、和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoea ananatis AJ13335株(FERM BP-6615)等。

作为编码果糖二磷酸醛缩酶的基因，可以列举大肠杆菌来源的fbaA基因(SEQ ID NO：20：GenBank登录号NC_000913的碱基序号3068187..3069266的互补链)和fbaB基因(SEQ ID NO：72：GenBank登录号NC_000913的碱基序号2175534..2176586的互补链)。

编码果糖二磷酸醛缩酶的基因还可以是与SEQ ID NO：20、72的碱基序列的互补序列或与可从该互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有果糖二磷酸醛缩酶活性的蛋白的DNA。此外，可以列举编码SEQ IDNO：21、73的蛋白的DNA。此外，只要在导入属于肠杆菌科的微生物后果糖二磷酸醛缩酶活性上升，还可以是相对于SEQ ID NO：21的氨基酸序列全长具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同源性的蛋白。

此外，只要不损害果糖二磷酸醛缩酶活性，还可以是编码具有在SEQ IDNO：21、73的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等的序列的蛋白的DNA。

果糖二磷酸醛缩酶的活性可以采用Richard和Rutter的方法(J.Biol.Chem.236，3177-3184)来测定。活性可以采用与上述增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的方法相似的方法来增强。

果糖1,6-二磷酸酶是指：可逆地催化将D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖6-磷酸的以下反应的酶。(EC：3.1.3.11)

D-果糖-1,6-二磷酸(D-fructose1,6-bisphosphate)+H₂O=D-果糖6-磷酸(D-fructose6-phosphate)+磷酸(phosphate)

“经过修饰而升高了果糖1,6-二磷酸酶的活性”对应于下述情形：相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的果糖1,6-二磷酸酶分子数增加，或者果糖1,6-二磷酸酶的平均每个分子的活性提高。优选经过修饰而使得果糖1,6-二磷酸酶的活性与野生株或非修饰株相比较，平均每个菌体提高至150%以上、优选200%以上、更希望为平均每个菌体300%以上。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCCNo.47076)、和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoea ananatis AJ13335株(FERM BP-6615)等。

作为编码果糖1,6-二磷酸酶的基因，可以列举大肠杆菌来源的glpX基因(SEQ ID NO：22：GenBank登录号NC_000913的碱基序号4112592..4113602的互补链)、fbp基因(SEQ ID NO：82：GenBank登录号NC_000913的碱基序号4452634..4453632)、ybhA基因(SEQ ID NO：84：GenBank登录号NC_000913的碱基序号796836..7976554)。编码果糖1,6-二磷酸酶的基因还可以是与SEQ ID NO：22、82、84的碱基序列的互补序列或与可从该互补序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有果糖1,6-二磷酸酶活性的蛋白的DNA。此外，可以列举编码SEQ ID NO：23、83、85的蛋白的DNA。此外，只要在导入属于肠杆菌科的微生物后果糖二磷酸醛缩酶活性上升，还可以是与SEQ ID NO：23、83、85的氨基酸序列全体具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同源性的蛋白。

此外，只要不损害果糖1,6-二磷酸酶活性，还可以是编码具有在SEQ IDNO：23、83、85的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等的序列的蛋白的DNA。

果糖1,6-二磷酸酶的活性可以采用中岛等的方法(蛋白質核酸酵素22，1585-1589)来测定。活性可以采用与上述的增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的相似的方法来增强。

在本发明中，“果糖-6-磷酸醛缩酶”是指：可逆地催化将二羟基丙酮转化为果糖-6-磷酸的以下反应的酶。

D-果糖-6-磷酸(D-fructose-6-phosphate)=二羟基丙酮(dihydroxyacetone)+D-甘油醛-3-磷酸(D-glyceraldehyde-3-phosphate)

“经过修饰而升高了果糖-6-磷酸醛缩酶的活性”对应于下列情形：相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的果糖-6-磷酸醛缩酶分子数增加、或者果糖-6-磷酸醛缩酶平均每个分子的活性提高。优选经过修饰使得果糖-6-磷酸醛缩酶的活性与野生株或非修饰株相比较，平均每个菌体提高至150%以上、优选200%以上、更希望为平均每个菌体300%以上。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCCNo.47076)、和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoea ananatis AJ13335株(FERM BP-6615)等。

作为编码果糖-6-磷酸醛缩酶的基因，可以列举：编码I型醛缩酶的大肠杆菌来源的fsaA基因(SEQ ID NO：68：GenBank登录号NC_000913的碱基序号862865..863527)、编码II型醛缩酶的fsaB基因(talC基因)(SEQ ID NO：70：GenBank登录号NC_000913的碱基序号4137069..4137731的互补链)。

编码果糖-6-磷酸醛缩酶的基因还可以是与SEQ ID NO：68、70的碱基序列的互补序列或与可由该互补序列制备的探针在严格条件下杂交、且编码具有果糖-6-磷酸醛缩酶活性的蛋白的DNA。此外，还可以列举编码SEQ IDNO：69、71的蛋白的DNA。此外，只要在导入属于肠杆菌科的微生物后果糖-6-磷酸醛缩酶活性上升，还可以是与SEQ ID NO：69、71的氨基酸序列全长具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同源性的蛋白。

此外，只要不损害果糖-6-磷酸醛缩酶活性，还可以是编码具有在SEQ IDNO：69、71的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等的序列的蛋白的DNA。

果糖-6-磷酸醛缩酶的活性可以采用Schurmann M，Sprenger GA等的方法(J Biol Chem.2001Apr6；276(14)：11055-61)来测定。活性可以采用与上述的增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的方法相似的方法来增强。

本发明的生产方法中使用的微生物，除了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶增强、甘油摄入活性增强、选自丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶、果糖-6-磷酸醛缩酶中的1种以上的酶活性增强之外，优选还经过修饰而降低了甘油激酶和/或膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的活性。

在本发明中，“甘油激酶”是指：可逆地催化从甘油和ATP生成甘油3-磷酸和ADP的以下反应的酶。(EC2.7.1.30)

ATP+甘油(glycerol)=ADP+sn-甘油3-磷酸(sn-glycerol3-phosphate)

“经过修饰而降低了甘油激酶的活性”对应于下述情况：相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的甘油激酶分子数减少，或者甘油激酶的平均每个分子的活性降低。优选经过修饰使得与野生株或非修饰株相比甘油激酶的活性平均每个菌体降低至70%以下、优选50%以下、更希望30%以下、最优选平均每个菌体20%以下，也可以使酶活性丧失。酶活性可以通过降低编码该酶的基因的表达量来降低。基因表达量的降低包括由该基因转录的mRNA的转录量降低、和该mRNA的翻译量降低。

此外，使得酶蛋白分子完全不生成、或者使酶蛋白平均每个分子的活性降低或丧失，可以通过破坏编码该酶的基因来实现。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCCNo.47076)、和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoea ananatis AJ13335株(FERM BP-6615)等。

作为编码甘油激酶的基因，可以列举大肠杆菌来源的glpK基因(SEQ IDNO：24：GenBank登录号NC_000913的碱基序号4113737..4115245的互补链)。甘油激酶的酶活性可以采用Thorner&Paulus的方法来测定(TheEnzymes(3^rd ed.)8，487-508)

在本发明中，“膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶”是指：可逆地催化从甘油-3-磷酸到磷酸二羟基丙酮的氧化反应的酶，即催化以下反应的酶。

sn-甘油-3-磷酸(sn-glycerol-3P)+泛醌(ubiquinone)=磷酸二羟基丙酮(dihydroxyaceton-P)+泛醇(ubiquinol)(EC：1.1.99.5)

“经过修饰而降低了膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的活性”对应于下列情形：相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶分子数减少，或者膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的平均每个分子的活性降低。优选经过修饰使得与野生株或非修饰株相比，膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的活性平均每个菌体降低至70%以下、优选50%以下、更希望30%以下，也可以使酶活性丧失。酶活性可以通过降低编码该酶的基因的表达量来降低。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCC No.47076)、和W3110株(ATCC No.27325)、Pantoeaananatis AJ13335株(FERM BP-6615)等。

膜结合型的甘油-3-磷酸脱氢酶由glpABC操纵子、glpD基因编码。作为大肠杆菌的glpA基因，可以列举SEQ ID NO：26(GenBank登录号NC_000913的碱基序号2350669..2352297)；作为glpB基因，可以列举SEQID NO：28(GenBank登录号NC_000913的碱基序号2352287..2353546)；作为glpC基因，可以列举SEQ ID NO：30(GenBank登录号NC_000913的碱基序号2353543..2354733)；作为glpD基因，可以列举SEQ ID NO：32(GenBank登录号NC_000913的碱基序号3560036..3561541)。

上述甘油激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶等目的酶的活性降低，可以通过

(1)通过在编码目的酶的基因的编码区域内导入突变来导致酶活性降低或丧失、

(2)通过对编码目的酶的基因的表达调节序列进行修饰来导致酶活性降低或丧失，

来实现。

(1)通过在编码目的酶的基因的编码区域内导入突变来导致酶活性降低或丧失

编码目的酶的基因的编码区域内的突变导入可以通过下述方法实现：通过基因重组，在染色体上的编码酶的区域中导入氨基酸取代(错义突变)，或导入终止密码子(无义突变)，或者导入一～二个碱基添加或缺失引起的移框突变(Journal of Biological Chemistry272：8611-8617(1997)Proceedings of theNational Academy of Sciences，USA955511-5515(1998)，Journal of BiologicalChemistry266，20833-20839(1991))。此外，也可以通过缺损编码区域内的基因的一部分或全部来实现。具体地，可以通过在SEQ ID NO：24、26、28、30、32的DNA的一部分中导入突变、或者缺失DNA的一部分或者全部来实现。

这些突变导入也可以通过下述方式来降低或缺损酶活性：构建编码区域中有缺失或导入了突变的突变酶的基因，通过同源重组等用该基因将染色体上的正常基因取代为突变型基因；将转座子、IS因子等导入该基因。

例如，为了通过基因重组导入上述能够降低或缺损的酶活性的突变，可以采用以下的方法。可以对目的基因的部分序列进行修饰，制作不产生正常发挥功能的酶的突变型基因，用含该基因的DNA转化属于肠杆菌科的微生物，使突变型基因与基因组上的基因间发生重组，从而将基因组上的目的基因取代为突变型。利用了这样的同源重组的基因取代，可以利用下述方法：称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko，K.A，andWanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))、组合使用Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(Datsenko，K.A，and Wanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000)；美国专利第6303383号；特开平05-007491号公报)。此外，诸如上述的通过利用了同源重组的基因取代进行的定点突变导入，还可以使用在宿主上不具有复制能力的质粒来进行。此外，酶活性的降低或丧失还可以是通过X射线或紫外线照射、或者利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理，在目的基因的编码区域内导入突变的修饰。

(2)通过对编码目的酶的基因的表达调节序列进行修饰来导致酶活性降低或丧失

通过对编码目的酶的基因的表达调节序列进行修饰来导致酶活性降低或丧失，可以这样实现：在染色体DNA上的启动子、SD序列等表达调节序列中导入突变来降低表达量；扩增编码能够降低这些基因的表达的调节物的基因；缺失或弱化编码能够提高这些基因的表达的激活物的基因。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中。而且，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列、特别是起始密码子紧邻上游的序列中数个核苷酸的取代对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对它们进行修饰。特别是，glpA、B、C基因采取操纵子结构，因此，可以通过在glpA上游的启动子区域等表达调节区域中导入突变来降低表达量。

<2>本发明的生产方法

本发明的方法是以在培养基中包含甘油的培养基中培养上述的属于肠杆菌科、且具有L-氨基酸生产能力的细菌，并在培养基中或菌体内生成并蓄积L-氨基酸，从该培养基或菌体收集L-氨基酸为特征的L-氨基酸的生产方法。这里，本发明的方法可以采用分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batchculture)、连续培养法(continuous culture)中的任何方法，培养基中的甘油可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中，或者包含于这两者中。

这里，在本发明中，上述流加培养是指下述培养方法：将培养基连续地或间歇地添加至培养容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出培养基。此外，连续培养指下述培养方法：连续地或间歇地将培养基流加至培养容器中，同时从容器中取出培养基(通常而言，等于所流加的培养基的量)。“初始培养基”的意思是在流加培养或连续培养中，流加流加培养基之前的分批培养中所用的培养基(培养开始时的培养基)；“流加培养基”的意思是在进行流加培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。此外，分批培养(batch culture)是指：每批一次准备新的培养基，将菌株接种到其中，并且直至收获都不加入培养基。

本发明的培养基中包含的甘油可以是单独的碳源，还可以使用除甘油以外还添加了其它碳源的混合培养基。优选的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解物或由生物质的水解得到的糖液等糖类，乙醇等醇类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。在使用混合培养基时，培养基中的甘油的比例希望包含50%以上、60%以上、优选70%以上、更优选80%以上、特别优选90%以上。特别优选的是，所利用的甘油是作为生物柴油的副产品得到的。(Mu Y，et al，Biotechnol Lett.，28，1755-91759(2006)，HaasMJ，et al；Bioresour Technol.97，4，671-8678(2006))

可以使用常规的培养基，其中除碳源外，还含有氮源、无机离子和视需要而定的其它有机成分作为培养基中添加的其它成分。

作为本发明的培养基中包含的氮源，可以使用氨气、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等，pH调整中使用的氨气、氨水也可作为氮源利用。此外，还可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。培养基中也以只含这些氮源中的1种，也可以含有2种以上。这些氮源可以用于初始培养基，也可以用于流加培养基。此外，初始培养基、流加培养基中可以使用相同的氮源，也可以将流加培养基的氮源改变为与初始培养基不同。

本发明的培养基中，除了碳源、氮源、硫之外，优选还包含磷酸源、硫源。作为磷酸源，可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、焦磷酸等磷酸多聚物等。此外，作为硫源，只要包含硫原子即可，优选硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等硫酸盐，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸，这其中优选硫酸铵。

此外，培养基除碳源、氮源、硫之外，还可以包含生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。能够使用的生长促进因子包括痕量金属、氨基酸、维生素、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解产物等。作为痕量金属，可以列举铁、锰、镁、钙等；作为维生素，可以列举维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12等。这些生长促进因子可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中。

此外，在使用其生长需求氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选在培养基中添补所需求的营养素。特别是，可在本发明中使用的L-赖氨酸生产菌中大多如后述地强化了L-赖氨酸生物合成途径，而弱化了L-赖氨酸分解能力，因此，优选添加选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1种或2种以上。

初始培养基和流加培养基的培养基组成可以相同，也可以不同。此外，初始培养基与流加培养基的硫浓度可以相同，也可以不同。而且，当流加培养基的流加分多个阶段进行时，各流加培养基的组成可以相同，也可以不同。

培养优选在发酵温度20至45℃，特别优选33至42℃的通气条件下进行。这里，将氧浓度调节到5至50%，优选至大约10%。此外，优选将pH控制在5至9进行通气培养。如果在培养期间pH降低，例如，可添加碳酸钙或碱例如氨气和氨水以中和培养物。在这些条件下，进行优选大约10至120小时的培养，从而在培养液中积累显著量的L-氨基酸。蓄积的L-氨基酸的浓度只要是高于野生型菌株中的浓度并且在该浓度下能够将L-氨基酸从培养基收集和回收即可，可以是50g/L或更高，理想的是75g/L或更高，更理想的是100g/L或更高。

就培养结束后从培养液中收集L-氨基酸的方法而言，可以按照公知的回收方法来进行。例如，通过采用离心分离等从培养液中除去菌体、然后进行浓缩晶析来进行收集。

在本发明中，为了确保高于一定水平的L-氨基酸蓄积，微生物的培养可以分为种子培养(seed culture)和主培养(main culture)来进行，种子培养可通过使用培养瓶等的摇动培养或通过分批培养来进行，而主培养可以以流加培养或连续培养的形式进行。或者，种子培养和主培养均可以以分批培养的方式进行。

当根据本发明进行流加培养或连续培养时，可间歇地流加流加培养基，使甘油或其它碳源的流加暂时停止。优选的是，停止流加培养基供给的时间为流加进行时间的至多30%，理想的是至多20%，特别理想的是至多10%。当间歇流加流加培养液时，可添加一定时间的流加培养基，并如下控制第二次及以后的添加：在某个添加期前面的添加停止期中发酵培养基内碳源耗尽时pH的上升和溶氧浓度的上升通过计算机被检测到时，即开始添加；并且因此培养罐(culture tank)中的基质浓度可自动地保持在低水平(美国专利5,912,113号说明书)。

流加培养中使用的流加培养基，优选含甘油或其它碳源、以及具有生长促进效果的营养素(生长促进因子)的培养基，可以进行控制，使得发酵培养基中的甘油浓度、其它碳源的浓度在一定水平以下。作为其它碳源，优选葡萄糖、蔗糖、果糖；作为生长促进因子，优选氮源、磷酸、氨基酸等。作为氮源，可以使用氨气、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，作为氨基酸，优选在使用营养缺陷型突变株时添补要求的营养素。此外，流加培养基可以是1种，也可以混合2种以上的培养基。在使用2种以上流加培养基时，这些培养基可以混合起来通过1个发酵罐流加，也可以通过多个发酵罐流加。

在将连续培养方法用于本发明时，可以同时取出和添加；也可以取出部分后再添加。此外，所述方法也可以是对菌体进行再利用的连续培养方法，其中将包含L-氨基酸和细胞的培养液取出，并且仅将细胞再循环回发酵罐(参照法国专利号2669935说明书)。作为连续或间歇流加营养源的方法，使用与流加培养中所用的相同方法。

再利用菌体的连续培养方法是如下所述的方法：在氨基酸浓度达到预定水平时，将发酵培养基间歇或连续地取出，仅取出L-氨基酸，并且将包含菌体的过滤残余物再循环到发酵罐中，这种方法可通过参考例如法国专利号2669935说明书来实施。

其中，将培养液间歇取出时，可以在L-氨基酸浓度达到预定浓度时取出部分L-氨基酸，并且新添加培养基以继续培养。此外，至于添加的培养基的量，优选进行设定使其与最终取出之前培养液的量为等量。这里，“等量”的意思是取出之前培养液量的大约93～107%的量。

在将培养液连续取出时，优选在流加营养培养基的同时或之后开始取出。例如，取出开始于添加开始之后的5小时之内，优选3小时之内，更优选1小时之内。此外，至于培养液的取出量，优选取出的量和流加的量为等量。

<3>作为本发明的微生物的亲本株使用的微生物

在本发明中，可以使用下述细菌作为亲本株，并按上述方法来赋予本发明的性质，所述细菌属于肠杆菌科，且具有能够以甘油为碳源进行代谢的L-氨基酸生产能力。

这里，肠杆菌科细菌中包含属于埃希氏菌、肠杆菌、欧文氏菌、克雷伯氏菌、泛菌、光状杆菌(Photorhabdus)、普罗威登斯菌(Providencia)、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、摩根氏菌、耶尔森氏菌等属的细菌。特别是优选通过NCBI (National Center for Biotechnology Information)的数据库(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)中采用的分类法分类在肠杆菌科的细菌。

关于“属于埃希氏菌属的细菌”，不意在限制，是指该细菌按照微生物学专家知晓的分类方法分类在埃希氏菌属。在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌的例子包含大肠杆菌(E.coli)，但不限于此。

对于可在本发明中使用的属于埃希氏菌属的细菌而言，不意在限制，包含例如Bachmann等的著作的表1(Bachmann，B.J.1996.p.2460-2488.In F.D.Neidhardt(编)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition，American Society for Microbiology Press，Washington，D.C)中描述的系统。具体地，可以列举原型野生株K12株来源的大肠杆菌W3110(ATCC27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。

这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，United States of America)通过分售获得。即，对各菌株赋予了对应的注册号，可以利用该注册号通过分售获得。对应于各菌株的注册号见美国典型培养物保藏中心的目录。

属于泛菌属的细菌是指：该细菌通过微生物学专家知晓的分类被分类在泛菌属。成团肠杆菌的某些种，最近基于16S rRNA碱基序列分析等被重新分类为成团泛菌、Pantoea ananatis、斯氏泛菌((Pantoea stewartii))等(Int.J.Syst.Bacteriol.1993.43：162-173)。在本发明中，属泛菌属的细菌也包含这样重新分类在泛菌属的细菌。

在本发明中，具有L-氨基酸生产能力的细菌是指：具有在培养基中培养后，生产L-氨基酸，并将L-氨基酸分泌到培养基中的能力的细菌。此外，优选是指：能够在培养基中蓄积优选0.5g/L以上、更优选1.0g/L以上的量的目的L-氨基酸的细菌。L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。特别优选L-苏氨酸和L-赖氨酸。

在本发明的亲本株中，可以使用目前为止报导的L-氨基酸生产菌，只要能够同化甘油即可。以下，对可在本发明的方法中使用的各L-氨基酸生产菌进行说明。

L-苏氨酸生产菌

作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举：大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利第5,175,107号、美国专利第5,705,371号)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC98081)(美国专利第5,631,157号)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利第5,939,307号)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利第5,474,918号)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利第5,376,538号)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner et al.,Genetika(俄语)，14，947-956(1978))、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。

TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突变(leaky mutation)。该菌株的rhtA基因也有突变，该突变赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。B-3996菌株包含pVIC40，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到由RSF1010获得的载体中而获得的。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I对苏氨酸的反馈抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于All-UnionScientific Center of Antibiotics(全联盟抗生素科学中心)(Nagatinskaya Street3-A,117105Moscow，Russia)，保藏号为RIA1867。该菌株也在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection ofIndustrial Microorganisms)(VKPM)，保藏号为B-3996。

还可以使用大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792B)作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株。B-5318菌株是异亮氨酸原养型的，并且pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域被置换为温度敏感的λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，1Dorozhny proezd.，1Moscow117545，Russia)，保藏号为VKPM B-5318。

优选地，本发明的细菌进一步经过修饰而增强了一种或多种下列基因的表达：

-突变thrA基因，其编码对苏氨酸的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I；

-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；

-thrC基因，其编码苏氨酸合酶(threonine synthase)；

-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；

-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；

-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)。

编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的大肠杆菌thrA基因已经阐明(核苷酸编号337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrL基因和thrB基因之间。大肠杆菌的编码高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(核苷酸编号2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA基因和thrC基因之间。大肠杆菌的编码苏氨酸合酶的thrC基因已经阐明(核苷酸编号3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所有这3个基因作为一个单独的苏氨酸操纵子发挥功能。为增加苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子中将影响转录的弱化子区域去除(WO2005/049808，WO2003/097839)。

编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因可以作为一个操纵子从熟知的pVIC40质粒中获得，该质粒存在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996菌株中。pVIC40质粒在美国专利5,705,371中有详述。

rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上的18min处，靠近编码谷氨酰胺转运系统的成分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸编号764至1651，GenBank登录号AAA218541，gi：440181)相同，位于pexB与ompX基因之间。已将表达由ORF1编码的蛋白的序列命名为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸抗性)。此外，已经证明rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置用G→A取代(ABSTRACTS of the17th InternationalCongress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with AnnualMeeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology(第17界国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学协会年会摘要)，San Francisco，California，1997年8月24-29日，摘要号457，EP1013765A)。

大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸编号3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16131307)，并且可以根据该基因的碱基序列利用引物通过PCR(参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))来获得。其它微生物的asd基因可以通过类似方式获得。

此外，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸编号983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16128895)，并且可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因可以通过类似方式获得。

L-赖氨酸生产菌

属于埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属细菌的生长，但是当L-赖氨酸共存于培养基中时这种抑制会被全部或部分解除。L-赖氨酸类似物的实例包括、但不限于，氧化赖氨酸，赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate)，S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯代己内酰胺等。对属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理可以得到对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株。可用于L-赖氨酸生产的菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；参见美国专利第4,346,170号)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制已被解除。

WC196菌株可用作L-赖氨酸生产菌。这种菌株是通过赋予源自大肠杆菌K-12的W3110菌株以AEC抗性选育而成的。将该菌株命名为大肠杆菌AJ13069，并于1994年12月6日保藏在日本工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，邮箱305-8566，日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)，取得保藏号FERMP-14690。其后根据布达佩斯条约的规定于1995年9月29日转为国际保藏，并取得保藏号FERM BP-5252(美国专利第5,827,698号)。

L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株的实例还包括编码L-赖氨酸生物合成酶的1种以上的基因的表达增强的菌株。相关基因的实例包括但不限于，二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(美国专利6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)和天冬氨酸酶基因(aspA)(EP1253195A)。此外，亲本菌株中涉及能量效率(energy efficiency)的基因(cyo)(EP1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA)(Gene23：199-209(1983))或它们的组合的表达水平增加。而且，括号内为该基因的简记符号。

已知大肠杆菌来源的野生型二氢吡啶二羧酸合成酶受L-赖氨酸的反馈抑制，大肠杆菌来源的野生型天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，在使用dapA基因和lysC基因时，优选这些基因是不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型基因。

作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA，可以列举编码具有第118位的组氨酸残基被取代成酪氨酸残基的序列的蛋白的DNA。此外，作为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的DNA，可以列举编码具有第352位的苏氨酸残基被取代为异亮氨酸残基、第323位的甘氨酸残基被取代为天冬酰胺残基、第318位的甲硫氨酸被取代为异亮氨酸的序列的AKIII的DNA(关于这些突变体，可参见美国专利第5661012号和第6040160号说明书)。突变型DNA可以通过利用PCR等的定点突变方法获得。

而且，作为包含编码突变型突变型二氢吡啶二羧酸合成酶的突变型dapA和编码突变型天冬氨酸激酶的突变型lysC的质粒，已知有广宿主域质粒RSFD80、pCAB1、pCABD2(美国专利第6040160号说明书)。用RSFD80转化的大肠杆菌JM109株(美国专利第6040160号说明书)命名为AJ12396，该株于1993年10月28日保藏在日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)，保藏号FERM P-13936；并于1994年11月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-4859。RSFD80可采用公知方法从AJ12396株获取。

作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株的例子，可列举催化下述反应的酶的活性减少或缺损的菌株，所述反应通过从L-赖氨酸生物合成途径分支，而生成除L-赖氨酸外的化合物。作为催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成除L-赖氨酸外的化合物的反应的酶的例子，可以列举高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利第5,827,698号)、和苹果酸酶(WO2005/010175)。这里，为了降低或缺损赖氨酸脱羧酶活性，优选降低编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因和ldcC基因这两者的表达(国际公布第WO2006/038695号小册子)。

L-半胱氨酸生产菌

L-半胱氨酸生产菌或用于衍生L-半胱氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抑制抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)，具有过表达编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白的基因的大肠杆菌W3110(美国专利5,972,663)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteinedesulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110(WO0127307A1)，等等。

L-亮氨酸生产菌

L-亮氨酸生产菌或用于衍生L-亮氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利6,124,121))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸等)有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)；通过WO96/06926中描述的遗传工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)，等等。

可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的1种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例可优选列举leuABCD操纵子中的基因，所述操纵子中的基因以经过突变的leuA基因为代表，该突变的leuA基因编码对L-亮氨酸反馈抑制具有抗性的异丙基苹果酸合酶(美国专利6,403,342)。此外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的1种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。

L-组氨酸生产菌

L-组氨酸生产菌或用于衍生L-组氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945，RU2003677)；大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，RU2119536)；大肠杆菌NRRL B-12116–B12121(美国专利4,388,405)；大肠杆菌H-9342(FERMBP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利6,344,347)；大肠杆菌H-9341(FERM BP-6674)(EP1085087)；大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利6,258,554)等等。

L-组氨酸生产菌或用于衍生L-组氨酸生产菌的亲本株的实例还包括如下菌株，所述菌株中编码L-组氨酸生物合成系统酶的1种以上的基因的表达增强。相关基因的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisI)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶基因(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。

已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成系统酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中引入诱导对反馈抑制有抗性的突变来有效地增加产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677和2119536)。

具有L-组氨酸生产能力的菌株具体实例包括大肠杆菌FERM-P5038和5048，其已经导入了携带编码L-组氨酸生物合成系统酶的DNA的载体(特开昭56-005099号)，导入了用于氨基酸输送的基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利2119536号)，等等。

L-谷氨酸生产菌

L-谷氨酸生产菌或用于衍生L-谷氨酸生产菌的亲本株的实例包括但不限于大肠杆菌VL334thrC+(EP1172433)等属于埃希氏菌属的菌株。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型，在thrC和ilvA基因中有突变(美国专利4,278,765)。利用可在野生型大肠杆菌菌株K12(VKPM B-7)中增殖的噬菌体P1，通过常规转导转移了thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了L-异亮氨酸营养缺陷型的L-谷氨酸生产菌VL334thrC⁺(VKPM B-8961)。

L-谷氨酸生产菌或用于衍生L-谷氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于编码L-谷氨酸生物合成系统酶的1种以上的基因的表达增加的菌株。作为相关基因的实例，可列举谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(citrate synthase；gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)和葡糖磷酸异构酶(pgi)等。

经修饰而增加了柠檬酸合成酶(citrate synthetase)基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A中公开的那些菌株。

L-谷氨酸生产菌或用于衍生L-谷氨酸生产菌的亲本株的实例还包括下述酶的活性减少或缺损的菌株，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支的L-谷氨酸以外的化合物的合成。这类酶的实例包括异柠檬酸裂合酶(aceA)，α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)，磷酸转乙酰酶(pta)，乙酸激酶(ack)，乙酰羟酸合酶(acetohydorxy acid synthase)(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvI)，甲酸乙酰转移酶(pfl)，乳酸脱氢酶(ldh)，谷氨酸脱羧酶(gadAB)等。在美国专利5,378,616和5,573,945中描述了α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失，或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于埃希氏菌属的细菌及它们的获得方法。

具体地，这些菌株可列举如下：

大肠杆菌W3110sucA::Kmr

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)。

大肠杆菌W3110sucA::Kmr是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(在下文也称为“sucA基因”)而获得的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺失。

L-谷氨酸生产菌的其它实例包括属于埃希氏菌属并且具有对天冬氨酸抗代谢物的抗性的细菌。这些菌株也可以是α-酮戊二酸脱氢酶缺陷的菌株，包括例如大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利5,908,768)；进一步降低了L-谷氨酸分解能力的FERM P-12379(美国专利5,393,671)；AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利6,110,714)，等等。

L-谷氨酸生产菌的实例还包括α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于泛菌属的细菌，并且可以如上所述获得。这些菌株包括Pantoea ananatis AJ13356(美国专利6，331，419)。将Pantoea ananatisAJ13356于1998年2月19日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称作独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，邮政信箱305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERMP-16645。其后按照布达佩斯条约的规定，在1999年1月11日将其转为国际保藏，并得到保藏号FERM BP-6616。Pantoea ananatis AJ13356由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏而缺失了α-酮戊二酸脱氢酶活性。当将上述菌株分离时将其鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌AJ13356保藏。但是，近来基于对16S rRNA的核苷酸测序等，将其重新归类为Pantoeaananatis。尽管AJ13356作为成团肠杆菌保藏在前述保藏单位，就本说明书而言，将它们描述为Pantoea ananatis。

L-苯丙氨酸生产菌

L-苯丙氨酸生产菌或用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)；具有突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利5,354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRLB-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利4,407,952)等。而且，也可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和命名为AJ12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](FERMBP-3579)作为亲本菌株(EP488424B1)。此外，还可使用增加了yedA基因或yddG基因所编码蛋白的活性的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。

L-色氨酸生产菌

L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如可以使用由突变的trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷的大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美国专利5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利4,371,614)；产生磷酸烯醇丙酮酸的能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利6,319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增加的产生L-色氨酸的埃希氏菌属细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。

L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还包括增加了选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)中的一种以上酶活性的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶同受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入导致反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164菌株和通过将质粒pGH5转入大肠杆菌SV164获得的菌株(WO94/08031)，所述质粒pGH5包含编码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。

L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还包括导入了如下所述的色氨酸操纵子的菌株，所述色氨酸操纵子包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利4,371,614)。此外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由α和β亚基组成，α和β亚基分别由trpA和trpB编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进产生L-色氨酸的能力(WO2005/103275)。

L-脯氨酸生产菌

L-脯氨酸生产菌或用于衍生L-脯氨酸生产菌的亲本株实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如ilvA基因缺陷并且能够产生L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)(EP1172433)等。

可以通过增加涉及L-脯氨酸生物合成的1种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。用于L-脯氨酸生产菌的优选基因的实例包括编码L-脯氨酸反馈抑制解除的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利第3127361号)。此外，可以通过增加1种以上编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。

具有L-脯氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括下列大肠杆菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(英国专利第2075056号)，VKPMB-8012(俄罗斯专利申请2000124295)，德国专利第3127361中描述的质粒突变体，Bloom F.R.等描述的质粒突变体(The15^th Miami winter symposium(第15届迈阿密冬季研讨会)，1983，第34页)等等。

L-精氨酸生产菌

L-精氨酸生产菌或用于衍生L-精氨酸生产菌的亲本株包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315A1)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请No.2001112869)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的产生精氨酸的菌株(EP1170361A1)，等等。

L-精氨酸生产菌或用于衍生L-精氨酸生产菌的亲本株包括、但不限于编码L-精氨酸生物合成酶的1种以上的基因的表达增加的菌株。相关基因的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。

L-缬氨酸生产菌

L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株实例包括、但不限于经修饰以过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5,998,178)。理想的是将衰减所需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，理想的是将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。

L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的实例还包括具有氨酰t-RNA合成酶突变的突变株(美国专利5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，113545Moscow，1Dorozhny Proezd.)，保藏号为VKPM B-4411。

此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变株和/或缺失H⁺-ATP酶的突变株(WO96/06926)。

L-异亮氨酸生产菌

L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因转化的重组菌株(特开平2-458号，FR0356739，和美国专利第5,998,178号)作为亲本菌株。

实施例

[实施例1]果糖6磷酸醛缩酶和甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性增强的L-赖氨酸生产菌的构建

<1-1>dak1基因表达用质粒的构建

酿酒酵母染色体的全碱基序列已经阐明(Science25(1996))。基于该文献报告的dak1基因的碱基序列，使用SEQ ID NO：14的合成寡核苷酸作为5’侧引物，使用SEQ ID NO：15所述的合成寡核苷酸作为3’侧引物，以酿酒酵母JCM7255株的染色体DNA为模板进行了PCR。将纯化后的PCR产物与用HindIII、SalI消化的载体pMW119(TAKARABIO公司制造)相连接，构建了dak1表达用质粒pMW-dak1。而且，JCM7255是保藏在日本琦玉县和光市广泽2-1(独立行政法人)理化学研究所“微生物系统保藏设施”的菌株。

<1-2>甘油脱氢酶活性提高株的构建

构建了具有SEQ ID NO：11所示结构的WC196ΔcadAΔldcC株。为了构架具有该结构的菌株，使用了SEQ ID NO：9所示的序列(PCR产物)。在SEQID NO：9所示的序列中，碱基序号第1位～第172位是λ噬菌体的attR序列，碱基序号第324位～第983位是氯霉素抗性基因(cat)，碱基序号第1540位～第1653位是λ噬菌体的attL序列，碱基序号第1654位～第1733位是tacM启动子。

而且，tacM启动子(SEQ ID NO：10)可通过将tac启动子(Gene25(2-3)，167-178(1983))的-35区的TTGACA序列替换为TTCACA来构建。SEQ IDNO：9的序列可参考pMW118-attL-Cm-attR(WO2005/010175)来构建。

以SEQ ID NO：9的序列为模板，通过使用SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示引物的PCR进行扩增，将该扩增产物通过λ-RED法(WO2005/010175)插入到WC196ΔcadAΔldcC株(参照国际公布第WO2006/038695号小册子)的染色体上，获得了gldA上游的启动子序列被替换的菌株。这样一来，得到了甘油脱氢酶活性提高的菌株：WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm株。

<1-3>果糖6磷酸醛缩酶和甘油脱氢酶活性增强的L-赖氨酸生产菌的构建

构建了具有SEQ ID NO：92所示结构的WC196ΔcadAΔldcC株。为了构建具有该结构的菌株，使用了SEQ ID NO：9所示的序列(PCR产物)。在SEQ ID NO：9所示的序列中，碱基序号第1位～第172位为λ噬菌体的attR序列，碱基序号第324位～第983位为氯霉素抗性基因(cat)，碱基序号第1540位～第1653位为λ噬菌体的attL序列，碱基序号第1654位～第1733位为tacM启动子。

而且，tacM启动子(SEQ ID NO：10)可通过将tac启动子(Gene25(2-3)，167-178(1983))的-35区的TTGACA序列替换成TTCACA来构建。SEQ IDNO：9的序列可参考pMW118-attL-Cm-attR(WO2005/010175)来构建。

以SEQ ID NO：9的序列为模板，通过使用SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94所示引物的PCR进行了扩增，将该扩增产物采用λ-RED法(WO2005/010175)插入WC196ΔcadAΔldcC株(参照国际公布第WO2006/038695号小册子)的染色体上，得到了fsaB-gldA操纵子上游的启动子序列被替换的菌株。由此，得到了果糖6磷酸醛缩酶和甘油脱氢酶活性提高的菌株WC196ΔcadAΔldcCPtacM fsaB-gldA::Cm株。

<1-4>果糖6磷酸醛缩酶和甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性增强的L-赖氨酸生产菌的构建

对于WC196ΔcadAΔldcC株(参照国际公布第WO2006/038695号小册子)、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm株和WC196ΔcadAΔldcCPtacMfsaB-gldA::Cm株，使用携带dapA、dapB和LysC基因的Lys生产用质粒pCABD2(国际公布第WO01/53459号小册子)按常规方法进行转化，得到了WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm/pCABD2株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMfsaB-gldA::Cm/pCABD2株。而且，对于WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm/pCABD2株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMfsaB-gldA::Cm/pCABD2株，用dak1表达用质粒pMW-dak1按常规方法进行转化，得到了WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2，pMW-dak1株、WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm/pCABD2，pMW-dak1株、和WC196ΔcadAΔldcCPtacM fsaB-gldA::Cm/pCABD2，pMW-dak1株。

将这些菌株在含20mg/L的链霉素、或20mg/L的链霉素和50mg/L的氨苄青霉素的L培养基中于37℃培养至终OD600≒0.6，然后，加入与培养液等量的40%甘油溶液并进行搅拌，然后以适当的量分装，于-80℃保存。将其称为甘油保存液。

[实施例2]果糖6磷酸醛缩酶和甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性增强的L-赖氨酸生产菌的评价

融化上述甘油保存液，各取100μL均匀涂布在含20mg/L的链霉素、或20mg/L的链霉素和50mg/L的氨苄青霉素的L平板上，37℃培养24小时。将所得的平板上的菌体悬浮在1ml的生理食盐水中，用常数50除以将悬浮液稀释101倍时的吸光度600nm的值(n)，计算出液量(V)(V=50/n)，将该液量接种到500mL坂口培养瓶中的、含20mg/L的链霉素、或20mg/L的链霉素和50mg/L的氨苄青霉素的发酵培养基20mL中，用往复式振荡培养装置37℃培养48小时。培养后，采用公知方法(SAKURA精机BIOTECHANALYSER AS210)测定培养基中蓄积的赖氨酸的量。

发酵培养基的组成如下(单位g/L)。

用KOH调整至pH7.0，115℃高压灭菌10分钟(但甘油和MgSO₄·7H₂O另行灭菌)

添加符合日本药典的(局方)CaCO₃30g/L(180℃干热灭菌2小时)。

作为抗生素，添加20mg/L的链霉素、或20mg/L的链霉素加50mg/L的氨苄青霉素。培养在温度37℃、搅拌115rpm的条件下进行48小时。

结果示于表5(OD表示吸光度600nm下的菌体量、Lys(g/L)表示培养瓶中蓄积的L-赖氨酸蓄积量、产率[产率](%)表示从基质到L-赖氨酸的产率)。就单独强化甘油脱氢酶的菌株、单独强化二羟基丙酮激酶的菌株、和强化果糖6磷酸醛缩酶和甘油脱氢酶的菌株而言，与非修饰株相比，在收率、生产性方面均无变化；而在同时强化甘油脱氢酶和以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶的WC196ΔcadAΔldcCPtacMgldA::Cm/pCABD2,pMW-dak1株中，与其它菌株相比较，蓄积了大量的L-赖氨酸。此外，就同时强化果糖6磷酸醛缩酶和甘油脱氢酶和以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶的WC196ΔcadAΔldcCPtacM fsaB-gldA::Cm/pCABD2, pMW-dak1株而言，蓄积了更大量的L-赖氨酸。

[表5]：果糖6磷酸醛缩酶(fsaB)和甘油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激酶(dak1)活性增强株的L-赖氨酸蓄积

	O.D.	Lys(g/L)	产率(％)
				WC196LC pCABD2 -	16.7	14.7	36.8
WC196LC pCABD2 pM W-dakl	14.3	14.8	36.9
				WC196LCP tacM gklA pCABD2 -	18.1	14.7	36.8
WC196LCP tacM fsaB-gldA pCABD2 -	18.5	14.3	35.8
				WC196LCP tacM gldA pCABD2 pM W-dakl	15.3	15.3	38.1
WC196LCP tacM fsaB-gldA pCABD2 pM W-dakl	14.0	16.9	42.1

表中的菌株名中，“LC”为“ΔcadAΔldcC”的简记，省略了“::Cm”。

[实施例3]增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性的L-苏氨酸生产菌的构建

<3-1>甘油脱氢酶活性提高株的构建

构建了具有SEQ ID NO：90和91所示结构的B5318株。为了构建具有该结构的菌株，使用了SEQ ID NO：88和89所示的序列(PCR产物)。在SEQID NO：88和89所示的序列中，碱基序号第1位～第72位为λ噬菌体的attR序列，碱基序号第324位～第983位为氯霉素抗性基因(cat)，碱基序号第1540位～第1653位为λ噬菌体的attL序列，碱基序号第1654位～第1733位为tacM2和tacM3启动子。

而且，tacM2和tacM3启动子是可通过将tac启动子(Gene 25 (2-3)，167-178 (1983))的-35区的TTGACA序列替换为TGTACA和TTGGCA来构建的组成型启动子(Molecular Biology 39 (5) 719-726 (2005))。SEQ ID NO：88和89的序列可参考pMW118-attL-Cm-attR(WO2005/010175)来构建。

以SEQ ID NO：88和89的序列为模板，通过使用SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示引物的PCR进行扩增，将该扩增产物用λ-RED法(WO2005/010175)插入到B5318株(VKPM B-5318)的染色体上，得到了gldA上游的启动子序列被替换的菌株。由此，得到了甘油脱氢酶活性提高的菌株即B5318PtacM2gldA::Cm株和B5318PtacM3gldA::Cm株。

<1-3>增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性的L-苏氨酸生产菌的构建

对于B5318PtacM2gldA::Cm株和B5318PtacM3gldA::Cm株，使用dak1表达用质粒pMW-dak1按常规方法进行转化，得到了B5318PtacM2gldA::Cm/pMW-dak1株和B5318PtacM3gldA::Cm/pMW-dak1株。

将这些菌株在含20mg/L的链霉素、或20mg/L的链霉素及50mg/L的氨苄青霉素的L培养基中37℃培养至终OD600≒0.6，然后，加入与培养液等量的40%甘油溶液并进行搅拌，然后以适当量分装，于-80℃保存。将其称为甘油保存液。

[实施例4]强化了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性的L-苏氨酸生产菌的评价

融化上述甘油保存液，各取100μL均匀涂布在含20mg/L的链霉素、或20mg/L的链霉素和50mg/L的氨苄青霉素的L平板上，37℃培养24小时。将所得的平板上的菌体悬浮在1ml的生理食盐水中，用常数50除以将悬浮液稀释101倍时的吸光度600nm的值(n)，计算出液量(V)(V=50/n)，将该液量接种到500mL带挡板三角培养瓶中的含20mg/L的链霉素、或含20mg/L链霉素及50mg/L的氨苄青霉素的发酵培养基20mL中，用旋转培养装置于40℃培养24小时。培养后，采用公知方法(日立液相色谱，ODS-2柱)测定培养基中蓄积的苏氨酸的量。

发酵培养基的组成如下(单位g/L)。

添加符合日本药典的(局方)CaCO₃30g/L(180℃干热灭菌2小时)。

作为抗生素，添加了20mg/L的链霉素、或20mg/L的链霉素及50mg/L的氨苄青霉素。培养在温度40℃、搅拌144rpm旋转培养的条件下进行24小时。

结果示于表6(OD表示吸光度600nm下的菌体量，Thr(g/L)表示培养瓶中蓄积的L-苏氨酸蓄积量，产率[产率](%)表示从基质到L-苏氨酸的产率)。与非修饰株相比，单独强化甘油脱氢酶的菌株在产率、生产性方面均无变化，而在同时强化甘油脱氢酶和以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶的B5318PtacM2gldA::Cm/pMW-dak1株和B5318PtacM3gldA::Cm/pMW-dak1株中，与其它菌株相比较，蓄积了大量的L-苏氨酸。

[表6]：甘油脱氢酶(gldA)和二羟基丙酮激酶(dak1)活性增强株的L-苏氨酸蓄积

	OD600	Thr(g/L)	产率（％)
				B5318 - -	22.5	12.5	30.9
B5318 Ptac M2gldA -	21.5	11.9	29.4
				B5318 Ptac M2gldA pM W-dak	21.1	13.2	32.6
B5318 Ptac M3gldA -	23.1	12.3	30.4
				B5318 Ptac M3gldA pM W-dak	22.3	13.3	32.9

表中的株名中，“pMW-dak”为“pMW-dak1”的简记，省略了“::Cm”。

〔序列表的说明〕

SEQ ID NO：1：大肠杆菌的gldA基因序列(1104bp)

SEQ ID NO：2：大肠杆菌的GldA氨基酸序列(367AA)

SEQ ID NO：3：酿酒酵母的dakA1基因序列(1755bp)

SEQ ID NO：4：酿酒酵母的DakA氨基酸序列(584AA)

SEQ ID NO：5：根瘤土壤杆菌的dhbK1基因序列(1695bp)

SEQ ID NO：6：根瘤土壤杆菌的Dhbk1氨基酸序列(564AA)

SEQ ID NO：7：弗氏柠檬酸杆菌的dhaK基因序列(1659bp)

SEQ ID NO：8：弗氏柠檬酸杆菌的DhaK氨基酸序列(552AA)

SEQ ID NO：9：attR-cat-attL-ptacM-SD-间隔序列(1740bp)

SEQ ID NO：10：tacM启动子(80bp)

SEQ ID NO：11：PtacMgldA::Cm序列

SEQ ID NO：12：atL-Ptac-gldA(gldA染色体上强化用PCR引物)

SEQ ID NO：13：atR-Ptac-fsaB1(gldA染色体上强化用PCR引物)

SEQ ID NO：14：pMW-dak1F(dakA克隆用引物)

SEQ ID NO：15：pMW-dak1R(dakA克隆用引物)

SEQ ID NO：16：大肠杆菌的glpF基因序列(846bp)

SEQ ID NO：17：大肠杆菌的GlpF氨基酸序列(281AA)

SEQ ID NO：18：大肠杆菌的tpiA基因序列(768bp)

SEQ ID NO：19：大肠杆菌的TpiA氨基酸序列(255AA)

SEQ ID NO：20：大肠杆菌的fbaA基因序列(1080bp)

SEQ ID NO：21：大肠杆菌的FbaA氨基酸序列(359AA)

SEQ ID NO：22：大肠杆菌的glpX基因序列(1011bp)

SEQ ID NO：23：大肠杆菌的GlpX氨基酸序列(336AA)

SEQ ID NO：24：大肠杆菌的glpK基因序列(1509bp)

SEQ ID NO：25：大肠杆菌的GlpK氨基酸序列(502AA)

SEQ ID NO：26：大肠杆菌的glpA基因序列(1629bp)

SEQ ID NO：27：大肠杆菌的GlpA氨基酸序列(542AA)

SEQ ID NO：28：大肠杆菌的glpB基因序列(1260bp)

SEQ ID NO：29：大肠杆菌的GlpB氨基酸序列(419AA)

SEQ ID NO：30：大肠杆菌的glpC基因序列(1191bp)

SEQ ID NO：31：大肠杆菌的GlpC氨基酸序列(396AA)

SEQ ID NO：32：大肠杆菌的glpD基因序列(1506bp)

SEQ ID NO：33：大肠杆菌的GlpD氨基酸序列(501AA)

SEQ ID NO：34：大肠杆菌的dhaK基因序列(1071bp)

SEQ ID NO：35：大肠杆菌的DhaK氨基酸序列(356AA)

SEQ ID NO：36：大肠杆菌的dhaL基因序列(633bp)

SEQ ID NO：37：大肠杆菌的DhaL氨基酸序列(210AA)

SEQ ID NO：38：大肠杆菌的dhaM基因序列(1419bp)

SEQ ID NO：39；大肠杆菌的DhaM氨基酸序列(472AA)

SEQ ID NO：40：粟酒裂殖酵母的二羟基丙酮激酶基因(1776bp)

SEQ ID NO：41：粟酒裂殖酵母的二羟基丙酮激酶(591AA)

SEQ ID NO：42：Pichia angusta的二羟基丙酮激酶基因(1830bp)

SEQ ID NO：43：Pichia angusta的二羟基丙酮激酶(609AA)

SEQ ID NO：44：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的二羟基丙酮激酶基因(1827bp)

SEQ ID NO：45：巴斯德毕赤酵母的二羟基丙酮激酶(608AA)

SEQ ID NO：46：汉森德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的二羟基丙酮激酶基因(1824bp)

SEQ ID NO：47：汉森德巴利酵母的二羟基丙酮激酶(607AA)

SEQ ID NO：48：蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)的二羟基丙酮激酶基因(1752bp)

SEQ ID NO：49：蟑螂埃希氏菌的二羟基丙酮激酶(583AA)

SEQ ID NO：50：肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)638的二羟基丙酮激酶基因(1647bp)

SEQ ID NO：51：肠杆菌属菌种638的二羟基丙酮激酶(548AA)

SEQ ID NO：52：嗜冷单胞菌属菌种(Psychromonas sp.)CNPT3的二羟基丙酮激酶基因(1695bp)

SEQ ID NO：53：嗜冷单胞菌属菌种CNPT3的二羟基丙酮激酶(564AA)

SEQ ID NO：54：Stappia aggregata的二羟基丙酮激酶基因(1647bp)

SEQ ID NO：55：Stappia aggregata的二羟基丙酮激酶(548AA)

SEQ ID NO：56：豌豆根瘤菌蚕豆生物变种(Rhizobium leguminosarum bv.viciae)3841的二羟基丙酮激酶基因(1641bp)

SEQ ID NO：57：豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841的二羟基丙酮激酶(546AA)

SEQ ID NO：58：黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DK1622的二羟基丙酮激酶基因(1701bp)

SEQ ID NO：59：黄色粘球菌DK1622的二羟基丙酮激酶(566AA)

SEQ ID NO：60：伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp.)383的二羟基丙酮激酶基因(1701bp)

SEQ ID NO：61：伯克霍尔德氏菌属菌种383的二羟基丙酮激酶(566AA)

SEQ ID NO：62：泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)E264的二羟基丙酮激酶基因(1704bp)

SEQ ID NO：63：泰国伯克霍尔德氏菌E264的二羟基丙酮激酶(567AA)

SEQ ID NO：64：多食伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ATCC17616的二羟基丙酮激酶基因(1851bp)

SEQ ID NO：65：多食伯克霍尔德氏菌ATCC17616的二羟基丙酮激酶(616AA)

SEQ ID NO：66：大肠杆菌的dhaR基因(1920bp)

SEQ ID NO：67：大肠杆菌的DhaR氨基酸序列(639AA)

SEQ ID NO：68：大肠杆菌的fsaA基因(663bp)

SEQ ID NO：69：大肠杆菌的FsaA氨基酸序列(220AA)

SEQ ID NO：70：大肠杆菌的fsaB基因(663bp)

SEQ ID NO：71：大肠杆菌的FsaB氨基酸序列(220AA)

SEQ ID NO：72：大肠杆菌的fbaB基因(1053bp)

SEQ ID NO：73：大肠杆菌的FbaB氨基酸序列(350AA)

SEQ ID NO：74：痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)Sd197的gldA基因(1143bp)

SEQ ID NO：75：痢疾志贺氏菌Sd197的GldA氨基酸序列(380AA)

SEQ ID NO：76：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)LT2的gldA基因(1104bp)

SEQ ID NO：77：鼠伤寒沙门氏菌LT2的GldA氨基酸序列(367AA)

SEQ ID NO：78：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的gldA基因(1098bp)

SEQ ID NO：79：恶臭假单胞菌的GldA氨基酸序列(365AA)

SEQ ID NO：80：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)36D1的gldA基因(1104bp)

SEQ ID NO：81；凝结芽孢杆菌36D1的GldA氨基酸序列(367AA)

SEQ ID NO：82；大肠杆菌的fbp基因(999bp)

SEQ ID NO：83：大肠杆菌的Fbp氨基酸序列(322AA)

SEQ ID NO：84：大肠杆菌的ybhA基因(819bp)

SEQ ID NO：85：大肠杆菌的YbhA氨基酸序列(272AA)

SEQ ID NO：86：大肠杆菌的ptsI基因(1782bp)

SEQ ID NO：87：大肠杆菌的PtsI氨基酸序列(575AA)

SEQ ID NO：88：attR-cat-attL-PtacM2-SD-间隔序列

SEQ ID NO：89：attR-cat-attL-PtacM3-SD-间隔序列

SEQ ID NO：90：PtacM2gldA::Cm序列

SEQ ID NO：91：PtacM3gldA::Cm序列

SEQ ID NO：92：PtacM fsaB-gldA::Cm序列

SEQ ID NO：93：atL-Ptac-fsaB(fsaB+gldA染色体上强化用PCR引物)

SEQ ID NO：94：atR-Ptac-fsaB(fsaB+gldA染色体上强化用PCR引物)

工业实用性

通过使用本发明的微生物，可以高效地从甘油发酵生产L-氨基酸。

Claims

1.一种生产L-氨基酸的方法，包括：

在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性的大肠杆菌，从而在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且

从该培养基或菌体收集L-赖氨酸，

其中所述甘油脱氢酶源自大肠杆菌且所述二羟基丙酮激酶源自酿酒酵母。

2.权利要求1所述的方法，其中所述甘油脱氢酶是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质。

3.权利要求1所述的方法，其中所述二羟基丙酮激酶以ATP为磷酸供体。

4.权利要求1所述的方法，其中所述二羟基丙酮激酶是具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白质。

5.权利要求1所述的方法，其中所述甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性是通过增加编码甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因的拷贝数，和/或修饰所述基因的表达控制序列而增强的。

6.权利要求1所述的方法，其中所述微生物还经过修饰而增强了甘油易化蛋白活性，

其中甘油易化蛋白活性是通过增加编码甘油易化蛋白的基因的拷贝数，或者将所述基因的启动子更换成更强的启动子而增强的。

7.权利要求1所述的方法，其中所述微生物还经过修饰而增强了选自由丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1,6-二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛缩酶组成的群组中的1种以上的酶活性。

8.权利要求1所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而降低了甘油激酶和/或膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活性。