CN105792925B - 磁性颗粒的制造 - Google Patents

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Abstract

一种生产颗粒的方法，所述方法通过如下方式进行：使位于非磁性多孔颗粒的表面上的官能团与位于磁性颗粒的表面上的官能团反应以形成共价键，从而获得补充有共价结合至所述颗粒的外面部分上的磁性颗粒的颗粒。优势包括结合容量增大。

Description

磁性颗粒的制造
技术领域
本发明大致地涉及适用于分子和细胞的分离和分析的磁性颗粒的制造，所述磁性颗粒包含多个团簇，其中非磁性多孔颗粒中补充有磁性颗粒。
背景技术
生物分子和细胞的分离和分析技术在许多技术领域中是至关重要的，所述技术领域包括但不限于生物制药、生物技术、食品技术、分析化学、药物化学和水净化。例如，基于生物亲和性的层析法已被使用超过50年。一种重要的生物亲和性系统是固定化蛋白A(immobilized Protein A)，免疫球蛋白将通过它生物特异性地相互作用。这使得以极高效的方式分离单克隆抗体成为可能。
现今最频繁使用的分离技术是层析技术，其中将分离介质装填在圆柱体中并且连接至使得分离感兴趣的分子成为可能的层析系统中。这种技术存在的若干缺陷之一在于处理时间。不但分离其本身需要相当长的时间，而且搭建层析系统也费时。仪器和设备价格昂贵而且需要时间搭建。此外，还需要有专业知识和经验才能够操纵该系统和评估结果。
存在可替代方案，磁性颗粒的使用是其中的一种可替代方案。
US 6,623,655公开了制备金属螯合化合物的方法。
Zhao等人在Lab Chip,2009,9,2981-2986中描述了一种制造具有用于细胞的隔室和带有磁性纳米颗粒的隔室的颗粒的技术。
US 4,438,179描述了一种具有结合至其表面的磁性颗粒的聚合物颗粒。所述磁性材料与一层结合聚合物结合，所述结合聚合物包含这样的官能团，所述官能团是离子的或能够形成金属螯合物或络合物。替代地，磁性材料与聚乙二醇和/或聚丙二醇结合。
WO 2012/015891公开了一种颗粒，所述颗粒可能是多孔的，其表面上具有较小的无机颗粒。所述颗粒是用于打印机的调色剂颗粒。
GB 1577930公开了包埋在多孔聚合物基体中的吸附颗粒和磁性颗粒。所述基体的孔隙率是这样的，其仅允许至多某特定分子量的分子能够穿透到基体的间隙中，使得该产品选择性地吸附溶液中溶解的物质。复合材料，尤其珍珠形式的复合材料，在食品工业中尤其有用，例如，用来从各种食物产品中分离出不想要的微量风味剂或者从各种产品中回收诸如维他命之类的有用材料。具体应用包括从浓缩的酵母提取物中除去苦味的异葎草酮(isohumulone)及从乳清中回收核黄素。含有被选择性吸附的物质的颗粒，因为它们的磁性特性而容易与介质分离，因而克服了现有技术领域中这种类型的吸附材料遇到的分离问题。所述吸附颗粒可以具有例如碳、Al2O3、硅胶、活性硅酸镁、粘土等。所述磁性颗粒可能具有例如磁铁矿、γ-Fe2O3、铁氧体等。多孔基体可能为例如PVC、聚丙烯酰胺(任选地与表氯醇交联)酚醛树脂、与HCHO交联的尼龙-6,6等。
US 8,518,265涉及一种功能性粉末，其包括磁性颗粒及提供在磁性颗粒表面上的疏水基团和亲水基团；其中疏水基团的数目(M)与亲水基团的数目(N)满足M/N等于0.2-0.8的条件。所包括的独立权利要求涉及水处理方法(例如废水诸如工业废水的处理)，所述方法包括将功能性粉末分散在含有杂质的水中以便杂质吸附在粉末的表面上，以及使用磁力从水中除去已吸附有杂质的功能性粉末。
包括磁性材料的多孔聚合物颗粒当前被用于多个目的，诸如各种物质的纯化等。尽管此类颗粒成功地用在商业应用中，但是仍然有改进的余地。在现有技术颗粒中，磁性材料占据了颗粒中能被用于纯化或分析的空间中的相当大一部分。
因而，现有技术中需要提供具有增大的负载容量的用于纯化目的颗粒。还需要针对制造及当在各种目的下使用颗粒时的简单而稳健的方法。
发明内容
本发明的一个目的在于减轻现有技术的至少某些缺陷并且提供用于分离和/或分析的改进材料以及所述材料的制造方法。
在第一方面，提供了生产颗粒(P)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供
-非磁性多孔颗粒(Pp)，所述多孔颗粒(Pp)具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的连接的内表面，所述多孔颗粒(Pp)包括至少一种聚合物，所述多孔颗粒(Pp)包括位于所述外表面和内表面上的至少一种类型的官能团，以及
-磁性颗粒(Mp)，所述磁性颗粒(Mp)包括位于其表面上的至少一种类型的官能团，其中所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径，以及
b.使位于非磁性多孔颗粒(Pp)的表面上的官能团与位于磁性颗粒(Mp)的表面上的官能团反应从而形成共价键，
从而获得补充有磁性颗粒(Mp)的颗粒(P)，所述磁性颗粒(Mp)共价结合至选自多孔颗粒(Pp)的内表面和外表面的至少一者上，
其中位于磁性颗粒(Mp)的表面上的至少一种类型的官能团全部尚未与位于多孔颗粒(Pp)的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团反应形成共价键，使得至少一种类型的官能团的一部分在选自磁性颗粒(Mp)和多孔颗粒(Pp)的至少一者上仍然可利用。
在第二方面，提供了包括非磁性多孔颗粒(Pp)的颗粒(P)，所述多孔颗粒(Pp)具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的内表面，所述多孔颗粒(Pp)包括至少一种聚合物，所述颗粒(Pp)具有至少一个共价结合至其上的磁性颗粒(Mp)，其中所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径。
根据本文描述的方面和实施方案的颗粒(P)与已知磁性颗粒相比较具有增大的结合容量。通过补充有磁性颗粒(Mp)的颗粒(P)的形成，维持和/或甚至提高了结合容量，配体也可以固定在磁性颗粒(Mp)上，使得多孔颗粒(Pp)的内部容积的主要部分不受影响并且可供与待分离组分发生吸附和结合反应之用。因为多孔颗粒(Pp)的大部分比表面积在内部，所以如果磁性颗粒(Mp)不是太小并且没有阻塞多孔颗粒(Pp)的孔隙，那么反应和/或吸附容量将得以维持。
进一步的优势是在颗粒(P)制备期间的所有步骤都容易执行，甚至在水溶液中并且在中等温度下(即，在大约20-60℃下)。
另一优势是在反应期间形成的牵涉位于多孔颗粒(Pp)的表面上和内部的基团的共价键是稳定的，甚至对于单一点附接的分子亦是如此。
重要的优势是磁性颗粒强有力地结合至多孔颗粒上，这使得让所述颗粒经受高流速成为可能。所述颗粒的强度的提高维持了颗粒的完整性，并且还使得它们强有力地粘附至磁性表面，从而使得磁性分离也可以在流动介质中进行。
再一个优势是所述方法可以极少的步骤来执行。与根据现有技术的方法相比较，所述方法更容易执行。
颗粒(P)的结合容量增大是一个优势，结合容量增大是例如因为磁性颗粒(Mp)的表面上的官能团使得磁性颗粒(Mp)也会对结合容量作出贡献。未参与建立磁性颗粒(Mp)与多孔颗粒(Pp)之间的共价键的官能团可适宜地用来提高结合容量，要么照原样使用，要么通过与其他分子进一步反应来提高结合容量。
附图说明
将参考以下各图描述各个方面和实施方案，其中：
图1示意性地示出包括多孔非磁性颗粒(Pp)和分布在其表面上的多个磁性颗粒(Mp)的颗粒(P)的横断面。在这个具体实施方案中，磁性颗粒(Mp)没有附接至多孔颗粒(Pp)的内表面，而是附接至多孔颗粒(Pp)的外表面。
图2示意性地示出包括非磁性多孔颗粒(Pp)与磁性颗粒(Mp)的相似的颗粒(P)的横断面，磁性颗粒(Mp)根据它们的尺寸与多孔颗粒中的孔隙直径的关系或多或少地穿透到所述颗粒中。在这个具体实施方案中，磁性颗粒(Mp)因而既附接至多孔颗粒(Pp)的内表面，又附接至多孔颗粒(Pp)的外表面。
图3示出以琼脂糖珠作为多孔颗粒的光学显微镜图像，所述琼脂糖珠具有结合至其表面的较小磁性颗粒，是由环氧化物活化的琼脂糖6B与具有10μm、5μm和2μm尺寸的巯基化M NH2颗粒之间的反应产生的。
图4示出磁性琼脂糖颗粒的光学显微镜图像，所述磁性琼脂糖颗粒是由环氧化物活化的琼脂糖6B与2μmM NH2颗粒之间的反应产生的。
图5示出通过使用永久性立方体磁体对磁性琼脂糖4B颗粒进行分离的图像。
图6示出还原条件下的SDS-PAGE凝胶的图像，所述SDS-PAGE凝胶是用蛋白A功能化磁性琼脂糖4B和6B颗粒及从人血清中纯化IgG。泳道1：蛋白分子量标记；泳道2：纯化前的人血清；泳道3-4：来自蛋白A磁性琼脂糖6B颗粒的洗脱级分；泳道5-7：来自蛋白A磁性琼脂糖4B颗粒的洗脱级分；泳道8：来自蛋白A的洗脱级分；泳道9-10：分别为10μg和20μg 98％纯度的人IgG。
具体实施方式
在详细描述各个方面和实施方案之前，应理解本说明书不局限于本文公开的具体化合物、构造、方法步骤、基质和材料，因为此类化合物、构造、方法步骤、基质和材料可以有些变化。还应理解，本文采用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而无意于限制，因为本发明实施方案的范围仅由所附权利要求书及其等价物限定。
必须注意，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。
而且，术语“大约”用于指示在适当的时候，偏离数值±10％，最优选±5％。
如果没有其他定义，包括本文使用的任何术语在内的科学术语意在具有本公开所属领域技术人员通常理解的含义。
如贯穿说明书和权利要求书使用的，球体的直径是穿过球体的中心并且其端点落在球体上的任何直线。
本发明人已进行广泛的研究并且发现权利要求中限定的颗粒(P)容易以高产率形成并且容易分离。据发现，使生物分子与所述团簇结合以及从所述团簇中分离出生物分子的能力比针对根据现有技术状态的相应颗粒的任何公开的数据都更高。
根据实施方案所形成颗粒(P)具有磁性并且在生物分子分离工艺中易于使用。它们的有用性在小规模和大规模应用中同样巨大。与固定化分子和/或细胞在一起的所述颗粒容易使用外部磁体分离。因为磁性颗粒(Mp)给颗粒(P)带来附加密度，所以所述分离可以通过离心或者利用重力通过静态沉降来辅助。基于密度的分离可以用作预分离步骤和/或作为磁性分离的一部分。
在第一方面，提供了生产颗粒(P)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供
-非磁性多孔颗粒(Pp)，所述多孔颗粒(Pp)具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的连接的内表面，所述多孔颗粒(Pp)包括至少一种聚合物，所述多孔颗粒(Pp)包括位于所述外表面和内表面上的至少一种类型的官能团，以及
-磁性颗粒(Mp)，所述磁性颗粒(Mp)包括位于其表面上的至少一种类型的官能团，其中所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径，以及
b.使位于非磁性多孔颗粒(Pp)的表面上的官能团与位于磁性颗粒(Mp)的表面上的官能团反应从而形成共价键，
从而获得补充有共价结合至选自多孔颗粒(Pp)的内表面和外表面的至少一者上的磁性颗粒(Mp)的颗粒(P)，
其中位于磁性颗粒(Mp)的表面上的至少一种类型的官能团全部都没有与位于多孔颗粒(Pp)的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团反应形成共价键，使得至少一种类型的官能团中的一部分在选自磁性颗粒(Mp)和多孔颗粒(Pp)的至少一者上仍然可利用。
在一个实施方案中，所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的所有孔隙的至少95％的最大直径。
所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径描述了所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的所有可能直径的最小值。使用重量百分比而不是数目来减少极小颗粒的相对重量。
多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径被衡量并且定义为表观孔隙尺寸，如在Hagel,Andersson,Journal of Chromatography A，743卷，第1期，1996年8月30日，第33-42页中进一步详细描述的。还存在针对一些市售聚合物的数据。例如，6％琼脂糖的平均(或表观)孔隙直径为24nm。
当所有磁性颗粒(Mp)的几乎全部(至少95重量％)的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径时，磁性颗粒可以在一定程度上进入多孔颗粒(Pp)中，但未大到磁性颗粒(Mp)阻碍多孔颗粒(Pp)的容量的程度。通过允许磁性颗粒(Mp)在一定程度上进入多孔颗粒(Pp)中，颗粒(P)的总结合容量可能实际上有所增大，因为磁性颗粒(Mp)在其表面上具有可利用的官能团，其可直接用来增大结合容量或者通过为结合其他分子进行的进一步反应来增大结合容量。通过允许磁性颗粒(Mp)中的一部分进入，磁性材料在颗粒中的负载量增大，这使得颗粒(P)对于分离更有用，因为如果它们在它们内部具有更多磁性材料，则分离它们更容易。
对于许多应用，特别是对于分离，期望颗粒具有高磁矩。颗粒P的结合容量也应当高。对此进行解决，以使得磁性颗粒(Mp)可以用官能团进行衍生化以便它们对颗粒(P)的总结合容量作出贡献。颗粒(P)的结合容量及磁矩都通过允许一些磁性颗粒(Mp)进入多孔颗粒(Pp)中以及通过用对颗粒(P)的总结合容量作贡献的官能团对磁性颗粒(Mp)进行衍生化来最大化。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)为20nm或更大。在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)为4μm或更小。在可替代的实施方案中，磁性颗粒(Mp)为100nm或更小。在一个实施方案中，在制造工艺期间利用稳定的磁性颗粒(Mp)胶体。使用各个磁性颗粒(Mp)的直径，如果磁性颗粒(Mp)形成团簇，则整个团簇的最大直径可能要大得多
设想到即使制造工艺是令人满意的，在实际制造过程中也可能存在少数比预期尺寸更小或更大的颗粒。
在可替代的实施方案中，磁性颗粒(Mp)的最小直径等于或小于多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径。在这个实施方案中，磁性颗粒中的至少一部分将进入多孔颗粒的孔隙中。通过相对于孔隙尺寸来选择磁性元件的尺寸，磁负荷(magnetic load)可以根据需要加以调整。
磁性颗粒(Mp)的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径(表观直径)。磁性颗粒(Mp)的最小直径意指基本上所有(至少95重量％)的磁性颗粒(Mp)的最小直径，其中最小直径是在其中颗粒尺寸最小的维度上测量的。在此种可替代的实施方案中，基本上所有的磁性颗粒(Mp)都太大而不能进入多孔颗粒的平均孔隙中。设想到孔隙尺寸可以变化并且将具有一定的大小分布，并且在此种实施方案中一些孔隙可供磁性颗粒(Mp)进入。
在又一个可替代的实施方案中，磁性颗粒(Mp)的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的所有孔隙的直径。在此种实施方案中，没有孔隙可供磁性颗粒(Mp)进入。
对于一些诊断应用，期望磁性颗粒(Mp)仅在多孔颗粒(Pp)的外表面上。
根据一个实施方案，多孔颗粒(Pp)基本上是球形的，然而也包括其他形状，并且多孔颗粒(Pp)不局限于任何特定形状。所有形状都包括在本文提供的实施方案的范围内。上述情况也适用于磁性颗粒(Mp)。
对于球形或基本上球形的颗粒，直径容易根据常规定义测定。对于完美的球形颗粒，最小直径和最大直径是相同的。然而，对于不规则形状的颗粒，即，非球形颗粒，可在许多不同的方向上从表面上的一点穿过质量中心到表面上的另一个点来测量直径。对于不规则颗粒而言，一个这样的直径将是最小的，并且一个这样的直径将是最大的。倘若球体是均匀的，那么球体的质量中心是球体的中心。对于球体，直径应当穿过球体的中心。
在一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)包括选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、右旋糖酐、丙烯酸酯以及它们的衍生物组成的组中的材料。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)具有比非磁性多孔颗粒(Pp)的密度更高的密度。
在一个实施方案中，位于多孔颗粒(Pp)的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酐、环氧基(epoxy)、S-Au，以及酰胺组成的组。
在一个实施方案中，位于多孔颗粒(Pp)的外表面和内表面上的官能团包含至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷(bisepoxirane)、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)上的官能团包含选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酐、环氧基、S-Au，以及酰胺组成的组中的至少一者。
在一个实施方案中，选自位于多孔颗粒(Pp)的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团及位于磁性颗粒(Mp)的表面上的至少一种类型的官能团的至少一者包括络合结合基团。在一个实施方案中，络合结合基团是选自由IDA(亚氨基二乙酸)及其衍生物、TED(三(羧甲基)乙二胺)及其衍生物、CM-Asp(羧基甲基化天冬氨酸)及其衍生物、NTA(次氮基三乙酸)及其衍生物、TREN(三(2–氨基乙基)胺)及其衍生物、DPA(二甲基吡啶胺)及其衍生物、C6–S凝胶(己基硫基基团)及其衍生物、EDTA(乙二胺四乙酸)及其衍生物组成的组中的至少一者。这些络合结合结构可以例如与金属离子结合，金属离子进而可与包含组氨酸的肽链相互作用。如果要纯化包含组氨酸链或标记物的抗体，则适合使用此类基团。
在一个实施方案中，选自位于多孔颗粒(Pp)的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团及位于磁性颗粒(Mp)的表面上的至少一种类型的官能团的至少一者包括疏水基团。在一个实施方案中，疏水基团是选自由CnHm(1≤n≤20 4≤m≤42)、苯酚及其衍生物、硫代苯酚及其衍生物，以及巯基吡啶及其衍生物组成的组中的至少一者。如果要在与疏水层析类似的应用中使用所述颗粒，则此类疏水基团是合适的。CnHm(1≤n≤20 4≤m≤42)是包括但不局限于烷烃CnH2n+2的许多不同有机化合物的通式。
在一个实施方案中，选自位于多孔颗粒(Pp)的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团及位于磁性颗粒(Mp)的表面上的至少一种类型的官能团的至少一者包括选自由氨乙基(aminoetyl)、二乙基氨乙基(dietylaminetyl)、季铵基乙基(quaternaryaminoetyl)、羧基甲基(carboxymetyl)、磷酸基(phosphor)和磺基丙基(sulphopropyl)以及它们的衍生物组成的组中的至少一者。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括至少一种聚合物。
在一个实施方案中，使位于磁性颗粒(Mp)的表面上的至少一种类型的官能团的剩余未反应部分发生反应，以促进分子与磁性颗粒(Mp)随后的结合。通过提供与磁性颗粒(Mp)以及多孔颗粒(Pp)的结合，没有发生反应形成连接到多孔颗粒(Pp)的共价键的官能团适宜用来增大颗粒(P)对所选物质的结合容量。在一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)上的所有官能团也没有发生反应，因此它们也可以用来增大颗粒(P)的总结合容量。
在一个实施方案中，至少25％的官能团仍未发生反应。在可替代的实施方案中，至少50％的官能团仍未发生反应。在再一个可替代的实施方案中，至少75％的官能团仍未发生反应。
在一个实施方案中，位于磁性颗粒(Mp)的表面上的官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
在一个实施方案中，在多孔颗粒(Pp)、磁性颗粒(Mp)，或二者上引入适合于分子相互作用的分子。
在一个实施方案中，适合于分子相互作用的分子是选自由：有机分子、蛋白质、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、维他命、糖缀合物、核酸、凝集素，及碳水化合物组成的组中的至少一者。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括包埋在聚合物基体中的至少一种磁性材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包括所述官能团。
根据一个实施方案，磁性颗粒(Mp)包括至少一种选自以下的磁性材料：磁性金属、磁性金属合金和磁性氧化物或它们的组合。非限制性实例包括铁、镍、钴、钆、钕和钐，以及它们的氧化物和合金。在可替代的实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括至少一种选自以下的磁性材料：铁、镍、钴以及它们的氧化物和合金。在另一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括至少一种选自以下的磁性材料：铁、镍、钴、钆、钕和钐，以及它们的氧化物和合金。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)具有比非磁性多孔颗粒(Pp)的密度更高的密度。因而，磁性颗粒(Mp)可用来增加整个颗粒(P)的密度。如果在任何工艺期间应使用重力或离心来分离颗粒(Sp)，则这可能是有用的。
在第二方面，提供了颗粒(P)，颗粒(P)包括非磁性多孔颗粒(Pp)，所述多孔颗粒(Pp)具有内表面、孔隙和由所述孔隙界定的内表面，所述多孔颗粒(Pp)包括至少一种聚合物，所述颗粒(Pp)具有至少一个共价结合至其上的磁性颗粒(Mp)，其中所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的孔隙的平均直径。
在第二方面的一个实施方案中，所有磁性颗粒(Mp)的至少95重量％的最小直径大于多孔颗粒(Pp)的所有孔隙的至少95％的最大直径。
在第二方面的一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)包括至少一种选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、右旋糖酐、丙烯酸酯以及它们的衍生物组成的组中的材料。
在一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)的直径在40-150μm范围内。在可替代的实施方案中，多孔颗粒(Pp)的直径在10-250μm范围内。对于非球形颗粒，直径定义为最大直径。在一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)的尺寸的尺寸分布很窄，使得所有颗粒的多于95重量％在直径范围内，从而使得该范围的上限和下限相差不大于10％。
在第二方面的一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)具有比非磁性多孔颗粒(Pp)的密度更高的密度。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括选自铁氧化物和钴的至少一者。在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包含FeCo合金。
在第二方面的一个实施方案中，选自由多孔颗粒(Pp)和至少一种磁性颗粒(Mp)组成的组中的至少一者包含适合于分子相互作用的分子。
在第二方面的一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括包埋在聚合物基体中的至少一种材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包括所述官能团。
在第二方面的一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括至少一种聚合物。
磁性颗粒(Mp)上和非磁性多孔颗粒(Pp)上的化学基团是相适应的，使得磁性颗粒(Mp)上的化学基团与非磁性多孔颗粒(Pp)上的化学基团之间可以发生反应。因而，可以使适合于与另一种官能团反应的一种官能团附接至非磁性多孔颗粒(Pp)，并且可使合适的相应官能团附接至磁性颗粒(Mp)。一种官能团可以附接至非磁性多孔颗粒(Pp)或者附接至磁性颗粒(Mp)，只要另一种颗粒上存在可与它反应的合适官能团即可。在一个实施方案中，使不同的数种化学基团附接至非磁性多孔颗粒(Pp)，并且使具有相应不同类型的合适官能团的不同类型的磁性颗粒附接至多孔颗粒(Pp)上的不同官能团。
一种使分子附接在颗粒(P)上的方式是US 5,942,463中描述的方法。
在第一方面的一个实施方案中，在选自由多孔颗粒(Pp)和磁性颗粒(Mp)组成的组中的至少一者上引入适合于分子相互作用的分子。在第一方面的一个实施方案中，适合于分子相互作用的分子是选自由有机分子、蛋白质、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、维他命、糖缀合物、核酸、凝集素，及碳水化合物组成的组中的至少一者。
在第一方面的一个实施方案中，在选自由多孔颗粒(Pp)和磁性颗粒(Mp)组成的组中的至少一者上引入适合于检测的分子。在第一方面的一个实施方案中，适合于检测的分子是选自由有机分子、蛋白质、核酸和凝集素组成的组中的至少一者。
在第一方面的一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括包埋在聚合物基体中的至少一种磁性材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包含所述官能团。
在第二方面的一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)包括选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯，以及它们的衍生物组成的组中的至少一者。
磁性颗粒(Mp)包括至少一种磁性材料，例如但不限于磁性金属、磁性金属合金，及磁性氧化物或它们的组合
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)具有比非磁性多孔颗粒(Pp)的密度更高的密度。根据ISO 1183-1:2012测量密度。
在一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)和至少一种磁性颗粒(Mp)中的至少一者包括适合于分子相互作用的分子。适合于相互作用的分子是具有通过包括但不限于与另一种分子形成键的方式与另一种分子发生相互作用的能力的分子。
在一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)和/或至少一种磁性颗粒(Mp)中的至少一者包括适合于检测的分子。
在一个实施方案中，适合于检测的分子是选自由有机分子、核酸、抗原、酶、酶抑制剂、辅因子、荷尔蒙、毒素、糖缀合物、凝集素，及碳水化合物组成的组中的至少一者。适合于检测的分子是可通过任何方式检测的分子。实例包括发出具有至少一种特定波长的光的分子。
在一个实施方案中，磁性颗粒(Mp)包括包埋在聚合物基体中的至少一种材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包括所述官能团。磁性颗粒(Mp)中的材料的实例包括但不限于磁性金属、磁性金属合金，及磁性氧化物，诸如铁、钴及它们的氧化物。
在一个实施方案中，多孔颗粒(Pp)比磁性颗粒(Mp)大得多，在一个实施方案中，就尺寸而言，多孔颗粒(Pp)比磁性颗粒(Mp)大至少5倍，优选至少10倍。对于非球体颗粒，使用最小直径。
根据一个实施方案，颗粒(P)是层析分离介质。在用于层析的柱子中，层析介质包括大量颗粒(P)并且可用作常规层析介质。
本文还提供了用于执行测定的方法，所述测定包括使用如第二方面中描述的颗粒(P)，所述方法包括以下步骤：a)使颗粒(P)与至少一种待分析的被分析物接触，b)使颗粒(P)暴露于选自由i)磁场、ii)重力和iii)离心组成的组中的至少一者中，以及c)读出来自颗粒(P)的可检测信号。
分离可通过磁场或通过利用密度差来进行。在一个实施方案中，磁性颗粒具有磁性并且具有高密度，使得可以使用基于磁场的分离和/或基于密度差的分离。基于密度的分离包括离心和/或暴露于重力中。暴露于重力中只是让样本静置以便密度较大的颗粒沉降。
实施例
实施例1.环氧化物活化的琼脂糖颗粒的制备
按照如下方式用环氧化物基团分别活化琼脂糖6B、琼脂糖CL 6B、琼脂糖4B和琼脂糖CL 4B。在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤琼脂糖凝胶，并将其抽干。将大约3g干琼脂糖凝胶颗粒悬浮在2.4ml 1M氢氧化钠溶液中，并于室温在搅拌下逐滴加入0.45ml表氯醇。将温度升高至60℃并维持2小时。在烧结过滤漏斗(Por 3)上用蒸馏水将环氧化物活化的琼脂糖凝胶洗涤至中性，最终按50％凝胶浓度将其再悬浮在蒸馏水中。该产品构成多孔颗粒(Pp)的实例。平均表观孔隙半径为大约24-45nm。
实施例2.磁性颗粒在环氧化物活化的琼脂糖颗粒的外面部分(outer part)上的 共价固定化
在这些调查中使用尺寸为30nm至10μm的具有氨基(NH2)官能度的市售磁性纳米颗粒和微颗粒作为磁性材料。这些颗粒是磁性颗粒(Mp)的实例。
通常按如下方式使磁性颗粒(Mp)共价附接至多孔环氧化物活化的琼脂糖颗粒(Pp)。将来自Micromod Partikelteknologie GmbH的巯基化-M-NH2(250μL，7×108个颗粒/ml)用1000μL PBS(15mM磷酸盐、150mM NaCl、pH7.4)洗涤两次，并再悬浮在1000μL PBS中。将环氧化物活化的琼脂糖颗粒，即1ml沉降的凝胶，再悬浮在10ml 0.01MNaOH溶液中，添加到所述磁性颗粒悬浮液中，并于室温在涡旋振荡下反应12小时。
在烧结过滤漏斗中用50ml 10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)除去过量的具有氨基官能度的磁性颗粒，从而产生具有经磁性颗粒修饰的琼脂糖颗粒的溶液，图3和图4示出经磁性颗粒修饰的琼脂糖6B颗粒。这将构成颗粒(P)。
实施例3.磁性颗粒(P)的磁性分离
将悬浮在1000μl PBS中的大约50μl沉降的磁性颗粒(P)移入2ml小瓶中。涡旋振荡小瓶并将其暴露于永久性立方体磁体中5秒。在1秒钟内，磁性琼脂糖6B、CL 6B、4B和CL 4B颗粒完全粘附至靠近永久性立方体磁体的小瓶壁。针对磁性琼脂糖4B颗粒的磁性分离在图5中示出。
实施例4.巯基化蛋白A在磁性琼脂糖颗粒上的固定化
吸取大约60μl沉降的磁性琼脂糖6B、CL 6B、4B和CL 4B颗粒到1.5ml Eppendorf管中。用永久性磁体使磁性琼脂糖颗粒粘附至Eppendorf管壁上，除去溶液并且将颗粒再悬浮在1ml巯基化蛋白A溶液(1mg/ml，在15mM磷酸盐缓冲液中，pH8)中。在于室温和缓慢混合下反应1小时后，通过用永久性磁体将颗粒从溶液中分离出来来收集上清液。上清液中蛋白A的含量利用Uv/Vis光谱法通过测量280nm处的吸光度(A280nm)来评价，见表1中在存在磁性琼脂糖4B颗粒情况下的反应。
表1.通过测量上清液在280nm处的吸光度评价在磁性琼脂糖4B颗粒上的蛋白A的 配体浓度。
通过将上清液(0.6mg/ml)中的蛋白A含量从所添加的蛋白A溶液(1mg/ml)中的蛋白A含量中扣除来确定60μl磁性琼脂糖4B颗粒上的蛋白A含量。确定蛋白A的配体浓度为大约6.5mg/ml沉降的磁性琼脂糖4B颗粒。
实施例5.利用蛋白A磁性琼脂糖颗粒捕获人IgG
将在0.5ml PBS中的大约50μl沉降的蛋白A磁性琼脂糖6B、CL 6B、4B和CL 4B颗粒移入2ml小瓶中，并用1.0ml PBS利用磁体进一步洗涤2次，从而除去任何未结合蛋白A和储存液。将蛋白A磁性琼脂糖颗粒再悬浮在1.0ml人IgG溶液(2mg/ml)中并且于室温和颠倒混合(end-over-end mixing)下反应60分钟。然后通过用永久性磁体从溶液中分离出颗粒来收集上清液，并且储存用于利用280nm处的Uv/Vis光谱进行IgG定量(IgG结合容量)。然后用1.0ml PBS洗涤磁性琼脂糖颗粒两次以便除去未结合蛋白和杂质。然后通过加入500μl柠檬酸盐溶液(60mM,pH3.0)将蛋白A捕获的人IgG从磁性琼脂糖颗粒上洗脱出来。在室温下涡旋振荡15分钟后，收集洗脱级分，用500μl PBS稀释并且储存用于利用280nm处的Uv/Vis光谱进行IgG定量(回收率)，参见表2。人IgG在280nm处的吸光度被设定为在1.0mg/ml下为1.38。
表2.蛋白A磁性琼脂糖颗粒的IgG结合容量和回收率。
确定每毫升磁性颗粒与人IgG结合的容量大约为：
·18mg/ml沉降的蛋白A磁性琼脂糖6B颗粒
·16mg/ml沉降的蛋白A磁性琼脂糖CL 6B颗粒
·34mg/ml沉降的蛋白A磁性琼脂糖4B颗粒
·30mg/ml沉降的蛋白A磁性琼脂糖CL 4B颗粒
就作者的知识所及，蛋白A磁性琼脂糖4B和CL 4B的IgG结合容量是任何种类的磁性颗粒可获得的IgG结合容量中最高的。
实施例6.利用蛋白A磁性琼脂糖颗粒从人血清中初步纯化IgG
与常规固体磁性颗粒蛋白A相比较，利用蛋白A磁性琼脂糖6B和4B颗粒对人血清中的IgG进行纯化。如下面描述的那样平行测试500μl 10％蛋白A磁性琼脂糖6B和4B颗粒溶液(50μl颗粒)及500μl蛋白A溶液。将500μl蛋白A磁性颗粒加入到1.5ml微型离心管中。借助于磁性分离除去储存液。用1ml PBS洗涤磁性颗粒。通过磁性分离除去悬浮液。将磁性颗粒再悬浮在500μl PBS中。
将350μl人血清加入到含有500μl磁性颗粒悬浮液的微型离心管中，并将混合物在室温下缓慢混合60分钟以便让蛋白A磁性颗粒捕获IgG。
利用磁性分离用1ml PBS洗涤所述颗粒三次以便除去未结合的蛋白和杂质。
利用磁性分离将PBS悬浮液从颗粒上移出。将500μl洗脱缓冲液(60mM柠檬酸盐，pH3.0)加入到所述颗粒中，并将混合物在室温下混合15分钟以便让IgG从蛋白A磁性颗粒中洗脱出来。通过磁性分离收集洗脱级分，并用70μl pH9.0的1M Tris-HCl进行中和。用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)还原条件解析洗脱物，参见图6。
结果表明，就抗体产率均值而言，蛋白A磁性琼脂糖颗粒(图6中的泳道3-7)比它的对应物(图6中的泳道8)表现得好得多。所有级分与98％纯人IgG(图6中的泳道9-10)相比较都表现出高特异性纯化，其中蛋白A磁性琼脂糖4B(图6中的泳道3-5)比蛋白A磁性琼脂糖6B颗粒(泳道6-7)显示出更高的产率，这与先前获得的有关IgG结合容量的结果相一致。使用蛋白A磁性琼脂糖4B颗粒在每种洗脱级分中对大约2mg人IgG进行定量。

Claims (15)

1.一种生产颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供
-非磁性多孔颗粒，所述多孔颗粒具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的连接的内表面，所述多孔颗粒包括至少一种聚合物，所述多孔颗粒包括位于所述外表面和内表面上的至少一种类型的官能团，以及
-磁性颗粒，所述磁性颗粒包括位于其表面上的至少一种类型的官能团，其中所有磁性颗粒的至少95重量％的最小直径大于所述多孔颗粒的孔隙的平均直径，并且其中所述磁性颗粒的一部分具有使得其进入所述多孔颗粒中的直径，以及
b.使位于所述非磁性多孔颗粒的表面上的部分官能团与位于所述磁性颗粒的表面上的部分官能团反应从而形成共价键，
从而获得补充有共价结合至选自所述多孔颗粒的内表面和外表面中的至少一者上的磁性颗粒的颗粒，
其中位于所述磁性颗粒的表面上的至少一种类型的部分官能团没有与位于所述多孔颗粒的外表面和内表面上的至少一种类型的部分官能团反应形成共价键，使得至少一种类型的部分官能团中的一部分在选自所述磁性颗粒和所述多孔颗粒中的至少一者上仍然可利用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔颗粒包括至少一种选自由琼脂糖、二氧化硅、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯、右旋糖酐、丙烯酸酯以及它们的衍生物组成的组中的材料。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒具有比所述非磁性多孔颗粒的密度更高的密度。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中位于所述多孔颗粒的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团是选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酸酐基团、环氧基、S-Au以及酰胺组成的组中的至少一者。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中位于所述多孔颗粒的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒上的至少一种类型的官能团包括选自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酸酐基团、环氧基、S-Au以及酰胺组成的组中的至少一者。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒包含至少一种聚合物。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中位于所述磁性颗粒的表面上的至少一种类型的官能团包括至少一种由于与至少一种选自由以下化合物组成的组中的化合物反应而产生的基团：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸盐、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸盐、重氮化合物、异脲盐、碳化二亚胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、双环氧乙烷、羰基二咪唑、N-羟基琥珀酰亚胺、硅烷以及它们的衍生物。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在选自由所述多孔颗粒和所述磁性颗粒组成的组中的至少一者上引入适合于分子相互作用的分子。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒包括包埋在聚合物基体中的至少一种磁性材料的颗粒，并且其中所述聚合物基体包括至少一种类型的官能团。
11.根据权利要求9所述的方法，其中使位于所述磁性颗粒的表面上的至少一种类型的官能团的剩余未反应部分发生促进分子与所述磁性颗粒随后的结合的反应。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中选自以下a)和b)中的至少一者：
a)位于所述多孔颗粒的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团，以及
b)位于所述磁性颗粒上的至少一种类型的官能团
包括至少一种选自由IDA(亚氨基二乙酸)及其衍生物、TED(三(羧甲基)乙二胺)及其衍生物、CM-Asp(羧基甲基化天冬氨酸)及其衍生物、NTA(次氮基三乙酸)及其衍生物、TREN(三(2–氨基乙基)胺)及其衍生物、DPA(二甲基吡啶胺)及其衍生物、C6–S凝胶及其衍生物、EDTA(乙二胺四乙酸)及其衍生物组成的组中的基团。
13.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中选自以下a)和b)中的至少一者：
a)位于所述多孔颗粒的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团，以及
b)位于所述磁性颗粒上的至少一种类型的官能团
包括至少一种选自由CnHm其中1≤n≤20 4≤m≤42、苯酚及其衍生物、硫代苯酚及其衍生物、以及巯基吡啶及其衍生物组成的组中的基团。
14.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中选自以下a)和b)中的至少一者：
a)位于所述多孔颗粒的外表面和内表面上的至少一种类型的官能团，以及
b)位于所述磁性颗粒上的至少一种类型的官能团
包括至少一种选自由氨乙基、二乙基氨乙基、季铵基乙基、羧基甲基和磺基丙基以及它们的衍生物组成的组中的基团。
15.一种颗粒，所述颗粒包括非磁性多孔颗粒，所述多孔颗粒具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的内表面，所述多孔颗粒包括至少一种聚合物，所述颗粒具有至少一个共价结合至其上的磁性颗粒，其中所有磁性颗粒的至少95重量％的最小直径大于所述多孔颗粒的所述孔隙的平均直径，并且其中所述磁性颗粒的一部分具有使得其进入所述多孔颗粒中的直径，其中所述磁性颗粒包括位于其表面上的至少一种类型的官能团，其中至少一种类型的官能团的一部分在所述磁性颗粒和所述多孔颗粒之间形成共价键，并且其中所述至少一种类型的官能团的剩余部分在选自所述磁性颗粒和所述多孔颗粒中的至少一者上仍然可利用。
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