CN111226116B - 组合式分离 - Google Patents

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Abstract

公开一种组合式分离系统，其包括：第一隔室，其适于与具有对分子具有亲和力的磁珠一起处理混合物，该系统包括磁体以吸引磁珠；第二隔室，其适于容纳与液体流一起转移到其中的所述磁珠，并且所述至少一个第二隔室适于洗脱要从所述磁珠分离的所述至少一种类型的分子，所述至少一个第二隔室具有出口，所述出口包括用于将所述磁珠保留在所述至少一个第二隔室中的装置。优点包括该方法变得更简单快捷并且因此更便宜，因为与现有技术相比，该方法能够以更少的步骤去除细胞和颗粒、分离分子并进行病毒灭活。此外，该方法能够提供更浓缩的终产物。

Description

组合式分离
技术领域
本发明涉及分离在包含几种不同物质的混合物中的分子。例如，当在包含许多不同的溶解分子和包括细胞在内的分散固体颗粒的复杂混合物中分离生物分子时，可以使用本发明。
背景技术
50多年来，色谱法一直是分子分离的主要原理之一，并且已在该领域发表了大量文献。
几个重要的应用领域之一是生物分子的分离，从经济的角度来看，生物分子分离现在是工业上分子分离的最重要领域之一。
Porath和Flodin凝胶过滤的引入是生命科学领域内全球研究实验室的一场革命的起点。后来，还有其他几个重要的发明，诸如亲和色谱法和离子交换色谱法，使得在医学、生物学和药学领域取得重要发现成为可能。
尽管色谱法对生命科学和生物技术行业的整个领域都产生巨大的影响，但该技术仍存在一些有待改进的瓶颈和薄弱点。
一个问题是，在许多情况下，特别是在工业过程中，需要对样品进行净化，否则，堵塞的风险将立即成为问题，并且背压将增加，过程直接失败。为避免该问题，所有样品在加到色谱柱上之前都需要进行处理，并且这涉及例如作为繁琐过程的过滤，并且涉及针对净化的昂贵步骤。
另一个问题是色谱柱中的流速，尤其是在大样品体积的情况下工作时，并且这即使对于几升样品也是问题所在。生物制药行业中的例如单克隆抗体的工业生产必须处理数千升的样品体积，在此情况下该问题是严重的。
为避免色谱柱出现问题，一种在捕获步骤期间基于批处理性能的方法可以解决这些问题中的一些，并能够有效捕获溶液中的生物分子，并且能够进行有效的洗涤过程以从溶液中消除不需要的分子、碎片以及甚至细胞，分批磁分离可以作为传统色谱法的替代方案。
分批磁分离的一个问题是在亲和色谱过程中磁珠结合生物分子的能力低。瑞典公司(Lab-on-a-Bead AB)已经解决这个问题，该公司现在生产的磁珠的能力与相应的色谱介质相似甚至更高。参见例如EP 2 598 884、EP 2 227 322、EP 3 043 904、US 9,389,226、US8,679,807和US 9,777,075。
现有技术的问题在于捕获磁珠的隔室的总容积很大，因此用于洗脱生物分子的容积将太大，结果将是所需的生物分子将以其最终形式被稀释得太低。
根据现有技术，当要分离并回收来自细胞培养物的生物分子时，这可通过过滤、在包含分离介质的色谱柱上分离以及随后的病毒灭活来完成，可选地包括在色谱柱分离之前分离呈较小部分形式的批料。
WO 2015/034428公开用于分子的大规模分离的方法，该方法包括将磁性颗粒与包含待分离分子的溶液混合，收集磁性颗粒分子以及从磁性颗粒中分离分子。
WO 2009/111316公开一种利用磁性颗粒从液体中分离分子的系统。分子在较小容积的单独部分中洗脱。
US 2009/0206039公开一种具有第一容器、第二容器和连接表面的从液体中分离磁性颗粒的设备。磁性颗粒通过连接表面从第一容器吸取，然后直至第二容器。
然而，尽管目前存在现有方法，但是需要一种更快、更简单并因此更便宜的系统和方法。需要一种系统和方法，其能够从混合物中分离分子，包括去除颗粒和/或细胞以及病毒灭活，并在足够浓缩以备将来使用的溶液中提供所需的分子。
发明内容
本发明的目的是减轻现有技术中的至少一些问题，并提供一种用于分子分离的改进的系统及其方法。
本发明人进行广泛的研究，发现一种系统和方法，其能够分离分子、去除细胞和颗粒、进行病毒灭活并且还提供浓缩的终产物。
在第一方面中，提供一种用于分离混合物中的分子的系统，所述系统包括：适于容纳所述混合物的至少一个第一隔室，并且所述第一隔室适于与对至少一种类型的待分离分子具有亲和力的磁珠一起处理所述混合物，所述系统包括至少一个磁体，所述磁体适于至少在所述混合物与所述磁珠接触之后吸引所述磁珠，所述至少一个磁体适于在所述第一隔室的至少一部分中施加磁场，其中，所述系统包括至少一个第二隔室，所述至少一个第二隔室适于在所述磁珠已经被所述至少一个磁体至少部分地收集之后容纳所述磁珠，所述至少一个第二隔室具有适于容纳所述磁珠的体积的容积，所述系统适于借助液体流将所述磁珠从所述至少一个第一隔室转移至所述至少一个第二隔室，所述至少一个第二隔室适于洗脱要与所述磁珠分离的所述至少一种类型的分子，所述至少一个第二隔室具有出口，该出口包括用于将所述磁珠保留在至少一个第二隔室中的装置。
在第二方面，提供一种用于分离混合物中分子的方法，所述方法包括以下步骤：
使混合物与磁珠接触，所述磁珠对至少一种类型的待分离分子具有亲和力，使得至少一种类型的待分离分子的至少一部分结合到该磁珠上，
在第一隔室中：用磁场吸引磁珠，并丢弃至少一部分剩余混合物，
可选地在将至少一种类型的待分离分子结合至磁珠的条件下洗涤磁珠，
用液体将磁珠转移到第二隔室中，所述至少一个第二隔室具有适于容纳所述磁珠的体积的容积，
在第二隔室中，通过在一定条件下将液体添加到磁珠进行洗脱，以使至少一种类型的待分离分子不与磁珠结合，以洗脱至少一种类型的待分离分子并收集洗脱液。
在所附权利要求中描述其他方面和实施例。
本发明的优点包括该方法变得更简单快捷并且因此更便宜，因为与现有技术相比，该方法能够以更少的步骤去除细胞和颗粒、分离分子并进行病毒灭活。此外，该方法能够提供更浓缩的终产物。
附图说明
参考以下附图描述本发明，其中：
图1示出根据现有技术的系统。1.混合器，其用于在细胞培养物与磁珠进入第一隔室之前将细胞培养物与磁珠混合。2.第一隔室，也称为磁性过滤器。3.用过的磁性颗粒的储罐。4.在混合物上施加低剪切力的循环泵。
图2示出根据本发明的系统。1.混合器，其用于在进入第一隔室之前将细胞培养物与磁珠混合。2.第一隔室，也称为磁性过滤器。4.在混合物上施加低剪切力的循环泵。5.也称为浓缩器/堆积设备的第二隔室。6.用于磁珠的分离网/筛网，其可防止磁珠离开第二隔室。
图3示出根据本发明的第二隔室(浓缩器/堆积设备)的另一示例。设备适于附接至烧瓶。该设备配备有止回阀。
图4示出如示例中详述的通过在280nm处的吸光度测量的洗脱曲线。
图5示出根据示例的mAb对LOABeads MabBind A磁珠的吸附曲线。
图6示出样品的结果，该样品在T0、15、30、60和120分钟采集，并通过对纯化mAb的Protein A HPLC.SEC-HPLC色谱图分析该样品的mAb的残留含量。色谱柱：TSK 3000 SWXL。注入量，20μl。流动相：10mM NaH2PO4 pH 7。流速为0.3ml/min。在280nm处的紫外线检测。
图7示出未纯化和纯化的mAb的SDS-PAGE(还原)凝胶。对于SDS-PAGE分析，将蛋白质样品设置为包括1x Laemmli样品缓冲液(BioRad)和100mM DTT。将样品加热至95℃，持续5分钟，冷却至室温，随后在4-20％的Mini-PROTEAN TGX凝胶(BioRad)上分离蛋白质。使用QC胶体考马斯染色(BioRad)可视化分离的蛋白质。其中，M道，大小标记；道1，8μl输入样品；道2，8μl未结合部份；以及道3，2μg洗脱的IgG抗体材料。
图8示出使用组合式磁分离和过滤用磁珠纯化IgG抗体的洗脱曲线。
具体实施方式
应理解，在公开和详细描述本发明之前，本发明不限于本文公开的特定化合物、构型、方法步骤、底质和材料，因为这样的化合物、构型、方法步骤、底质和材料可以有所不同。还应理解，本文所采用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在具有限制性，因为本发明的范围仅由所附权利要求及其等同物限制。
必须指出，如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。
如果没有其他定义，则本文使用的任何术语和科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。
在整个说明书和权利要求书中，与数值结合使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉并可接受的精度间隔。所述间隔为数值的±10％。
除非另有明确说明，所有百分比均以重量计。
在第一方面中，提供一种用于分离混合物中的分子的系统，所述系统包括：适于容纳所述混合物的至少一个第一隔室，并且所述第一隔室适于与对至少一种类型的待分离分子具有亲和力的磁珠一起处理所述混合物，所述系统包括至少一个磁体，所述磁体适于至少在所述混合物与所述磁珠接触之后吸引所述磁珠，所述至少一个磁体适于在所述第一隔室的至少一部分中施加磁场，其中，所述系统包括至少一个第二隔室，所述至少一个第二隔室适于在所述磁珠已经被所述至少一个磁体至少部分地收集之后容纳所述磁珠，所述至少一个第二隔室具有适于容纳所述磁珠的体积的容积，所述系统适于借助液体流将所述磁珠从所述至少一个第一隔室转移至所述至少一个第二隔室，所述至少一个第二隔室适于洗脱要与所述磁珠分离的所述至少一种类型的分子，所述至少一个第二隔室具有出口，该出口包括用于将所述磁珠保留在至少一个第二隔室中的装置。
系统中的第一隔室通过具有可在其中添加混合物的入口而适于容纳混合物。适当地，当添加混合物时，还有一种使第一隔室中的空气或气体逸出的方法。
混合物为通常包含溶解的物质和可选地分散的物质的液体混合物。
磁珠被认为是用于分子分离的系统的一部分。然而，在所有实施例中，磁珠并非始终在系统内部，在一些实施例中，在操作期间，磁珠的至少一部分可以在系统外部至少一段时间。磁珠的体积适于装到第二隔室中。可以在混合物进入第一隔室之前或在第一隔室中或在进入第一隔室之前和在第一隔室中的组合中将磁珠添加到混合物中。第一隔室适于与磁珠一起处理混合物。在一个实施例中，具有适于使混合物和磁珠在第一隔室中循环的泵。在另一个实施例中，在第一隔室中有搅拌器，使得混合物和磁珠在第一隔室中四处移动。在一个实施例中，轨道振动器用于混合和移动流体和磁珠。
磁珠是为要从混合物中分离出来的分子量身定制的。可以从混合物中分离出一种或几种不同的分子。液体可接近的磁珠的部分涂有对一种或多种待分离分子具有亲和力的分子。此亲和力因分子而异。根据此描述，技术人员可以找到用于将分子结合至磁珠的合适系统。示例包括但不限于抗体，在此情况下合适的抗原附着于磁珠。
磁珠优选具有相当高的磁矩，使得可以通过施加磁场来容易地处理它们。
系统包括第二隔室，磁珠在经收集并与混合物分离之后转移到第二隔室中。合适但并非总是必须的，在转移到第二隔室之前对磁珠进行洗涤。在第二隔室中，将液体添加到磁珠，从而使分子与磁珠分离并保留在液体中。此过程称为洗脱。洗脱所需分子的条件适于待分离的分子与磁珠之间的亲和力。在抗体的示例中，它可以是较低的pH。其他示例包括但不限于pH，离子强度，温度，添加其他物质等。
将磁珠转移到第二隔室进行洗脱的优点在于分子变得更加浓缩。第二隔室的容积通常小于第一隔室。磁珠应装到第二隔室中，留有一定余量以容纳其他液体。至少一个第二隔室具有适于容纳所述磁珠的体积的容积。第二隔室的容积应略大于磁珠的体积，以使磁珠可装入第二隔室中，并使得可以添加用于洗脱相关分子的液体。然而，第二隔室的容积不应太大，因为这样待洗脱的分子将变得太稀释。在一个实施例中，至少一个第二隔室的容积小于打算在系统中使用的磁珠的体积的三倍，以允许用于液体的足够余量。在一个实施例中，至少一个第二隔室的容积小于打算在系统中使用的磁珠的体积的两倍，以允许用于液体的余量。在另一实施例中，至少一个第二隔室的容积不大于磁珠体积的150％。在又一实施例中，至少一个第二隔室的容积不大于磁珠体积的120％。在又一实施例中，至少一个第二隔室的容积不大于磁珠体积的110％。通过将磁珠倒入测量体积中并让任何液体通过重力滴落直到不再有液体从磁珠中流出来测量磁珠的体积。在一个实施例中，至少一个第二隔室的容积为至少一个第一隔室的容积的5％。在一个实施例中，至少一个第二隔室的容积为至少一个第一隔室的容积的10％。在一个实施例中，至少一个第二隔室的容积为至少一个第一隔室的容积的20％。
在一个实施例中，洗脱缓冲液的量适于磁性颗粒的体积。为了获得良好的分子浓度，洗脱缓冲液的体积相对于磁珠的体积不应太大。在一个实施例中，洗脱缓冲液的体积小于磁珠体积的四倍。在另一实施例中，洗脱缓冲液的体积小于磁珠体积的三倍。在又一实施例中，洗脱缓冲液的体积小于磁珠体积的两倍。在一个实施例中，在步骤e)中添加用于洗脱的液体的体积小于第二隔室中的磁珠的体积的四倍。
在一个实施例中，系统包括用于在洗脱开始之前从第二隔室中的磁珠去除液体的装置。此装置通常为用于施加抽吸和空气或气体入口的装置。因此，可以进一步提高终产物的浓度。
通过具有用于洗脱液的入口和用于洗脱液的出口，第二隔室适于洗脱待分离分子。还应该有将磁性颗粒保留在第二隔室中的装置，例如网、过滤器或类似物。
在一个实施例中，所述至少一个磁体为选自由永磁体和电磁体组成的组中的至少一种。
在一个实施例中，所述至少一个磁体被成形为至少一个可伸缩杆，所述至少一个可伸缩杆定位在第一隔室处，使得其可以插入第一隔室中或从第一隔室中缩回。
在一个实施例中，所述至少一个磁体可以被插入第一隔室中的至少一个护套内部和从其缩回。由此，至少一个护套永久地在至少一个第一隔室内，而一个或多个磁体被插入一个或多个护套内部和从其缩回以控制磁场。
系统适于利用液体流将所述磁珠从所述至少一个第一隔室转移到所述至少一个第二隔室。旨在存在液体流，其将磁性颗粒从第一隔室带到第二隔室。当已经使用磁体将磁性颗粒收集在第一隔室中时，使用液体流将磁性颗粒输送到第二隔室。当液体流将磁性颗粒输送到第二隔室时，可以通过卸下或缩回永磁体或关闭电磁体来减小磁力。在一个实施例中，第二隔室位于第一隔室的下方，以便于将磁性颗粒向下冲洗至第二隔室。在一个实施例中，第二隔室具有排出口，使得磁性颗粒留下，但是用于输送的液体从第二隔室流走。
在一个实施例中，第一隔室包括至少一个喷嘴，该喷嘴适于将液体至少部分地朝向磁珠在被所述至少一个磁体吸引之后聚集的位置引导。可以设想，磁性颗粒通过磁力收集，而剩余的液体通过出口从第一隔室中去除。当要进一步转移磁性颗粒时，利用液体流将颗粒带到所需位置。例如，液体优选地被泵送至磁场其中已经收集磁珠的一个或多个位置。如果可以控制磁场，则在将磁珠从磁场中移走并转移出去时，最好减弱或关闭磁场。
在第一隔室内有至少一个护套或杆的一个实施例中，一个喷嘴将液体至少部分地朝向所述至少一个护套的外部引导。如果有多个护套，则将液体喷洒到护套或杆上，使得磁性颗粒被转移走并跟随液体的流动。朝着颗粒喷洒的液体产生借助流体带走颗粒的液体流。
用于从第一隔室中去除磁珠的液体应使得待分离的分子仍与磁珠结合。根据本发明，洗脱应在第二隔室中进行。
在一个实施例中，第二隔室位于第一隔室的下方，使得磁珠可以从第一隔室向下冲洗到第二隔室。
在一个实施例中，系统包括在泵送的液体上施加低剪切力的一个或多个泵。在一个实施例中，系统包括一个或多个蠕动泵。由于系统在许多情况下应该能够处理细胞，因此整个系统的设计应使细胞不会因剪切力而破裂。此适应性可以很容易地通过使用施加低剪切力的泵并通过使用适当的液体压力和流速来实现。在一个实施例中，系统适于处理细胞。
在一个实施例中，系统连接到过程计算机系统。因此，该过程可以全部或至少部分地自动化。
在一个实施例中，模拟和数字传感器中的至少一个连接到过程计算机系统。传感器将有助于确定应如何操作系统。
在一个实施例中，所述系统包括至少一个液位传感器。液位传感器对于本领域技术人员而言是已知的，将有助于确定分离过程的状态。在一个实施例中，UV检测器在所述至少一个第二隔室的出口处。在一个实施例中，能够测量流体的光密度的检测器在所述至少一个第一隔室中。在一个实施例中，所述检测器使用波长间隔在400-600nm的光来测量光密度。
在一个实施例中，计算机系统连接到用户使用系统的权利。例如，在一个实施例中，计算机系统远程连接到服务器，其中服务器确定用户是否可以使用系统。可以根据来自用户的付款来确定系统的允许使用。
在一个实施例中，从网和过滤器组成的组中选择的至少一个被定位在第二隔室的出口处，并且网和过滤器中的一个具有通孔的大小，使得它具有将磁珠保留在第二隔室中的能力。系统的第二隔室具有出口，该出口包括用于将所述磁珠保留在至少一个第二隔室中的装置。保留磁珠的此装置适当地为某种具有适当尺寸的网或过滤器，其尺寸适于使得磁珠不通过网状物或过滤器，但是使得液体可以通过。
在一个实施例中，无菌过滤器在第二隔室的出口处。在低pH下适当地进行无菌过滤以及病毒灭活将为获得准备用于进一步用途的无菌终产物提供快速而有吸引力的方法。
在一个实施例中，当不使用系统时，第二隔室为用于磁珠的储存器。在洗脱待分离的分子之后，可以在第二隔室中洗涤磁珠，并且可以添加抑菌剂。然后，磁珠可以存储在第二隔室中，直到下次使用。通常，磁珠可以多次使用，尽管可以仅使用一次磁珠，然后丢弃它们。
在一个实施例中，第二隔室为可拆卸且可密封的。由此，第二隔室可以被移除并存储在其他地方。当下一次运行时，这有助于在过程中添加磁珠。
在一个实施例中，至少一个第一隔室为烧瓶，并且其中，至少一个第二隔室为附接在所述烧瓶上并与所述烧瓶流体连通的容器，其中，所述系统适于在磁性颗粒被转移到第二隔室时倒置，并且其中，第二隔室包括位于第二隔室的出口处的选自网和过滤器中的至少一个，并且网和过滤器中的至少一个具有通孔的大小，使得其具有将磁珠保留在第二隔室中的能力。
这是适用于小规模分离的系统的简单小规模版本。在一个实施例中，使用具有标准螺帽的标准实验室烧瓶。然后将包括入口和出口的第二隔室以及网或过滤器拧到烧瓶上，然后将磁性颗粒转移到第二隔室中。通过使用烧瓶外部的磁体将磁珠收集在第一隔室中。在一个实施例中，系统安装在保持器中，该保持器可以从第一隔室向下的第一位置旋转到第二隔室向下的第二位置。在一个实施例中，系统包括具有止回阀的入口。在一个实施例中，止回阀具有排气过滤器，以防止污染系统内容物。排气过滤器可防止周围的污染物进入系统中。
在一个实施例中，系统旨在一次性使用，在使用后将被丢弃。通常对于小型系统可以设想到这一点。
在一个实施例中，旨在与混合物接触的系统的部分旨在一次性使用，在使用后被丢弃，并且系统的其他部分旨在多次使用。旨在与混合物接触的部分的示例包括但不限于第一隔室和第二隔室的内部以及管。
在一个实施例中，系统是可洗涤的。在一个实施例中，系统是可高压灭菌的。在一个实施例中，系统符合制药工程标准。在实践中，这意味着系统由例如药用级抛光不锈钢或其他药用级材料制成。存在涵盖过程控制、设计和性能，以及制药业的质量验收/保证测试的几种不同的标准。一个示例为ASTM E2500-13“药品和生物制药制造系统和设备的规格、设计和验证的标准指南(Standard Guide for Specification,Design,and Verificationof Pharmaceutical and Biopharmaceutical Manufacturing Systems andEquipment)”。
在一个实施例中，系统包括串联的至少两个第一隔室。在一个替代实施例中，系统包括至少两个并联的第一隔室。因此，可以有多个第一隔室，并且它们可以串联或并联或以其任何组合连接。因此，待净化的混合物被泵送通过第一隔室。例如，连接作为第一隔室的几个较小单元可能更具可扩展性。
在一个实施例中，系统包括并联的至少两个第二隔室。因此，可以有多个并联的第二隔室。
在一个实施例中，系统包括至少一个磁体，该磁体适于通过在所述第二隔室的至少一部分中施加磁场来吸引所述磁珠。这样的一个或多个磁体可以为电磁体和/或永磁体。在第二隔室中的这种磁体可以在洗脱之前促进磁珠在第二隔室中的集中和堆积。因此，当使用时，磁珠被第二隔室中的至少一个磁体吸引。首先将磁珠与磁体一起收集在第一隔室中，然后借助流动的液体将其移至第二隔室。在此实施例中，磁珠被第二隔室中的磁场吸引。
在第二方面中，提供一种用于分离混合物中分子的方法，所述方法包括以下步骤：
使混合物与磁珠接触，所述磁珠对至少一种类型的待分离分子具有亲和力，使得至少一种类型的待分离分子的至少一部分结合到磁珠上，
在第一隔室中：用磁场吸引磁珠，并丢弃至少一部分剩余混合物，
可选地在将至少一种类型的待分离分子结合至磁珠的条件下洗涤磁珠，
用液体将磁珠转移到第二隔室中，所述至少一个第二隔室具有适于容纳所述磁珠的体积的容积，
在第二隔室中，通过在一定条件下将液体添加到磁珠中进行洗脱，以使至少一种类型的待分离分子不与磁珠结合，以洗脱至少一种类型的待分离分子并收集洗脱液。
在一个实施例中，步骤a)在第一隔室中进行。然后将混合物添加到第一隔室中，并使磁珠在第一隔室中与混合物接触。
在一个替代实施例中，步骤a)在混合物进入第一隔室之前进行。然后，在混合物和颗粒进入第一隔室之前，使磁性颗粒与混合物接触。在一个实施例中，在将磁性颗粒馈送至第一隔室之前将其加入细胞培养物中。
在一个实施例中，从磁珠洗脱至少一种类型的待分离分子的条件是间隔在2-4.5、优选在3-3.5的低pH，在该pH下同时发生病毒灭活。当要分离抗体时，适合使用低pH。低pH具有提供病毒灭活的优势，因此可以同时执行两个步骤。
在一个实施例中，将混合物一次泵入第一隔室中的磁场中。这是混合物与磁性颗粒一次通过磁场的单次通过模式。然后应调整磁珠的数量和磁场强度以及流速，以使大多数磁珠保留在磁场中。
在一个替代实施例中，使混合物循环并多次泵入第一隔室的磁场中。可以将包括磁场的混合物在第一隔室内搅拌，然后将它们保留在第一隔室中具有足够强磁场的部分中，或者可以借助位于第一隔室外部的管和泵将包括磁性颗粒的混合物在部分位于第一隔室外部的回路中经泵循环。然后可以调整循环时间，以使足够部份的磁珠保留在第一隔室的磁场中。
在一个实施例中，步骤c)中的磁珠的可选洗涤包括利用磁场吸引磁珠并进行洗涤，随后磁珠从磁场中释放，并且随后被磁场再次吸引，随后再次进行洗涤。因此，磁珠在结合到磁体时首先被洗涤，并且然后被释放且被结合，随后它们再次被洗涤。因此，磁珠将在洗涤之间重新排列。此释放和洗涤可以重复多次。最接近表面的颗粒将很有可能在远离该表面并更靠近洗涤液的位置获得新的位置。假设对于最接近磁体的磁珠，洗涤效率最低，而对于最接近洗涤液的磁珠，洗涤效率最高。因此，假设分子的大部分输送将通过扩散进行。
在一个实施例中，在步骤e)中洗脱之前，通过抽吸去除剩余的液体，以进一步增加至少一种类型的待分离分子的浓度。此方法步骤具有通过去除液体进一步提高浓度的优点。
在一个实施例中，通过测量混合物的光密度并以较低的光密度作为对磁场中磁珠的增加吸引来监测步骤b)中磁场对磁珠的吸引。由于磁珠保留在磁场中，混合物的光密度将由于磁性颗粒的存在将增加光密度而降低。设想通过测量单次通过模式和循环模式的光密度来监测磁珠的保留。
磁珠与液体一起转移到第二隔室。液体的流动借助液体带走磁性颗粒并因此输送磁性颗粒。在一个实施例中，通过将液体喷射到磁性颗粒来从第一隔室中去除磁珠。这种液体应使得待分离的分子仍与磁珠结合。液体的流动会将磁珠转移到第二隔室。磁性颗粒跟随液体的流动，并随流动而借助液体被带走。在一个实施例中，在将磁珠转移到第二隔室之前，减小或去除第一隔室中的磁场。通过减小或去除磁场来促进磁珠的转移。
在一个实施例中，步骤e)中的洗脱通过在适于至少一种类型的待分离分子的一种或多个选定波长下测量吸光度并以低于阈值的吸光度作为已经洗脱至少一种类型的待分离分子的足够部份的指示来监测。在洗脱期间，通过在适于特定分子的一个或多个波长下测量吸光度来监测待分离分子的浓度。对于包括抗体的蛋白质，可以将例如在280nm(UV)下的UV吸光度作为浓度的量度。
在一个实施例中，混合物包含细胞。系统和方法适于处理源自细胞培养物的混合物，其中当过程开始时细胞保留在混合物中。细胞可以很容易地与所有其他不需要的物质一起分离和去除。在一个实施例中，混合物从分批补料培养物中添加。在一个替代实施例中，混合物从灌注培养物中添加。
在一个实施例中，在完成分离之后进行清洁。在一个实施例中，用包含0.5M NaOH的液体进行清洁。这是许多应用领域的标准程序。
在一个实施例中，在该方法期间遵循良好生产规范GMP。GMP在不同国家/地区可会有所不同，并且是为制造、测试和质量保证提供指导的指南，以确保食品或药品对人类食用是安全的。FDA(美国食品和药物管理局)在“当前良好生产规范(CGMP)法规”中详细描述良好生产规范。这些准则是公认的，并且在本申请和权利要求中被视为对良好生产规范的描述。
在一个实施例中，第二隔室在完成该过程之后用作磁珠的储藏隔室，并且其中，至少一种抑菌化合物被添加到储藏隔室中的磁珠。在一个实施例中，抑菌化合物为乙醇。本领域技术人员可以选择合适的抑菌化合物，也可以选择这种化合物的合适浓度以防止细菌繁殖。
在一个实施例中，至少一个第一隔室为烧瓶，并且其中，至少一个第二隔室为附接在所述烧瓶上并与所述烧瓶流体连通的容器，其中，系统适于在磁性颗粒被转移到第二隔室时倒置，并且其中，第二隔室包括定位在第二隔室的出口处的选自网和过滤器中的至少一个，并且网和过滤器中的至少一个具有通孔的大小，使得其具有将磁珠保留在第二隔室中的能力。
在一个实施例中，使用一种系统，其中，至少一个第一隔室为烧瓶，并且其中，至少一个第二隔室为附接在所述烧瓶上并与所述烧瓶流体连通的容器，其中，所述系统适于在磁性颗粒被转移到第二隔室时倒置，并且其中，第二隔室包括位于第二隔室的出口处的选自网和过滤器中的至少一个，并且网和过滤器中的至少一个具有通孔的大小，使得其具有将磁珠保留在第二隔室中的能力。在此系统中，第二隔室的容积不大于磁珠体积的两倍。
在一个实施例中，步骤e)中的洗脱通过使用加压气体进行。在一个实施例中，步骤e)中的洗脱通过从第二隔室中抽空液体(洗脱缓冲液)的真空来完成。这样做的优点在于可以进一步减少液体(洗脱缓冲液)的体积，从而进一步浓缩样品。
在一个实施例中，在收集洗脱液之前，在步骤e)中洗脱进行一定时间。通常，添加液体(洗脱缓冲液)，并经过一定的接触时间后，打开第二隔室(通常在底部)的排出孔，以便收集洗脱缓冲液。过滤器防止磁性颗粒跟随液体并将磁性颗粒保持在第二隔室中。
示例
示例1
使用组合式过滤纯化单克隆抗体的程序
1.制备含有单克隆抗体的无细胞收获物
将收获物从哺乳动物细胞的灌注培养物中收集到收获罐中。这些细胞已使用重组技术进行改性，以分泌单克隆抗体。在生物反应器中进行灌注培养，在该反应器中，将用过的培养基连续去除(即所谓的“收获”)，同时以与从生物反应器中去除收获物相同的流速连续添加新鲜培养基。由于在收获罐之前的收获管路中安装过滤器，因此收获物中没有细胞。通过Protein A-HPLC测定抗体浓度，并且该浓度为0.44g/L。体积为26升。
2.LOABeads MabBind A磁珠(产品代码1004)的平衡。
磁珠通过3个磁珠体积的PBS缓冲液在过滤漏斗(孔2)上平衡。然后将磁珠重悬于2L PBS缓冲液中。
3.单克隆抗体对磁珠的吸附
将珠的悬浮液缓慢倒入装有灌注培养液的容器中，并且开始适度/充分搅拌。在时间0、15、30、60和120分钟时取出样品，以通过Protein A-HPLC分析追踪吸附相的动力学。30分钟后发现大于95％的吸附，而120分钟后发现大于99％的吸附。SDS-PAGE分析显示120分钟后没有残留抗体。
4.制备组合式磁过滤器以供使用。
组装好过滤器，并将其连接到蠕动泵上，以泵送缓冲液和磁珠以及用于净化目的的氮气。连接压缩空气以操作可伸缩磁体。彻底清洁系统并从排干PBS缓冲液。膜过滤器/微珠固定器安装在第二隔室的底部。接下来是通过蠕动泵将PBS缓冲液充满上部腔室(第一隔室)(容积为7.5L)。
5.将可磁化的磁珠结合到上部腔室过滤器的磁棒(第一隔室中的磁体)。
将超顺磁性棒(8)放到包围的不锈钢管中，从而激活磁过滤器。接下来是灌注培养物的悬浮液和磁珠从底部泵入上部腔室(第一隔室)中。打开顶阀以允许液体从腔室排出。连续取出样品以检查是否有逸出的黑磁珠。流速保持在100至260L/h之间，直到所有悬浮液已泵送通过腔室为止(总时间为1小时20分钟)。在收集的废液池中找不到磁珠。
6.在磁珠结合到磁体的情况下洗涤未结合的细胞培养基成分和杂质蛋白质。
接下来是将2个腔室体积的PBS缓冲液泵送通过上部腔室，以置换细胞培养物组分和杂质蛋白质。此步骤经过的时间为15分钟。
7.借助PBS的重悬磁珠的首次洗涤。
现在将一个腔室体积的PBS缓冲液泵送通过腔室以置换之前的洗涤液。
接下来是使磁棒缩回以使磁珠能够重悬。现在将来自腔室的PBS缓冲液在回路中循环，以使磁珠能够快速重悬。流速为290L/h，经过了20分钟的时间，获得所有磁珠的重悬。悬浮液以100L/h的速度再继续循环15分钟，此时磁体处于激活位置，磁珠现在被吸引到磁棒，并且洗涤液也从磁珠上清除了。
8.用PBS第二次洗涤重悬的磁珠。
现在将一个腔室体积的PBS缓冲液泵送通过腔室以置换之前的洗涤液。
接下来是使磁棒缩回以使磁珠能够重悬。现在将来自腔室(第一隔室)的PBS缓冲液在回路中循环，以使磁珠能够快速重悬。流速为290L/h，经过了20分钟的时间，获得所有磁珠的重悬。悬浮液以100L/h的速度再继续循环15分钟，此时磁体处于激活位置，磁珠现在被吸引到磁棒，并且洗涤液也从磁珠上清除了。洗涤液通过上部腔室的底阀排出。
9.第三次洗涤重悬的磁珠，然后将其转移到下部隔室(第二隔室)。下部隔室(第二隔室)的容积为3升。现在将一个腔室体积的PBS缓冲液泵入上部腔室中。现在使洗涤缓冲液与灭活的磁体一起循环通过隔室，以使洗涤后的磁珠能够重新悬浮。接下来是将上、下隔室的底阀同时打开。现在从上部隔室清除悬浮液，并且从下部隔室(第二隔室)清除液体。
10.通过用PBS缓冲液喷洒来冲洗上部隔室(第一隔室)的磁珠。
现在经由位于腔室中不锈钢管两侧的喷嘴向上部隔室喷洒2X 2L的PBS，以回收下部隔室(第二隔室)中的任何残留磁珠。
11.将磁珠堆入柱床中(在第二隔室中)。
现在从上部腔室施加氮气压力，该压力被调节为1.5-2巴。通过下部隔室的底部阀排出PBS缓冲液，直到约2-3cm的液体保留在床表面上方。然后关闭下部隔室的底阀。形成的柱床的高度为约13cm。磁珠的体积为1升。
12.单克隆抗体从磁珠的解吸、洗脱。
现在在形成的床上方的下部隔室中充满洗脱缓冲液，该洗脱缓冲液由60mM柠檬酸钠、pH 3.0的缓冲液组成。再次施加氮气压力，压力保持在1.5-2巴。然后缓慢打开底阀以调节来自腔室的洗脱液的流速。流速为39L/h。取部份，测量其在280nm下的吸光度，以确定何时开始和停止收集含有抗体的洗脱液。在30分钟内收集的洗脱液池的体积为2.6L，相当于2个床体积，并且根据灌注起始溶液计算出的浓缩因子为10。起始原料为26升。通过ProteinA-HPLC法和A280nm吸光度的测量而测定池中抗体的浓度为3.9g/L。由起始溶液计算的相应产率为87％。
13.通过低pH处理的病毒灭活，然后为洗脱液的pH中和。
将洗脱液轻轻搅拌60分钟，这代表有效病毒灭活的合适时间。然后加入体积为0.26L的2M Tris缓冲液pH 9，以将pH值增加至7.4。
14.MabBind磁珠的再生、清洁和卫生。清洁磁过滤器。
通过2倍床体积的洗脱缓冲液，接着通过2倍体积的60mM柠檬酸pH 2.3缓冲液和3倍床体积的PBS缓冲液，以及最后通过3倍床体积的作为防腐剂的包含20％乙醇的PBS缓冲液来清洁磁珠。然后在下次使用之前，将磁珠以25％的悬浮液形式保存在2-8℃下。
15.纯化的单克隆抗体的定性评估。
通过SEC-HPLC法进行分析。色谱图中明显可见一个代表单体抗体的主峰。在还原条件下的SDS-PAGE分析显示两个主要带：抗体的轻链和重链。
示例2.通过使用组合式磁分离和过滤的中等规模纯化人IgG抗体
1.目的
与传统的柱色谱法相比，使用技术含量低且成本低的仪器，使用磁分离，利用蛋白A偶联的磁珠进行抗体纯化非常方便。可能的缺点在于使用磁分离法从解吸的抗体分离磁珠时的洗脱体积。通常，使用2x10的磁珠体积来达到高产量并利用磁体的全部分离强度。相比之下，柱色谱法通常为在3倍柱体积的洗脱缓冲液中发现超过90％的解吸抗体。
在这里，我们研究通过使用组合式磁分离和过滤方法来大幅减少在磁分离中发现的洗脱体积的可能性。
2.方法
·将100ml的蛋白A偶联LOABeadsTM10％浆液转移到500ml Duran瓶(第一隔室)中。
·加入400ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且将悬浮液手动混合30秒，然后在LOABeads MagSep 500分离器中分离。
·约5分钟后，磁珠被磁体吸引，并通过移液将液体去除。
·将磁珠重悬于480ml的PBS中。
·加入20ml人血清(输入)，并使用轨道振动器(200rpm)混合溶液。
·2小时结合后，使用磁分离(LOABeads MagSep 500)收集未结合物。
·使用磁分离，用3×500ml的PBS洗涤磁珠。
·将磁珠重悬在另外的500ml PBS中，并安装顶部过滤器(第二隔室)，并将Duran瓶倒置放在吸瓶上。
·使用吸水设备去除PBS溶液。
·从Duran瓶上卸下顶部过滤器。
·当磁珠存在于过滤器上时，通过向磁珠添加6x10ml柠檬酸(60mM，pH 3.0)来洗脱结合的IgG抗体。
·在冲洗通过过滤器之前，允许从磁珠上解吸IgG抗体1分钟。
·将6x洗脱部份进一步过滤(0.4pm)并保存以进行蛋白质含量分析。
3.洗脱部份分析
在1mg/ml下使用1.38的吸光度在280nm下用分光光度法测定6x洗脱部份中IgG抗体的浓度。数据列于表1和图8中。如所示，在3个第一洗脱部份中发现90％的的洗脱IgG抗体，这相当于3个柱体积的洗脱体积。
表1.在6倍洗脱部份中发现的IgG抗体量。
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Claims (53)

1.一种用于分离混合物中的分子的系统，所述系统包括：适于容纳所述混合物的至少一个第一隔室，并且所述第一隔室适于与对至少一种类型的待分离分子具有亲和力的磁珠一起处理所述混合物，所述系统包括适于至少在所述混合物与所述磁珠接触之后吸引所述磁珠的至少一个磁体，所述至少一个磁体适于在所述第一隔室的至少一部分中施加磁场，其特征在于，所述系统包括至少一个第二隔室，所述至少一个第二隔室适于在所述磁珠已经被所述至少一个磁体至少部分地收集之后容纳所述磁珠，所述系统适于借助液体流将所述磁珠从所述至少一个第一隔室转移至所述至少一个第二隔室，所述至少一个第二隔室具有适于容纳所述磁珠的体积的容积，所述第二隔室的容积不大于所述磁珠的所述体积的三倍，所述至少一个第二隔室适于洗脱要与所述磁珠分离的所述至少一种类型的分子，所述至少一个第二隔室具有出口，所述出口包括用于将所述磁珠保留在所述至少一个第二隔室中的装置，所述第二隔室是可拆卸且可密封的。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述至少一个磁体为选自由永磁体和电磁体组成的组中的至少一个。
3.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述至少一个磁体被成形为至少一个可伸缩杆，所述至少一个可伸缩杆定位在所述第一隔室处，使得其能够被插入到所述第一隔室中并从所述第一隔室中缩回。
4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述至少一个磁体能够被插入所述第一隔室中的至少一个护套内部和从其缩回。
5.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述第一隔室包括至少一个喷嘴，所述喷嘴适于将液体至少部分地朝向磁珠在被所述至少一个磁体吸引之后聚集的位置引导。
6.根据权利要求4所述的系统，其中，至少一个喷嘴适于将液体至少部分地朝向所述至少一个护套的外部引导。
7.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括对所泵送的液体施加低剪切力的一个或多个泵。
8.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括一个或多个蠕动泵。
9.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统适于处理细胞。
10.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统连接至过程计算机系统。
11.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，模拟传感器和数字传感器中的至少一个连接至过程计算机系统。
12.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括至少一个液位传感器。
13.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，紫外线检测器位于所述至少一个第二隔室的出口处。
14.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，能够测量流体的光密度的检测器在所述至少一个第一隔室中。
15.根据权利要求14所述的系统，其中，所述检测器使用波长间隔在400-600nm的光来测量光密度。
16.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，从网和过滤器组成的组中选择的至少一个被定位在所述第二隔室的出口处，并且所述网和过滤器中的一个具有通孔的大小，使得它具有将所述磁珠保留在所述第二隔室中的能力。
17.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，无菌过滤器位于所述第二隔室的出口处。
18.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述第二隔室为当不使用所述系统时用于磁珠的储存器。
19.根据权利要求1所述的系统，其中，所述至少一个第一隔室为烧瓶，并且其中，所述至少一个第二隔室为附接在所述烧瓶上并与所述烧瓶流体连通的容器，其中，所述系统适于在磁性颗粒被转移到所述第二隔室时倒置，并且其中，所述第二隔室包括定位在所述第二隔室的出口处的选自网和过滤器中的至少一个，并且所述网和过滤器中的至少一个具有通孔的大小，使得其具有将所述磁珠保留在所述第二隔室中的能力。
20.根据权利要求19所述的系统，其中，所述系统被安装在保持器中，所述保持器能够从所述第一隔室向下的第一位置旋转到所述第二隔室向下的第二位置。
21.根据权利要求19至20中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括入口，所述入口包括止回阀。
22.根据权利要求21所述的系统，其中，所述止回阀具有排气过滤器，以防止污染所述系统的内容物。
23.根据权利要求19至20中的任一项所述的系统，其中，所述系统旨在一次性使用，在使用后被丢弃。
24.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，旨在与所述混合物接触的系统的部分旨在一次性使用，在使用后被丢弃，而所述系统的其他部分旨在使用一次以上。
25.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统是可洗涤的。
26.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统是可高压灭菌的。
27.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统满足制药工程标准。
28.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括串联的至少两个第一隔室。
29.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括并联的至少两个第一隔室。
30.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括并联的至少两个第二隔室。
31.根据权利要求1至2中的任一项所述的系统，其中，所述系统包括至少一个磁体，所述磁体适于通过在所述第二隔室的至少一部分中施加磁场来吸引所述磁珠。
32.一种利用权利要求1-31中任一项所述的系统分离混合物中分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使所述混合物与磁珠接触，所述磁珠对至少一种类型的待分离分子具有亲和力，使得所述至少一种类型的待分离分子的至少一部分结合到所述磁珠，
b.在第一隔室中：用磁场吸引所述磁珠，并丢弃至少一部分剩余混合物，
c.可选地在将所述至少一种类型的待分离分子结合至所述磁珠的条件下洗涤所述磁珠，
d.用液体将所述磁珠转移到第二隔室中，所述至少一个第二隔室具有适于容纳所述磁珠的体积的容积，
e.在所述第二隔室中，通过在一定条件下将液体添加到所述磁珠进行洗脱，以使所述至少一种类型的待分离分子不与所述磁珠结合，以洗脱所述至少一种类型的待分离分子并收集洗脱液，在步骤e)中添加以进行洗脱的液体的体积小于所述第二隔室中的所述磁珠的所述体积的四倍。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤a)在所述第一隔室中进行。
34.根据权利要求32所述的方法，其中步骤a)在所述混合物进入所述第一隔室之前进行。
35.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，从所述磁珠洗脱所述至少一种类型的待分离分子的条件是pH间隔在2-4.5的低pH，在所述pH下同时发生病毒灭活。
36.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，从所述磁珠洗脱所述至少一种类型的待分离分子的条件是pH间隔在3-3.5的低pH，在所述pH下同时发生病毒灭活。
37.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，将所述混合物一次性泵入所述第一隔室中的磁场中。
38.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，将所述混合物循环并多次泵入所述第一隔室中的磁场中。
39.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，步骤c)中的所述磁珠的所述可选洗涤包括利用所述磁场吸引所述磁珠并进行洗涤，随后所述磁珠从所述磁场中释放并且被所述磁场再次吸引，随后再次进行洗涤。
40.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，在步骤e)中进行洗脱之前，通过抽吸去除剩余的液体，以进一步提高所述至少一种类型的待分离分子的浓度。
41.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，通过测量所述混合物的光密度并以较低的光密度作为对所述磁场中磁珠的增加吸引来监测步骤b)中所述磁场对所述磁珠的吸引。
42.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，在将所述磁珠转移到所述第二隔室之前，减小或去除所述第一隔室中的所述磁场。
43.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，步骤e)中的所述洗脱通过以下来监测：在适于所述至少一种类型的待分离分子的一个或多个选定波长下测量吸光度并以低于阈值的吸光度作为已经洗脱所述至少一种类型的待分离分子的足够部份的指示。
44.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，所述混合物包括细胞。
45.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，所述混合物从分批补料培养物中添加。
46.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，所述混合物从灌注培养物中添加。
47.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，在完成所述分离之后进行清洁。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述清洁用包含0.5M NaOH的液体进行。
49.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，在所述方法期间遵循良好生产规范GMP。
50.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，所述第二隔室在完成所述过程之后用作磁珠的储藏隔室，并且其中，至少一种抑菌化合物被添加到所述储藏隔室中的磁珠。
51.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，步骤e)中的所述洗脱通过使用加压气体来进行。
52.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，在步骤e)中的所述洗脱在收集所述洗脱液之前进行一定时间。
53.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中，在所述第二隔室中，磁珠由至少一个磁体吸引。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4038184A1 (en) 2019-10-05 2022-08-10 Lab-on-a-Bead AB Purification process based on magnetic beads
CN113391010B (zh) * 2021-07-07 2023-03-24 安图实验仪器(郑州)有限公司 临床自动分析仪器的进样方法
CN115139427A (zh) * 2022-05-18 2022-10-04 内蒙古中锂新材料有限公司 一种改善锂电池隔膜物理性能一致性的自动混料系统

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101010592A (zh) * 2004-07-26 2007-08-01 拜奥默里克斯有限公司 将磁性粒子与流体分离、混合和浓缩的设备和方法及其在提纯方法中的用途
CN202011883U (zh) * 2007-12-12 2011-10-19 里兰斯坦福初级大学理事会 用于捕获和分离目标细胞的装置
DE102012003863B3 (de) * 2012-02-22 2013-03-07 Technische Universität Bergakademie Freiberg Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von Nanopartikelmaterialien auf lebende Zellen durch Messung der Wärmeleistungsproduktion der Zellen mittels Chip-Kalorimeter
CN104748656A (zh) * 2015-03-20 2015-07-01 江苏大学 基于巨磁阻的微流控磁珠位置检测方法与装置
CN104998700A (zh) * 2007-12-20 2015-10-28 皇家飞利浦电子股份有限公司 具有磁性颗粒的多隔室设备
CN105792926A (zh) * 2013-09-09 2016-07-20 微球实验公司 用于磁性分离的新工艺和系统

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5536475A (en) * 1988-10-11 1996-07-16 Baxter International Inc. Apparatus for magnetic cell separation
US20050266394A1 (en) * 2003-12-24 2005-12-01 Massachusette Institute Of Technology Magnetophoretic cell clarification
DE102005039175A1 (de) 2005-08-18 2007-02-22 Qiagen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Abtrennen von magnetischen Partikeln aus einer Flüssigkeit
WO2009074692A2 (en) 2007-12-13 2009-06-18 Sven Oscarsson Partial derivatization of particles
EP2257802A4 (en) 2008-02-29 2014-07-02 Univ Northwestern BARRIERS TO FACILITATE BIOLOGICAL REACTIONS
US8323568B2 (en) * 2008-06-13 2012-12-04 Honeywell International Inc. Magnetic bead assisted sample conditioning system
WO2010057318A1 (en) 2008-11-24 2010-05-27 Early Warning Inc. Devices and methods for providing concentrated biomolecule condensates to biosensing devices
FR2951961B1 (fr) * 2009-10-30 2011-11-04 Snecma Dispositif et procede de recuperation de particules magnetiques piegees sur un bouchon magnetique
EP2598884B1 (en) 2010-07-27 2016-03-30 Lab-on-a-Bead AB Covalent immobilization of molecules comprising an amino group
WO2012172503A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 Koninklijke Philips Electronics N.V. Processing of biological sample components
EP2541250A1 (en) 2011-06-30 2013-01-02 Koninklijke Philips Electronics N.V. Molecular architecture on magnetic particles for affinity assays with low non-specific binding
US9599610B2 (en) * 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
CA2923725A1 (en) 2013-09-09 2015-03-12 Lab-On-A-Bead Ab New diagnostic assay using particles with magnetic properties

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101010592A (zh) * 2004-07-26 2007-08-01 拜奥默里克斯有限公司 将磁性粒子与流体分离、混合和浓缩的设备和方法及其在提纯方法中的用途
CN202011883U (zh) * 2007-12-12 2011-10-19 里兰斯坦福初级大学理事会 用于捕获和分离目标细胞的装置
CN104998700A (zh) * 2007-12-20 2015-10-28 皇家飞利浦电子股份有限公司 具有磁性颗粒的多隔室设备
DE102012003863B3 (de) * 2012-02-22 2013-03-07 Technische Universität Bergakademie Freiberg Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von Nanopartikelmaterialien auf lebende Zellen durch Messung der Wärmeleistungsproduktion der Zellen mittels Chip-Kalorimeter
CN105792926A (zh) * 2013-09-09 2016-07-20 微球实验公司 用于磁性分离的新工艺和系统
CN104748656A (zh) * 2015-03-20 2015-07-01 江苏大学 基于巨磁阻的微流控磁珠位置检测方法与装置

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