KR20160133489A - 생물학적 생성물들의 제조를 위한 장치 및 방법들 - Google Patents

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피터 스탠리 가그논
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

생물 분자들의 정제를 위한 방법들 및 장치는 단일 장치 내의 접선 유동 여과 서브유닛들 및 흡착 서브유닛들의 결합들을 이용하며, 여기서 상기 서브유닛들은 독립적으로 또는 직렬로 동작될 수 있고, 여기서 상기 장치 및 방법들은 이전의 완충제 평형화 없이 오염된 샘플 내의 생물 분자의 정제를 위해 흡착 서브유닛들을 사용하여 프로세스 단계들을 수행하는 것과 같은 크로마토그래피 프로세스들에 대해 요구되는 조건들과 구분되는 포맷들의 넓은 범위에서의 사용을 위해 적합하다.

Description

생물학적 생성물들의 제조를 위한 장치 및 방법들{APPARATUS AND METHODS FOR FRACTIONATION OF BIOLOGICAL PRODUCTS}
여기에 개시되는 실시예들은 단백질들, 폴리뉴클레오티드들 및 바이러스 입자들의 정제에 적합한 장치들 및 프로세스들에 관한 것이다.
본 출원은 2014년 3월 7일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제61/949,944호를 우선권으로 수반하는 출원이며, 그 개시 사항들은 여기에 전체적으로 참조로 포함된다.
단백질들, 예를 들면 IgG 단일클론성 항체들의 정제는 원하는 단백질을 크로마토그래피 칼럼 상에 포집하는 낮은 효율에 의해 지장을 받을 수 있다. 다공성의 입자 크로마토그래피 매체들의 느린 유동 속도와 작은 용량은 칼럼 부피를 증가시킬 수 있고, 이는 처리 완충제 부피들을 증가시키고, 처리 시간을 증가시킨다. 관류(flow-through) 크로마토그래피 방법들이 대안으로 고려되었으며, 여기서 상기 크로마토그래피 매체들은 오염물들과만 결합하지만, 이러한 경우들에서 심지어 칼럼들 내에 충전되는 다공성의 입자 매체들로 용량 또한 제한되며, 이러한 방법들은 그렇더라도 느리다. 멤브레인 및 모놀리스(monolith) 기반의 크로마토그래피는 때때로 느린 문제를 극복할 수 있지만, 이들의 용량이 다공성의 입자 칼럼들로 충전된 칼럼들보다 몇 배 적으므로 이들은 결국 효율이 낮은 것으로 입증되었다. 침전 기술들 및 여과 기술들이 알려져 있지만, 또한 동등한 분별 성능이지만 보다 높은 효율을 가지는 칼럼 대안을 제공할 수 없는 것으로 입증되었다. 개별적으로 비효율적인 점 이외에도, 순차적인 다단계 정제 프로세스들은 프로세스 단계들 사이의 불연속성으로부터 추가적인 효율의 손실을 야기하며, 이는 결국 여분의 물의 소모, 보다 높은 물질 비용 및 보다 긴 프로세스 시간의 부담들을 가져온다. 동일한 제한들이 바이러스 입자들의 정제 및 DNA의 정제에 적용된다.
흡착 크로마토그래피 및 단류 접선 유동 여과(tangential flow filtration)의 결합을 수반하는 특정한 장치들과 프로세스들은 알려져 있다. 폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences)에는 연속적인 크로마토그래피를 수행하기 위해 단일 경로 접선 유동 여과 크로마토그래피를 동일한 매체들로 충전된 다중의 칼럼들과 연계시키는 문헌이 공개되어 있고, 여기서 상기 단일 경로 접선 유동 어셈블리는 상기 생성물을 농축시키는 기능을 수행한다(M. Schofield 등의 "Pall Life Sciences"(2014, Application note USD 302, "Productivity and economic advantages of coupling single-pass tangential flow filtration to multi-column chromatography for continuous processing"). O. Shinkazh 등(미국 특허 제7,988,859호 및 제7,947,175호)에도 연속적인 처리를 위해 접선 유동 여과 시스템들을 통해 펌프되는 유동화된 흡착 크로마토그래피 입자들을 수반하는 장치들 및 프로세스들이 기재되어 있다.
특히 크로마틴(chromatin) 함량을 감소시키는 수확물 정화 방법들이 알려져 있다(H.T. Gan 등의, "J. Chromatography A"(191 (2013) 33-40); P. Gagnon 등의 "J. Chromatogr. A"(1340 (2014) 68-78)). 이들은 정제의 전체적인 품질을 향상시키고, 일부 경우들에서 요구되는 순도를 구현하기 위해 칼럼 크로마토그래피 단계들의 숫자를 감소시키지만, 상기 정제 프로세스의 생산성은 계속 손상되며, 다중 칼럼 크로마토그래피 단계들이 여전히 요구된다.
본 발명은 단백질들, 폴리뉴클레오티드들 및 바이러스 입자들의 정제에 적합한 장치들 및 프로세스들을 제공한다.
특정 측면들에 있어서, 본 발명은 제제(preparation)로부터 생물학적 생성물(biological product)을 정제하기 위한 프로세스를 제공하며, 상기 프로세스는 장치를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 장치는, (a) 실제로 모든 상기 생물학적 생성물을 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 서브유닛 및 하나 또는 그 이상 흡착(adsorption) 서브유닛들을 구비하는 다중 정제 서브유닛(subunit)들; (b) 상기 다중 정제 유닛들 및 연관되는 펌프들 및 밸브들을 연결하여, 다중의 선택적인 구성(configuration)들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 하는 다중 도관(conduit)들을 포함하고, 상기 구성들은 (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물(retentate) 라인 배출이 재생물(recyclate)로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성 및 (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛의 투입에 대해 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성을 포함하고, 선택적으로 (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른(상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고) 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 포함하며, 상기 장치는 상기 제제를 상기 장치에, 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하기 위한 도관들을 포함한다. 특정 측면들에 있어서, 이러한 프로세스들은 상기 생물학적 생성물의 농도를 증가시키고, 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환할 수 있도록 상기 제1 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 A를 수행하는 단계; 및 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통해 순환될 수 있도록 상기 제2 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 B를 수행하는 단계를 추가적으로 포함하고; 선택적으로, 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른 상기 흡착 서브유닛을 통해 순환될 수 있도록 상기 제3 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 C를 수행하는 단계를 포함한다.
특정 측면들에 있어서, 본 발명은 제제로부터 생물학적 생성물을 정제하기 위한 장치를 제공하며, 여기서 상기 장치는 (a) 실제로 모든 상기 생물학적 생성물을 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제1 접선 유동 여과 서브유닛 및 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들을 구비하는 다중 정제 서브유닛들; (b) 상기 다중 정제 유닛들을 연결하는 다중 도관들; (c) 상기 다중 도관들을 통해 흐름을 안내하고, 상기 다중 정제 유닛들의 하나 또는 그 이상의 서로로부터의 분리를 허용하는 밸브들; (d) 흐름을 유도하고, 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 부분들 내의 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들; 및 (e) 상기 제제를 상기 장치에, 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하기 위한 도관들을 포함하며, 여기서 상기 다중 도관들 및 연관되는 펌프들 및 밸브들은, (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성, (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성; 및 (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른(상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고) 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 한다.
다음의 도면들은 개시되는 장치들의 특징들 및 그 적용들의 분명한 설명을 지지하도록 제공된다. 이들 도면들이 단지 예시적이고, 어떠한 방식으로도 상기 장치의 특정한 구성들 및 적용들을 전체적으로 제한하지 않는 점이 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 장치의 모든 특정한 기능적인 특징들을 구현하는 하나의 구성을 나타낸다. 참조 부호 01로 나타내는 용기는 정제되는 생성물 제제를 함유한다. 참조 부호 02로 나타내는 용기는 흡착 서브유닛을 평형화시키는 데 사용될 수 있는 완충제를 함유한다(하나의 완충제를 함유하는 용기만이 도시되지만, 다중의 완충제들이 02에 대해 도시되는 바와 같이 공급될 수 있다). 03은 재순환 용기를 나타낸다. 04는 여과물(filtrate)(폐기물) 용기를 나타낸다. 10은 상기 재순환 용기의 중량이 시간의 임의의 시점에서 액체의 함유된 부피의 표시자로 알려질 수 있도록 균형을 나타낸다. 20은 흐름을 안내하기 위한 밸브를 나타낸다. 50, 51, 52 및 53은 펌프들을 나타낸다. 30은 압력 센서를 나타낸다. 100은 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 200은 흡착 서브유닛을 나타낸다. 도면 내의 흡착 서브유닛은 크로마토그래피 입자들로 충전된 칼럼, 또는 모놀리스, 또는 이른바 멤브레인 흡착기를 가지는 경우가 될 수 있는 바와 같이 축류를 채용하는 물리적 구성을 나타낸다. 컨트롤러가 이와 같은 장치에 특유한 프로세스들을 유지하기 위해 상기 장치의 다양한 부분들을 통한 차압들을 제어하도록 압력 및 다른 센서 신호들을 통합시키는 데 사용될 수 있는 점이 명백해질 것이다. 도 1-도 9의 임의의 도면에 대해 번호로 나타낸 특징들은 도 1-도 9 모두 내에서 동일한 참조 부호들을 가지는 특징들에 적용된다.
도 2는 상기 생성물 제제가 상기 접선 유동 여과 서브유닛에 의채 농축되는 동안에 흐름 경로를 강조한다. 농축 동안, 작은 오염물들은 상기 접선 유동 여과 모듈 내의 공극들을 통해 제거된다. 농축시키는 것에 대한 선택은 택일적이며, 농축의 정도는 선택적이지만, 상기 생성물을 농축시키는 능력은 상기 장치의 측면이다.
도 3은 상기 완충제 조성이 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통한 디아필트레이션(완충 교환)에 의해 변화되는 동안에 흐름 경로를 나타낸다. 디아필터(diafilter)에 대한 선택은 택일적이고, 디아필트레이션의 정도는 선택적이며, 종료점(endpoint) 완충제의 화학적 특성들은 선택적이지만, 상기 제제를 디아필터하는 능력은 상기 장치의 측면이다.
도 4는 인-라인인 상기 접선 유동 여과 및 흡착 서브유닛들 모두를 갖는 흐름 경로를 강조한다. 이러한 흐름 경로는 선택적인 완충 교환 이전에, 그 동안에 또는 후에 개시될 수 있다. 상기 원하는 생성물을 유지하는 접선 유동 여과 모듈의 능력은 상기 제제가 상기 흡착 서브유닛을 통해 일회 이상 순환되는 것을 허용한다. 이는 상기 흡착 서브유닛이 완충제 교환과 일치되는 결합 조건들로 평형화되는 것을 허용한다. 이는 또한 상기 제제가 상기 흡착 서브유닛에 대한 오염물들의 결합을 방지하는 조건들 하에서 상기 흡착 서브유닛에 초기에 노출되는 것을 허용하여, 이들이 상기 접선 유동 여과 모듈 내의 공극들을 통해 제거될 수 있다. 이는 상기 완충제 조건들이 후에 이러한 결합을 증진시킬 때에 오염물들을 결합시키기 위한 상기 흡착 서브유닛의 능력을 보존한다. 작은 가용성의 오염물들은 상기 흡착 서브유닛이 인-라인인 전체 기간 동안에 상기 접선 유동 여과 멤브레인 내의 공극들을 통해 계속하여 제거된다. 생성물 농도는 완충제 투입 및 상기 접선 유동 여과 모듈의 유체 유동의 균형을 제어하여 상기 프로세스에 걸쳐 원하는 레벨로 유지된다.
도 5는 상기 흡착 서브유닛이 상기 원하는 생성물을 회수하도록 깨끗한 완충제로 세정되는 동안에 흐름 경로를 강조한다. 생성물 농도는 투입 완충제 및 상기 접선 유동 여과 모듈을 통한 유체 유동의 균형을 제어하여 상기 프로세스에 걸쳐 원하는 레벨로 유지된다.
도 6은 원하는 생성물을 회수하도록 깨끗한 완충제로 접선 유동 여과 모듈의 세정 동안에 오프-라인된 흡착 서브유닛을 갖는 흐름 경로를 나타낸다. 상기 완충제는 이러한 단계에서 선택적으로 교환될 수 있다.
도 7은 제제가 별도의 크로마토그래피 시스템 상에서 별도의 단계를 수행하는 요구 없이 더 정제될 수 있도록 외부 흡착 크로마토그래피(201)를 포함하는 도 1의 변형을 나타낸다. 상기 시스템은 정제된 생성물을 위한 수집 용기(5)를 더 포함한다. 흐름 경로는 또한 흡착 서브유닛의 몸체 외부측 상의 센서 또는 센서 어레이로 맞추어 질 수 있다.
도 8은 추가 접선 유동 여과 모듈이 포함되는 도 1의 변형을 나타낸다. 이와 같은 모듈은 제1 흡착 단계 동안에 제제의 초기 농축을 수행하고, 생성물을 유지하도록 제1 접선 유동 여과 모듈을 사용하는 능력을 제공하며, 그 후에 이후의 프로세스 단계들에서 상기 제1 접선 유동 모듈에 흡착된 오염물들이 제제 내로 침출되는 가능성을 회피하도록 제2 접선 유동 여과 모듈로 전환된다. 두 접선 유동 여과 모듈들 내의 멤브레인 조성 및 공극률은 동일하거나 다를 수 있다.
도 9는 세 개의 축류 흡착 서브유닛들(200, 201, 202)을 포함하여 구별되는 도 1에 기초하는 보다 복잡한 장치를 나타낸다. 다른 구성들은 2, 또는 4, 또는 그 이상의 흡착 서브유닛들을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 흡착 서브유닛들은 모두 축류 포맷을 채용할 수 있거나, 모두 접선 유동 포맷, 또는 포맷들의 결합을 을 채용할 수 있다. 05, 06 및 07은 선택적인 추가 완충제들 또는 다른 원하는 물질들을 나타낸다.
도 10은 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 단일 흡착 크로마토그래피 서브유닛을 포함하는 장치로부터의 부분적인 흐름 경로를 나타내며, 상기 흡착 크로마토그래피 서브유닛은 상기 접선 유동 여과 서브유닛과 직렬로 배치될 수 있도록 배관된다. 01은 완충제들, 샘플 및/또는 재생물로부터의 유체 투입들을 나타낸다. 02는 재생물로의 유체 배출을 나타낸다. 03은 투과물(permeate)을 나타낸다. 10은 흐름 분포를 제어하는 밸브들을 나타낸다. 100은 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 200은 흡착 서브유닛을 나타낸다. 도 10-도 14의 임의의 도면에 대해 기재되는 번호가 부여된 특징들은 도 10-도 14의 모두에서 동일한 참조 부호들을 가지는 특징들에 적용되며, 도 10-도 14에 도시된 특징들에 대한 참조 부호들은 도 1-도 10 및 도 15의 경우들과 구별된다. 도 10에 도시된 이러한 구성은 실험예 1, 실험예 2, 실험예 5, 실험예 8-실험예 13 및 실험예 15-실험예 22에 기재되는 경우들과 같은 적용들을 지지하기에 충분한 실시예이다.
도 11은 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 두 흡착 크로마토그래피 서브유닛들을 포함하는 장치로부터의 부분적인 흐름 경로를 나타내며, 상기 흡착 크로마토그래피 유닛들은 하나가 임의의 시간에서 상기 접선 유동 여과 서브유닛과 직렬로 될 수 있거나, 모두 상기 접선 유동 여과 서브유닛에 대해 오프-라인될 수 있도록 서로에 대하여 병렬로 배관된다. 01은 완충제들, 샘플 및/또는 재생물로부터의 유체 투입들을 나타낸다. 02는 재생물의 유체 배출을 나타낸다. 03은 투과물을 나타낸다. 10은 흐름 분포를 제어하는 밸브들을 나타낸다. 100은 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 200은 흡착 서브유닛을 나타낸다. 201은 제2 흡착 서브유닛을 나타낸다. 이러한 구성은 상기 장치가 각 흡착제가 다른 동작 조건들을 요구하는 상황들에서 오염물들을 제거하기 위한 두 가지 구별되는 흡착 방법들의 적용을 매개하는 것을 허용한다. 도 11에 도시된 이러한 구성은 실험예 3, 실험예 4, 실험예 6, 실험예 7, 실험예 24 및 실험예 25에 기재된 경우들과 같은 적용들을 지지하기에 충분한 실시예이다.
도 12는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 두 개의 흡착 크로마토그래피 서브유닛들을 포함하는 장치로부터의 부분적인 흐름 경로를 나타내며, 상기 흡착 크로마토그래피 유닛들은 이들이 함께 상기 접선 유동 여과 서브유닛에 대해 직렬로 배치될 수 있도록 서로에 대해 직렬로 배관된다. 01은 완충제들, 샘플 및/또는 재생물로부터의 유체 투입들을 나타낸다. 02는 재생물로의 유체 배출을 나타낸다. 03은 투과물을 나타낸다. 10은 흐름 분포를 제어하는 밸브들을 나타낸다. 100은 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 200은 흡착 서브유닛을 나타낸다. 201은 제2 흡착 서브유닛을 나타낸다. 이러한 구성은 상기 장치가 모든 흡착제들이 동일한 동작 조건들에 의해 수용될 수 있는 상황들에서 오염물들을 제거하기 위한 두 가지 구분되는 흡착 방법들의 적용을 매개하는 것을 허용한다. 도 12에 도시된 이러한 구성은 실험예 14에 기재된 경우들과 같은 적용들을 지지하기에 충분한 실시예이다.
도 13은 두 접선 유동 여과 서브유닛들 및 단일 흡착 크로마토그래피 유닛을 포함하는 장치로부터의 부분적인 흐름 경로를 나타내며, 여기서 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들은 서로에 대해 병렬로 배관되지만, 하나는 상기 흡착 크로마토그래피 서브유닛과 직렬로 동작할 수 있다. 01은 완충제들, 샘플 및/또는 재생물로부터의 유체 투입들을 나타낸다. 02는 재생물로의 유체 배출을 나타낸다. 03은 투과물을 나타낸다. 10은 흐름 분포를 제어하는 밸브들을 나타낸다. 100은 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 101은 제2 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 200은 흡착 서브유닛을 나타낸다. 이러한 구성은 상기 장치가 상기 흡착 크로마토그래피 서브유닛을 통한 상기 제제의 처리 후에, 그 동안에 또는 이전에 상기 흡착 크로마토그래피 서브유닛을 통한 제제의 처리에 앞서 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 이후에 다른 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 상기 제제를 농축시키거나 및/또는 완충제 교환시키는 것을 허용한다. 이러한 구성의 이점은 상기 제제에 먼저 접촉되는 상기 접선 유동 여과 유닛이 더러워질 수 있고, 이후에 오염물들을 흡착 단계 후에 상기 제제 다시 내로 침출시킬 수 있는 점이다. 두 접선 유동 여과 서브유닛들을 가짐으로써, 더러워지는 이러한 제1 서브유닛이 오염물들을 고도로 정제된 제제 내로 다시 침출시키는 가능성을 중단시키도록 오프-라인될 수 있다.
도 14는 단일 접선 유동 여과 서브유닛, 단일 흡착 크로마토그래피 유닛 및 상기 접선 유동 여과 서브유닛으로부터의 투과물 라인 상의 말단의 재순환하지 않는 흡착 크로마토그래피 서브유닛을 포함하는 장치로부터의 부분적인 흐름 경로를 나타낸다. 01은 완충제들, 샘플 및/또는 재생물로부터의 유체 투입들을 나타낸다. 02는 재생물로의 유체 배출을 나타낸다. 03은 투과물을 나타낸다. 10은 흐름 분포를 제어하는 밸브들을 나타낸다. 100은 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 200은 흡착 서브유닛을 나타낸다. 300은 말단의 순환하지 않는 흡착 서브유닛을 나타낸다. 이러한 구성은 상기 장치가 상기 제제가 상기 투과물 라인을 통해 상기 장치를 나가면서 말단 오염물 흡착 단계를 수행하는 것을 허용한다.
도 15는 통합된 완충제 제형을 포함하는 다른 선택적인 구성을 나타낸다. 01로 표시된 박스는 물 투입을 나타낸다. 02, 03 및 04로 표시된 박스들은 완충제들 또는 완충제 농축물들에 대한 투입들을 나타낸다. 05로 표시된 박스는 정제되지 않은 단백질 제제에 대한 투입을 나타낸다. 06으로 표시된 06으로 표시된 흑색 원은 투입 소스가 펌프(07b)에 의해 시스템 내로 당겨지는 것을 제어하는 스위치 밸브를 나타낸다. 펌프(07a)를 통해 허용되는 물의 양은 특히 완충제 농축물들을 희석시키는 능력을 유지시킨다. 7c로 표시된 펌프는 펌프들(071 및 07b)과 결합되어 07a/07b 및 07c 사이의 동작 압력을 제어한다. 08로 표시된 흑색 삼각형들의 그룹들은 3방 밸브들을 나타낸다. 09로 표시된 흑색 삼각형들의 쌍은 닫히거나 열릴 수 있는 2-피스톤 밸브를 나타낸다. 10으로 표시된 박스는 잔류물-재순환 용기를 나타낸다. 11로 표시된 박스는 폐기물 탱크를 나타낸다. 12로 표시된 박스는 상기 정제된 단백질이 내부에 수집될 수 있는 탱크를 나타낸다. 13으로 표시된 라인은 재순환 루프를 나타낸다. 100으로 표시된 박스는 접선 유동 여과 서브유닛을 나타낸다. 200으로 표시된 박스는 흡착 서브유닛을 타나낸다. 201로 표시된 점선으로 둘러싸인 박스는 선택적인 추가 흡착 서브유닛을 나타낸다. 1000으로 표시된 개방된 원은 혼합기를 나타낸다. 1001로 표시된 박스는 압력 센서를 나타낸다. 1002로 표시된 박스는 기체 교환 장치 또는 버블 트랩(bubble trap)을 나타낸다. 개방된 삼각형들은 상기 장치의 다양한 흐름 경로들 내의 흐름의 방향을 나타낸다. 도 15에 나타낸 도면들에 대한 참조 부호들은 도 1-도 14의 경우들과 구별된다.
도 1-도 15에 도시되고 이들을 참조하여 설명되는 실시예들은 장치 및 프로세스 구성들 중에서 특정한 개별적인 변형들을 예시하지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 모든 개별적인 특징들을 잠재적으로 포함하는 다양한 결합들이 단일 장치 구성 내에 포함될 수 있는 점이 명백할 것이다.
특정 측면들에 있어서, 본 발명은 제제(preparation)로부터 생물학적 생성물(biological product)을 정제하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 장치를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 장치는 (a) 실제로 모든 상기 생물학적 생성물을 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 접선 유동 여과 서브유닛(tangential flow filtration subunit) 및 하나 또는 그 이상 흡착(adsorption) 서브유닛들을 구비하는 다중 정제 서브유닛들; (b) 상기 다중 정제 유닛들 및 관련된 펌프들과 밸브들을 연결하여, 다중의 선택적인 구성(configuration)들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 하는 다중 도관(conduit)들을 포함하고, 상기 구성들은 (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물(retentate) 라인 배출이 재생물(recyclate)로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성 및 (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상의 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 서브유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성을 포함하고, 선택적으로, (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른(상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고) 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 포함하며, 상기 장치는 (c) 상기 제제를 상기 장치에, 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하기 위한 도관들을 포함한다. 특정 측면들에 있어서, 이러한 프로세스들은 상기 생물학적 생성물의 농도를 증가시키고, 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환될 수 있도록 상기 제1 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 A를 수행하는 단계; 및 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환될 수 있도록 상기 제2 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 B를 수행하는 단계를 추가적으로 포함하며, 선택적으로, 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른 상기 흡착 서브유닛을 통해 순환될 수 있도록 상기 제3 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 C를 수행하는 단계를 포함한다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 장치는 상기 제1 구성, 상기 제2 구성 및 상기 제3 구성을 제공하고, 여기서 각각의 단계 A, 단계 B 및 단계 C가 수행된다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 장치는 상기 제1 구성 및 상기 제2 구성을 제공하고, 또한 여기서 단계 A에 이어서 단계 B가 수행되고, 상기 정제된 생물학적 생성물은 상기 재생물 로부터 얻어진다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 장치는 상기 제1 구성 및 상기 제2 구성을 제공하고, 또한 여기서 단계 A에 이어서 단계 B가 수행되며, 이후에 단계 A가 다시 수행되고, 상기 정제된 생물학적 생성물은 상기 재생물로부터 얻어진다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 재생물에는 크로마토그래피 프로세스에 의해 다른 정제가 수행된다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 재생물은 추가 흡착 유닛으로 흐르며, 이러한 추가 흡착 유닛을 나가는 상기 생물학적 생성물은 상기 장치를 나가기 전에 상기 접선 유동 유닛으로 돌아가지 않는다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 단계 A는 또한 단계 B 및 단계 C 사이에서 수행된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 재생물에 크로마토그래피 프로세스에 의해 다른 정제가 수행된다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 재생물은 추가 흡착 유닛으로 흐르며, 이러한 추가 흡착 유닛을 나가는 상기 생물학적 생성물은 상기 장치를 나가기 전에 상기 접선 유동 유닛으로 돌아가지 않는다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 제공되는 장치는 실제로 모든 상기 생물학적 생성물을 유지하기에 충분한 공극률로 공극들을 갖는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 정제 유닛 및 제2 흡착 유닛을 포함하며, 상기 다중 도관들은 추가적으로, 상기 제1 구성, 상기 제2 구성, (iv) 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제4 구성, 그리고 (v) 상기 제2 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 흡착 서브유닛의 투입에 대해 연결되어 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제5 구성을 포함하는 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통해 상기 생물학적 생성물을 가능하게 한다. 특정 측면들에 있어서, 이러한 프로세스들은 상기 생물학적 생성물의 농도를 증가시키고, 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환될 수 있도록 상기 제4 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 D를 수행하는 단계; 및 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 제2 흡착 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환될 수 있도록 상기 제5 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 E를 수행하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 구성, 상기 제2 구성, 상기 제4 구성 및 상기 제5 구성을 제공하며, 여기서 각각의 단계 A, 단계 B, 단계 D 및 단계 E가 수행된다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 단계 B의 부분들 동안에 여기서 화학적 조건들은 다음의 하나 또는 그 이상을 포함한다. (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들, 그리고 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 B의 부분 동안에 화학적 조건들은 다음의 둘 또는 그 이상을 포함한다. (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들, 그리고 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들.
특정 측면들에 있어서, 단계 C를 포함하는 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 단계 C의 부분들 동안에 여기서 화학적 조건들 다음의 하나 또는 그 이상을 포함한다. (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들, 그리고 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 E의 부분들 동안에 화학적 조건들은 다음의 둘 또는 그 이상을 포함한다. (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들, 그리고 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들.
특정 측면들에 있어서, 단계 E를 포함하는 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 단계 E의 부분들 동안에 여기서 화학적 조건들은 다음의 하나 또는 그 이상을 포함한다. (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들, 그리고 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 B의 부분들 동안의 화학적 조건들은 다음의 둘 또는 그 이상을 포함한다. (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들, 그리고 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 단계 A 동안에 화학적 조건들은 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통한 상기 제제의 디아필트레이션(diafiltration)을 거쳐 변경된다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 접선 유동 서브유닛들의 공극률은 상기 프로세스 동안에 상기 잔류물 내의 실질적으로 상기 모든 생물학적 생성물을 유지하면서 실질적으로 가능한 한 크다.
특정 측면들에 있어서, 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들 모두를 갖는 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 실질적으로 동일하다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 다른 화학적 조성들 및 실질적으로 유사한 공극률들을 가진다. 이러한 또 다른 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 다른 화학적 조성들 및 다른 공극률들을 가진다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 하나의 멤브레인은 is 0.2미크론의 공극들을 갖는 폴리에테르술폰(polyethersulfone) 멤브레인이고, 다른 하나의 멤브레인은 30kDa의 질량을 갖는 구상 단백질(globular protein)에 대응되는 공극 크기들을 갖는 셀룰로오스(cellulose) 멤브레인이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나 또는 그 이상 내부의 하나 또는 그 이상의 멤브레인들은 흡착성 표면 특성들을 가지므로, 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography)를 수행하기 위해 적합할 수 있다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내부의 멤브레인의 물리적인 포맷(format)은 시트(sheet), 권취된(감긴) 시트, 중공형 섬유(hollow fiber) 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 흡착성 서브유닛들의 물리적인 포맷은 흡착성 입자들로 충전된 칼럼, 모놀리스(monolith), 하나 또는 그 이상의 흡착성 멤브레인들, 하나 또는 그 이상의 시트들 또는 하나 또는 그 이상의 중공형 섬유들 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 흡착성 서브유닛들에 의해 채용되는 흡착 메커니즘(adsorptive mechanism)은 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, pi-pi 결합, 수소 결합, 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용, 금속 친화, 생물학적 친화도(biological affinity) 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환(anion exchange) 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민(amine) 모이어티(moiety)들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 양이온 교환(cation exchange) 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 SO3 모이어티들에 의해 제공되는 양이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다.
특정 측면들에 있어서, 단계 C 또는 단계 E를 수반하는 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이며, 이러한 특정 실시예들에서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이며, 이러한 특정 실시예들에서, 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 페닐(phenyl) 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이며, 이러한 특정 실시예들에서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 페닐 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다.
특정 측면들에 있어서, 단계 C를 수반하는 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 단계 B는 관류(flow-through) 모드로 수행되고, 단계 C는 결합-용리(bind-elute) 모드로 수행된다. 특정 측면들에 있어서, 단계 E를 수반하는 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 단계 B는 관류 모드로 수행되고, 단계 E는 결합-용리 모드로 수행된다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 생물학적 생성물들은 10㎚ 내지 100미크론의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 가진다. 특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 생물학적 생성물은 DNA 플라스미드(plasmid), 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자, 세포 소기관(cellular organelle), 세포, 항체 및 비-항체 단백질로부터 선택된다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 제제의 소스는 세포 배양 수확물(cell culture harvest) 또는 혈청, 혈장, 젖 및 조직 균질액(homogenate)으로부터의 유체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자연 체액이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 상기 제제에 단계 A 이전에 분별 또는 정화 프로세스가 수행되도록 프로세스를 제공한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 A 이전의 상기 분별 또는 정화 프로세스는 상기 제제 내의 크로마틴(chromatin)의 양을 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상으로 감소시킨다. 특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 상기 제제가 상기 제제가 얻어졌던 소스 샘플 내에 있는 크로마틴의 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하를 가지는 형태가 되도록 프로세스를 제공한다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 프로세스를 제공하며, 여기서 상기 장치는 두 접선 유동 여과 서브유닛들 및 적어도 하나의 흡착 유닛을 구비하여, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들이 병렬로 배관되며, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나는 상기 제2 구성 내의 흡착 유닛과 결합될 수 있다. 이러한 실시예의 이점은 is that 정제 프로세스가 하나의 접선 유동 여과 서브유닛으로 시작될 수 있고, 상기 프로세스의 나중의 단계들에서 상기 제1 접선 유동 여과 서브유닛의 어떠한 파울링(foluing)의 효과도 회피되도록 상기 제2 접선 유동 여과 유닛을 이용하여 완료된다. 이러한 실시예들의 예시적인 구성들은 도 8 및 도 13에 나타난다. 예를 들면, 이러한 특정 실시예들에 있어서, 단계 A는 상기 제1 접선 유동 여과 서브유닛으로 시작될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛으로 완료(모든 후속하는 단계들과 함께)될 수 있다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 단계 A는 상기 제1 접선 유동 여과 서브유닛으로 수행될 수 있고, 모든 후속하는 단계들(단계 A의 후속되는 수행들을 포함하여)은 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛으로 완료될 수 있다. 이러한 또 다른 실시예들에 있어서, 단계들 A 및 B는 상기 제1 접선 유동 여과 서브유닛으로 수행될 수 있고, 단계 C 및 임의의 후속하는 단계들(단계 A의 후속되는 수행들을 포함하여)은 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛으로 완료될 수 있다.
특정 측면들에 있어서, 본 발명의 앞서의 실시예들은 바람직하게는 다단계 프로세스들을 제공하며, 이들은 이러한 정제 단계의 일부 또는 모두의 과정 동안에 완충제 평형(buffer equilibration)이 수행되도록 단계의 수행 이전에 완충제 평형이 없는 포맷에 따라 수행된다. 이러한 실시예들의 이점들은 보다 작은 부피가 샘플 취급 및 처리를 위해 요구되기 때문에 완충제(buffer)들 및 다른 자원들의 보다 효율적인 사용을 포함한다.
장치 또는 이러한 장치를 이용하는 방법들에 관한 본 발명의 특정 측면들에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 멤브레인은 선택된 크기보다 큰 유체역학적 직경을 갖는 흡착되지 않은 용질들의 적어도 최소의 퍼센티지가 크기에 기초하여 유지되지만, 상기 선택된 크기보다 작은 유체역학적 직경을 갖는 흡착되지 않은 용질들은 상기 멤브레인를 통과하는 것이 허용되도록 선택되는 공극률을 가진다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 최소 퍼센티지는 50% 내지 100%의 임의의 양이 될 수 있고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 최소 퍼센티지는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%이다. IgG 항체의 정제와 관련되는 바와 같은 이들 실시예들의 특정한 것에 있어서, 상기 선택된 크기는 약 10㎚ 내지 15㎚의 임의의 양이 될 수 있으며, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 선택된 크기는 대략 10㎚, 11㎚, 12㎚, 13㎚, 14㎚ 또는 15㎚이다.
장치 또는 이러한 장치를 이용하는 방법들에 관한 본 발명의 특정 측면들에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 멤브레인은 약 3㎚ 내지 약 6㎚, 또는 약 6㎚, 또는 약 5㎚, 또는 약 4㎚, 또는 약 3㎚의 평균 공극 크기를 가지는 것으로 특징지어지는 공극률을 가진다. 장치 또는 이러한 장치를 이용하는 방법들에 관한 본 발명의 특정 측면들에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 멤브레인은 약 9㎚ 또는 그 이하, 혹은 약 8㎚ 또는 그 이하, 혹은 약 7㎚ 또는 그 이하, 혹은 약 6㎚ 또는 그 이하, 혹은 약 5㎚ 또는 그 이하의 최대 공극 크기를 갖는 것으로 특징지어지는 공극률을 가진다. IgG 항체들의 유체역학적 직경은 이들의 가장 긴 치수에 따라 측정되는 경우에 국소적 조건들에 의존하는 일부 변화들과 함께 대략 10㎚-15㎚가 되는 경향이 있다. 항체들의 유연성과 이들의 크기의 변화들이 정해지면, 항체들을 유지하기 위한 공극 크기의 선택은 통상적으로 상기 관심의 대상인 항체의 유체역학적 직경보다 인지할 수 있게 작은 공극 크기를 요구한다. 예를 들면, 대략 9㎚의 최대 공극 크기는 모든 보다 큰 IgG들을 유지시킬 수 있는 반면, 보다 작거나 보다 유연한 IgG들은 대략 5㎚와 같이 보다 작은 최대 공극 크기를 요구할 수 있다. 또한, 멤브레인 내의 공극 크기는 평균 공극 크기가 최대 공극 크기보다 인지할 수 있게 작게 되는 분산을 가지는 것으로 예상될 수 있다. 예를 들면, 대략 9㎚의 최대 공극 크기를 갖는 멤브레인은 6㎚의 평균 공극 크기를 가질 수 있으며, 유사하게, 대략 5㎚의 최대 공극 크기를 갖는 멤브레인은 3㎚의 평균 공극 크기를 가질 수 있다. 숙련된 종사자들은 앞서의 논의를 어떻게 이들의 대략적인 유체역학적 직경들의 지식에 기초하여 다른 원하는 생물학적 생성물들에 대해 적합한 멤브레인 공극률들의 선택에 적용시킬 지를 이해할 것이다.
특정 측면들에 있어서, 본 발명은 제제로부터 생물학적 생성물을 정제하기 위한 장치를 제공하며, 여기서 상기 장치는, (a) 실제적으로 상기 생물학적 생성물의 모두(또는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상)을 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제1 접선 유동 여과 서브유닛 및 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들을 구비하는 다중 정제 서브유닛들; (b) 상기 다중 정제 유닛들을 연결하는 다중 도관들; (c) 흐름을 상기 다중 도관들을 통해 안내하고, 서로로부터 상기 다중 정제 유닛들의 하나 또는 그 이상의 분리를 허용하는 밸브들; (d) 흐름을 유도하고, 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 부분들 내부의 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들, 그리고 (e) 상기 제제를 상기 장치, 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하기 위한 도관들을 포함하며, 여기서 상기 다중 도관들 및 연관된 펌프들과 밸브들은, (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성, (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성, 그리고 (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내의 선택된 상기 흡착 서브유닛(상기 제2 구성 내의 선택된 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고)과 다른 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 한다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 상기 장치는 또한 실제적으로 상기 생물학적 생성물의 모두를 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 정제 유닛 및 제2 흡착 유닛을 가지며, 여기서 상기 다중 도관들은 추가적으로 상기 제1 구성, 상기 제2 구성, 상기 제3 구성, (iv) 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제4 구성, 그리고 (v) 제5 구성 상기 제2 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제5 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 한다.
특정 측면들에 있어서, 본 발명은 제제로부터 생물학적 생성물을 정제하기 위한 장치를 제공하며, 여기서 상기 장치는, (a) 약 2.5㎚부터 약 5000㎚까지의 평균 공극 크기를 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제1 접선 유동 여과 서브유닛 및 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들을 포함하는 다중 정제 서브유닛들, (b) 상기 다중 정제 유닛들을 연결하는 다중 도관들; (c) 흐름을 상기 다중 도관들을 통해 안내하고, 서로로부터 상기 다중 정제 유닛들의 하나 또는 그 이상의 분리를 허용하는 밸브들; (d) 흐름을 유도하고, 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 부분들 내부의 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들; 그리고 (e) 상기 제제를 상기 장치, 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하기 위한 도관들을 포함하며, 여기서 상기 다중 도관들 및 연관된 펌프들과 밸브들은, (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성, (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성, 그리고 (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내의 선택된 흡착 서브유닛(상기 제2 구성 내의 선택된 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고)과 다른 흡착 서브유닛에 대한 투입과 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 한다. 특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 상기 장치는 또한 약 2.5㎚부터 약 5000㎚까지의 평균 공극 크기를 갖는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 정제 유닛 및 제2 흡착 유닛을 가지며, 여기서 상기 다중 도관들은 추가적으로 상기 제1 구성, 상기 제2 구성, 상기 제3 구성, (iv) 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제4 구성, 그리고 (v) 상기 제2 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입으로 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제5 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 약 5㎚부터 약 1000㎚까지, 또는 약 10㎚부터 약 500㎚까지, 또는 약 25㎚부터 약 100㎚까지의 평균 공극 크기를 가진다. 앞서의 실시예들의 특정한 것에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 그 유체역학적 반경(hydrodynamic radius)에 기초하여 원하는 생물학적 생성물의 적어도 99%를 유비하도록 선택되는 평균 공극 크기를 가진다.
앞서의 실시예들의 특정한 것에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 원하는 생물학적 생성물의 평균 유체역학적 반경보다 크도록 선택되는 평균 공극 크기를 가진다. 특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들이 실질적으로 동일한 장치를 제공한다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 다른 화학적 조성들 및 실질적으로 유사한 공극률들을 가진다. 이러한 또 다른 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들 다른 화학적 조성들 및 다른 공극률들을 가지며, 이러한 특정 실시예들에서, 하나의 멤브레인은 0.2미크론의 공극 크기들을 갖는 폴리에테르술폰 멤브레인이고, 다른 하나의 멤브레인은 30kDa의 질량을 갖는 구상 단백질에 대응되는 공극 크기들을 갖는 셀룰로오스 멤브레인이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나 또는 그 이상 내부의 하나 또는 그 이상의 멤브레인들은 흡착 크로마토그래피를 수행하기 위해 적합할 수 있도록 흡착성 표면 특성들을 가진다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내부의 멤브레인의 물리적인 포맷은 시트, 권취된(감긴) 시트, 중공형 섬유 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 특정한 실시예들에 있어서, 상기 흡착성 서브유닛들의 물리적인 포맷은 흡착성 입자들로 충전된 칼럼, 모놀리스, 하나 또는 그 이상의 흡착 멤브레인들, 하나 또는 그 이상 시트들 혹은 하나 또는 그 이상의 중공형 섬유들, 또는 이들의 결합이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 흡착성 서브유닛들에 의해 채용되는 흡착 메커니즘은 독립적으로 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, pi-pi 결합, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 금속 친화, 생물학적 친화도 또는 이들의 결합의 임의의 것이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 제2 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 제2 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 제2 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 양이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 제2 구성에 사용되는 흡착 유닛은 SO3 모이어티들에 의해 제공되는 양이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 제3 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 제3 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 제5 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 제5 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 제3 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 제3 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 페닐 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 제5 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 제5 구성에서 사용되는 흡착 유닛은 페닐 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 장치를 제공하며, 여기서 상기 장치는 또한 상기 제제를 경로 명령들에 따라 유체 경로를 통과시키도록 상기 펌프들과 밸브들을 제어하는 컴퓨터 판독 가능한 명령들에 의해 구성되는 하나 또는 그 이상의 프로세서들을 포함하고, 여기서 상기 경로 명령들은 정제 유닛들의 순서를 정의하며, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 장치는 또한 경로 명령들의 사용자에 의한 엔트리 또는 선택을 수용하도록 구성되는 인터페이스(interface)를 포함하고, 이러한 특정 실시예들에서, 상기 인터페이스는 컴퓨터, 메모리, 네트워크, 무선 또는 이들의 결합들이다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 멀티-밀리그램(multi-milligram) 규모 또는 멀티-그램(multi-gram) 규모 또는 멀티-킬로그램(multi-kilogram) 규모로 수행되도록 선택되는 장치를 제공한다.
특정 측면들에 있어서, 앞서의 실시예들은 두 접선 유동 여과 서브유닛들 및 적어도 하나의 흡착 유닛을 갖는 장치를 제공하여, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들은 병렬로 배관되고, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들의 어느 하나는 상기 제2 구성 내의 흡착 유닛과 결합될 수 있다. 이러한 실시예의 이점은 정화 프로세스가 하나의 접선 유동 여과 서브유닛으로 시작되고, 상기 프로세스의 나중의 단계들에서 상기 제1 접선 유동 여과 서브유닛의 어떠한 파울링의 효과를 회피하도록 상기 제2 접선 유동 여과 유닛을 이용하여 완료되는 것이다. 이러한 실시예들의 예시적인 구성들은 도 8 및 도 13에 예시된다.
일부 실시예들에 있어서, 장치들 및 이를 이용하는 방법들이 제공되며, 상기 장치들은 원하는 생물학적 생성물의 제제를 함유하는 용기(vessel)를 포함하며, 가용성 상태로 상기 제제로부터 상기 원하는 제제를 유지하는 맴브레인을 갖는 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 통합하고, 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 더 통합하며, 선택적으로 제2 또는 제3 또는 추가 흡착 서브유닛을 포함할 수 있고, 선택적으로 침전된 상태 또는 복수의 입자들과 연관된 상태로 상기 생성물을 유지하는 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 서브유닛을 포함할 수 있다. 개시되는 장치 및 프로세스들의 개발과 사용을 통해, 많은 이점들이 정제를 수행하기 위한 알려진 장치 및 프로세스들의 능력들을 실질적으로 놀랍게도 초과하는 것으로 발견되었다,
도면들(예를 들면, 도 1, 도 10 또는 도 15)은 정화된 세포 배양 수확물로부터 IgG 단일클론성(monoclonal) 항체와 같은 원하는 단백질을 정화하기 위한 장치 구성들을 예시하며, 여기서 상기 원하는 단백질은 전체 프로세스에 걸쳐 가용성으로 남는다. 상기 접선 유동 서브유닛(100)은 IgG의 허용될 수 없는 손실을 방지하기 위해 충분히 작지만, 보다 작은 오염물들의 통과를 허용하기에는 충분히 큰 공극 크기 분포를 갖는 불활성 멤브레인을 구비한다. 실제로, 이러한 요구사항은 약 50kDa까지의 질량을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 크기를 갖는 공극들을 가지는 멤브레인에 의해 제공될 수 있다. 이와 같은 멤브레인 내의 공극 크기들의 범위가 대체로 평균 주변의 가우스 분포(Gaussian distribution)로 상기 크기의 반 또는 그 이하까지의 공극들 또는 상기 크기의 두 배 또는 그 이상의 공극들을 포함하는 점이 이해될 것이다. 이에 따라, 보다 큰 평균 공극 크기를 갖지만, 보다 좁은 공극 크기의 범위를 갖는 멤브레인이 적절하거나 보다 우수하게 수행할 수 있는 점 또한 이해될 것이다. 일반적인 사실상, IgG의 허용될 수 없는 손실을 허용하지 않는 가장 큰 공극 크기를 갖는 멤브레인이 상기 멤브레인 물질이 샘플 성분들에 대해 불활성인 한 가장 바람직할 것이다. 매우 불활성인 재생된 셀룰로오스 멤브레인들이 이에 따라 보다 소수성이며, 오염물 제거를 제한할 수 있고 생성물 회수를 감소시킬 수 있는 비특이적 화학적 상호작용들에 참여하는 높은 경향이 있는 폴리에테르술폰(PES) 멤브레인들보다 바람직할 수 있다. 도면들 내의 흡착 서브유닛(200)은 멤브레인 흡착기(membrane adsorber), 또는 모놀리스, 또는 다공성 입자들로 충전된 칼럼과 같은 고정층(fixed bed) 음이온 교환 장치가 될 수 있다. 일반적인 사실 상, 상기 흡착 서브유닛이 상기 접선 유동 여과 서브유닛에 대해 크기가 조절될 수 있으므로, 상기 흡착 서브유닛은 상기 접선 유동 여과 서브유닛에 의해 유지되는 유량을 제한하지 않는다. 도면들에 나타낸 바와 같이, 상기 장치는 원하는 바에 따라 상기 장치를 통한 채널 흐름이 필요한 경우에 펌프들, 밸브들, 배관 및 모니터링 장치들을 포함하며, 원하는 경우에 부분적으로 또는 완전히 자동화된 동작을 유지하도록 컨트롤러를 선택적으로 포함한다.
도면들의 장치 구성들을 채용하는 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 단계는 전체적인 프로세스 부피를 감소시키도록 상기 투입 단백질 제제(protein preparation)를 농축시키는 것이다. IgG 단일클론성 항체의 경우에 있어서, 상기 제1 단계는 상기 항체를 10g/L, 또는 25g/L, 또는 50g/L, 또는 60g/L, 또는 70g/L, 또는 80g/L, 또는 90g/L, 또는 100g/L 또는 그 이상, 그 이하, 혹은 중간 농도까지 농축시키는 것이 될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 프로세스 부피를 감소시키는 것이 후속되는 처리 단계들에 걸쳐 물의 소모를 감소시키며, 이는 동일한 증분으로 화학 약품의 소모와 처리 시간을 감소시키는 점이 분명해질 것이다.
도면들의 하나 또는 그 이상에 따른 장치 구성을 채용하는 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제2 단계는 상기 농축된 항체의 바이러스 불활성화를 수행하는 것이다. 이러한 일 예에서, 완충제는 상기 접선 유동 여과 서브유닛(100)을 통해 상기 항체가 도입되었던 최초 완충제로부터, 예를 들면 pH 3.5의 100mM의 아세트산(acetic acid), 1.7M의 NaCl을 함유하는 완충제로 완충제 교환된다. 항체 농도는 낮은 처리 부피의 이점들을 유지하고 여분의 탱크 설비를 요구하지 않도록 이러한 프로세스 동안에 상대적으로 일정하게 유지된다.
도면들의 하나 또는 그 이상에 따른 장치 구성을 채용하는 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제3 단계는 상기 원하는 단백질 제제를 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛과 접촉시키는 것이다. 이러한 일 예에서, 음이온 교환 모놀리스(200)가 투입되고, 초기에 pH 3.5의 100mM 아세트산, 1.7M의 NaCl로 완충되었던 상기 단백질 제제는 상기 모놀리스와 접촉된다. 상기 완충제는 접선 유동 여과 서브유닛(100)을 통해 pH 8.0의 50mM의 트리스(Tris)를 포함하는 완충제로 교환된다. 상기 완충제 교환 동안, 상기 IgG 제제 및 상기 모놀리스는 NaCl의 명목상 부존재까지 pH 3.5부터 pH 8.0까지 범위 및 1.7M의 NaCl의 조건들을 겪는다. 상기 IgG 제제가 pH 8.0의 50mM의 트리스에 도달하는 시점에서, 산성의 오염물들이 상기 음이온 교환 모놀리스에 결합되게 될 것이다. 이 시점에서, 상기 흐름 경로는 상기 모놀리스로부터 상기 항체를 회수하도록 상기 모놀리스가 pH 8.0의 깨끗한 50mM의 트리스 완충제로 세정되게 하고, 라인들이 그로 향하고 그로부터 유도되게 하는 구성으로 변경된다. 이들 단계들은 상기 시스템의 특정 실시예들의 많은 특유한 능력들을 강조하며, 그 첫 번째는 개념적인 예에 의해 예시된다. 폴리뉴클레오티드 DNA는 매우 전기음성이다. 단백질 리소자임(lysozyme)은 매우 전기양성이다. 적은 NaCl이나 NaCl이 없는 완충제 내에 함께 두어질 때, DNA는 리소자임과 결합하고 이들은 함께 침전된다. 불충분한 NaCl가 첨가될 경우, 이들은 재가용화되고, 서로에 대해 독립적으로 남는다. 목적이 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)의 방법에 의해 상기 원하는 생성물 리소자임로부터 DNA를 제거하는 것이었을 경우, 상기 음이온 교환체(anion exchanger) 상의 전기양성의 전하들이 상기 DNA와 결합하는 것을 불가능하게 하고, 이에 따라 상기 리소자임으로부터 이를 제거하는 제한을 부여하는 높은 염 농도를 제외하면 두 종들이 가용성이었고 서로로부터 독립적이었던 상기 샘플을 적용하는 것이 이상적일 수 있었다. 개시되는 장치 및 프로세스로써, 상기 DNA와 리소자임이 pH 3.5의 100mM 아세트산, 1.7M의 NaCl 내에서 가용성이고 서로로부터 독립적일 수 있었던 것으로 여겨진다. 상기 염 농도가 내려가기 시작하면서, DNA는 리소자임보다 그 표면상에 수백만 배의 보다 전기양성인 기들을 구현하기 때문에 리소자임에 비해 상기 음이온 교환 모놀리스 보다 강하게 이끌릴 수 있었던 것으로 여겨진다. 리소자임은 한편 상기 음이온 교환 모놀리스의 전기양성의 표면으로부터 축출될 수 있었다. 상기 염 농도가 보다 약해질수록, 상기 음이온 교환체에 대한 DNA의 이끌림이 보다 강해졌으며, 이에 따라 상기 리소자임으로부터 이의 효과적인 제거를 향상시켰다. 이온 교환 크로마토그래피의 전체 분야에서, 모든 다른 방법들과 변형들이 상기 샘플이 하나를 제외하고 상기 음이온 교환체와 접촉되기 전에 상기 샘플이 결합 조건들로 평형화되는 것을 요구하는 점에 특히 유의할 가치가 있다. 이러한 하나의 예외는 보이드 배제(void exclusion) 모드로 호칭되는 음이온 교환 크로마토그래피의 모드이며(Nian 등의 "J. Chromatography A"((2012) 127-132)), 심지어 이러한 모드에서도, 샘플 부피는 입자들로 충전된 칼럼의 부피의 약 40% 이상이 되지 않도록 제한된다. 상기 샘플을 필요한 결합 조건들까지 평형화시키기 위한 별도의 이전의 단계 없이 임의의 pH 또는 염 농도에서 제한되지 않는 샘플 부피의 적용을 허용하도록 개시되는 방법의 능력을 유지하는 것으로 이전에 기술되었던 음이온 교환 크로마토그래피의 알려진 변형은 없다. 개시되는 장치 및 방법은 이러한 능력을 유지한다. 두 번째 특유한 특징은 상기 시스템의 특정 실시예들이 상기 음이온 교환체에 결합될 수 있었고, 결국 상기 단백질 제제가 이들이 결합될 수 있었던 조건들 하에서 상기 음이온 교환체와 접촉되기 전에 이러한 오염물들의 보다큰 부하를 제거하기 위해 상기 음이온 교환체로부터 높은 용량을 요구하는 오염시키는 단백질들의 대부분을 제거하는 점이다. 대부분의 이러한 오염물들은 상기 IgG 농축 및 바이러스 불활성화 단계들 동안에 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내의 공극들을 통해 제거된다. 이는 멤브레인들 및 모놀리스들과 같은 통상적으로 신속하지만 낮은 용량의 대류성 흡착 크로마토그래피 물질들의 사용을 허용하는 중요한 실현할 수 있는 단계인 상대적으로 도전받지 않는 상기 음이온 교환체의 능력을 가져온다. 일부 이러한 오염물들이 상기 음이온 교환체가 라인 내로 투입될 때에 상기 제제 내에 남을 수 있는 정도까지, 초기의 높은 염 농도가 이들이 결합되는 것을 방지하고, 이들이 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 공극들을 통해 제거되는 추가적인 기회를 가능하게 한다. 본 발명의 특정 실시예들의 세 번째 특유한 특징은 상기 완충제가 교환되면서 상기 단백질 제제가 상기 음이온 교환 모놀리스를 통해 수회 순환되는 사실에 관한 것이다. 사실상 고정층 흡착 크로마토그래피의 모든 알려진 방법들은 음이온 교환체와 같은 칼럼을 통한 샘플의 단일의 통과에 기초한다. 어떤 특정한 이론에 귀결되지 않고, 상기 음이온 교환체를 통한 다중의 통과들이 오염물들의 보다 효과적인 결합을 유지하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 특정 실시예들의 네 번째 특유한 특징은 보다 우수한 프로세스 제어에 관한 것이다. 이온 교환체들에 적용되는 샘플들은 통상적으로 상기 완충제와 이들의 조성에서 약간 다르며, 상기 교환체는 약간 다른, 특히 통상적으로 보다 높은 염의 농도를 포함하도록 평형화된다. NaCl과 같은 염으로부터의 염화물 이온들은 음이온 교환체의 표면으로부터의 수산화물 이온들을 대체하며, 제어되지도 않는 기간 동안 조절 없이 상기 완충제의 pH가 상승되게 한다. 이러한 현상은 pH 편위(excursion)들로 널리 알려져 있다. pH 편위들은 상기 음이온 교환체가 상기 IgG가 머무르는 동일한 조건들까지 동시에 평형화되기 때문에 개시되는 방법들로 제거된다. 본 발명의 특정 실시예들의 다섯 번째 특유의 특징은 프로세스 제어에도 적용된다. 음이온 교환체들에 적용되는 대부분의 IgG 샘플들은 이전의 단백질 A 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 단계, 또는 이전의 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 단계, 또는 다른 크로마토그래피 단계로부터 용리되었다. 양 경우들에서, 상기 IgG 제제는 과도한 염을 함유하였다. 별도의 장비를 요구하는 완충 교환 단계를 회피하기 위해, 대부분의 프로세스들은 상기 샘플이 희석 및 pH 적정에 의해 평형화되는 것을 요구한다. 이는 샘플 부피를 증가시키며, 수동으로 수행되기 때문에 상이한 제조 로트들에 걸쳐 높은 정도의 재현성을 유지하기가 어렵다. 특정 실시예들의 개시되는 장치로써, 상기 단백질 제제는 매번 각각의 수행에 대해 목표 조건들로 정확하게 완충제 교환되며, 이에 따라 재현성이 향상된다. 본 발명의 특정 실시예들의 여섯 번째 특유한 특징은 크로마토그래피 매체들의 평형화, 샘플 제제, 샘플 적용 및 오염물 제거가 칼럼 크로마토그래피의 통상적인 다중의 구분되는 단계들 대신에 단일의 단계로 수행되는 사실에 의해 허용되는 프로세스 부피의 감소이다. 이러한 능력을 가능하게 하는 다른 정제의 시스템은 없다. 이러한 특징은 상기 원하는 IgG의 초기 농도에 의해 구현되는 부피 감소, 물, 화학 약품의 소모 및 프로세스 시간의 상응하는 감소들을 절충시킨다. 본 발명의 특정 실시예들의 일곱 번째의 특유한 특징은 상기 프로세스의 모든 단일의 단계를 통해 10g/L 또는 20g/L 또는 50g/L 혹은 그 이상과 같이 상기 IgG를 높은 농도로 유지시키는 능력이다. 이러한 능력이나 이러한 능력들의 결합을 가능하게 하는 다른 정제의 시스템은 없다.
도면들(예를 들면, 도 1, 도 10 또는 도 15)의 장치 구성을 채용하는 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 흡착 서브유닛이 세정되었고 오프-라인(off-line)으로 되었던 후, 상기 IgG 제제가 완충 교환된다. 개시되는 장치 및 방법으로 이러한 단계를 수행하는 특별한 이점은 이러한 단계가 보다 조기의 단계들로서 동일한 장치 내에서 일어나는 점이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 정제된 IgG 제제는 상기 시스템으로부터 수집될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 제제는 상기 시스템에 배관되는 추가의 흡착 서브유닛을 통한 통과에 의해 더 정제될 수 있으며, 여기서 상기 제제는 도 7에 도시한 바와 같이 상기 시스템을 나간다. 이들 상황들은 본 발명의 특정 실시예들의 개시되는 장치 및 방법들의 또 다른 특유의 이점을 강조한다. 통상적으로, 프로세스의 각 동작 단계에서 손실들이 초래된다. 이들 손실들은 때때로 생성물이 상기 장치 내부의 표면들에 결합되기 때문에 그리고 때때로 유체들이 장치로부터 완전히 회수될 수 없기 때문에 일어나며, 회복되지 못한 부피 내에 남는 상기 원하는 항체가 손실된다. 심지어 각 단계로부터의 회수가 90%일 때, 3단계 프로세스는 생성물의 27%의 손실(73%의 회수)을 가져올 것이다. 본 발명의 방법으로써, 다중 부분 메커니즘들을 채용하는 전체 프로세스가 상기 시스템으로부터 잔류하는 원하는 생성물을 씻어 내리는 능력을 구현하는 단일 장치 내에서 수행된다. 예비 데이터는 본 발명의 시스템이 분별의 다중 메커니즘들을 수반하는 통합된 프로세스임에도 불구하고 90% 이상의 회수를 유지하는 점을 나타낸다. 모든 이전의 단계들로서와 같이, 생성물 농도는 이들 최후의 단계들에 걸쳐 거의 일정하게 유지된다. 이는 흡착 서브유닛에 결합되고 용리되거나 단순히 이를 통해 흐르면서 생성물 농도가 단계들에 걸쳐 높은 값들로부터 낮은 값들까지의 범위가 되고, 각 단계를 수용하기 위한 탱크 설비를 요구하는 종래의 크로마토그래피 프로세스들에 비해 극히 유리하다.
도 9는 정화된 세포 배양 수확물로부터 IgG 단일클론성 항체와 같은 원하는 단백질을 정제하기 위한 보다 복합한 구성을 구현하며, 여기서 상기 장치는 3개의 흡착 서브유닛들을 포함한다. 농축 및 바이러스 불활성화 단계들은 전술한 바와 같이 수행될 수 있다. 다음에, 상기 페닐 흡착 멤브레인 서브유닛은 인-라인으로 되고, pH 3.5의 100mM의 아세트산, 1.7M의 NaCl 내에 상기 IgG 제제에 초기에 노출된다. 여전히 인-라인인 상기 페닐 멤브레인 서브유닛으로, 완충제가 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 pH 7.0의 50mM의 인산나트륨(sodium phosphate), 1.7M의 NaCl로 교환된다. 상기 시스템이 이들 조건들에 도달한 후, 상기 페닐 멤브레인 및 이를 향하고 이로부터 안내되는 라인들은 상기 항체를 회수하도록 세정된다. 상기 음이온 교환 모놀리스가 인-라인으로 되고, pH 7.0의 50mM의 인산나트륨, 1.7M의 NaCl에서 상기 IgG 제제와 접촉하게 된다. 상기 제제는 이후에 pH 8.0의 50mM의 트리스로 완충제 교환된다. 상기 IgG 제제가 이들 조건들에 도달한 후, 상기 음이온 교환 모놀리스와 이를 향하고 이로부터 안내되는 라인들은 pH 8.0의 깨끗한 50mM의 트리스로 세정된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제3 흡착 서브유닛은 SO3(양이온 교환) 모놀리스로 구성될 수 있고, pH 8의 50mM의 트리스, 5mM의 NaCl로 평형화되는 동안이나 그 후에 인-라인으로 배치될 수 있다. 단계들의 순서는 원하는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 상기 흡착 단계들의 완료 후, 상기 제제는 앞서 기술한 바와 같이 최종 또는 예비 최종 제형 단계들로 완충제 교환될 수 있다. 이러한 예는 IgG 농축, 바이러스 불활성화, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 최종 제형의 전체 프로세스가 10가지 이상의 완충제들을 총괄적으로 요구할 수 있는 IgG 포집, 중간 정제, 최종 정제 및 제형에 비하여 4가지의 완충제들만을 요구하는 상기 시스템의 특유한 특징을 강조한다. 이는 완충제 제조와 관련된 노력을 크게 감소시키고, 탱크 설비 요구 사항들을 감소시키며, 이를 수행하기 위해 요구되는 상기 프로세스 및 상기 장치의 복잡성을 감소시킨다. 이러한 구성의 다른 변형된 실시예에 있어서, 제4(외부) 흡착 서브유닛이 상기 장치에 배관될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 시스템은 전술한 바와 같이 적어도 하나의 흡착 서브유닛 및 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛으로 구성될 수 있고, 제2 흡착 서브유닛(말단 흡착 서브유닛)은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 말단 흡착 서브유닛을 포함하는 재순환이 일어나지 않는 방식으로 상기 장치의 유출구에 배관될 수 있다. 이러한 실시예에 있어서, 이미 사용된 제1 흡착 서브유닛을 구비하는 상기 라인들로부터 상기 원하는 생성물을 세정한 후, 상기 제제는 상기 말단 흡착 서브유닛에 의한 오염물 제거를 위해 적합한 완충제로 완충제 교환된다. 상기 말단 흡착 서브유닛은 이후에 인-라인으로되고, 상기 원하는 단백질 제제가 상기 말단 흡착 서브유닛을 통과하면서 상기 유출구에서 수집된다. 이러한 시스템의 다른 변형 실시예에 있어서, 상기 시스템은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 구비하여 각각의 프로세스에서 유체 접촉하는 제1 및 제2 흡착 서브유닛으로 구성될 수 있는 반면, 제3 흡착 서브유닛(말단 흡착 서브유닛) 유닛은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 말단 흡착 서브유닛을 포함하는 재순환이 일어나지 않는 방식으로 상기 장치의 유출구에 배관될 수 있다. 이러한 시스템의 또 다른 변형 실시예에 있어서, 보다 많은 흡착 서브유닛들이 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 구비하여 각각의 프로세스 단계들에서 유체 접촉되어 포함될 수 있는 반면, 최종 흡착 서브유닛(말단 흡착 서브유닛)은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 말단 흡착 서브유닛을 포함하는 재순환이 일어나지 않는 방식으로 상기 장치의 유출구에 배관될 수 있다. 이전의 실시예들의 임의의 것에 있어서, 상기 말단 흡착 서브유닛은 멤브레인, 또는 모놀리스, 또는 충전된 입자들의 칼럼을 포함하는 물리적 형태가 될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들은 도면들(예를 들면, 도 1, 도 10 또는 도 15)에 예시되는 경우들과 같은 시스템들에 의해 가능하게 되는 다른 이점들을 유지한다. 상기 원하는 단백질이 접선 유동 여과 서브유닛에 의해 상기 시스템 내에 함유되기 때문에, 상기 흡착 서브유닛(들)에 의해 유지가 불가능하게 되는 염을 잘 견딜 뿐만 아니라 상기 원하는 단백질 및 오염물들의 하나 또는 그 이상의 종들을 포함하는 그렇지 않은 안정한 복합체들의 존재를 유지하는 비특이적 상호작용들을 분리시키는 이들의 능력에 대해 특히 알려진 염의 높은 농도들도 잘 견딘다. 이는 상기 원하는 단백질 제제가 분리 완충제로 완충제 교환되고, 충분히 작은 크기의 분리된 오염물들이 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내의 상기 멤브레인을 통한 이들의 통과에 의해 제거되는 분리시키는 세척 단계의 적용을 허용한다. 이와 같은 세척 단계는 전술한 바와 같은 바이러스 불활성화 대신에 수행될 수 있거나, 전술한 바와 같은 바이러스 불활성화가 이와 같은 단계로 간주될 수 있다. 이와 같은 세척 단계는 바이러스 불활성화 단계 이외에 선택적으로 수행될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 카오트로픽 염(chaotropic salt)은 구아니딘 하이드로클로이드(guanidine hydrochloride), 구아니딘 아세테이트(guanidine acetate), 나트륨 티오시아네이트(sodium thiocyanate), 칼륨 티오시아네이트(potassium thiocyanate), 또는 다른 카오트로픽 염으로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있고, 여기서 카오트로픽 염들의 하나 또는 결합의 농도는 상기 농도가 상기 원하는 단백질의 영구적인 변성을 가져오지 않는 한 0.05M, 0.1M, 0.5M, 1.0M, 또는 중간 값, 혹은 그 이상이 될 수 있다. 동일한 표시로, 다른 분리 작용제(dissociating agent)들과 결합되는 NaCl, 또는 KCl, 또는 K 혹은 Na 아세트산염(acetate)과 같은 중성염들의 결합이 가능하다. 하나 또는 그 이상의 이러한 실시예들에 있어서, 중성염에 첨가되는 분리 작용제는 요소(urea); 소르비톨(sorbitol)이나 자일리톨(xylitol); 아르기닌(arginine), 리신(lysine) 또는 히스티딘(histidine); 시스테인(cysteine), 글루티온(glutathione) 또는 시스테인(cysteine)과 같은 환원제(reducing agent); EDTA, EGTA, 시트르산(citric acid) 또는 TREN과 같은 킬레이트제(chelating agent); 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌((polyarginine) 또는 폴리알릴아민(polyallylamine)과 같은 다가의 양이온; 에틸렌글리콜(ethyleneglycol), 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 글리세롤(glycerol), 부탄올(butanol), 프로판올(propanol), 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol) 또는 페녹시에탄올(phenoxyethanol(과 같은 유기 용매; 트윈(Tween), 트리톤(Triton), 브리즈(Brij), 옥타글루코시드(octaglucoside), CHAPS, 또는 CHAPSO와 같은 계면활성제; 혹은 추가적인 분리 작용제들의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 개시되는 바와 같은 분리시키는 세척들의 원리를 적용하는 많은 방식들이 존재하는 점을 인지할 것이다.
본 발명의 특정 실시예들은 도면들(예를 들면, 도 1, 도 10 또는 도 15)에 예시되는 경우들과 같은 시스템들에 의해 가능해지는 다른 이점들을 제공한다. 상기 원하는 단백질을 유지하는 공극률을 갖는 멤브레인들 상의 접선 유동 여과 기술은 보다 작은 오염물들의 감소를 가져오지만, 감소의 정도는 완충제의 부피를 목표하는 완충제 사양에 도달하기 위해 요구되는 최소한까지 축소시키는 통상적인 실행에 의해 제한되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 장치 및 방법들로서의 완전한 정제의 과정 동안, 다중 완충 교환 단계들과 연관되는 완충제의 보다 큰 부피는 상기 멤브레인을 통한 작은 오염물 감소의 정도를 증가시킨다. 이는 상기 단백질 제제가 겪는 완충제 환경들의 다양성에 의해 더 향상되며, 이들 각각은 오염물들의 다른 하위 세트들의 용해도를 잠재적으로 증가시키고, 이에 따라 전체적으로 상기 프로세스를 통해 제거될 수 있는 오염물들의 다양성을 증가시키는 것으로 이해된다.
일부 실시예들에 있어서, 다공성 입자들로 충전된 칼럼들이 흡착 서브유닛들로 채용될 수 있다. 이는 이들의 사용이 점도를 최소화시키도록 제한되는 상기 단백질의 농도를 요구할 수 있기 때문에 효율을 감소시킬 수 있으며, 이는 입자 기반의 칼럼 크로마토그래피 시스템들에서 확산성 질량 이동을 저해하는 것으로 이해되고, 체적 유량의 감소를 요구할 수 있지만, 원하는 경우에, 이는 예를 들면 원하는 표면 화학적 성질들이 결핍된 멤브레인들 또는 모놀리스들이 사용 가능하지 않거나 경제적이지 않은 상황들에서 효과적으로 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 보다 넓은 직경들 및 짧은 층 높이들을 갖는 입자-충전 칼럼들이 채용될 수 있다. 종래의 크로마토그래피에 있어서, 이는 통상적으로 흔히 심하게 용량과 오염물 제거 효율을 제한하지만, 본 발명의 시스템에서, 완충제 교환-칼럼 평형화와 함께 상기 칼럼을 통해 상기 제제를 수회 순환시키는 능력은 이러한 장애를 감소시키거나 극복할 수 있고, 모놀리스들 및 멤브레인 기반의 흡착 크로마토그래피 장치들과 비교하여 프로세스가 다공성 입자 매체들의 일반적으로 보다 높은 용량으로부터 유익해지도록 허용한다.
일부 실시예들에 있어서, 흡착 서브유닛은 접선 유동 여과 멤브레인의 물리적인 형태가 될 수 있고, 개시되는 장치는 세포들 및 세포 소기관들과 같은 마이크로 미립자의 생성물들의 정제를 위해서 뿐만 아니라, 바이러스 입자들과 같은 마노 미립자의 생성물들을 위해서나, 단백질들 또는 폴리뉴클레오티드들 혹은 복합 탄수화물들과 같은 가용성의 생성물들을 위해서 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 IgG보다 큰 단백질들에 적용될 수 있다. 상기 시스템을 보다 큰 단백질들에 적용하는 것은 보다 큰 공극 크기 분포들을 갖는 접선 유동 여과 멤브레인들을 사용하는 기회를 제공하며, 원하는 경우에 이는 전술한 바와 같이 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통한 통과에 의해 감소될 수 있는 오염물 종들의 다양성을 잠재적으로 증가시킨다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 IgG보다 작은 단백질들에 적용될 수 있다. 상기 시스템을 보다 작은 단백질들에 적용하는 것은 보다 작은 공극 크기 분포들을 갖는 멤브레인들의 사용을 요구할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 표면 화학적 성질들을 채용하는 다른 흡착 서브유닛들이 특정한 정제 프로세스의 목표들을 구현하기 위해 필요한 경우에 다른 선택성들을 확립하도록 채용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 시스템은 결합-용리 모드로 흡착을 수행하는 데 사용될 수 있고, 여기서 상기 원하는 단백질은 상기 흡착제와 결합되며, 이후에 양이온 교환 단계가 IgG 농축 후 또는 바이러스 불활성화 후에 적용되었던 경우와 같이 상기 흡착제로부터 용리된다. 이는 또한 추가적인 완충제를 요구할 것이며, 이는 상기 시스템의 복잡성을 약간 증가시킬 것이고, 또한 프로세스 시간을 증가시킬 것인 프로세스 부피를 증가시킬 것이지만, 상기 장치의 통합된 제한들 내의 상기 결합-용리 모드 단계의 통합은 여전히 전체적으로 종래의 순차적인 크로마토그래피 동작들에 비해 물 부피의 현저한 감소들을 전달할 것이다.
앞서의 실시예들의 일부에 있어서, 단백질들의 정제를 위해 사용되는 기본적으로 동일한 구성들이 DNA의 정제를 위해 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 완충 조건들 및 흡착성 표면 화학적 성질들의 선택은 원하는 경우에 다를 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 흡착 서브유닛들의 하나는 양이온 교환체(cation exchanger)가 될 수 있고, 여기서 동작 pH는 오염시키는 단백질들을 흡착시키기 위해 약 pH 4로 설정된다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 대류 흡착 서브유닛들의 하나는 단백질들이 유지되는 반면에 DNA는 그렇지 않도록 염의 충분히 높은 농도에서 동작되는 소수성 상호작용 매체가 될 수 있다.
앞서의 실시예들의 일부에 있어서, 단백질들의 정제를 위해 사용되는 기본적으로 동일한 구성들이 바이러스 또는 바이러스 유사 입자들의 정제를 위해 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 완충 조건들 및 흡착성 표면 화학적 성질들의 선택은 원하는 경우에 다를 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 장치의 규모는 몇 ㎎의 원하는 생성물의 정제를 유지하도록 소형화될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 장치의 규모는 1㎎-100㎎의 원하는 생성물의 정제를 유지하도록 구현될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 장치의 규모는 100㎎ 내지 몇 그램의 원하는 생성물의 정제를 유지하도록 구현될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 장치의 규모는 몇 내지 수백 그램의 원하는 생성물의 정제를 유지하도록 구현될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 장치의 규모는 수백 그램 내지 킬로그램의 원하는 생성물의 정제를 유지하도록 구현될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 장치의 규모는 1㎏ 이상, 또는 10㎏ 이상, 혹은 100㎏ 이상의 원하는 생성물의 정제를 유지하도록 구현될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 장치의 규모는 보다 작거나, 중간이거나, 보다 큰 양의 원하는 생성물의 정제를 유지하도록 구현될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 도 1-도 15의 임의의 도면에 예시되는 경우들과 같은 본 발명의 장치 및 프로세스들의 변형들은 또한 침전 단계, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 비이온성 유기 중합체(nonionic organic polymer)로의 침전이나 황산암모늄이나 시트르산 나트륨과 같은 침전시키는 염으로의 침전을 포함하는 통합된 다단계 정제 프로세스의 수행을 포함하도록 채용될 수 있으며, 여기서 상기 침전 단계는 하나의 흡착 단계와 통합된다. 세포 배양 수확물의 정화(clarification)에 후속하여, 상기 수확물은 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통한 통과에 의해 원하는 부피까지 농축될 수 있다. 상기 IgG보다 작은 오염물들은 상기 접선 유동 여과 멤브레인을 통한 통과에 의해 제거된다. 이러한 단계는 또한 상기 IgG가 특정된 농도까지 농축되는 것을 가능하게 하는 이점을 유지하며, 이는 후속되는 침전 단계의 재현성을 위해 중요하다. 상기 IgG는 원하는 경우에 상기 시스템의 선택성을 조절하기에 적합한 적절한 pH 및 조건들에서 투입 완충제를 목표 농도의 원하는 침전제(precipitating agent)를 함유하는 것으로 변경하여 침전된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 IgG를 침전시키는 완충제는 pH 6.0의 1.3M의 시트르산 나트륨이 될 수 있다. 상기 장치 구성은 침전된 단백질을 유지하지만, 가용성의 단백질은 그렇지 않은 멤브레인을 구비하는 추가적인 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 흐름을 안내하도록 변경된다. 침전되지 않은 오염물들은 상기 접선 유동 여과 멤브레인을 통해 제거된다. pH 6.0의 1.3M의 시트르산 나트륨이 상기 침전물을 세척하는 효과로 상기 시스템 내로 계속적으로 펌프되며, 가용성 오염물들이 상기 접선 유동 여과 유닛의 멤브레인을 연속적으로 통과하게 한다. 상기 장치 구성은 흐름이 상기 초기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 안내되도록 다시 전환된다. 상기 투입 완충제는 침전된 상태로 상기 원하는 생성물을 유지시키지 않을 수 있는 제형(formulation)으로 변경되며, 이에 따라 pH 8.0의 50mM의 트리스와 같이 그 재가용화를 구현한다. 상기 항체가 재가용화된 직후, 예를 들면 음이온 교환 모놀리스 또는 멤브레인으로 구성되는 상기 흡착 서브유닛이 인-라인(in-line)으로 위치하고, 상기 시스템은 pH 8.0의 50mM의 트리스로 완전히 완충제 교환된다. 상기 흡착 서브유닛 유닛은 pH 8.0의 50mM의 트리스로 세정되고, 라인으로부터 벗어나며, 이후에 상기 시스템은 예비 제형 완충제(preformulation buffer)로 선택적으로 완충제 교환되고, 그 후에 상기 시스템은 상기 IgG의 모두를 회수하도록 세정된다. 관련 실시예에 있어서, 2개의 흡착 서브유닛들을 포함하는 시스템이 채용된다. 양 시스템 구성에서, 바이러스 불활성화 및/또는 비특이적 상호작용들의 분리와 같은 추가의 선택적인 단계들은 모든 단계들이 하나의 장치로 수행되는 단일 유닛 동작으로 통합되는 방식으로 통합될 수 있는 점이 이해될 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 가용성 상태로 상기 원하는 생성물을 유지하는 멤브레인을 구비하는 제1 접선 유동 서브유닛 및 통합된 다단계 프로세스의 적어도 하나의 단계 동안에 상기 원하는 생성물을 유지하지 않지만, 상기 생성물이 결합될 수 있는 현탁된 입자들을 유지하는 능력을 갖는 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 서브유닛을 포함하는 상기 장치의 변형이 채용될 수 있다. 예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피 입자들과 같은 이러한 입자들은 제1 흡착 서브유닛의 선택적인 물리적 포맷을 제공한다. 각 초미세여과 서브유닛이 그 자신의 여과액 포트를 포함할 것이며, 작업자에 의해 원하는 경우에 적어도 하나의 초미세여과 서브유닛이 폐기물이나 생성물이 다른 용기들로 안내될 수 있도록 상기 여과액 포트 상에 밸브를 추가로 포함할 수 있는 점이 이해될 것이다. 상기 장치는 실시예들에서 또는 도면들을 참조하여 예시되고 설명되거나 그렇지 않으면 여기에 기재되는 바와 같이 구성되는 하나 또는 그 이상의 추가 흡착 서브유닛을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 특정 실시예들에서, 본 발명이 유동화된 입자들로 구성되는 적어도 하나의 흡착 서브유닛 및 상기 크로마토그래피 입자들을 유지하지만, 가용성의 종들을 유지하지 않는 다공성 멤브레인을 구비하는 하나의 접선 유동 여과 서브유닛의 본질적인 핵심은 남기면서, 고정층 흡착 서브유닛을 생략하고, 가용성의 생성물을 유지하는 멤브레인을 갖는 접선 유동 여과 서브유닛을 생략하도록 단순화될 수 있는 유동화된 입자들에 대해 흡착 단계들을 수행하기 위한 장치를 제공하는 점이 이해될 것이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들은 상기 원하는 생물학적 생성물을 유지하기에 충분한 공극률들을 가질 수 있고, 여기서 공극률들의 크기는 상기 생물학적 생성물 단독과는 대조적으로 상기 생물학적 생성물이 연관되는 상기 입자들을 참조하여 결정된다.
여기에 기재되는 본 발명의 실시예들의 임의의 것에 있어서, 상기 장치 또는 프로세스는 물질들의 조성이 처리 동안에 평가될 수 있고 보고될 수 있도록 2 또는 그 이상의 지점들에서의 모니터링을 포함할 수 있다. 이러한 모니터링은 UV 광 흡광도 모니터들, 탁도(turbidity) 모니터들, 전도도 모니터들, pH 모니터들, 압력 모니터들 및/또는 중량 모니터들뿐만 아니라 다른 것들에 의해 구현될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 2 이상의 지점들에서 모니터될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 컨트롤러가 두 개의 특정한 지점들에서 상기 시스템을 통해 흐르는 액체의 조성을 연속적으로 모니터하도록 설정될 수 있고, 이러한 비교에 기초하여 자동적으로 사건들을 촉발시키도록 설정될 수 있다. 이러한 일 예에서, 접선 유동 여과 서브유닛을 나가는 용액의 pH 및 전도도가 투입 용액의 전도도와 정합될 때, 완충제 교환이 완료에 도달되었던 것으로 판단될 것이며, 단계들의 순서에서 다음 사건이 개시될 것이다. 관련 예에서, 상기 사건은 접선 유동 여과 서브유닛을 나가는 용액이 상기 투입 용액과 99%의 동일성, 또는 98%, 또는 97%, 또는 96%, 또는 95%, 또는 90%, 혹은 조작자에 의해 설정되는 다른 정도의 동일성을 이룰 때에 개시될 수 있다. 공통적으로 모니터링되는 변수들은 pH, 전도도 및 하나 또는 그 이상 파장들에서 UV 흡광도를 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 프로세스 액체들 내에 용해되는 기체들을 포함하여 유체 유동 스트림(stream)으로부터 과잉의 기체들을 제거하는 능력과 부합될 것이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 기체 제거를 위한 장치는 통상적인 버블 트랩(bubble trap)으로 구성될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 기체 제거가 상기 시스템 내의 액체들이 펌프의 유입구측 상의 가압된 상태로부터 상기 펌프의 유출구측 상의 상대적으로 가압되지 않은 상태로 진행한 후에 즉시 일어나는 경향이 있을 것이기 때문에, 상기 펌프가 상기 시스템 내에 막간 차압을 생성하는 데 사용된 직후에 상기 버블 트랩을 배치하는 것이 유리할 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 기체 제거를 위한 장치는 헬륨 또는 아르곤과 같은 비활성 기체가 공급되는 기체 교환 멤브레인으로 구성될 수 있고, 이들의 일반적인 물과의 불혼화성(immiscibility) 때문에 상기 액체로부터 상기 멤브레인을 지나 기체들을 흡수하지만, 이들을 상기 액체 유동 스트림으로 들어가게 하지는 않는다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 흡착 서브유닛들의 하나 또는 그 이상은 결합-용리 모드로 동작하며, 여기서 동작 완충제들의 적어도 하나는 상기 원하는 생성물이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들에 결합하게 되도록 조제된다. 이러한 접근은 관류(flow-through) 모드로 배타적으로 이용될 때에 상기 시스템의 많은 이점들을 제공하지는 못하지만, 종래의 크로마토그래피 시스템들보다 실질적으로 우수하거나 보다 경제적인 성능을 제공할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양 수확물, 세포 배양 상청액(supernatant), 세포 배양으로부터 유래되는 단백질을 함유하는 용액, 세포 배양으로부터 유래되는 항체를 함유하는 용액, 세포 배양으로부터 유래되는 바이러스를 함유하거나 바이러스 유사 입자를 함유하는 용액, 또는 정제의 이전의 단계로부터의 표적 종들을 함유하는 용액이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 혈청, 혈장 또는 다른 체액, 혹은 조직 균질액과 같이 부분으로 나누어지는 생성물을 함유하는 자연적으로 생성되는 유체이다.
일부 실시예들에 있어서, 세포 배양이 원하는 단백질들의 정제를 위한 제제 내에서 정화되는 방법이 가장 우수한 결과들을 얻는 상기 장치 및 방법들의 능력에 실질적으로 영향을 미치는 점이 예기치 않게 발견되었다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 샘플은 정화된 세포 배양 상청액(CCS)을 포함한다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 CCS는 원심분리, 응집(flocculation), 여과, 혹은 이들 또는 다른 기술들의 일부 결합에 의해 정화될 수 있다. 특히, 크로마틴 및 연관 분해대사산물(catabolite)들의 적어도 90%의 제거를 구현하는 정화 방법의 능력은 고도의 정제를 구현하는 상기 시스템의 능력을 불균형적으로 증가시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 개시되는 장치 및 방법에 의해 처리되는 상기 원하는 생성물 제제는 세포들을 함유하지 않는 세포 배양 수확물이 될 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 수확물은 원심분리 및 여과와 같은 물리적인 방법들에 의해 정화될 수 있다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 수확물은 하나 또는 그 이상의 양성으로 하전된 표면들과 접촉시켜 정화될 수 있다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 수확물은 크로마틴 및 크로마틴 분해대사산물들의 90% 또는 그 이상을 제거하는 방법에 의해 정화될 수 있다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 정화 방법은 상기 원하는 생성물 제제를 가용성 및/또는 불용성 다가 유기 이온들과 접촉시키는 단계를 수반한다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 제제 유기 다가 이온들로 컨디셔닝(conditioning)하는 단계는 상기 샘플을 전기양성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 전기양성의 유기 첨가제는 에타크리딘(ethacridine), 메틸렌 블루(methylene blue), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide)으로 이루어진 그룹으로부터의 적어도 하나의 종들을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 이와 같은 종들의 농도 또는 상기 종들의 결합의 응집체(aggregate) 농도는 0.001% 내지 1%, 또는 0.01% 내지 0.1%, 또는 0.02% 내지 0.05%의 범위 내에 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 상기 원하는 단백질의 회수의 상당한 감소를 야기하지 않는 알칼리 값까지 조정될 수 있다. 상기 원하는 단백질이 IgG 단일클론성 항체인 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 pH는 항체 등전점(isoelectric point)의 pH 단위의 반인 pH 값까지, 또는 실험 결과들이 항체 회수가 허용될 수 있지만 이러한 조정이 일반적으로 필수적이 아닌 것을 나타내는 경우에는 그 이상으로 조정될 수 있다. 임의의 pH 조정이 이루어지는 정도까지, 단백질 등전점의 1 pH 단위 이내의 값 또는 1.5 pH 단위 이내의 값이 충분할 것이며, 일부 경우들에서 2 pH 단위 이내 또는 그 이상의 값이 충분할 것이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 컨디셔닝하는 단계는 상기 샘플을 전기음성의 유기 첨가제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 전기음성의 유기 첨가제는 헵탄산(heptanoic acid), 헵텐산(heptenoic acid), 옥탄산(octanoic acid), 옥텐산(octenoic acid), 노난산(nonanoic acid), 노넨산(nonenoic acid), 데칸산(decanoic acid), 메틸 블루(methyl blue)로 이루어진 그룹으로부터의 적어도 하나의 종들을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 이와 같은 종들의 농도 또는 종들의 결합의 전체 농도는 0.001% 내지 10%, 또는 0.01% 내지 1%, 또는 0.1% 내지 0.5%의 범위 내에 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 상기 원하는 단백질의 회수의 상당함 감소를 야기하지 않는 산성의 값들까지 조정될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제제의 pH는 3.5 내지 6.5, 4.0 내지 6.0, 4.5 내지 5.5, 5.0 내지 5.3, 5.15 내지 5.25, 또는 5.2의 범위, 혹은 다른 중간 값까지 조정될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 컨디셔닝하는 단계는 상기 샘플을 용해되지 않은 알란토인(allantoin)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 단백질 제제 내에 체류하는 상기 첨가된 알란토인은 약 0.6% 내지 50%, 또는 0.7% 내지 20%, 또는 0.8% 내지 10%, 또는 0.9% 내지 5%, 또는 1% 내지 2%, 혹은 중간 값까지의 양이 될 수 있다. 앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 건조 알란토인의 평균 입자 크기는 과포화된 용액 내의 용해되지 않은 알란토인의 가장 큰 전체 표면적을 구현하는 목표로 이용 가능한 가장 작은 크기로 선택된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 알란토인은 보다 작은 입자 크기를 생성하도록 과립화된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 건디셔닝하는 단계는 상기 샘플을 그 임계 미셀 농도(critical micelle concentration)보다 낮은 농도에서 비이온성 또는 쌍성이온성 계면활성제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 컨디셔닝하는 단계는, (i) 전기음성의 표면을 갖는 제1 고체 기재(substrate)인 제1 성분을 제공하는 단계를 포함하고; (ii) 상기 단백질 제제를 상기 제1 성분과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 동작 조건들은 상기 제1 성분에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하고; (iii) 크로마틴 함량을 갖는 상기 원하는 단백질을 상기 제1 성분으로부터 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기음성의 표면은 제2 전기음성의 표면을 동반할 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 컨디셔닝하는 단계는, (i) 전기양성의 표면을 갖는 제1 고체 기재인 제1 성분을 제공하는 단계를 포함하고; (ii) 상기 단백질 제제를 상기 제1 성분과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 동작 조건들은 상기 제1 성분에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하고; (iii) 감소된 크로마틴 함량을 갖는 상기 원하는 단백질을 상기 제1 성분으로부터 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기양성의 표면은 트리스(Tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine)(TREN)의 잔류물들을 지닌다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기양성의 표면은 상기 표면상에 TREN의 다중 층들을 합성적으로 생성하여 형성되는 TREN 덴드리머(dendrimer)와 같거나, 그 아미노 잔기들에 결합되는 소수성 잔류물들을 갖는 TREN과 같은 TREN의 유도체를 지닌다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 소수성 잔류물들은 알킬(alkyl)이나 아릴(aryl) 조성이 될 수 있거나, 결합된 조성이 될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 알킬 잔류물들은 3개, 또는 5개, 또는 6개, 또는 7개, 또는 8개, 또는 9개, 혹은 10개의 탄소 원자들로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 탄소 원자들의 범위는 4부터 8까지이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기양성의 표면은 제2 전기양성의 표면을 동반할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제제를 컨디셔닝하는 데 사용되는 전기양성의 고상(solid phase)은 TREN(트리스(2-아미노에틸)아민)과 같은 아미노계 금속 킬레이트 리간드(chelating ligand) 또는 그 유도체들이나 다른 전기양성의 킬레이트 리간드의 하나를 채용하며, 여기서 상기 리간드에는 철이 포함되고, 과잉의 이온은 상기 제제를 컨디셔닝하기 위해 상기 고상이 채용되기 전에 제거된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 컨디셔닝하는 단계는, (i) 전기양성의 표면을 갖는 제1 고체 기재인 제1 성분을 제공하는 단계를 포함하고; (ii) 전기음성의 표면을 갖는 제2 고체 기재인 제2 성분을 제공하는 단계를 포함하며; (iii) 상기 단백질 제제를 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 단백질 제제가 양 성분들에 동시에 접촉될 수 있도록 구성되며, 여기서 상기 동작 조건들은 상기 제1 또는 제2 성분들에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하고; (iv) 감소된 크로마틴 함량을 갖는 상기 원하는 단백질을 상기 제1 및 제2 성분들로부터 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 전기양성의 표면은 트리스(2-아미노에틸)아민의 잔류물들을 지닌다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제를 유기 다가 이온들로 컨디셔닝하는 단계는, (i) 상기 단백질 제제를 금속과 결합할 수 있는 적어도 하나의 표면-결합 리간드를 구비하는 적어도 하나의 고체 표면과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 금속과 결합할 수 있는 표면-결합 리간드는 초기에 실질적으로 금속이 없으며, 여기서 동작 조건들은 상기 적어도 하나의 고체 표면에 대한 상기 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하도록 선택되고; (ii) 상기 단백질 제제를 상기 적어도 하나의 표면-결합 리간드로부터 분리하는 단계를 포함한다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 가용성의 전기양성 또는 전기음성의 유기 첨가제 및/또는 전기음성, 전기양성 또는 금속 친화 리간드를 지니는 고체 표면으로 이미 처리된 단백질 제제는 후속하여 그 유체-접촉 표면이 양성의 전하들을 포함하는 장치를 통해 흐를 수 있다.
크로마틴-지향(chromatin-directed) 정화 방법의 적용을 예시하는 일 실시예에 있어서, 알란토인이 세포 배양 수확물에 1%(v/v)의 양으로 첨가된다. 상기 세포 배양은 세포들을 함유할 수 있거나, 상기 세포들은 이전에 제거되었을 수 있다. 메틸렌 블루가 0.025%(w/v)의 농도로 첨가된다. 선택적으로, 에타크리딘이 0.025%의 농도로 첨가될 수 있다. 선택적으로, 0.025%의 세틸트리메틸암모늄 브로마이드가 0.025%의 농도로 첨가될 수 있다. 선택적으로, 이들 또는 다른 전기양성의 유기 첨가제들의 결합이 0.025%의 결합 농도로 사용될 수 있다. 혼합물은 이후에 2시간 동안 교반되면서 배양된다. 상기 전기양성의 금속 친화 리간드 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)을 지니는 입자들이 2%-5%(v:v)의 양으로 첨가된다. 상기 혼합물은 4시간 동안 교반되면서 배양되며, 이후에 고체들이 임의의 편리한 방법으로 제거된다. 상기 원하는 단백질을 함유하는 남아 있는 용액은 선택적으로 그 유체 접촉 표면상에 양성의 전하들을 지니는 뎁스 필터(depth filter)를 통해 흐를 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 TREN은 그 말단 아미노 잔기들이 소수성 잔기들을 지니도록 화학적으로 변형되며, 여기서 상기 소수성 잔기들은 아릴, 알킬 또는 혼합 조성이 될 수 있고, 알킬일 경우, 1개부터 10개까지의 숫자의 탄소 원자들을 가진다.
크로마틴-지향 정화 방법의 적용을 예시하는 다른 실시예에 있어서, 알란토인이 세포 배양 수확물에 약 1%(v/v)의 양으로 첨가된다. 상기 세포 배양은 세포들을 함유할 수 있거나, 상기 세포들은 이전에 제거될 수 이었다. 약 0.6%의 헵탄산이 첨가된다. 선택적으로 약 0.4%의 옥탄산이 첨가되거나, 약 0.4%의 옥텐산이 첨가된다. 선택적으로 약 0.3%의 펠라곤산(pelargonic acid)(노난산(nonanoic acid))이 첨가되거나, 약 0.4%의 노넨산(nonenoic acid)이 첨가된다. 선택적으로 약 0.2%의 카프릭산(capric acid)이 첨가된다. 선택적으로, 약 0.5%의 메틸 블루가 첨가된다. 선택적으로, 이들 또는 다른 전기음성의 유기 첨가제들의 결합이 사용될 수 있다. 상기 혼합물은 이후에 2시간 동안 교반되면서 배양된다. 상기 전기양성의 금속 친화 리간드 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)을 지니는 입자들이 약 2%(v:v) 내지 약 5%(v:v)의 양으로 첨가된다. 혼합물은 4시간 동안 혼합되면서 배양되며, 이후에 고체들이 임의의 편리한 방법으로 제거된다. 상기 원하는 단백질을 함유하는 남아 있는 용액은 선택적으로 그 유체 접촉 표면상에 양성의 전하들을 지니는 뎁스 필터를 통해 흐를 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 TREN은 그 말단 아미노 잔기들이 소수성 잔기들을 지니도록 화학적으로 변형되며, 여기서 상기 소수성 잔기들은 아릴, 알킬 또는 혼합 조성이 될 수 있고, 알킬일 경우, 1개부터 10개까지의 숫자의 탄소 원자들을 가진다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 염이 가용성 또는 불용성의 다가 이온과의 과도한 상호작용들을 통한 상기 원하는 단백질의 손실을 방지하도록 정화 혼합물에 첨가될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, NaCl이 IgM 항체 또는 비-항체 단백질이 크로마틴-지향 정화 시스템의 구성 요소들과 결합하는 것을 방지하는 목적을 위해 약 20mS/㎝와 동등한 대략적인 전도도로 약 200mM에 대응되는 레벨까지 전도도를 증가시키도록 첨가될 수 있다. 이러한 다른 실시예들에 있어서, 상기 NaCl 농도는 특정한 재조합 단백질을 수용하도록 보다 크거나 보다 작은 정도까지 상승될 수 있다. 임의의 특정한 단백질을 수용하기 위한 적절한 염 농도들은 상기 원하는 단백질의 샘플을 양이온 교환체 또는 음이온 교환체에 적용하고, 이들을 증가하는 염의 차이로 용리시키며, 상기 원하는 단백질 피크에서 상기 전도도를 결정하고, 이후에 상기 정화 프로세스에 대한 전도도 값을 이용하여 빠르고 용이하게 산정될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 생물학적 생성물은 단백질, 항체, 응고 인자(clotting factor), 세포 소기관, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 유전자 치료 벡터(gene therapy vector), 폴리뉴클레오티드, 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 생물학적 생성물은 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM의 다클론성 또는 단일클론성 항체, 혹은 Fc-융합 단백질과 같은 이들의 복합 재조합 구성체(construct), 혹은 접합체(conjugate)와 같은 이들의 합성 복합 구성체이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 생물학적 생성물은 엽록체, 미토콘드리아, 리보솜들, 엑소좀(exosome) 또는 다른 소기관과 같은 세포 소기관이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 생물학적 생성물은 원핵(prokaryotic) 세포, 진핵(eukaryotic) 세포, 줄기 세포 또는 바이러스 입자이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 단백질 또는 바이러스를 침전시키기 위해 채용되는 약제(agent)는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜(polypropyleneglycol), 폴리비닐피르롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 덱스트란(dextran), 녹말(starch), 셀룰로오스(cellulose)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나가 될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 흡착 서브유닛은 멤브레인 흡착기일 수 있으며, 여기서 멤브레인 흡착기라는 용어는 표면이 단백질 제제 내에 용해되거나 현탁된 종들과의 화학적 상호작용들에 참여하는 것을 허용하도록 그 표면이 화학적으로 변형되었던 미세다공성 멤브레인을 언급하는 통상적인 명칭을 나타내는 것으로 이해된다. 멤브레인 흡착기들은 통상적으로, 예를 들면 15 또는 그 이상이나 그 이하의 다층의 멤브레인 물질로 구성된다. 화학적 변형의 성질은 상기 멤브레인이 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, 수소 결합 상호작용들, 금속 친화 상호작용들로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상에 참여할 수 있게 하는 것과 같은 성질이 될 수 있다. 정전기적 상호작용들 중에서, 상기 멤브레인의 표면은 전기양성 또는 전기음성 또는 쌍성이온성이 될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 흡착 서브유닛은 표면이 단백질 제제 내에 용해되거나 현탁된 종들과의 화학적 상호작용들에 참여하는 것을 허용하도록 그 표면이 화학적으로 변형되었던 모놀리스가 될 수 있다. 화학적 변형의 성질은 상기 모놀리스가 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, 수소 결합 상호작용들, 금속 친화 상호작용들로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상에 참여할 수 있게 하는 것과 같은 성질이 될 수 있다. 정전기적 상호작용들 중에서, 상기 멤브레인의 표면은 전기양성 또는 전기음성 또는 쌍성이온성이 될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 흡착 서브유닛은 그 표면들이 단백질 제제 내에 용해되거나 현탁된 종들과의 화학적 상호작용들에 참여하는 것을 허용하도록 그 표면들이 화학적으로 변형되었던 충전된 입자들의 칼럼이 될 수 있다. 화학적 변형의 성질은 상기 멤브레인이 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, 수소 결합 상호작용들, 금속 친화 상호작용들로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상에 참여할 수 있게 하는 것과 같은 성질이 될 수 있다. 정전기적 상호작용들 중에서, 상기 멤브레인의 표면은 전기양성 또는 전기음성 또는 쌍성이온성이 될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 흡착 서브유닛은 표면이 단백질 제제 내에 용해되거나 현탁된 종들과의 화학적 상호작용들에 참여하는 것을 허용하도록 그 표면이 화학적으로 변형되었던 혼성체 또는 화합물 구조를 구현할 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 혼성체 또는 화합물 흡착 서브유닛은 수소화 상(hydrogelatinous phase)이 존재하는 구조 골격을 포함할 수 있다. 화학적 변형의 성질은 상기 모놀리스가 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, 수소 결합 상호작용들, 금속 친화 상호작용들로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상에 참여할 수 있게 하는 것과 같은 성질이 될 수 있다. 정전기적 상호작용들 중에서, 상기 멤브레인의 표면은 전기양성 또는 전기음성 또는 쌍성이온성이 될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 흡착 서브유닛의 유체 접촉 표면은 전기양성이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 전기양성의 흡착 서브유닛은 음이온 교환체(anion exchanger)이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 전기양성 크로마토그래피 서브유닛은 수소 결합들, 소수성 상호작용들, pi-pi 결합, 금속 친화도로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상에 참가하는 능력과 같은 추가적인 화학적 기능성들을 구현한다. 이러한 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 다중의 화학적 상호 작용성들을 구현하는 크로마토그래피 매체들은 혼합 모드 또는 다중 모드 매체들로 언급된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 흡착 서브유닛의 유체 접촉 표면은 전기음성이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 전기음성의 흡착 서브유닛은 양이온 교환체(cation exchanger)이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 전기음성의 흡착 서브유닛은 수소 결합들, 소수성 상호 작용들, pi-pi 결합, 금속 친화도로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상에 참가하는 능력과 같은 추가적인 화학적 기능성들을 구현한다. 이러한 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 다중의 화학적 상호 작용성들을 구현하는 크로마토그래피 매체들은 혼합 모드 또는 다중 모드 매체들로 언급된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 흡착 서브유닛의 유체 접촉(fluid contact) 표면은 소수성이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 소수성은 프로필기(propyl group), 부틸기(butyl group), 펜틸기(pentyl group), 헥실기(hexyl group), 헵틸기(heptyl group), 옥틸기(octyl group)와 같은 알킬 화학 모이어티(moiety)에 의해 부여된다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 소수성은 페닐기(phenyl group), 벤질기(benzyl group), 비-페닐기(bi-phenyl group)와 같은 아릴 또는 방향족 모이어티에 의해 부여될 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 전기음성의 흡착 서브유닛은 소수성 상호작용 크로마토그래피 매체이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 소수성 크로마토그래피 서브유닛은 수소 결합들, 정전기적 상호작용들, pi-pi 결합, 금속 친화도로 이루어진 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상에 참여하는 능력과 같은 추가적인 화학적 기능성들을 구현한다. 이러한 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 다중의 화학적 상호 작용성들을 구현하는 크로마토그래피 매체들은 혼합 모드 또는 다중 모드 매체들로 언급된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 장치의 표면들에 접촉되는 샘플, 시약 및 반응 혼합물의 임의의 결합은 쉽게 제거될 수 있고 선택적으로 폐기될 수 있는 물질을 포함하거나 연관된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 분할제(fractionating agent)들, 생물학적 제제(biological preparation), 시약들 및 반응 혼합물의 임의의 결합과 접촉하게 되는 복수의 모듈식 정제 구성 요소들은 일회용이며, 상기 정제 모듈 구성 요소들은 배관 세트들, 멤브레인들, 혼합기들 및 밸브 몸체들의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 시스템은 부분적으로 또는 완전히 자동화된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 원하는 생물학적 생성물은 단백질이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 단백질은 항체이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 항체는 IgG이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 단일클론성 IgG이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 방법은 비-IgG 항체를 정제하는 데 이용된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 항체는 IgM이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 방법은 비-항체 단백질을 정제하는 데 이용된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 비-항체 단백질은 응고 단백질(clotting protein)이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 비-항체 단백질은 인자(Factor) VIII이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 원하는 단백질은 여기에 개시되는 방법들로 처리되기 전에 부분적으로 정제된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 원하는 생성물은 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 DNA는 유전자 치료를 위한 플라스미드이다. 관련 실시예에 있어서, 상기 원하는 생성물은 RNA이다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 원하는 생성물은 바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 바이러스는 항바이러스 치료들의 테스트를 지지하는 데 서용된다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 바이러스 백신(vaccine)으로 사용된다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 바이러스 입자는 항생제 대치(antibiotic replacement)를 위해 사용된다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 바이러스 입자는 유전자 치료 벡터(vector)로 사용된다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 방법의 단계는 트리(tri)(n)부틸 포스페이트(butyl phosphate), 옥탄산, 메틸렌 블루, 에타크리딘, 클로르헥시딘(chlorhexidine), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 또는 특히 유기 용매들 및 계면활성제들을 포함하여 앞서 열거한 바와 같은 다른 약제들과 잠재적으로 결합되는 관련 화합물들과 같은 바이러스를 불활성화시키는 약제들을 추가적으로 포함할 수 있다.
앞서의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 동작 pH는 4 내지 9, 또는 5 내지 8, 또는 6 내지 7, 또는 7 내지 8, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 혹은 중간 값의 범위 내에 있을 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 장치를 제공하는 단계를 포함하는 프로세스들이 제공되며, 상기 장치는, (1) 목표 부피 내에 생물학적 생성물을 함유하는 용기(vessel)를 포함하고, (2) 다중 정제 유닛들을 포함하며, 상기 다중 정제 유닛들은 (a) 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하고, 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛은 상기 생물학적 생성물의 유체역학적 반경의 약 50% 보다 작은 유체역학적 반경을 갖는 오염물들의 통과를 허용하면서 상기 생물학적 생성물을 유지하는 하나 또는 그 이상의 멤브레인들을 구비하며, (b) 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하고, (3) 상기 용기 및 상기 다중 정제 유닛들을 연결함에 따라 상기 장치를 통한 순환을 가능하게 하는 다중 도관(conduit)들을 포함하고, (4) 상기 도관들을 통해 흐름을 안내하고, 상기 용기 및 서로로부터 상기 다중 정제 유닛들의 임의의 하나 또는 그 이상의 분리를 허용하는 밸브들을 포함하며, (5) 흐름을 유도하고 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 부분들 내부의 차압(differential pressure)을 제어하도록 구성되는 펌프들을 포함하며, 상기 프로세스는, 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛이 상기 밸브들을 통해 서로 유체 연통되도록 구성될 때에 상기 제제를 일회 또는 수회 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 일회의 접촉시키는 단계는 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 대한 오염물들 및 상기 생물학적 생성물의 결합을 실질적으로 방지하는 조건들 하에서 수행되며, 이후에 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 (1) 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 대한 오염물들의 결합을 가능하게 하지만 상기 생물학적 생성물의 결합은 가능하게 하지 않거나, (2) 오염물들의 적어도 일부를 유지하면서 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛으로부터 상기 생물학적 생성물을 방출하도록 조건들을 변경시키는 단계가 수반되는, 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 대한 오염물들 및 상기 생물학적 생성물의 결합을 가능하게 하도록 조건들을 변경시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 접촉시키는 단계가 일회 이상 수행될 때, 변경된 조건 (1)이 선택된다.
일부 실시예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 멤브레인들을 구비하는 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛은 상기 생물학적 생성물의 적어도 50%를 유지할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 생물학적 생성물의 유체역학적 반경의 약 50% 보다 작은 유체역학적 반경을 갖는 오염물들의 통과를 가능하게 하는 단계는 상기 생물학적 생성물의 유체역학적 반경의 약 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 보다 작은 유체역학적 반경을 포함할 수 있다.
여기에 개시되는 프로세스들의 수행에 있어서, 해당 기술 분야의 숙련자는 여기에 개시되는 프로세스들에 채용되는 정확한 "조건들"이 많은 변수들에 의존하며, 그 중에서도 상기 흡착 서브유닛 매체들 및 상기 생물학적 표적을 위한 조성의 선택에 의존하는 점을 이해될 것이다. 숙련자는 상기 조건들을 특정 생성물에 맞추기 위한 프로세스들이 동일하고 익숙한 원리들을 따르며, 기본적으로 이들이 종래의 방법들을 위한 조건들을 맞추어지기 위한 경우와 동일한 점을 동등하게 이해할 것이다. 따라서, 조작자들은 종래의 흡착 크로마토그래피 방법들로 정제 방법들을 발전시키도록 이들이 발전시켰던 동일한 기술들로 개시되는 장치 및 방법들의 유익들을 얻을 수 있다. 단지 예로써, 생물학적 생성물이 IgG 항체가 될 수 있고, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 양이온 교환체가 될 수 있으며, 상기 "조건들"은 상기 IgG 항체와 오염물들의 결합을 방지하도록 충분히 높은 농도의 염을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 상황 하에서 가능한 조건은 0.1M의 NaCl보다 클 수 있다. 숙련자는 적절한 조건들을 선택하기 위해 상기 매체들 및 상기 생물학적 생성물 모두에 대한 이러한 의존을 이해할 것이다. 따라서, 음이온 교환체들을 채용할 때, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 입체 배제(steric exclusion), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 및 임의의 숫자의 알려진 다중 모드 크로마토그래피 기술들을 수행하는 적절한 동작 조건들을 선택하는 것이 일상적인 실행의 문제인 점이 이해될 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 프로세스들은 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 우회시키면서 상기 제제를 일회 또는 수회 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛과 접촉시키는 단계 및 선택적으로 상기 제제를 하나 또는 그 이상의 다른 접선 유동 여과 서브유닛들과 각기 다른 정제 유닛들로부터 독립적으로 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 이온 교환체이며, 상기 조건들은 약 0.05M 이상부터 약 2M 이상까지의 증분으로 오염물들의 결합을 방지하기 위해 필요한 경우보다 큰 농도로 중성염을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조건들은 포화 염에 대응되는 농도까지를 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 소수성 상호작용 크로마토그래피 매체이며, 상기 조건은 약 0.05M 이상부터 2M 이상까지의 증분으로 일부 오염물들을 결합시키기 위해 필요한 경우보다 낮은 농도로 염을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 염의 영(zero)의 농도가 채용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 단일의 접선 유동 여과 서브유닛 및 두 흡착 서브유닛들을 포함할 수 있고, 여기서 상기 두 흡착 서브유닛들의 하나는 음이온 교환체이며, 다른 하나는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매체이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 단일의 접선 유동 여과 서브유닛, 적어도 하나의 흡착 서브유닛 및 하나의 추가 흡착 서브유닛을 포함할 수 있고, 여기서 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛들은 음이온 교환체이며, 상기 하나의 추가 흡착 서브유닛은 소수성 상호작용 크로마토그래피 매체이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 단일의 접선 유동 여과 서브유닛, 적어도 하나의 흡착 서브유닛 및 하나의 추가 흡착 서브유닛을 포함할 수 있고, 여기서 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛들은 음이온 교환체이며, 추가 흡착 서브유닛은 소수성 상호작용 크로마토그래피 매체이고, 여기서 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 서브유닛은 상기 프로세스의 적어도 하나의 단계 동안에 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛과의 유체 접촉을 재순환시키는 방식으로 배관되며, 상기 음이온 교환 흡착 서브유닛(말단 크로마토그래피 서브유닛)은 상기 말단 흡착 서브유닛과 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛 사이의 재순환되는 유체 접촉이 일어나지 않는 방식으로 상기 장치의 유출구에 또는 이에 근접하여 배관되고, 상기 단백질 제제는 수집을 위해 상기 장치를 나가면서 상기 말단 흡착 서브유닛을 통해 처리된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 단일의 접선 유동 여과 서브유닛, 적어도 하나의 흡착 서브유닛 및 하나의 추가 흡착 서브유닛, 즉 적어도 두 흡착 서브유닛들을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 하나의 흡착 서브유닛들은 양이온 교환체이며, 상기 추가 흡착 서브유닛은 소수성 상호작용 크로마토그래피 매체이고, 모두는 상기 프로세스의 적어도 하나의 단계 동안에 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛과 유체 접촉을 재순환시키는 것을 각기 허용하는 방식으로 배관되며, 전기양성의 표면을 갖는 크로마토그래피 매체의 형태인 제3 흡착 서브유닛(말단 크로마토그래피 서브유닛)은 상기 말단 흡착 서브유닛과 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛 사이의 상기 재순환되는 유체 접촉이 일어나지 않는 방식으로 상기 장치의 유출구에 또는 이에 근접하여 배관되고, 상기 단백질 제제는 수집을 위해 상기 장치를 나가면서 상기 말단 흡착 서브유닛을 통해 처리된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 양성의 전하들을 과잉의 수소 결합 잔기들, 과잉의 소수성 잔기들 또는 모두와 결합시키는 전기양성의 크로마토그래피 매체를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 예시적인 전기양성의 크로마토그래피 매체는 캅토 애드히어(Capto adhere)이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 두 접선 유동 여과 서브유닛들을 포함할 수 있고, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나는 유동화된 입자들 상으로 흡착되는 상기 생물학적 생성물을 유지하며, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나는 상기 생물학적 생성물을 가용성 상태로 유지하고, 상기 장치는 음이온 교환체인 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 더 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 두 접선 유동 여과 서브유닛들을 포함할 수 있고, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나는 상기 생물학적 생성물을 침전된 상태로 유지하며, 상기 두 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나는 상기 생물학적 생성물을 가용성 상태로 유지하고, 상기 장치는 음이온 교환체인 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 더 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 흡착 서브유닛은 고정층(fixed bed) 또는 유동층(fluidized bed) 포맷으로 하나 또는 그 이상의 멤브레인들, 하나 또는 그 이상의 모놀리스들, 또는 입자들을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 생물학적 생성물은 DNA 플라스미드, 바이러스 입자, 단백질, 재조합 단백질, 항체, 단일클론성 항체, IgG, IgM, 비-항체 단백질, 응고 인자, 인자 VIII, 인자 VIII-폰 빌레브란트 복합체(von Willebrand complex) 및 피브리노겐(fibrinogen)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 혈청, 혈장, 젖, 조직 균질액으로부터의 유체 및 세포 배양 수확물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자연 체액을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 제제는 물질 부스러기를 제거하도록 처리되었다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 크로마틴의 대부분들 제거하도록 선택적으로 또는 더 처리되었을 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제제는 우레이드(ureide), 전기양성의 이온, 전기음성의 이온, 유기 용매, 유기 중합체 및 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유기 첨가제와의 접촉에 의해 대부분의 크로마틴이 제거되도록 처리되었다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 전기양성의 이온은 가용성이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 전기양성의 이온은 고체 표면에 공유결합으로 부착되기 때문에 가용성이 아니다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 전기음성의 이온은 가용성이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 전기음성의 이온은 고체 표면에 공유결합으로 부착되기 때문에 가용성이 아니다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 생물학적 생성물은 세포 배양 수확물 내의 재조합 단백질이며, 상기 프로세스는 상기 접촉시키는 단계들 이전에 상기 제제로부터 크로마틴의 90% 또는 그 이상(혹은 95% 또는 그 이상)을 제거하도록 세포 배양 수확물을 컨디셔닝하는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 제제로부터 생물학적 생성물을 정제하기 위한 장치들이 제공되며, 상기 장치들은, (1) 목표 부피 내에 상기 생물학적 생성물을 함유하도록 구성되는 용기를 포함하고, (2) 다중 정제 유닛들을 포함하며, 상기 다중 정제 유닛들은, (a) 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하고, 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛은 상기 생물학적 생성물의 유체역학적 반경의 약 50% 보다 작은 유체역학적 반경을 갖는 오염물들의 통과를 가능하게 하면서 상기 생물학적 생성물을 유지하는 하나 또는 그 이상의 멤브레인들을 포함하며, (b) 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하고, (3) 상기 용기 및 상기 다중 정제 유닛들을 연결함으로써, 상기 장치를 통한 순환을 가능하게 하는 다중 도관들을 포함하며, (4) 상기 도관들을 통해 흐름을 안내하고 상기 용기 및 서로로부터 상기 다중 정제 유닛들의 임의의 하나 또는 그 이상의 분리를 허용하는 밸브들을 포함하고, (5) 상기 흐름을 유도하고 상기 장치의 상기하나 또는 그 이상의 부분들 내의 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 적어도 두 접선 유동 여과 서브유닛들이 존재하며, 여기서 제1 접선 유동 여과 유닛은 상기 생물학적 생성물을 가용성 상태로 유지하도록 선택되는 공극률을 갖는 제1 멤브레인을 포함하며, 여기서 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛은 상기 생물학적 생성물이 침전된 또는 입자-관련 상태에 있을 때에 상기 생물학적 생성물만을 유지하도록 선택되는 공극률을 갖는 제2 멤브레인을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 용기는 혼합기(mixer)를 더 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛은 상기 생물학적 생성물을 유지하도록 선택되는 공극률을 갖는 멤브레인을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 흡착 서브유닛의 표면은 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, pi-pi 결합, 수소 결합, 금속 친화, 생물학적 친화도 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상호작용이 가능한 기능성 모이어티를 지닌다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 두 흡착 서브유닛들을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 두 흡착 서브유닛들의 표면들은 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, pi-pi 결합, 수소 결합, 금속 친화, 생물학적 친화도 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상호작용이 가능한 다른 기능성 모이어티들을 지닌다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 셋 또는 그 이상의 흡착 서브유닛들을 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 각각의 흡착 서브유닛들의 표면들은 정전기적 상호작용들, 소수성 상호작용들, pi-pi 결합, 수소 결합, 금속 친화, 생물학적 친화도 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상호작용이 가능한 다른 기능성 모이어티들을 지닌다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 상기 제제를 경로 명령들에 따라 유체 경로를 통과시키도록 상기 펌프들 및 밸브들을 제어하는 컴퓨터 판독 가능한 명령들로 구성되는 하나 또는 그 이상 프로세서들을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 경로 명령들은 연속적으로 정제 유닛들을 정의한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 경로 명령들은 상기 경로의 끝에서 상기 용기를 지정한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 경로 명령들의 사용자에 의한 엔트리나 선택을 수용하도록 구성되는 인터페이스(interface)를 더 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 인터페이스는 컴퓨터, 메모리, 네트워크, 무선 또는 이들의 결합들이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 멀티 밀리그램 규모로 수행되도록 규모가 조절된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 멀티 그램 규모로 수행되도록 규모가 조절된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 멀티 킬로그램 규모로 수행되도록 규모가 조절된다.
일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 프로세스들에 관한 것이며, 상기 프로세스들은 장치를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 장치는, 생물학적 생성물을 목표 부피 내에 함유하도록 구성되는 용기를 포함하고, 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하는 다중 정제 유닛들을 포함하며, 상기 다중 정제 유닛은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛은 상기 생물학적 생성물의 유체역학적 반경의 약 50% 보다 작은 유체역학적 반경을 갖는 오염물들의 통과를 가능하게 하면서 상기 생물학적 생성물을 유지하는 하나 또는 그 이상의 멤브레인들을 구비하고, 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하며, 상기 장치는 상기 용기 및 상기 다중 정제 유닛들을 연결함으로써, 상기 장치를 통한 순환을 가능하게 하는 다중 도관들을 포함하고, 상기 도관들을 통해 흐름을 안내하고 상기 용기 및 서로로부터 상기 다중 정제 유닛들의 임의의 하나 또는 그 이상의 분리를 허용하는 밸브들을 포함하며, 흐름을 유도하고 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 부분들 내에 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들을 포함하고, 상기 프로세스는, 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛이 밸브들을 통해 서로 유체 연통되도록 구성될 때에 상기 제제를 일회 또는 수회 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 접촉시키는 단계는 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 대한 오염물들 및 상기 생물학적 생성물의 결합을 실질적으로 방지하는 조건들 하에서 수행되고, 이후에 조건들을 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 통해, (1) 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 대한 오염물들의 결합을 가능하게 하지만 상기 생물학적 생성물의 결합은 가능하지 않게 하거나, (2) 조건들을 오염물들의 적어도 일부를 유지하면서 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛으로부터 상기 생물학적 생성물을 방출하도록 변경하는 단계가 수반되는 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 대한 오염물들 및 상기 생물학적 생성물의 결합을 가능하게 하도록 변경된다.
일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 제제로부터 생물학적 생성물을 정제하기 위한 장치들에 관한 것이며, 상기 장치는, 생물학적 생성물을 목표 부피 내에 함유하도록 구성되는 용기를 포함하고, 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하는 다중 정제 유닛들을 포함하며, 상기 다중 정제 유닛은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛은 상기 생물학적 생성물의 유체역학적 반경의 약 50% 보다 작은 유체역학적 반경을 갖는 오염물들의 통과를 가능하게 하면서 상기 생물학적 생성물을 유지하는 하나 또는 그 이상의 멤브레인들을 구비하고, 적어도 하나의 흡착 서브유닛을 포함하는 적어도 하나의 정제 유닛을 구비하며, 상기 장치는, 상기 용기 및 상기 다중 정제 유닛들을 연결함으로써, 상기 장치를 통한 순환을 가능하게 하는 다중 도관들을 포함하고, 상기 도관들을 통해 흐름을 안내하고 상기 용기 및 서로로부터 상기 다중 정제 유닛들의 임의의 하나 또는 그 이상의 분리를 허용하는 밸브들을 포함하며, 흐름을 유도하고 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 부분들 내에 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들을 포함한다.
다음의 용어들은 실시예들이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설시된다.
"단백질(protein)"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 통상적으로 황을 함유하고, 주로 펩티드 결합들에 의해 연결되는 아미노산의 하나 또는 그 이상의 사슬들로 재구성되는 복합 유기 고분자들의 그룹의 임의의 것을 언급한다. 상기 단백질은 자연이나 재조합 기원이 될 수 있다. 단백질들은 글리코실레이션(glycosylation), 페길레이션(pegylation) 등을 통한 바와 같이 비-아미노산 모이어티(moiety)들로 변형될 수 있거나, 다른 화학적 모이어티들과 접합될 수 있다. 단백질들의 예들은 이에 한정되는 것은 아니지만, 항체들, 응고 인자(clotting factor)들, 효소들 및 펩티드 호르몬들을 포함한다.
"숙주 오염물(host contaminant)" 또는 "숙주 세포 오염물(host cell contaminant)"은 관심의 대상인 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 생물 분자들을 언급한다. 상기 용어는 숙주 단백질들 및 숙주 DNA와 같이 다양한 클래스들의 숙주 오염물들을 포함할 수 있다.
"숙주 단백질(host protein)" 또는 "숙주 세포 단백질(host cell protein)" 혹은 "HCP"는 이러한 단백질들은 관심의 대상인 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 단백질들을 언급한다. 이러한 단백질들은 관심의 대상인 생성물로부터 제거되어야 하는 오염물들의 하나의 클래스를 나타낸다.
"항체(antibody)"는 인간화, 인간, 단일 사슬, 키메라, 합성, 재조합, 혼성, 돌연변이, 그라프트(graft)되거나 생체 외로 생성된 항체들과 같이 자연이나 유전적으로 변형된 형태들을 포함하여 인간이나 다른 포유동물의 세포주들로부터 유래되는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 면역글로불린(immunoglobulin)을 언급한다. 상기 항체들은 단일 클론에 의해 생산될 수 있고, 이 경우에 이들은 단일클론성으로 언급되거나, 하나 이상의 클론으로부터 생산될 수 있으며, 이 경우에 이들은 다클론성으로 언급된다. IgG 항체들은 특히, 예를 들면 인간들에서 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로서; 혹은 마우스(mouse)들에서 IgG1, IgG2A, IgG2B 또는 IgG3로서; 혹은 랫(rat)에서 IgG1, IgG2A, IgG2B 또는 IgG2C로서 서브클래스들의 하나 또는 혼합물로 존재할 수도 있는 면역글로불린 G로 언급되는 항체들의 클래스를 언급한다. 자연적으로나 재조합으로 진핵(eukaryotic) 숙주들 내에 생성되는 항체들은 다양한 글리코실화된 형태들로 존재할 수 있는 반면, 비-진핵 숙주들 내에서 생성되는 항체들은 다양한 글리코실화된 및 비-글리코실화된 형태들로 존재할 수 있다. "항체"는 또한 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역글로불린 모이어티들을 함유하는 융합 단백질들, 다른 항체, 효소, 형광단(fluorophore)이나 다른 신호 발생 모이어티, 바이오틴(biotin), 약물 또는 다른 기능성 모이어티를 포함하여 다른 기능성 모이어티들에 대한 IgG의 합성 연결에 의해 생성되는 면역접합체들을 포함하는 복합 형태들을 포함할 수 있다.
"비이온성 유기 중합체(non-ionic organic polymer)"는 하전된 기들이 결핍된 연결된 반복되는 유기 서브 유닛들로 구성되는 자연 또는 합성 탄화수소를 언급한다. 이는 선형일수 있거나, 일부 분지들을 갖는 주로 선형일 수 있거나, 또는 주로 분지될 수 있다. 여기에 개시되는 실시예들을 수행하기에 적합한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리비닐피르롤리돈(polyvinylpyrrolidone: PVP)을 포함한다. PEG는 HO-(CH2-CH2-O)n-H의 구조식을 가진다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 100달톤(dalton) 이하로부터 10,000달톤 이상까지의 평균 중합체 분자량을 갖는 조성물들을 포함한다.
"접선 유동 여과(tangential flow filtration: TFF)"는 유체가 하나 또는 그 이상의 다공성 멤브레인들에 의해 한정되는 공간을 통해 가압되는 멤브레인 여과의 방법을 언급하며, 여기서 상기 공극들을 통과하기에 충분히 작은 분자들은 여과액(filtrate)(때때로 투과물(permeate)) 내에 제거되고, 상기 공극들에 의해 걸러지기에 충분히 큰 분자들은 농축물(retentate) 내에 남는다. 접선 유동이라는 명칭은 특히 흐름이 상기 멤브레인에 대략적으로 직교하는 이른바 내장 여과(dead-end filtration)에 반대되는 것으로 유체 흐름의 방향이 상기 멤브레인에 대략적으로 평행한 경우를 언급한다.
"접선 유동 여과 멤브레인(tangential flow filtration membrane)"은 접선 유동 여과(TFF)의 기술을 수행하도록 구성되는 다공성 멤브레인을 언급한다. 이러한 멤브레인들은 통상적으로 다중의 멤브레인 유닛들 내로 적층될 수 있는 평탄한 시트(sheet)들, 또는 나선형으로 권취된 멤브레인들로 언급되는 이들이 차지하는 공간의 양을 감소시키도록 감기는 연장된 시트들, 또는 액체가 루멘(lumen)을 통해 흐르고, 액체들 및 충분히 작은 용질들은 기공들을 통과하지만, 보다 큰 고체들은 유지되며, 취급이 가능하도록 복수의 것들이 통상적으로 카트리지 포맷 내 수용되는 이른바 중공형 섬유들로 구성된다. 표준 용어로는 미세다공성 멤브레인들 및 초미세 다공성 멤브레인들로 호칭한다. 미세다공성 멤브레인들의 평균 공극 크기 분포는 일반적으로 공개되어 있고, 통상적으로 0.22미크론 및 0.45미크론의 공극률들을 포함하지만, 1미크론, 2미크론, 5미크론 또는 그 이상의 공극률을 포함할 수도 있다. 초미세 다공성 멤브레인들의 평균 공극 크기 분포는 일반적으로 공개되어 있지 않지만, 구상(globular) 단백질의 동등한 추정된 크기에 기초하는 임의의 용어들로 표현된다. 완전하게 구상인(구형의) 단백질은 약 5㎚의 직경을 가질 수 있지만, 실제로, 이러한 분자량의 단백질들은 그 경우(IgG, 11㎚의 유체역학적 직경) 보다 큰 유체역학적 직경을 가지는 것으로 보고되었다. 이러한 표준의 임의의 성질로 인하여, 초미세여과 멤브레인들은 때때로 나노여과(nanofiltration) 멤브레인들 또는 나노 다공성 멤브레인들로 보다 정확하게 기재된다. 엄격히 말하면, 이들은 1미크론 보다 작은 평균 공극률들을 갖지만, 보다 통상적으로는 아래로 10㎚ 또는 그 이하의 공극률들까지 100㎚ 또는 그 이하의 공극률들을 포함하는 것으로 간주되는 이른바 미세여과 멤브레인을 포함한다. 나노 다공성 및 미세 다공성 멤브레인들 모두는 통상적으로 화학적으로 불활성으로 의도된 표면들을 사용할 수 있지만, 정전기적 또는 소수성 상호작용들, 또는 심지어 생물학적 친화도를 포함하여 다른 유형들이나 혼합물들의 화학적 메커니즘에 의해 용해되는 분자들과 상호 작용할 수 있는 표면을 생성하도록 화학적으로 변형되었던 멤브레인들도 포함한다. IgG 항체를 유지하게에 적합한 TFF 멤브레인은, 특정 실시예들에서, 선택된 크기보다 큰 유체역학적 직경을 갖는 흡착되지 않은 용질들의 적어도 50%는 유지하지만, 선택된 크기보다 작은 유체역학적 직경을 갖는 흡착되지 않은 용질들의 통과를 허용하는 공극률을 갖는 전기양성의 멤브레인을 포함하며, 여기서 상기 선택된 크기는 약 10㎚ 내지 약 15㎚ 사이의 임의의 양이 될 수 있다.
"접선 유동 여과 모듈(tangential flow filtration module)" 또는 "접선 유동 여과 서브유닛(tangential flow filtration subunit)"은 상기 원하는 생성물의 적어도 50% (또는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 혹은 실제적으로 전체)의 유지를 허용하는 반면, 보다 작은 오염물들이 상기 멤브레인의 공극들을 통과하는 것을 허용하는 공극 크기 분포를 갖는 접선 유동 여과 멤브레인을 채용하는 개시되는 장치들 및 프로세스들의 기능적 구성 요소들을 언급한다. 개시되는 장치들 및 방법들은 다음에 정의되는 바와 같이 멤브레인 분별을 흡착 기능과 통합시킴에 의해 기본적으로 종래의 접선 유동 여과와 다르다.
"디아볼륨(diavolume)"은 잔류물(retentate)의 부피에 대한 동작(접선 유동 여과와 같은) 동안에 첨가되는 완충제의 전체 부피의 비율을 언급한다.
"흡착 서브유닛(adsorption subunit)" 또는 "흡착성 서브유닛(adsorptive subunit)"은 보완적인 특성의 분자들을 유지할 수 있고, 제제로부터의 이들의 제거를 통해 분별의 정도를 구현할 수 있는 화학적으로 상호작용성인 표면을 지니는 고상을 채용하는 개시되는 장치들 및 프로세스들의 기능적 구성 요소들을 언급한다. 개시되는 장치들 및 프로세스들은 앞서 정의한 바와 같이 멤브레인 여과 기능을 통합시킴에 의해 종래의 흡착 크로마토그래피와 구별된다.
"흡착 크로마토그래피(adsorptive chromatography)" 통상적으로 생물학적 생성물들의 정제를 위해 수행되는 두 가지 기본적인 유형들의 크로마토그래피의 하나를 언급하며, 다른 하나는 "비흡착 크로마토그래피(non-adsorptive chromatography)"이다. 비흡착 크로마토그래피는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 및 정해진 공극 크기 분포들을 갖는 멤브레인들을 통한 여과를 포함하는 특정 예들로써 실체(entity)들을 크기에 의해 분별하는 방법들을 포함한다. 비흡착 크로마토그래피에 있어서, 주어진 제제의 구성들에 대해 이상적인 것은 분별을 매개하는 데 사용된 상기 매체들의 표면들과 화학적으로 상호작용하지 않는다. 흡착 크로마토그래피를 수행하기 위한 물리적인 포맷들은 다공성 입자들로 충전된 칼럼들, 모놀리스들 및 평탄한 시트들이나 중공형 섬유들의 형태로의 멤브레인들 또는 이들의 결합들을 포함한다. 흡착 크로마토그래피는 혼합된 제제 내의 일부 종들과는 안정한 연관들 형성하지만 다른 것들과는 그렇지 않게 의도된 특정한 유형의 화학적 성질을 구현하거나 및/또는 완충 조건들을 변경시킴에 의한 화학적 환경의 조작을 통해 이들이 상기 흡착제와 상호작용하는 상대적 강도에 따라 성분들의 분별들 허용하는 표면을 이용하는 방법들을 포함한다. 많은 유형들의 흡착 메커니즘들이 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 음이온 크로마토그래피는 강한 전기음성 특성의 분자들과 결합하지만, 강한 전기양성의 분자들을 축출하는 전기양성의 흡착제(adsorbent)의 사용을 수반한다. 또한, 분별이 염의 농도를 증가시키거나 및/또는 pH를 감소시켜 결합된 종들 중에서 구현될 수 있다. 동일한 원리들이 상기 고상 위의 전하가 반전되는(전기음성) 점을 제외하면 양이온 교환 크로마토그래피에 수반되므로, 흡착이 전기양성인 종들을 선호하는 반면, 전기음성의 종들은 축출되는 경향이 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 소수성 흡착제들을 사용한다. "다중 모드" 특성의 흡착제들은 음성의 전하들, 양성의 전하들, 다양한 형태들의 소수성기들, 수소 결합들 그리고 다른 메커니즘들의 결합들을 포함한다.
종래의 흡착 크로마토그래피는 두 가지 모드들로 실행된다. "결합-용리(bind-elute)" 모드는 관심의 대상인 생성물이 상기 흡착제에 결합되는 조건들 하에서 수행된다. 결합되지 않은 오염물들은 상기 흡착제를 통해 흐르며, 이에 따라 제거된다. 상기 결합된 생성물은 이후에 상기 완충 조건들을 변화시켜 상기 흡착제로부터 분리된다. 이러한 분리 단계는 "용리(elution)"로 언급된다. 용리 조건들은 통상적으로 상기 흡착제에 결합되는 오염물들이 상기 생성물이 용리되었던 후에 결합되어 남는 생성물보다 강하게 결합되도록 설정된다. 흡착 크로마토그래피의 다른 하나의 동작 모드는 "관류(flow-through)" 모드이며, 이는 상기 생성물은 상기 흡착제를 통해 흐르는 반면, 상기 흡착제에 결합되는 오염물들은 관류 생성물로부터 분리되는 조건들 하에서 수행된다.
모든 전통적인 종래의 흡착 크로마토그래피 물질들-그러나 개시되는 장치들 및 프로세스들은 아닌-은 이들의 물리적 포맷이나 동작 특성들에 관계없이 동일한 동작 단계들을 채용한다. 상기 흡착제는 상기 제제와 접촉되기 전에 정해진 세트의 동작 조건들까지 평형화된다. 상기 제제는 상기 흡착제와 접촉되기 전에 정해진 세트의 동작 조건들까지 평형화된다. 상기 접촉 조건들은 제제의 성분(들)이 상기 흡착제에 결합되고, 결합되지 않는 것을 언급하는 "선택성(selectivity)"을 한정한다. 결합-용리 모드에서, 상기 용리 조건들은 어떤 종들이 용리되고 결합되어 남는 지의 선택성을 한정한다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합으로 결합된 다중의 뉴클레오티드 단량체들로 구성되는 생물고분자를 언급한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)는 폴리뉴클레오티드들의 예들이다. 폴리뉴클레오티드들은 수소 결합들의 형성에 대한 높은 경향을 가질 수 있다.
"단백질 제제(protein preparation)"는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, (실질적으로)무세포의 세포 배양 상청액, 또는 정제의 단계로부터 관심의 대상인 단백질을 함유하는 용액과 같이 관심의 대상인 단백질을 함유하는 임의의 수성이나 대부분이 수성인 용액을 언급한다.
"바이러스(virus)" 또는 "비리온(virion)"은 살아있는 숙주들, 주로 박테리아, 식물들 및 동물들의 세포들 내에서만 복제되는 극히 미소한(대략 20㎚ 내지 300㎚의 직경), 대사적으로 불활성인 감염원을 언급하며, RNA 또는 DNA 코어(core), 단백질 코트 및 보다 복합한 유형들에서는 둘러싸는 외피로 구성된다.
여기서의 실시예들은 정제되지 않거나 부분적으로 정제된 제제들로부터 생물학적 생성물들의 정제를 위해 적합한 기구 구성들을 갖는 다양한 장치들을 제공한다. 흡착은 개시되는 장치들 및 프로세스들 내에서 일어나지만, 동작적인 접근은 상기 시스템 내의 생성물 및 오염물들의 행동이 흡착 서브유닛과 접선 유동 기반의 크기 분별 서브유닛의 결합에 의해 구속되기 때문에 구분된다. 상기 결합은 종래의 크로마토그래피 가구들 또는 프로세스들로 수행되는 흡착 크로마토그래피로 가능하지 않고, 접선 유동 여과 기구들 또는 프로세스들로 가능하지 않으며, 흡착 크로마토그래피와 접선 유동 여과의 다른 알려진 결합들로 가능하지 않은 능력들을 허용한다. 상기 시스템의 특유성은 개시되는 처리 포맷이 전통적인 종래의 크로마토그래피 장치들로 수행될 수 있고, 종래의 크로마토그래피 프로세스들은 개시되는 장치들로 수행될 수 없는 사실에 의해 보다 강조된다. 종래의 크로마토그래프들과 본 발명의 개시되는 장치들 및 프로세스들 사이의 차이들은 다음의 실험예들을 포함하여 여기서의 설명에 전체적으로 예시된다. 실험예들은 상기 장치 및 프로세스들이 정제되지 않거나 부분적으로 정제된 제제들을 분별할 수 있는 본 발명의 특정 시스템들의 특유한 포맷을 예시한다. 예시적인 프로세스들 내의 화학적 세부 사항들은 상기 장치 및 방법들의 분명한 이해를 증진시키도록 제공되지만, 본 발명의 많은 실시예들에서 이러한 화학적 세부 사항들이 이러한 장치로 수행되는 개시되는 장치 또는 방법들을 한정하지는 않는다.
본 발명의 많은 실시예들에 있어서, 개시되는 장치들 및 프로세스들은 종래의 크로마토그래피에 채용되는 장치 및 프로세스 포맷들과 구분되지만, 동일한 흡착 크로마토그래피 구성 요소들의 일부를 채용할 수 있다. 본 발명의 개시되는 방법들/프로세스들의 특정 실시예들을 실행하는 데 사용되는 흡착 크로마토그래피 매체들의 물리적인 형태들은 모놀리스들, 멤브레인-흡착기들 및 다공성 입자들로 충전된 칼럼들과 같은 종래의 흡착 크로마토그래피 방법들을 실행하는 데 사용되는 물리적 형태들을 포함할 수 있지만, 이들은 구분되는 동작 포맷으로 적용된다. 흡착 서브유닛들 내에 채용될 수 있는 흡착 크로마토그래피 매체들은 종래의 흡착 크로마토그래피 프로세스들에 대해 사용되는 동일한 종류의 매체들을 포함하지만, 이들은 구별되는 동작 포맷으로 적용된다. 개시되는 방법들/프로세스들을 수행하기 위해 적합한 흡착 크로마토그래피 매체들은, 특정 실시예들에서, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 다중 모드 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피를 위한 크로마토그래피 매체들 또는 임의의 다른 흡착 메커니즘을 위한 크로마토그래피 매체들을 포함한다. 흡착 크로마토그래피 매체들의 선택성을 제어하기 위해 채용되는 완충제들은 마찬가지로 종래의 흡착 크로마토그래피의 선택성을 제어하기 위해 채용되는 완충제들과 유사하지만, 구분되는 처리 포맷으로 적용된다. 여기에 개시되는 특정 실시예들의 개시되는 방법들/프로세스들은 마찬가지로 어떤 생성물들, 단백질 또는 비-단백질이 처리되는 지에 관계없이 종래의 흡착 크로마토그래피와 구분되는 균일한 처리 포맷을 채용한다. 종래의 크로마토그래피와 개시되는 장치들 및 프로세스들의 일부 구성 요소들 사이의 유사성들에도 불구하고, 개시되는 장치의 구성, 처리 포맷 및 결과들은 종래의 흡착 크로마토그래피로 얻어지는 장치들, 처리 포맷들 및 결과들과 구별된다. 본 발명의 많은 실시예들의 장치들 및 프로세스들은 이들이 허용하는 특유한 처리 포맷과 능력들 및 이들을 생물학적 생성물들의 정제에 적용하여 얻어지는 특유한 결과들에 의해 한정되고, 흡착 크로마토그래피 매체들의 유형, 흡착 크로마토그래피 매체들의 물리적 형태, 흡착 크로마토그래피 매체들의 선택성을 제어하는 데 사용되는 완충제들 및 내부에 머무르는 상기 생물학적 생성물이나 상기 제제에 의해 한정되지 않는다.
특정 실시예들의 개시되는 장치들 및 프로세스들은 종래의 접선 유동 여과에서 채용되는 장치들 및 프로세스 포맷들과 구분되지만, 일부 동일한 접선 유동 여과 구성 요소들을 채용할 수 있다. 개시되는 방법들/프로세스들을 실행하는 데 사용되는 접선 유동 여과 매체들의 물리적인 형태들은 평탄하거나, 감긴(나선형으로 권취된) 멤브레인들 및 중공형 섬유들과 같은 접선 유동 여과를 수행하는 데 사용되는 물리적 형태들을 포함하지만, 이들은 구분되는 동작 포맷으로 적용된다. 상기 접선 유동 여과 모듈들 내에 채용될 수 있는 접선 유동 여과 매체들은 셀룰로오스계 또는 폴리에테르술폰(PES)계와 같이 종래의 흡착 크로마토그래피 프로세스들을 위해 사용되는 동일한 종류의 매체들을 포함하거나, 다른 중합체들을 채용하지만, 이들은 구별되는 동작 포맷으로 적용된다. 접선 유동 여과 동안에 채용되는 완충제들은 마찬가지로 종래의 접선 유동 여과에 채용되는 완충제들과 유사할 수 있지만, 구별되는 처리 포맷으로 적용된다. 특정 실시예들의 개시되는 방법들/프로세스들은 마찬가지로 어떤 생성물들, 단백질 또는 비-단백질이 처리되는 지에 관계없이 균일한 처리 포맷을 채용한다. 종래의 접선 유동 여과와 개시되는 장치들 및 프로세스들의 일부 구성 요소들 사이의 유사성에도 불구하고, 개시되는 장치의 구성, 처리 포맷 및 결과들은 종래의 접선 유동 여과로부터 얻어지는 장치들, 처리 포맷들 및 결과들과 구별된다. 상기 장치들 및 프로세스들은 이들이 허용하는 특유한 처리 포맷과 능력들 및 이들을 생물학적 생성물들의 정제에 적용하여 얻어지는 특유한 결과들에 의해 정의되며; 접선 유동 여과 매체들의 유형, 접선 유동 여과 매체들의 물리적인 형태, 완충제들에 의해 정의되지 않고, 내부에 머무르는 상기 생물학적 생성물이나 상기 제제에 의해 정의되지 않는다.
본 발명의 특정 측면들에 있어서, IgG 단일클론성 항체들을 정제하기 위한 방법들은 어떻게 개시되는 실시예들이 전체적으로 동작하고, 어떻게 조건들이 목표 결과들을 구현하도록 변경되는 가를 위한 유용한 예를 제공한다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 유사한 접근들이 다른 IgG 단일클론성 항체들, 다른 항체들 및 비-항체 단백질들, 폴리뉴클레오티드들 및 바이러스 입자들에 적용 가능할 것이고, 접선 유동 멤브레인 공극률, 숫자, 표면 화학적 성질 및 흡착 서브유닛들의 물리적 포맷 및 완충 조건들 중에서도 특정한 선택이 상기 표적 생성물의 성질들에 의해 결정될 수 있지만, 상기 방법들의 실행이 그렇지 않으면 동일하거나 유사하게 높아지는 점이 명백해질 것이다.
실험 결과들은 본 발명의 특정 실시예들의 방법들에 대하여 항체 제제가 크로마틴의 함량을 90% 또는 그 이상으로 감소시키도록 먼저 처리되었을 때에 유익한 결과들을 제공하는 점을 나타낸다. 이러한 크로마틴 감소는 여기에 기재되는 경우들과 같은 크로마틴-지향 정화 방법들에 의해 구현될 수 있다. 이러한 하나의 방법은 알란토인을 세포를 함유하거나 세포가 없는 세포 배양 수확물에 약 1%(v/v)의 균등한 양으로 첨가함에 의해 수행된다. 알란토인 첨가에 약 0.4%의 최종 농도까지의 카프릴산(caprylic acid)의 첨가가 후속되며, 동작 pH는 약 5.3까지 감소된다. 혼합물은 실온에서 두 시간 동안 교반되면서 배양되며, 이후에 양이온성 킬레이트제를 지니는 입자들 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)이 약 5%(v/v)의 양으로 첨가된다. 상기 혼합물은 네 시간 동안 교반되면서 배양된다. 고체들의 대부분은 원심분리에 의해 제거되고, 나머지는 선택적인 심층 여과 단계에 의해 제거된다. 선택적으로, 고체들은 TREN 입자들의 첨가 없이 지방산으로 처리된 후에 제거될 수 있지만, 여기서 고체들이 없는 제제는 TREN 입자들로 충전된 칼럼을 통과하며, 여기서 상기 칼럼 내의 TREN 입자들의 부피는 약 5% 또는 처리되는 제제 부피이다. 선택적으로, 상기 TREN 입자들로 충전된 칼럼은 우노스피어(UNOsphere) Q 입자들로 충전된 칼럼으로 대체될 수 있고, 상기 제제는 보이드 배제(void exclusion) 음이온 교환 크로마토그래피의 알려진 방법으로 처리된다. 선택적으로, 카프릴산은 다른 지방산들, 또는 에타크리딘, 메틸렌 블루 또는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드와 같은 전기양성의 소수성 약제들로 대체될 수 있다. 방법들은 또한 다른 화학적 표면들을 갖는 입자들을 채용할 수 있거나, 선택적으로는 멤브레인들, 모놀리스들 또는 다른 것들과 같은 물리적 포맷들을 채용할 수 있다. 알란토인은 여기에 개시되는 방법들로부터 선택적으로 생략될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 다음의 정제 서브유닛들과 맞을 수 있다. (i) 멤브레인이 약 30kDa의 질량을 갖는 구상 단백질을 유지하도록 하기에 충분한 평균 공극 크기를 갖는 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 구비하는 접선 유동 여과 서브유닛; (ii) 음이온 교환 크로마토그래피의 기술을 수행하기 위해 사용되는 바와 같이 사차 아미노기들을 지니는 모놀리스로 구성되는 제1 흡착 서브유닛. 이와 같은 모놀리스의 상업적인 예는 BIA 세퍼레이션즈(Separations)에서 제조된 CIM QA 모놀리스이다. 상기 모놀리스의 표면상에 오염물들의 흡착을 위한 조건들은 모든 흡착 크로마토그래프 방법들에 대해서 대부분의 오염물들이 결합되지만 상기 IgG 단일클론성 항체는 결합되지 않는 결합을 확인하기 위한 통상적인 실험에 의해 정의된다. 일반적인 사실상, 가장 우수한 조건들은 상기 항체가 추가되는 염의 부존재에서 결합되지 않는 가장 높은 pH가 될 것이다. 조건들은 각기 특유의 전하 성질들을 가지기 때문에 모든 항체에 대해 다른 것으로 이해되지만, 많은 IgG1 단일클론성 항체들에 대해 pH 8.0의 50mM의 트리스(Tris)에 의해 생성되는 8.0의 동작 pH는 우수한 출발점을 제공한다. 상기 조건들이 상기 흡착 서브유닛에 대해 확인되면, 개시되는 장치는 개시되는 프로세스로 상기 제제를 분별하는 데 사용될 수 있다. 상기 제제 자체는 정화된 세포 배양 수확물과 같이 조성에서 상당히 원료적일 수 있거나, 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 보다 이전의 프로세스 단계에서 정제 다음의 IgG 부분과 같이 고도로 또는 일부 다른 이전의 분별 단계 다음의 임의의 다른 정도의 순도로 정제될 수 있다. 상기 제제는 상기 항체를 손상시키지 않는 임의의 화학적 조건들 하에서 상기 장치 내로 도입된다. 상기 제제는 초기에 상기 TFF 서브유닛(흡착 서브유닛 오프-라인)에만 접촉될 수 있으며, 그 동안에 상기 IgG의 농도가 증가될 수 있고, 완충제 조건들은 변경될 수 있으며, 그 동안에 상기 멤브레인 내의 공극들을 통과하기에 충분히 작은 오염물들은 이에 따라 제거된다. 상기 흡착 서브유닛이 미리 평형화될 필요는 없으며, 이는 상기 제제를 접촉시키기 전에 상기 흡착 크로마토그래피 매체가 평형화될 것을 강하게 요구하는 종래의 흡착 크로마토그래피와의 기본적인 차이이다. 다음 단계는 상기 IgG를 함유하는 잔류물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛으로부터 상기 흡착 서브유닛을 통과하도록 상기 흡착 서브유닛을 인-라인되게 하는 것이다. 종래의 흡착 크로마토그래피와의 다른 기본적이 차이에 있어서, 상기 제제가 상기 흡착 서브유닛과 접촉되기 전에 평형화될 필요는 없다. 상기 제제도 상기 흡착 서브유닛도 서로 접촉되기 전에 평형화될 필요는 없다. 종래의 흡착 크로마토그래피에 있어서, 이는 상기 방법이 잘못되게 할 수 있었다. 개시되는 방법에 있어서, 이는 상기 크로마토그래피 흡착제가 상기 제제와 동시에 평형화되게 하기 때문에 유리하며, 완충제 부피 및 프로세스 시간을 감소시킨다. 상기 완충제 제형은 상기 TFF 서브유닛을 통한 디아필트레이션에 의해 최종 조건들을 향해 변경된다. 상기 제제 및 상기 흡착 서브유닛이 최종 조건들에 접근함에 따라, 작은 오염물들은 상기 멤브레인의 공극들을 통해 계속하여 제거되는 반면, 산성의 오염물들은 상기 흡착 서브유닛에 결합되기 시작한다. 상기 프로세스는 완전히 평형화된 샘플이 적어도 일회 상기 흡착 서브유닛을 통과하였을 때에 완료된다. 전체 프로세스 동안, 작은 오염물들은 상기 멤브레인 내의 공극들을 통해 제거되었다. 이는 상기 프로세스의 기간이 프로세스 시간이나 부피를 부풀리지 않도록 하기 위해 줄어들기 때문에 종래의 접선 유동 여과로는 보다 낮은 정도로 일어난다. 상기 흡착 크로마토그래피의 포함에 의해 야기되는 연장된 시간은 보다 작은 오염물들이 상기 멤브레인을 통해 제거되는 것을 가능하게 하기 때문에 개시되는 시스템이 보다 효과적이다. 처리 후, 상기 제제는 라인들로부터 세정될 수 있고 수확될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는 보다 복잡한 프로세스를 유지하도록 구성될 수 있다. 이러한 일 예에서, 상기 장치는 다음의 정제 서브유닛들과 부합된다. (i) 멤브레인이 약 30kDa의 질량을 갖는 구상의 단백질을 유지하기에 충분한 평균 공극 크기를 갖는 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 구비하는 접선 유동 여과 서브유닛; (ii) 그 표면상에 페닐기들을 지니는 멤브레인 기반의 장치, 또는 그 표면상에 부틸기를 지니는 모놀리스 기반의 장치와 같은 방향족 소수성기를 갖는 제1 흡착 서브유닛; (iii) 음이온 교환 크로마토그래피의 기술을 수행하기 위해 사용되는 바와 같이 사차 아미노기를 지니는 모놀리스 또는 멤브레인로 구성되는 제2 흡착 서브유닛; (iv) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위해 사용되는 바와 같이 설포기(sulfo group)들을 지니는 제3 흡착 서브유닛. 이러한 보다 복잡한 시스템을 위해, 조건들은 각각의 상기 흡착 서브유닛들에 대해 단일의 음이온 교환 흡착 서브유닛만을 구비하는 이전의 간단한 예에 대한 동일한 방식으로 확립된다. 각 경우에서, 상기 조건들은 충분한 양의 항체를 결합시키지 않고 오염물들의 가장 큰 다양성에 의한 결합을 허용하도록 확인된다. 상기 소수성 상호작용 흡착 서브유닛을 위한 조건들은 통상적으로 상승된 농도들의 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)들 또는 매우 낮은 농도들의 염들을 포함한다. 양 경우들에서, 조건들은 특히 응집체(aggregate)들을 포함하여 오염물들이 상기 흡착 서브유닛에 결합되지만, IgG의 결합은 최소화되도록 설정된다. 하나의 특정한 단일클론성 항체(실험예 1-실험예 8 참조)에 대해, 조건들의 다음의 두 가지 적절한 세트들이 확인되었다. pH 8.0에서 0.4M의 시트르산 나트륨(sodium citrate)과 50mM의 트리스 및 pH 6.0에서 12.5mM의 시트르산 나트륨과 50mM의 MES. 조건들은 또한 상기 양이온 교환 크로마토그래피 모듈을 위해 확립될 수 있다. 이 경우, 음이온 교환 및 소수성 상호작용으로, 조건들은 오염물들을 결합시키지만 항체는 그렇지 않도록 설정되었다. SO3 모놀리스 흡착 서브유닛을 위한 특정 조건들은 pH 8.0에서 약 5mM의 NaCl, 약 50mM의 트리스였다. 상기 음이온 교환 단계를 위한 조건들은 앞서의 예에서 기술한 바와 같다. 상기 흡착성 화학적 성질들과 조건들이 이른바 관류 모드로 이용되는 종래의 흡착 크로마토그래피와 상당히 동일하게 이용되지만, 상기 프로세스의 전체 기간 동안에 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 공극들을 통한 작은 오염물들의 지속적인 제거로 인해 개시되는 장치 및 방법들이 보다 우수한 결과들을 구현하는 점이 인식될 것이다. 다중 흡착 단계들을 채용하는 이러한 예는 본 발명의 특정 실시예들의 또 다른 특유한 특성인 단일 유닛 동작의 제한들 내에서 단일의 통합된 장치 내의 다른 흡착 크로마토그래피 화학적 성질들의 결합들을 강조한다. 단일 유닛 동작이라는 용어는 상기 샘플이 상기 시스템으로부터 제거될 때에 정제되지 않은 제제가 상기 시스템 내로 도입되고, 상기 프로세스가 완료된 것으로 간주되는 경우를 언급한다. 개시되는 장치 및 방법들은 오염물들이 상기 접선 유동 여과 멤브레인들을 통한 통과에 의해 제거되는 모든 동안에 다중의 구별되는 흡착 방법들에 의해 제제를 연속하여 처리하는 그 능력면에서 접선 유동 여과와 흡착 크로마토그래피의 결합들 중에서 특유하다. 이러한 프로세스들을 단일 유닛 동작으로 실행하는 특정한 이점은 이들이 보다 높은 생성물 회수를 유지하는 것이다. 이는 한 번에 수행되는 하나의 흡착 방법만을 유지하는 시스템들에서 상기 생성물이 다음 단계로 도입될 수 있기 전에 각 단계 후에 제거되어야 하기 때문이다. 일부 생성물은 각 이송에서 변함없이 손실되므로, 이러한 이송들을 제거하는 것은 보다 높은 생성물 회수에 기여한다.
단일 유닛 동작 내에서 다중의 흡착 방법들을 수행하는 목적을 위해 다중의 흡착 서브유닛들과 부합되는 일부 실시예들에 있어서, 흡착 방법들의 순서는 변화될 수 있으며, 일부 순서들은 다른 것들에 비해 유리한 것으로 입증될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 제공되는 장치는 다른 흡착 방법들이 상기 접선 유동 여과 서브유닛과 별도로 그리고 사용자에 의해 원해지는 임의의 순서로 개별적으로 결합되는 것을 허용하도록 구성될 것이다. 원리적인 문제로, 정해진 흡착 단계를 간섭할 수 있는 오염물들이 이러한 흡착 단계 전에 제거되는 순서가 유리할 것이다. 동일한 논리로, 정해진 흡착 단계의 능력 제한들을 압박할 수 있는 오염물들이 이러한 흡착 단계 전에 제거되는 순서가 유리할 것이다. 실제로, 이러한 단계들의 순서는 상기 시스템 내로 도입되는 상기 샘플의 오염물 함량에 의존할 것이며, 바람직한 순서는 필요한 경우에 간단한 실험에 의해 확인될 수 있다.
두 흡착 서브유닛들만을 채용하는 예가 여기에 예시된다. 크로마틴 결핍 IgG 제제는 20g/L의 농도까지 상기 접선 유동 여과 모듈 상에 농축된다. 약 100kDa 보다 작은 대부분의 오염물들은 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내의 멤브레인을 통한 이들의 통과에 의해 이러한 단계에서 제거될 것이다. 상기 농축된 IgG는, 예를 들면 상기 IgG 제제를 pH 3.5의 100mM의 아세트산, 1.7M의 NaCl로 완충제 교환에 의해 남아 있는 바이러스를 잠재적으로 비활성화시키기 위해 선택적으로 처리될 수 있다. 약 100kDa보다 작은 남아 있는 오염물들의 대부분은 이러한 단계에서 제거될 것이다. 상기 제1 흡착 서브유닛(축류(axial flow) 페닐 멤브레인 흡착기)은 인-라인(in-line)으로 위치하고, 상기 IgG 제제는 pH 7.2의 25mM의 인산나트륨, 1.7M의 NaCl로 완충제에 교환된다. 상기 흡착 서브유닛과 그 내부로 및 외부로의 배관 연결은 pH 7.2의 25mM의 인산나트륨, 1.7M의 NaCl로 세정된다. 상기 제1 흡착 서브유닛은 오프-라인(off-line)되고, 상기 제2 흡착 서브유닛(축류 QA 모놀리스)은 인-라인으로 된다. 상기 IgG 제제는 상기 접선 유동 여과 모듈을 통해 pH 8.0의 25mM의 트리스로 완충제 교환된다. 상기 제2 흡착 서브유닛은 pH 8.0의 25mM의 트리스로 세정되고, 상기 유닛은 오프-라인된다. 상기 IgG 제제는 선택되는 최종 제형(formulation) 또는 에비 제형으로 완충제 교환된다. IgG의 주요부는 수집되고, 상기 장치는 상기 장치 내에 남아 있는 항체의 수집을 가능하게 하기 위해 선택되는 상기 최종 제형 또는 예비 제형으로 세정된다.
앞서의 조건들은 허셉틴 바이오시밀러(Herceptin biosimilar) 항체에 대해 개발되었고, 단일 유닛 동작으로 수행되도록 허용된다. 중간 처리(완충제 교환)를 위해 상기 유닛으로부터 항체를 제거하거나, 상기 제2 흡착 단계를 수행하는 요구 사항은 없다. 다중의 처리 단계들은 상기 장치로부터 상기 제제를 제거하지 않고 상기 장치 내에서 수행될 수 있다.
IgG의 정제는 또한 적용될 수 있는 기술의 변형들이 인식되는 플랫폼을 나타낸다. 이러한 일 실시예에 있어서, 크로마틴-지향 정화는 알란토인을 세포를 함유하거나 세포가 없는 세포 배양 수확물에 약 1%(v/v)와 동등한 양으로 첨가하여 수행된다. 알란토인 첨가에 0.025%의 농도까지 메틸렌 블루의 첨가가 후속되며, 상기 동작 pH는 8.0까지 상승된다. 혼합물은 실온에서 2시간 동안 교반되면서 배양되며, 이후에 양이온 킬레이트제인 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)을 지니는 입자들이 5%(v/v)의 양으로 첨가된다. 상기 혼합물은 4시간 동안 교반되면서 배양된다. 고체들의 대부분은 원심분리에 의해 제거되고, 나머지는 PC1 뎁스 필터(depth filter)(사르토리우스(Sartorius))로와 같은 선택적인 심층 여과 단계에 의해 제거된다. 실제 사용에 있어서, 바이러스 여과 단계 또한 이 시점에서 적용될 수 있다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 내의 멤브레인은 약 50kDa의 질량을 갖는 가상적인 구상 단백질에 상응하는 평균 공극 크기를 갖는 폴리에테르술폰(PES) 멤브레인이다. 이러한 다른 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 내의 멤브레인은 약 30kDa의 질량을 갖는 가상적인 구상 단백질에 상응하는 평균 공극 크기를 갖는 재생된 셀룰로오스 멤브레인이다. 일부 실시예들에 있어서, 충분한 정제가 통합된 적어도 하나의 흡착 서브유닛으로 수행되는 단일 흡착 단계만으로 구현될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 이러한 서브유닛의 제제-접촉 표면은 양성의 전하들을 지닐 수 있어, 이온 교환체로서 수행하는 능력이 부여될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양성의 전하들은 일차 아미노기, 이차 아미노기, 삼차 아미노기, 사차 아미노기, 또는 이들의 결합들에 의해 부여될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 전기양성의 흡착 서브유닛의 표면은 소수성 상호작용들, 수소 결합 및/또는 금속 친화와 같은 다른 유형들의 화학적 상호작용들에 참여하는 능력을 더 구현할 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 흡착 서브유닛의 표면은 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)으로 기능화된다. 일부 실시예들에 있어서, 추가적인 흡착 서브유닛이, 예를 들면 상기 제제 내의 응집체들의 함량을 감소시키는 목적으로 바람직할 수 있다. 이러한 서브유닛들의 표면들은 특히 수소 결합들에 참여하는 잔기들 이외에도 소수성 잔기들을 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 기술한 바와 같이 크로마틴을 제거하기 위해 컨디셔닝된 수확물은 상기 장치와 접촉되며, 상기 IgG는 30kDa의 질량을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 갖는 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 구비하는 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛에 의해 약 60g/L까지 농축된다. 모든 수확물이 도입되었던 직후에, 투입 완충제는 pH 3.5의 50mM의 아세트산, 1.7M의 NaCl로 변경되었다. 상기 제제가 이들 조건들에 도달할 때, 소수성 페닐기들을 지니는 멤브레인 장치로 구성되는 제1 흡착 서브유닛은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛과 인-라인으로 배치된다. 이 시점까지, 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 내의 멤브레인의 공극 크기 분포보다 작은 오염물들은 상기 멤브레인의 공극들을 통한 통과에 의해 계속적으로 제거되었다. 높은 염의 형성이 또한 오염물들과 상기 원하는 IgG 사이 및/또는 오염물들과 전체적으로 상기 장치의 내부 접촉 표면 사이의 생리적 조건들 하에서 존재할 수 있는 비특이적 상호작용들에 대한 분리 영향을 중재할 수 있는 점이 인식될 것이다. 7.0의 50mM의 헤페스(Hepes), 1.7M의 NaCl을 함유하는 완충제가 도입된다. 상기 제제가 전체적으로 이들 조건들을 구현할 때, 응집체들은 상기 페닐 멤브레인 흡착 서브유닛의 표면에 대한 결합에 의해 제거되었을 것이다. 상기 유닛은 pH 7.0의 50mM의 헤페스(Hepes), 1.7M의 NaCl로 세정되고, 오프-라인된다. 동시에, 상기 제1 흡착 서브유닛이 오프-라인되고, 전기양성의 전하들을 지니는 제2 흡착 서브유닛이 인-라인으로 배치된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 TREN을 지니는 모놀리스이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 사차 아미노기들을 지니는 모놀리스이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 에틸렌 디아민(ethylene diamine) 기들을 지니는 모놀리스이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 사차 아미노기들을 지니는 미세다공성 멤브레인 기반의 장치이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 폴리알릴아민(polyallylamine) 기들을 지니는 미세다공성 멤브레인 기반의 장치이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 사차 아미노기들을 지니는 하이드로젤라티너스-충진(hydrogelatinous-filled) 장치이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 전기양성의 기들의 네트워크를 지니는 미세다공성 중공형 섬유 멤브레인 기반의 장치이다. 일부 실시예들에 있어서, pH 8.0의 50mM의 트리스로 구성되는 완충제가 도입되고, 상기 제제는 점진적으로 작은 오염물들이 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛의 멤브레인을 통해 계속하여 제거되는 동안에 상기 조성으로 전이된다. 상기 제제가 전체적으로 pH 8.0의 50mM의 트리스의 조건들을 구현하는 시점에서, 산성 오염물들이 상기 제2 흡착 서브유닛의 표면에 대해 결합되어, 이들의 제거가 구현되는 것으로 이해된다. 이 시점에서, 상기 제2 흡착 서브유닛은 오프-라인된다. 상기 정제된 IgG가 선택적으로 수집될 수 있거나, 예비 제형 완충제로 완충제 교환될 수 있으며, 이후에 수집될 수 있다. 상기 장치가 개시되는 장치 및 방법들의 본질적인 특징들과 기능들로부터 벗어나지 않고 폭넓게 다양한 접선 유동 서브유닛들 및/또는 크로마토그래피 서브유닛들과 맞을 수 있는 점은 분명해질 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 IgG의 농도 다음의 제1 분별 단계는 침전 단계가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 침전 단계는 분리 단계에 후속할 수 있다. 침전 단계들이 그렇지 않으면 오염물들과 상기 원하는 생성물 사이 또는 오염물들과 상기 장치의 내부 접촉-표면 사이의 비특이적 연관들의 일시적인 안정화의 고유한 위험성을 가지기 때문에 후자가 일부 실시예들에서 바람직할 수 있다. 특히 이와 같은 적용의 원리를 예시하도록 선택되는 일 실시예에서, 상기 컨디셔닝된 제제는 먼저 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 농축되며, 이후에 분리 완충제가 pH 5.5의 1M의 구아니딘-HCl과 같은 분리 완충제가 도입된다. 농축 및 분리 단계들 동안, 상기 오염물들의 대부분은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛의 멤브레인을 통해 제거될 것이다. pH 6.0 1.3M의 시트르산과 같은 침전 완충제가 일 실시예에서 도입된다. 침전 완충제의 비율이 상기 제제 내에서 전체적으로 증가됨에 따라, 상기 IgG가 침전된다. 흐름 경로는 이후에 상기 제제가 침전물들을 유지하지만 가용성의 단백질들은 그렇지 않은 적절한 공극 크기를 갖는 제2 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 안내되도록 전환된다. 상기 침전물이 가용성의 오염물들의 충분한 양이 상기 멤브레인을 통해 제거되었던 것으로 판단되는 pH 6.0의 1.3M의 시트르산으로 충분하게 세척되었던 후, 상기 흐름 경로는 흐름이 가용성 형태의 IgG를 유지하지만, 보다 작은 오염물들의 통과와 제거를 여전히 가능하게 하는 적절한 멤브레인을 갖는 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 안내되도록 다시 전환된다. 투입 완충제는 pH 8.2의 50mM의 트리스로 변경되어 투입된다. 상기 침전물들이 완전히 재가용화되었던 중간 시점에서, 일부 실시예들에서 사차 아미노기들을 지니는 모놀리스로 구성된 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛이 인-라인으로 배치된다. 상기 원하는 항체와 함께 재가용화되는 작은 오염물들은 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 장치의 멤브레인을 통한 통과에 의해 제거된다. 상기 제제가 전체적으로 pH 8.2의 50mM의 트리스 내에 머무르는 시간에서, 남아 있는 산성의 오염물들은 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 결합되었고, 이에 따라 제거되었던 것으로 이해된다. 상기 흡착 크로마토그래피 서브유닛은 상기 원하는 IgG를 제거하도록 깨끗한 pH 8.2의 50mM의 트리스로 세정되고, 상기 흡착 서브유닛은 오프-라인된다. 정제된 IgG는 선택적으로 수집될 수 있거나 예비 제형 완충제로 완충제 교환될 수 있으며, 이후에 수집될 수 있다. 양자의 경우에서, 작은 오염물들의 추적 레벨들은 상기 프로세스의 전체 기간 동안에 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 장치를 통한 통과에 의해 계속하여 제거된다. 단백질들, 바이러스들 및 바이러스 유사 종들을 포함하여 다른 원하는 생성물들의 침전에 기초하는 분별이 선택적으로는 다른 멤브레인들 및 흡착 서브유닛들을 통해 본질적으로 동일한 방식으로 수행될 수 있는 점이 분명해질 것이다.
IgG의 정제는 또한 어떻게 개시되는 장치들 및 방법들이 종래의 크로마토그래피 장치들 및 방법들과 통합될 수 있는 지를 예시하는 플랫폼으로 기능한다. 일부 실시예들에 있어서, 정제가 개시되는 장치 및 방법들과 배타적으로 수행될 필요는 없다. 일부 정제 단계들은 개시되는 장치 및 방법들로 수행될 수 있지만, 다른 단계들은 종래의 크로마토그래피 장치들 및 방법들, 또는 다른 새로운 크로마토그래피 장치들 및/또는 방법들로 수행될 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, IgG 단일클론성 항체의 초기 정제는 칼럼 내에 충전된 종래의 단백질 A 친화 크로마토그래피 매체들을 사용하는 종래의 크로마토그래프 상에서 수행되는 단백질 A 친화 크로마토그래피로 수행된다. 이후에 단백질 A 친화 크로마토그래피에 도 1과 같이, 음이온 교환 크로마토그래피 단계로만 제한됨에도 불구하고 종래의 크로마토그래피에 대해 몇몇 귀중한 이점들을 생성하는 개시되는 방법들을 이용하여 개시되는 장치 상에서 수행되는 음이온 교환 크로마토그래피가 후속될 수 있다. 예를 들면, 종래의 후-단백질(post-protein) A 샘플이 하나를 다른 하나와 접촉시키기 전에 음이온 교환 조건들로 평형화되어야 하고, 상기 음이온 교환 칼럼 또한 평형화되어야 하는 경우, 개시되는 장치 및 방법들로써 접촉 이전에 평형화될 필요가 없게 된다. 또한, 종래의 후-단백질 A 물질의 평형화는 흔히 샘플 부피를 증가시키는 희석에 의해 이루어지며, 이로 인하여 상기 희석은 자주 가장 낮은 가능한 염 농도까지 진행되지 못하게 한다. 개시되는 장치로써, 염 농도가 희석 없이 원하는 정도로 낮게 감소될 수 있다. 또한, 후-단백질 A 물질 내의 오염시키는 숙주 단백질들의 많은 양이 후속되는 종래의 음이온 교환 단계의 능력에 부담을 지우는 경우, 본 발명의 장치 및 방법들로써, 이들 오염물들의 대부분은 상기 접선 유동 여과 모듈의 공극들 before 상기 음이온 교환 흡착 서브유닛이 인-라인으로 배치되기 전에 상기 접선 유동 여과 모듈의 공극들을 통해 제거될 수 있으며, 이에 따라 상기 음이온 교환체의 용량이 보존되고, 상기 음이온 교환체가 IgG의 단위 당 보다 낮은 물질 비용으로 IgG의 보다 큰 부피를 처리하는 것을 잠재적으로 허용한다. 또한, IgG 정제와 함께 적용되는 모드에서 종래의 음이온 교환은 상기 음이온 교환체에 결합되는 오염물들을 제거하지만, 상기 음이온 교환체와 결합되지 못한 작은 오염물들을 제거하지 못한다. 개시되는 장치 및 방법들 이들 모두를 제거한다. 산성의 오염물들은 여전히 상기 음이온 교환체에 결합되는 반면, 작은 결합되지 않은 오염물들은 상기 접선 유동 여과 모듈 내의 공극들을 통해 제거된다.
IgM의 정제는 어떻게 상기 방법이 비-IgG 단백질에 적용될 수 있는 지를 이해하는 플랫폼을 나타낸다. 이러한 일 실시예에 있어서, 세포 배양 수확물의 전도도는 NaCl의 첨가에 의해 약 20mS/㎝까지 증가된다. 이는 상기 제제를 상기 장치와 접촉시키기 이전에 컨디셔닝 단계로 후속하여 추가되는 가용성 또는 불용성의 전기양성이나 전기음성 유기 이온들과의 상호작용들로 인한 우연한 결합 및 IgM 손실을 방지하도록 이루어진다. pH는 동일한 이유로 6.0까지 조정된다. 다른 비-IgG 단백질들로써, 전도도 및 pH는 원하는 단백질의 성질들에 따라 보다 높거나 보다 낮은 다른 값들로 조정될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인이 상기 수확물에 1%(v:v)의 양으로 첨가되고, 0.025%로 에타크리딘이나 메틸렌 블루, 또는 결합된 농도가 0.025%인 둘의 결합, 혹은 0.025%의 농도로 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 혹은 결합된 농도가 0.025%인 세틸트리메틸암모늄 브로마이드와 에타크리딘 및/또는 메틸렌 블루의 결합의 첨가가 후속되며, 60분-120분 동안 교반되면서 배양되게 한다. 일부 실시예들에 있어서, TREN으로 기능화된 입자들과 같은 기능화된 입자들이, 예를 들면 2%(v:v)-5%(v:v)의 양으로 첨가되고, 상기 혼합물은 2시간-4시간 또는 그 이상 배양되며, 이후에 고체들은 임의의 편리한 방법으로 제거된다. 상기 컨디셔닝된 제제는 도 1에 예시된 바와 같이 개시되는 장치와 접촉되며, 여기서 상기 제1 단계는 상기 원하는 단백질의 고유의 용해도 및 점도에 의해 허용되는 경우에 상기 원하는 생성물의 대략적인 농도가 20g/L, 또는 30g/L, 또는 40g/L, 또는 50g/L 혹은 그 이상의 농도가 되도록 상기 제제의 부피를 감소시키는 것이다. 약 1백만 달톤(Dalton) 및 22㎚-25㎚의 유체역학적 직경을 갖는 IgM의 큰 크기로 인하여, 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내에 수용된 멤브레인은 IgG와 같은 보다 작은 원하는 단백질의 정제을 위해 요구되는 경우보다 큰 공극들을 가질 수 있다. 예를 들면, 100kDa 또는 300kDa의 질량을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 갖는 멤브레인을 채용하는 것이 가능할 수 있다. 그러나, 실험 데이터는 경쟁적인 결과들이 50kDA 또는 30kDa 혹은 심지어 10kDa의 질량을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 크기를 갖는 멤브레인들과 같은 훨씬 작은 공극 크기 분포들을 갖는 멤브레인들으로 얻어질 수 있는 점을 나타낸다. 많은 경우들에서, 실험 데이터는 재생된 셀룰로오스로 구성된 멤브레인들이 폴리에테르술폰(polyethersulfone)과 같은 중합체들로 구성된 멤브레인들보다 높은 정도의 정제를 유지하는 점을 보여준다. 농축 후, 상기 제제는 이후에 바이러스 불활성화를 구현하도록 선택적으로 처리될 수 있거나, 상기 원하는 단백질과 비특이적으로 연관될 수 있는 오염물 종들을 분리시키는 약제들을 함유하는 단계로 처리될 수 있다. 오염물들을 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛에 결합시키는 조건들을 위해 상기 제제를 예비 평형화시키는 요구 없이, 상기 제제는 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛과 접촉된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 그 표면상에 양성의 전하들을 지닐 수 있다. 이후에, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛과 여전히 접촉되어, 상기 제제는 상기 원하는 단백질의 과도한 양을 결합시키지 않고 대부분의 오염물들을 결합시키는 조건들까지 인접하는 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 완충제 교환된다. 상기 원하는 단백질은 이후에 상기 시스템으로부터 소거되고, 수집된다. 상기 단백질은 선택적으로 두 흡착 서브유닛들을 포함하는 상기 장치의 형태 내에서 정제될 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 하나의 흡착 서브유닛은 음성의 전하들을 지닐 수 있는 반면, 다른 하나는 양성의 전하들을 가진다. 이러한 동일한 일반적인 접근이 임의의 재조합 단백질들에 적용될 수 있고, 여기서 세포 배양 수확물을 제조하기 위한 조건들이 상기 원하는 단백질의 성질들에 맞추어 지고, 상기 멤브레인의 공극률이 상기 원하는 단백질의 크기에 따라 선택되며, 상기 흡착 서브유닛 또는 서브유닛들의 화학적 표면이 상기 원하는 단백질 및 오염물 종들의 성질들에 따라 선택되는 점이 분명해질 것이다. 전체 정제 프로세스의 다양한 단계들을 수행하기 위해 적절한 조성과 공극률의 멤브레인들, 흡착 서브유닛들 및 화학적 조건들을 선택하는 것은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 이내일 것이다.
유전자 치료를 위해 사용되는 바와 같은 매우 큰 DNA 플라스미드들의 정제는 상기 장치의 적용을 설명하기 위한 또 다른 플랫폼을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 컨디셔닝하는 단계는 원심분리 및/또는 여과를 통한 정화를 수반하지만, 일반적으로 DNA가 크로마틴의 성분이기 때문에 크로마틴을 제거하는 데 사용되는 약제들을 피한다. 컨디셔닝하는 단계는 선택적으로 전기음성 및/또는 소수성 성질들을 구현하는 약제들로의 처리를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 단계는 상기 제제를 상기 장치와 접촉시킴에 따라 상기 멤브레인의 공극 크기 분포보다 작은 오염물들이 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛의 멤브레인을 통해 제거될 것인 동안에 DNA를 농축시킬 것이다. 상기 멤브레인은 상기 DNA 플라스미드를 유지하기에 충분한 공극 크기 분포를 구현하도록 선택될 수 있다. 공극 크기 분포가 보다 클수록, 통과할 수 있는 오염물들의 스펙트럼이 커지지만, 상기 DNA 플라스미드를 유지하기에 필요한 경우보다 작은 공극 크기 분포를 갖는 멤브레인들 또한 충분한 성능을 유지할 수 있다. 모든 상기 수확물이 도입되었던 직후, 분리 완충제가 도입되고, 상기 제제는 상기 시스템을 통해 계속 순환된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 분리 완충제는 높은 농도의 중성이나 카오트로픽 염 및/또는 계면활성제 및/또는 요소(urea) 및/또는 비특이적으로 연관될 수 있는 오염물들로부터 DNA 플라스미드를 제거하거나 및/또는 상기 장치 내부의 표면들과 연관될 수 있는 오염물들을 분리시키도록 의도되는 다른 분리 작용제들이며, 이에 따라 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛의 멤브레인을 통한 통과에 의한 이들의 제거를 가능하게 한다. 상기 제제가 여전히 분리 완충제 내에 머무르는 경우, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 인-라인으로 위치할 수 있다. 상기 흡착 서브유닛의 내부 제제-접촉 표면이 상승된 소수성을 구현하도록 기능화되는 일련의 실시예들에 있어서, 이후에 상기 완충제는 일부 실시예들에서 중성으로부터 약간 알칼리성 pH로 어떤 것이라도 존재하는 경우에 황산나트륨 또는 황산암모늄, 시트르산 나트륨 또는 시트르산 칼륨, 혹은 인산칼륨과 같은 침전시키는 염과 같은 단백질 오염물들의 소수성 상호작용들을 증진시키는 제형으로 교환된다. 상기 제제가 전체적으로 이들 조건들로 평형화되는 시점에서, 상기 흡착 서브유닛에 결합되는 오염물들이 이에 따라 제거된다. 상기 흡착 서브유닛은 상기 유닛의 내부 부피로부터 DNA를 회수하도록 동일한 제형의 깨끗한 완충제로 세정되고, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 오프-라인되며, 제2 흡착 서브유닛이 선택적으로 인-라인된다. 상기 흡착 서브유닛의 제제-접촉 표면이 음성의 전하를 구현하도록 기능화되는 일련의 실시예들에 있어서, 상기 완충제는 이후에 pH 4.0의 0.05M의 아세트산과 같은 낮은 pH와 낮은 전도도의 완충제로 교환된다. 상기 제제가 전체적으로 이들 조건들로 평형화되는 시점에서, 상기 DNA보다 덜 산성인 오염물들은 상기 제2 흡착 서브유닛에 결합될 수 있고, 이에 따라 제거될 수 있다. 상기 제2 흡착 서브유닛은 이후에 깨끗한 pH 4.5의 0.05M의 아세트산으로 세정되며, 그 후에 상기 서브유닛은 오프-라인된다. 정제된 DNA 플라스미드는 이후에 상기 시스템으로부터 수집되거나, 수집되기 이전에 선택적으로 예비 제형 또는 최종 제형의 완충제로 교환될 수 있다.
바이러스 또는 바이러스 유사 입자들의 정제는 상기 장치의 기능적 특징들을 이해하기 위한 또 다른 플랫폼을 제공한다. DNA와 함께 때때로 보다 높은 정도까지로, 크로마틴을 제거하도록 수확물을 컨디셔닝하는 단계는 상기 원하는 바이러스 역시 제거하는 높은 위험성을 수반한다. 지질 외피 바이러스들은 특히 크로마틴 제거에 기초하는 컨디셔닝 방법들에 의해 우연히 제거될 가능성이 매우 높다. 상기 샘플을 컨디셔닝하는 단계는 이에 따라 종종 원심분리 및/또는 여과와 같은 물리적인 방법들에 제한될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 단계는 상기 바이러스 제제를 상기 바이러스를 유지하기에 충분한 공극 크기 분포를 갖는 멤브레인을 구비하는 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 유닛에 의해 보다 작은 부피까지 농축시킬 것이다. 많은 실시예들에 있어서, 다음 단계는 DNA 정제를 위해 앞서 기술한 바와 같이 분리 완충제를 도입할 것이다. 일반적인 사실상, 의도된 사용에 적합하지 않은 바이러스를 영구적으로 남기지 않는 가장 강한 분리 제형이 바람직할 것이다. 상기 바이러스가 여전히 분리 완충제 내에 머무르는 경우, 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛은 인-라인으로 될 수 있고, 도입되는 완충제는 상기 제제 내의 조건들을 상기 완충제의 조건들로 전환시킬 것이며, 여기서 이들 조건들은 또한 상기 적어도 하나의 접선 유동 여과 서브유닛 내의 멤브레인의 공극들을 통해 미리 제거되지 않았던 오염물들이 상기 적어도 하나의 흡착 서브유닛의 표면에 결합되도록 설계된다. 기(group)로 인해, 바이러스들 및 바이러스 유사 입자들은 단백질들 및 결합된 DNA보다 훨씬 폭넓게 다양한 표면 화학적 특징들을 구현하지만, 음성 전하들, 양성 전하들, 소수성 전기들 및 이들의 결합들과 같은 공통의 크로마토그래피 표면들이 채용될 수 있다. 일반적인 사실상, 배양 동안에 상기 바이러스에 의해 죽은 세포들로부터 방출되는 DNA에 의한 바이러스 제제들의 오염은 특히 상기 DNA가 상기 원하는 바이러스 종들과 결합될 수 있는 정도까지 심각한 문제이다. 양성의 전하들을 지니는 흡착 서브유닛이 이에 따라 바람직하게 적어도 하나의 흡착 서브유닛으로 작용할 수 있다.
도면들로부터 벗어나는 많은 구성들이 개시되는 장치의 본직적인 특징들을 보존하도록 구현될 수 있는 점이 분명해질 것이다. 하나 또는 그 이상의 이러한 실시예들에 있어서, 개시되는 장치의 구성 요소들은 결합되지 않을 수 있고, 특정한 기능들이 단계적인 토대로 수행될 수 있다.
실험예들
실험예 1. 크로마틴이 259,218ppm의 숙주 단백질 오염물들 및 21%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 추출되었다. 크로마틴은 pH 5.2에서 1%의 알란토인(allantoin), 0.4%의 카프릴산(caprylic acid)의 첨가에 의해 추출되었고, 2시간 동안 배양되었으며, 후속하여 전기양성의 금속 친화 입자들(TREN 40 하이(high), 바이오-워크스(Bio-Works))이 4%의 용적 비율까지 첨가되었고, 추가로 4시간 동안 혼합되면서 배양되었으며, 이후에 고체들이 제제를 뎁스 필터(depth filter)(사르토리우스(Sartorius) PC1)를 통과시켜 제거되었다. 숙주 단백질들은 308ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.05% 이하로 감소되었다. 프로토타입(prototype) 장치가 단일의 접선 유동 여과 서브유닛 및 단일의 흡착성 서브유닛으로 구성되었다. 상기 접선 유동 여과 서브유닛은 50kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 폴리에테르술폰(PES) 멤브레인(밀리포어(Millipore))을 구비하였다. 상기 흡착성 서브유닛은 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈(Separations))였다. 컨디셔닝된 수확물은 오프-라인된 흡착 서브유닛을 갖는 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 약 20㎎/mL까지 농축되었다. 상기 흡착 서브유닛은 상기 접선 유동 여과 서브유닛과 인-라인으로 되었고, 완충제는 pH 8.0에서 50mM의 트리스로 교환되었다. 상기 시스템을 통해 흐르는 상기 완충제가 투입 완충제와 동일한 pH 및 전도도에 도달되었을 때, 상기 흡착 서브유닛 라인은 pH 8.0의 깨끗한 50mM의 트리스로 세정되었고, 상기 IgG가 수집되었다. 사람에게 주사 가능한 치료 항체들에 대한 규제적 표준들은 숙주 단백질들이 100ppm 또는 그 이하로 감소되고, 응집체들이 1% 또는 그 이하로 감소될 것을 요구한다. 단백질 A 친화 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피로 구성되는 3단계 정제 프로세스들은 일반적으로 이들 요구 사항들을 만족시킬 수 있지만, 실질적인 여지로 이들을 거의 넘지 않는다. 개시되는 방법들은 응집체들을 0.01% 이하까지 감소시켰고, 숙주 단백질들을 11ppm까지 감소시켰다. 세포 배양 수확물이 원심분리 및 미세여과만을 이용하여 제조되었던 대조 실험이 수행되었다. 이는 응집체들을 2.14%까지 감소시켰고, 숙주 단백질들을 78,698ppm까지 감소시켰으며, 개시되는 장치로 상기 제제를 처리하는 것에 앞서 크로마틴 추출의 기여가 강조된다.
실험예 2. 실험예 1의 크로마틴-추출된 수확물이 실험예 1과 같이 접선 유동 여과 서브유닛을 구비하는 프로토타입 장치에 적용되었지만, 흡착 서브유닛은 사르토빈드(Sartobind) 페닐 멤브레인 흡착기(사르토리우스)로 대체되었다. 컨디셔닝된 수확물은 인-라인인 상기 흡착 서브유닛으로 약 20㎎/mL까지 농축되었다. 상기 페닐 흡착 서브유닛은 인-라인으로 되었고, 완충제는 pH 7.0의 50mM의 헤페스(HEPES), 1.7M의 NaCl로 교환되었다. 상기 시스템을 통해 흐르는 상기 완충제가 투입 완충제와 동일한 pH 및 전도도에 도달되었을 때, 상기 페닐 흡착 서브유닛 라인은 pH 7.0에서 깨끗한 50mM의 헤페스, 1.7M의 NaCl로 세척되었고, 상기 흡착 유닛은 오프-라인되었다. 상기 IgG가 수집되었고, 분석되었다. 응집체들은 0.01% 이하로 감소되었고, 숙주 단백질들은 9ppm까지 감소되었다.
실험예 3. 실험예 1의 크로마틴-추출된 수확물이 동일한 접선 유동 여과 서브유닛 및 동일한 흡착 서브유닛(QA 모놀리스)을 가지지만, 사르토빈드 페닐 멤브레인 흡착기(사르토리우스) 형태의 추가 흡착 서브유닛을 갖는 프로토타입 장치에 적용되었다. 컨디셔닝된 수확물은 인-라인된 흡착 유닛들 없이 약 20㎎/mL까지 농축되었다. 상기 페닐 흡착 서브유닛은 인-라인으로 되었고, 완충제는 pH 7.0의 50mM의 헤페스, 1.7M의 NaCl로 교환되었다. 상기 시스템을 통해 흐르는 상기 완충제가 투입 완충제와 동일한 pH 및 전도도에 도달되었을 때, 상기 페닐 흡착 서브유닛 라인은 세정되었고, 오프-라인으로 전환되었으며, 동시에 상기 QA 모놀리스 흡착 서브유닛이 온-라인으로 되었다. 완충제는 pH 8.0의 50mM의 트리스로 교환되었다. 상기 시스템을 통해 흐르는 상기 완충제가 투입 완충제와 동일한 pH 및 전도도에 도달되었을 때, 상기 QA 모놀리스 흡착 서브유닛 라인은 세정되엇고, 상기 IgG가 수집되었다. 응집체들은 0.01% 이하로 감소되었고, 숙주 단백질들은 1ppm까지 감소되었다.
실험예 4. 실험예 3의 실험이 QA 모놀리스 대신에 대체되는 다른 음이온 교환 흡착 유닛들을 제외하면 동일한 장치, 물질들 및 조건들로 수행되었다. 사르토빈드 Q 멤브레인 흡착기(사르토리우스)의 대체는 1ppm까지의 숙주 단백질의 감소를 가져왔다. 염 내성의 상호작용 크로마토그래피 멤브레인 흡착기(사르토리우스)의 대체는 1ppm까지의 숙주 단백질의 감소를 가져왔다. DEAE 모놀리스(BIA 세퍼레이션즈)의 대체는 1ppm까지의 숙주 단백질의 감소를 가져왔다. EDA 모놀리스(BIA 세퍼레이션즈)의 대체는 1ppm까지의 숙주 단백질의 감소를 가져왔다. 응집체 레벨들은 모든 실험들에서 0.01% 이하까지 감소되었다.
실험예 5. 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 갖는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 접선 유동 여과 서브유닛을 설정한 점 이외에는 실험예 2의 실험 포맷이 재현되었다. 정제된 IgG 내의 숙주 단백질 오염은 2ppm까지 감소되었다. 응집체들은 0.01% 이하였다.
실험예 6. EDA 모놀리스의 형태로 제2 흡착 서브유닛을 포함하는 점을 제외하면 실험예 2의 실험 포맷이이 재현되었다. 숙주 단백질은 검출할 수 없었다. 응집체들은 0.01% 이하였다.
실험예 7. 277,433ppm 숙주 단백질 오염물들 및 23%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제되었으며, 이는 숙주 단백질 함량을 1,074ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 1.1%까지 감소시켰다. 이러한 단계는 또한 크로마틴의 대부분을 제거하는 목적에 기여하였다. 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 갖는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)과 페닐 멤브레인 흡착기 및 QA 모놀리스로 구성된 두 흡착 서브유닛들을 구비하는 단일의 접선 유동 여과 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 단백질 A 단계로부터 부분적으로 정제된 IgG는 상기 장치에 적용되었고, 실험예 2에 기재된 바와 같이 더 정제되었다. 숙주 단백질은 수집된 IgG 내에서 검출할 수 없었고, 응집체들은 0.01% 이하였다.
실험예 8. 243,997ppm의 숙주 단백질 오염물들 및 24%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 pH 5.2에서 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산의 첨가에 의해 크로마틴을 추출하도록 처리되었고, 2시간 동안 배양되었으며, 후속하여 전기양성의 금속 친화 입자들(TREN 40 하이, 바이오-워크스)이 4%의 양으로 첨가되었고, 추가의 4시간 동안 혼합되면서 배양되었으며, 이후에 고체들이 제제를 뎁스 필터(사르토리우스 PC1)를 통과시킴에 의해 제거되었다. 숙주 단백질들은 305ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.05% 이하까지 감소되었다. 항체는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제되었으며, 상기 숙주 단백질을 5ppm까지 감소시켰고, 이는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 갖는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛을 포함하는 프로토타입 장치에 적용되었다. 숙주 단백질은 검출할 수 없었다. 응집체들은 0.01% 이하였다.
실험예 9. 243,997ppm의 숙주 단백질 오염물들 및 24%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 pH 5.6에서 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산의 첨가에 의해 크로마틴을 추출하도록 처리되었고, 2시간 동안 배양되었으며, 후속하여 전기양성의 금속 친화 입자들(TREN 40 하이, 바이오-워크스)이 4%의 양으로 첨가되었고, 추가의 4시간 동안 혼합되면서 배양되었으며, 이후에 고체들이 제제를 뎁스 필터(사르토리우스 PC1)를 통과시킴에 의해 제거되었다. 숙주 단백질들은 3,551ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.5% 이하까지 감소되었다. 항체는 1.8M의 황산암모늄으로의 침전에 의해 더 정제되었고, 상기 숙주 단백질을 1,423ppm까지 감소시켰으며, 이는 50kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 PES 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛을 포함하는 프로토타입 장치에 적용되었다. 수집된 IgG 내의 숙주 단백질 오염은 12ppm까지 감소되었다. 응집체들은 0.05% 이하였다.
실험예 10. 369,422ppm의 숙주 단백질 오염, 11%의 응집체들 및 약 10%의 유리 경쇄를 갖는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 크로마틴 부하를 감소시키고 항체를 부분적으로 정제하도록 단백질 A에 의해 처리되었다. 숙주 단백질 오염은 1,873ppm까지 감소되었고, 응집체들은 1.12%까지 감소되었으며, 유리 경쇄(free light chain)는 0.4%까지 감소되었다. 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 제제는 오프-라인인 흡착 서브유닛을 갖는 상기 장치를 통과하도록 초기에 처리되었고, 그 시간 동안의 완충제는 pH 7.0의 50mM의 헤페스, 150mM의 NaCl이었다. 이는 숙주 단백질 오염을 350ppm까지 감소시켰고, 유리 경쇄를 0.2%까지 감소시켰지만, 응집체 함량은 1.70%까지 증가되었다. 상기 흡착 서브유닛이 인-라인으로 설정되었고, 상기 완충제는 pH 8.0의 20mM의 트리스(Tris)로 변경되었다. 숙주 단백질 오염은 8ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.55%까지 감소되었으며, 유리 경쇄는 0.19%까지 감소되었다.
실험예 11. 크로마틴이 293,158ppm의 숙주 단백질 오염, 23.35%의 응집체들 및 약 12%의 유리 경쇄를 갖는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 pH 5.4에서 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산으로 이를 처리하여 추출되었고, 2시간 동안 이를 배양시켰으며, 고체들을 미세여과에 의해 제거하였고, 이후에 이를 최초 세포 배양 수확물 부피의 5%의 부피로 바이오-워크스 TREN(하이)로 충전된 칼럼을 통과시켰다. 숙주 단백질 오염은 3,565ppm까지 감소되었고, 응집체들은 2.1%까지 감소되었으며, 유리 경쇄는 1.72%까지 감소되었다. 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 수집된 내의 숙주 단백질 오염은 563ppm까지의 양이었고, 응집체 함량은 2.7%까지 증가하였으며, 유리 경쇄는 2.37%까지 증가되는 것으로 나타났었다. 상기 제제는 별도의 후속되는 처리를 위해 3개의 부분들로 분할되었다. 결합-용리 모드로 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(CHT 타입(Type) I, 40미크론, 바이오-라드(Bio-Rad))에 의해 처리된 부분은 숙주 단백질들을 113ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 1.22%까지 감소시켰으며, 유리 경쇄를 1.7%까지 감소시켰다. 결합-용리 모드로 전기음성의 다중 모드 크로마토그래피 매체(HCX, 머크-밀리포어(Merck-Millipore))로 충전된 칼럼 상에서 크로마토그래피에 의해 처리된 부분은 숙주 단백질들을 18ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 1.61%까지 감소시켰으며, 유리 경쇄를 0.49%까지 감소시켰다. 결합-용리 모드로 전기양성의 다중 모드 크로마토그래피 매체(캅토 애드히어(Capto adhere), GE 헬스케어(Healthcare)) 상에서 크로마토그래피에 의해 처리된 부분은 숙주 단백질 오염을 3ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 0.47%까지 감소시켰으며, 유리 경쇄를 검출할 수 없는 점까지 감소시켰다.
실험예 12. 실험예 11로부터의 크로마틴-추출된 제제가 QA 음이온 교환 모놀리스가 SO3 양이온 교환 모놀리스로 대체되었던 점을 제외하면 실험예 11에서와 동일한 방식으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었고, 완충제는 pH 8.0의 50mM의 트리스, 25mM의 NaCl로 변경되었으며, 이에 따라 항체가 상기 양이온 교환체에 상당히 결합되지 않을 수 있었다. 숙주 단백질 오염은 3,565ppm부터 2,852ppm까지 감소되었고, 응집체들은 2.01%부터 0.96%까지 감소되었으며, 유리 경쇄 함량은 1.72%부터 2.75%까지 증가하는 것으로 나타났다. 상기 제제는 별도의 후속하는 처리를 위해 3개의 부분들로 분할되었다. 결합-용리 모드로 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(CHT 타입 I, 40미크론, 바이오-라드)에 의해 처리된 부분은 숙주 단백질들을 1,354ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 0.15%까지 감소시켰으며, 유리 경쇄를 2.80%까지 감소시켰다. 결합-용리 모드로 전기음성의 다중 모드 크로마토그래피 매체(HCX, 머크-밀리포어)로 충전된 칼럼 상에서 크로마토그래피로 처리된 부분은 숙주 단백질들을 147ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 0.96%까지 감소시켰으며, 유래 경쇄를 0.43%까지 감소시켰다. 결합-용리 모드로 전기양성의 다중 모드 크로마토그래피 매체(캅토 애드히어, GE 헬스케어) 상에서 크로마토그래피에 의해 처리된 부분은 숙주 단백질 오염을 72ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 0.16%까지 감소시켰으며, 유리 경쇄를 검출할 수 없는 점까지 감소시켰다.
실험예 13. 실험예 11로부터의 크로마틴-추출된 제제가 QA 음이온 교환 모놀리스가 소수성 부틸 모놀리스로 대체되었던 점을 제외하면 실험예 11에서와 동일한 방식으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 제제는 3개의 부분들로 분할되었다. 하나의 부분은 항체가 흡착제에 결합되지 않았던 조건 하에서 상기 장치 상에서 pH 6.0의 20mM의 MES로 완충제 교환되었다. 수집된 항체의 숙주 단백질 오염은 3,565ppm으로부터 1,894ppm까지 감소되었고, 응집체 함량은 2.01%로부터 2.17%까지 약간 증가하는 것으로 나타났으며, 유리 경쇄 함량은 1.72%로부터 2.51%까지 증가하는 것으로 나타났다. 또 하나의 부분은 상기 장치 상에서 pH 7.0의 20mM의 헤페스로 완충제 교환되었다. 수집된 항체의 숙주 단백질 오염은 3,565ppm부터 2,525ppm까지 감소되었고, 응집체 함량은 2.01%부터 1.61%까지 감소되었으며, 유리 경쇄 함량은 1.72%부터 2.43%까지 증가하는 것으로 나타났다. 다른 하나의 부분은 상기 장치 상에서 pH 8.0의 20mM의 트리스로 완충제에 교환되었다. 수집된 항체의 숙주 단백질 오염은 3,565ppm으로부터 3,095ppm까지 감소되었고, 응집체 함량은 2.01%로부터 0.82%까지 감소되었으며, 유리 경쇄 함량은 1.72%로부터 3.17%까지 증가는 것으로 나타났다.
실험예 14. 393,093ppm으로 숙주 단백질 오염 및 10.96%의 응집체들을 갖는 IgG를 함유하는 포유동물의 세포 배양 상청액이 IgG를 농후하게 하고 크로마틴 함량을 감소시키도록 단백질 A의 칼럼에 적용되었다. 숙주 단백질 함량은 2,058ppm까지 감소되었고, 응집체들은 1.22%까지 감소되었다. NaCl이 1M의 최종 농도까지 용해되었고, 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 갖는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛과 두 흡착 서브유닛들 강한 음이온 교환 모놀리스 및 하이드록실(hydroxyl) 함유 모놀리스(CIM QA, CIM OH, BIA 세퍼레이션즈)를 각기 구비하는 직렬로 배관된 두 흡착 서브유닛들로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 제제는 오프-라인인 흡착 크로마토그래피 서브유닛들로 pH 8.0에서 20mM의 트리스로 완충제 교환되었고, 그 동안에 숙주 단백질 오염은 1242ppm까지 더 감소되었던 반면, 응집체들은 1.33%까지 증가되었다. 상기 흡착 크로마토그래피 서브유닛들은 인-라인으로 위치하였고, 완충제 및 샘플은 상기 시스템을 통해 재순환되었다. 숙주 오염물들은 8ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.42%까지 감소되었다.
실험예 15. 크로마틴이 260,184ppm의 숙주 단백질 오염 및 26.05%의 응집체들을 갖는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 pH 5.4에서 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산으로 이를 처리하여 추출되었고, 2시간 동안 이를 배양하였으며, 고체들을 미세여과에 의해 제거하였고, 이후에 이를 최초 세포 배양 수확물의 부피의 5%의 부피로 바이오-워크스 TREN(하이)로 충전된 칼럼을 통과시켰다. 숙주 단백질 오염은 5,378ppm까지 감소되었고, 응집체들은 3.98%까지 감소되었다. IgG 농도는 최초의 0.71㎎/mL로부터 0.59㎎/mL까지 감소되었다. 제제는 전기음성의 다중 모드 입자들(HCX, 머크-밀리포어)로 충전된 칼럼에 적용되었고, 상기 칼럼은 세척되었으며, 상기 IgG는 염 차이에 의해 용리되었고, 숙주 단백질 함량을 490ppm까지 감소시켰으며, 응집체들을 2.06%까지 감소시켰다. IgG 농도 5.69㎎/mL이었다. HCX-용리된 제제는 약 0.7M의 NaCl에서 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)을 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 흡착 서브유닛은 초기에 오프-라인이었다. 상기 제제는 34㎎/mL의 IgG 농도까지 농축되었고, 그 동안에 숙주 단백질 농도는 297ppm까지 감소되었으며, 응집체들은 2.17%였다. 상기 흡착 서브유닛은 인-라인으로 되었고, 상기 제제는 pH 8.0의 50mM의 트리스의 투입 동안에 완충제를 교환하도록 재순환되었다. 상기 시스템이 평형(완충 교환 완료)이었을 때, 수집된 IgG(23.2㎎/mL) 내의 숙주 단백질 오염은 153ppm까지의 양이었고, 응집체 함량은 2.29%였다.
실험예 16. 실험예 15의 실험 단계들이 다음에 기재되는 바를 제외하면 실험예 15에서의 다른 세부 사항들로써 다른 세포 배양 수확물로 별도의 실험으로 재현되었다. 프로토타입 장치 내로 진행되는 제제의 숙주 단백질 함량은 196ppm(실험예 15에서 490ppm에 대해)이었다. pH 8.0의 50mM의 트리스로 완충제 교환 후, 숙주 오염은 110ppm까지 감소되었다. 흡착 서브유닛(QA 모놀리스)이 인-라인으로 되었고, 숙주 오염을 1디아볼륨(diavolume)에서 40ppm까지 감소시켰고, 5디아볼륨 후에 26ppm까지 감소되었다.
실험예 17. 실험예 15의 실험 단계들이 다음에 기재되는 바를 제외하면 실험예 15에서의 다른 세부 사항들로써 다른 세포 배양 수확물로 별도의 실험으로 재현되었다. 프로토타입 장치 내로 진행되는 제제의 숙주 단백질 함량은 215ppm(실험예 15에서 490ppm에 대해)이었다. pH 8.0에서 50mM의 트리스로 완충제 교환 후에, 숙주 오염은 116ppm까지 감소되었다. 흡착 서브유닛(QA 모놀리스)이 인-라인으로 되었고, 숙주 오염을 1디아볼륨에서 28ppm까지 감소시켰으며, 5디아볼륨 후에 19ppm까지 감소시켰다. 상기 실험은 상기 흡착 서브유닛 내의 QA 모놀리스를 사차 아민 멤브레인 흡착기(사트로빈드 Q, 사르토리우스)로 대체한 점을 제외하면 동일한 크로마틴-겹핍/HCX-처리 항체의 부분 표본으로 반복되었다. 숙주 오염은 1디아볼륨 후에 28ppm까지 감소되었고, 5디아볼륨 후에 17ppm까지 감소되었다. 상기 실험은 상기 흡착 서브유닛 내의 QA 모놀리스를 사차 아민 이온 교환 크로마토그래피 입자들(누비아(Nuvia) Q, 바이오-라드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories))로 충전된 칼럼으로 대체한 점을 제외하면 동일한 크로마틴-결핍/HCX-처리 항체의 다른 부분 표본으로 반복되었다. 숙주 오염은 1디아볼륨 후에 20ppm까지 감소되었고, 5디아볼륨 후에 11ppm까지 감소되었다.
실험예 18. 크로마틴이 260,183ppm의 숙주 단백질 오염 및 26.05%의 응집체들을 갖는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 이를 pH 5.4에서 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산으로 처리하여 추출되었고, 이를 2시간 동안 배양하였으며, 고체들을 미세여과에 의해 제거하였고, 이후에 이를 pH 8.0의 50mM의 트리스로 평형화된 우노스피어(UNOsphere) Q 의 칼럼 상의 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하였다. 숙주 단백질 오염은 228ppm까지 감소되었고, 응집체들은 2.47%까지 감소되었다. 제제는 전기음성의 다중 모드 입자들(HCX, 머크-밀리포어)로 충전된 칼럼에 적용되었고, 상기 칼럼은 세척되었으며, 상기 IgG는 염 차이에 의해 용리되었고, 숙주 단백질 함량을 38ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 1.93%까지 감소시켰다. 상기 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 흡착 서브유닛은 상기 접선 유동 여과 서브유닛과 인-라인으로 되었고, 완충제는 최초에 0.7M까지의 NaCl로부터 HCX 다음에 pH 8.0의 50mM의 트리스로 교환되었다. 숙주 단백질 오염은 38ppm까지 감소되었고, 응집체들은 1.37%까지 감소되었다.
실험예 19. 병행 실험에서, 실험예 18의 단계들이 초기에 380,492ppm의 숙주 단백질 및 25.88%의 응집체들을 함유하는 다른 세포 배양 수확물로 수행되었다. 크로마틴 추출은 숙주 단백질 레벨들을 1134ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 0.63%까지 감소시켰다. HCX는 숙주 단백질을 135ppm까지 감소시켰고, 응집체들은 0.82%였다. 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성되는 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 흡착 서브유닛은 상기 접선 유동 여과 서브유닛과 인-라인으로 되었고, 완충제는 최초에 0.7M까지의 NaCl로부터 HCX 다음에 pH 8.0의 50mM의 트리스로 교환되었다. 숙주 단백질 오염은 25ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.86%까지 감소되었다.
실험예 20. 크로마틴이 260,184ppm의 숙주 단백질 오염 및 26.05%의 응집체들을 갖는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 이를 pH 5.4에서 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산으로 처리하여 추출되었고, 이를 2시간 동안 배양하였으며, 고체들을 미세여과에 의해 제거하였고, 이후에 이를 뎁스 필터(PB1, 사르토리우스)와 직렬인 최초 세포 배양 수확물의 부피의 5%의 부피로 바이오-워크스 TREN(하이)로 충전된 칼럼을 통과시켰고, 이후에 이를 pH 8.0의 50mM의 트리스로 평형화된 우노스피어 Q의 칼럼 상의 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리하였다. 숙주 단백질 오염은 53ppm까지 감소되었고, 응집체들은 2.02%까지 감소되었다. 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 수집된 IgG 내의 숙주 단백질 오염은 3ppm까지의 양이었고, 응집체 함량은 1.76%였다. 캅토 애드히어(GE 헬스케어)의 칼럼에 대한 상기 제제의 적용은 숙주 단백질 오염을 검출 가능성의 레벨 아래로 감소시켰고, 응집체들을 0.1% 이하까지 감소시켰다.
실험예 21. 크로마틴이 260,184ppm의 숙주 단백질 오염 및 26.05% 응집체들을 갖는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 이를 pH 5.4에서 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴산으로 처리하여 추출되었고, 이를 2시간 동안 배양하였으며, 고체들을 미세여과에 의해 제거하였고, 이후에 이를 최초 세포 배양 수확물의 부피의 5%의 부피로 바이오-워크스 TREN(하이)로 충전된 칼럼을 통과시켰다. 숙주 단백질은 4,122ppm까지 감소되었고, 응집체들은 3.32%까지 감소되었다. 제제는 누비아 S(바이로-라드 라보라토리즈)를 사용하는 종래의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리되었다. 숙주 단백질은 34ppm까지 감소되었고, 응집체들은 2.69%까지 감소되었다. 상기 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 숙주 단백질 오염은 6ppm까지 감소되었고, 응집체들은 1.75%까지 감소되었다. 캅토 애드히어(GE 헬스케어)의 칼럼에 대한 상기 제제의 적용은 숙주 단백질 오염을 검출 가능성의 레벨 아래로 감소시켰고, 응집체들을 0.1% 이하까지 감소시켰다.
실험예 22. IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 항체를 농축시키고 크로마틴 함량을 감소시키도록 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 처리되었던 한 쌍의 실험들이 수행되었다. 이는 7,633ppm의 숙주 단백질 오염을 함유하였다. NaCl이 1M의 최종 농도까지 첨가되었다. 제제는 동등한 부분으로 분할되었고, 각 부분은 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 첫 번째 실험에서, 상기 흡착 서브유닛은 개시로부터 상기 접선 유동 여과 서브유닛과 인-라인으로 되었다. 두 번째 실험에서, 상기 흡착 서브유닛은 상기 제제가 5디아볼륨에 대해 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 순환하였던 후에 인-라인으로 되었다. 특히 첫 번째 실험에서, 1M의 NaCl이 오염물이 상기 흡착 유닛에 결합되는 것을 방지하는 것으로 이해되었고, 이에 따라 상기 멤브레인의 공극들을 통한 작은 오염물들의 선택적인 제거를 증진시켰다. 8.0에서 50mM의 트리스로 완충제 교환 후, 숙주 단백질은 첫 번째 실험에서 399ppm까지 감소되었고, 두 번째에서 368ppm까지 감소되었다.
실험예 23. 일부 실험들에서, 크로마틴이 결핍된 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 프로토타입 장치에 적용되었고, 여기서 흡착성 서브유닛은 IgG를 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 전기양성의 멤브레인이었다. 이러한 멤브레인들은 상업적으로 입수 가능하지 않기 때문에, 이들은 국제 공개 특허 WO20018792(A2)의 도 2A에 기재된 바와 같은 van Reis의 방법에 따라 제조되었다. 요약하면, 30kDa의 셀룰로오스 멤브레인들(사르토리우스 14459-76-D)이 실온에서 하룻밤 동안 2M의 3-브로모프로필 트리메틸암모늄 브로마이드(bromopropyl trimethylammonium bromide)와 반응되었다. van Reis와는 구분되게, 상기 멤브레인은 이후에 잔류 반응물들 및 반응 부산물들을 제거하기 위해 1M의 NaCl로 세척되었고, 다음에 물로 세척되었다. 사차 아미노기들의 고정화는 음이온 염료인 메틸 블루(Methyl Blue)의 결합에 의해 확인되었다. 상기 전기양성의 멤브레인들의 기능성은 다음과 같이 간략히 입증되었다. 약 1.5g/L의 농도로 IgG 단일클론성 항체를 함유하는 포유동물의 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인과 후속하여 0.4%의 카프릴산 나트륨의 첨가로 pH 5.4까지의 조정에 의해 정화되었고, 2시간 동안 교반되면서 배양되었다. 고체들은 미세여과에 의해 제거되었고, 상기 상청액은 TREN(워크 비드즈(Work Beads) 40 TREN 하이, 바이오-워크스, 웁살라)으로 대체된 아가로오스 비드(agarose bead)들을 함유하는 칼럼을 통과하였고, 여기서 상기 TREN 칼럼의 부피는 세포 배양 수확물의 최초 부피의 5%의 부피였다. 이는 숙주 단백질 오염물들을 최초의 219,570ppm으로부터 4441ppm까지 감소시켰다. 상기 샘플은 평형화 없이 30kDa의 사차 아민 치환 필터에 적용되었고, pH 8.0의 50mM의 트리스로 디아필터되었다. 숙주 단백질 오염물들은 679ppm까지 감소되었다. NaCl이 처리된 IgG에 1M의 최종 농도까지 첨가되었고, pH 8.0에서 50mM의 트리스, 1M의 NaCl로 평형화된 캅토 애드히어(GE 헬스케어)의 칼럼에 적용되었다. 상기 캅토 애드히어 칼럼은 단계에서 pH 6.0의 50mM의 MES, 300mM의 NaCl로 용리되었다. 용리된 IgG의 HCP 함량은 1ppm 이하였고, 1ppm 이하의 DNA 및 0.1% 이하의 응집체들을 함유하였다.
실험예 24. 644,254ppm의 숙주 단백질 오염 및 2.91%의 응집체 오염을 포함하는 포유동물의 세포 배양 수확물이 크로마틴을 제거하도록 0.4%까지의 카프릴산 및 0.1%까지의 알란토인의 첨가에 의해 처리되었고, 이후에 pH 5.4에서 3시간 동안 배양되었다. TREN을 지니는 입자들(TREN-하이, 바이오-워크스)이 5%의 비율로 첨가되었고, 추가 2시간 동안 배양되었으며, 후속하여 고체들이 원심분리에 의해 제거되었고, 상청액은 pH 7.0에서 50mM의 인산염, 200mM의 NaCl로 평형화된 우노스피어 Q의 칼럼 상의 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리되었다. 이는 모든 응집체들뿐만 아니라 크로마틴의 99% 이상을 제거하였고, 숙주 단백질 오염을 13,881ppm까지 감소시켰다. 제제는 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 대응되는 평균 공극 크기를 가지는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비하는 단일 접선 유동 여과 서브유닛 및 강한 양이온 교환 모놀리스(CIM SO3, BIA 세퍼레이션즈)를 구비하는 단일 흡착 서브유닛으로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 제제는 인-라인인 SO3 모놀리스로써 pH 5.5의 25mM의 MES, 25mM의 헤페스로 완충제 교환되었고, 상기 IgM가 상기 모놀리스에 결합되게 하였던 반면, 작은 흡착되지 않은 오염물들의 대다수는 상기 멤브레인의 공극들을 통과하였다. 상기 모놀리스는 이후에 상기 제제를 pH 6.5의 25mM의 MES, 25mM의 헤페스로 완충제 교환하여 세척되었고, 그 후에 상기 IgM가 상기 제제를 pH 6.5의 25mM의 MES, 25mM의 헤페스, 125mM의 NaCl로 완충제 교환하여 용리되었다. 상기 SO3 모놀리스는 깨끗한 완충제로 인-라인으로 세정되었고, 이후에 오프-라인으로 되었다. 상기 제제는 pH 7.0의 50mM의 헤페스로 완충제 교환되었고, 이후에 상기 장치로부터 3,146ppm의 숙주 단백질 오염을 갖고 응집체들이 없이 수집되었다. 상기 제제는 종래의 크로마토그래프 상에서 QA 모놀리스에 적용되었고, 세척되었으며, 용리되었고 숙주 단백질 오염을 29ppm까지 감소시켰다.
실험예 25. 박테리오파지 바이러스 M13, 17,034ng/mL의 숙주 단백질 오염 및 0.24ng/mL의 숙주 DNA를 함유하는 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 세포 배양 수확물이 30kDa의 유체역학적 직경을 갖는 가상적인 구상 단백질에 상응하는 평균 공극 크기를 갖는 셀룰로오스 멤브레인(밀리포어)을 구비한 단일 접선 유동 여과 서브유닛 그리고 서로에 대해 병렬로 배관되었고, 원하는 때에 이들의 하나 또는 모두를 오프-라인으로 만드는 밸브들을 갖는 상기 접선 유동 여과 서브유닛에 대해 병렬도 배관되었던 된 두 흡착 서브유닛들로 구성된 프로토타입 장치에 적용되었다. 상기 흡착 서브유닛들은 강한 양이온 교환 모놀리스(CIM SO3) 및 강한 음이온 교환 모놀리스(CIM QA)를 구비하였다. 상기 제제는 인-라인인 상기 SO3 모놀리스로써 pH 6.0의 50mM의 MES로 완충제 교환되었다. 이들 조건들 하에서, 상기 바이러스는 상기 모놀리스에 결합되지 않았지만, 상기 멤브레인에 의해 유지되었다. 일부 오염물들은 상기 SO3 모놀리스에 흡착되었던 반면, 작은 흡착되지 않은 오염물들은 상기 멤브레인의 공극들을 통과하였다. 상기 제제는 상기 SO3 모놀리스로부터 흡착되지 않은 바이러스를 세정하도록 완충제 교환되었다. 이러한 시점에서 수집된 샘플은 243ng/mL의 숙주 단백질 오염 및 0.11ng/mL의 DNA를 함유하였다. 이러한 시점에서 바이러스 회수는 73%였다. 상기 SO3 모놀리스는 상기 QA 모놀리스가 인-라인으로 되었던 것과 동시에 오프-라인으로 되었다. 상기 완충제는 pH 7.0의 50mM의 헤페스로 교환되었고, 그 동안에 상기 바이러스가 상기 QA 모놀리스에 결합되었고, 그 동안에 작은 흡착되지 않은 오염물들은 상기 멤브레인의 공극들을 통과하였던 것으로 이해된다. 완충제는 상기 QA 모놀리스로부터 상기 바이러스를 용리시키도록 pH 7.0의 50mM의 헤페스, 500mM의 NaCl로 교환되었고, 상기 모놀리스는 깨끗한 완충제로 세정되었으며, 이후에 오프-라인으로 되었다. 상기 바이러스는 90ng/mL의 숙주 단백질 및 0.04ng/mL의 DNA를 함유하는 시스템으로부터 수집되었다. 이러한 프로세스 부분에 대한 바이러스 회수는 86%였고, 전체 프로세스에 대한 바이러스 회수는 63%였다.
여기에 개시되는 실시예들은 정제의 보다 높은 레벨들을 구현하기 위해 다른 정제 방법들과 결합될 수 있다. 이러한 일부 실시예들은 일부 다른 분별 방법이 수행되었던 후에 수행되는 개시되는 방법들을 포함할 수 있다. 다른 이러한 실시예들은 일부 다른 분별이 채용되기 전제 수행되는 개시되는 방법들을 포함할 수 있다. 필요한 특정한 생물학적 생성물의 정제를 구현하기 위해 다양한 다른 방법들을 위한 적절한 조건들을 개발하고, 이들을 여기서의 실시예들과 통합하는 것은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 내에 있을 것이다.
해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 개시되는 장치 및 방법들의 일부 이점들이 상기 흡착성의 크로마토그래피 서브유닛 또는 서브유닛들과 상기 접선 유동 여과 서브유닛 또는 서브유닛들을 결합하지 않는 것을 포함하여 개시되는 장치 및 방법들의 변형들로 얻어질 수 있는 점이 이해될 것이다. 상기 제제나 다른 물질들이 상기 장치의 하나의 부분으로부터 다른 부분까지 조작자에 의해 수동으로 이송되는 것을 포함하여 도관들이외의 상기 장치의 부품들 사이에 이송되는 여기에 기재되는 장치 또는 프로세스 실시예들의 임의의 것과 같은 이러한 결합되지 않은 응용들도 개시되는 본 발명의 실시예들로 이해된다.
해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 앞서의 예들이 가장 공통적인 변수들의 일부의 효과들을 예시하도록 설계되었고, 많은 변형들이 개시되는 장치 및 방법들의 본질적인 요소들로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있는 점을 인식할 것이다. 동등하게, 다른 세포 배양 수확물들이 다른 상대적인 제제들에 다른 종들을 함유하고, 이는 실질적인 가변성을 도입할 것이며, 다른 가변성이 이에 의해 크로마틴에 추출되는 방법에 따라 주어진 제제의 샘플들 중에서 분명해질 것인 점이 예들로부터 이해될 것이다.
여기서 언급되는 모든 참고 문헌들은 각각의 개별적인 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 모든 목적들을 위해 그 전체 개시 사항들이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것과 같은 정도까지 그 전체 개시 사항들이 모든 목적들을 위해 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공개특허들이나 특허들 또는 특허출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항에 모순되지 않는 정도까지 본 명세서는 임의의 이러한 모순적인 문제를 대체하거나 및/또는 우선하도록 의도된다.
본 명세서와 특허청구범위에서 사용되는 구성 성분들, 크로마토그래피 조건들 등을 나타내는 모든 숫자들은 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어에 의해 변경되는 것으로 이해된다. 이에 따라, 다르게 기재되지 않는 한, 본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 설정되는 수치적 변수들은 본 발명의 개시되는 방법들에 의해 수득되는 것으로 간주되는 원하는 성능에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.
여기에 개시되는 실시예들의 많은 변형들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 분명한 바와 같이 그 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 개시되는 특정 실시예들은 단지 예로써 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본 명세서와 실험예들은 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 실시예들의 진실한 사상과 범주 내에서 단지 예시적인 것들로 간주되도록 의도된다.

Claims (82)

  1. 제제(preparation)로부터 생물학적 생성물(biological product)을 정제하기 위한 프로세스에 있어서,
    장치를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 장치는,
    모든 상기 생물학적 생성물을 실제로 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 접선 유동 여과 서브유닛(tangential flow filtration subunit) 및 하나 또는 그 이상의 흡착 서브유닛(adsorption subunit)들을 포함하는 다중 정제 서브유닛들을 포함하고;
    상기 다중 정제 유닛들 및 연관된 펌프들과 밸브들을 연결함으로써, 다중의 선택적인 구성(configuration)들에 따라 상기 장치를 통한 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 하는 다중 도관(conduit)을 포함하며, 상기 구성들은,
    (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물(retentate) 라인 배출이 재생물(recyclate)로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성; 및
    (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성을 구비하며, 선택적으로,
    (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른(상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고) 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 서브의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 구비하고,
    상기 제제를 상기 장치에 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하기 위한 도관들을 포함하며,
    상기 생물학적 생성물의 농도를 증가시키고 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환할 수 있도록 상기 제1 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 A를 수행하는 단계를 포함하고;
    상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환할 수 있도록 상기 제2 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 B를 수행하는 단계를 포함하며; 선택적으로,
    상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 제2 구성 내에서 선택되는 흡착 서브유닛과 다른 상기 흡착 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환할 수 있도록 상기 제3 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 C를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 구성, 상기 제2 구성 및 상기 제3 구성을 제공하며, 각각의 단계 A, 단계 B 및 단계 C가 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 구성 및 상기 제2 구성을 제공하며, 단계 A에 후속하여 단계 B가 수행되고, 상기 정제된 생물학적 생성물은 상기 재생물로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 구성 및 상기 제2 구성을 제공하며, 단계 A에 후속하여 단계 B기 수행되고, 이후에 단계 A가 다시 수행되며, 상기 정제된 생물학적 생성물은 상기 재생물로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 상기 재생물에 크로마토그래피 프로세스에 의한 다른 정제가 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 상기 재생물은 추가 흡착 유닛으로 흐르며, 이러한 추가 흡착 유닛을 나가는 상기 생물학적 생성물은 상기 장치를 나가기 전에 상기 접선 유동 유닛으로 돌아가지 않는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  7. 제 2 항에 있어서, 단계 A는 또한 단계 B 및 단계 C 사이에 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 상기 재생물에 크로마토그래피 프로세스에 의한 다른 정제가 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 정제된 생물학적 생성물을 함유하는 상기 재생물은 추가 흡착 유닛으로 흐르며, 이러한 추가 흡착 유닛을 나가는 상기 생물학적 생성물은 상기 장치를 나가기 전에 상기 접선 유동 유닛으로 돌아가지 않는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 제공되는 장치는 모든 상기 생물학적 생성물을 실제로 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 정제 유닛 및 제2 흡착 유닛을 포함하며, 상기 다중 도관들은 상기 제1 구성, 상기 제2 구성과,
    (iv) 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제4 구성, 그리고
    (v) 상기 제2 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제5 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 추가적으로 가능하게 하고,
    상기 프로세스는,
    상기 생물학적 생성물의 농도를 증가시키고, 상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환할 수 있도록 상기 제4 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 D를 수행하는 단계; 및
    상기 생물학적 생성물과 연관되는 오염물들의 레벨들을 감소시키면서, 상기 생물학적 생성물이 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛 및 상기 제2 흡착 서브유닛을 통해 일회 또는 수회 순환할 수 있도록 상기 제5 구성에 따라 상기 장치를 동작시키는 단계를 구비하는 단계 E를 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 구성, 상기 제2 구성, 상기 제4 구성 및 상기 제5 구성을 제공하며, 각각의 단계 A, 단계 B, 단계 D 및 단계 E가 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 B의 부분들 동안의 화학적 조건들은 (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들 및 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들의 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  13. 제 12 항에 있어서, 단계 B의 부분들 동안에 화학적 조건들은 (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들 및 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들의 둘 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  14. 제 2 항 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 C의 부분들 동안에 화학적 조건들은 (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들 및 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들의 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  15. 제 14 항에 있어서, 단계 E의 부분들 동안에 화학적 조건들은 (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들 및 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들의 둘 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  16. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 단계 E의 부분들 동안에 화학적 조건들은 (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들 및 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들의 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  17. 제 16 항에 있어서, 단계 B의 부분들 동안에 화학적 조건들은 (i) 상기 제제의 성분들의 대부분의 흡착을 방지하는 조건들, (ii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 방지하거나 중단시키는 조건들 및 (iii) 상기 생물학적 생성물의 흡착을 허용하는 조건들의 둘 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  18. 제 1 항에 있어서, 단계 A 동안에 화학적 조건들은 상기 접선 유동 여과 서브유닛을 통한 상기 제제의 디아필트레이션(diafiltration)을 거쳐 변경되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 서브유닛들의 공극률은 상기 프로세스 동안에 상기 잔류물 내에 실질적으로 모든 상기 생물학적 생성물을 유지하는 동안에 실질적으로 가능한 한 큰 것을 특징으로 하는 프로세스.
  20. 제 10 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는 프로세스.
  21. 제 10 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 다른 화학 조성들 및 실질적으로 유사한 공극률들을 가지는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  22. 제 10 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 다른 화학 조성들 및 다른 공극률들을 가지는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  23. 제 22 항에 있어서, 하나의 멤브레인은 0.2 미크론의 공극들을 갖는 폴리에테르술폰(polyethersulfone) 멤브레인이며, 다른 하나의 멤브레인은 30kDa의 질량을 갖는 구상 단백질(globular protein)에 대응되는 공극 크기들을 갖는 셀룰로오스(cellulose) 멤브레인인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나 또는 그 이상 내의 하나 또는 그 이상의 멤브레인들은 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography)를 수행하기 위해 적합할 수 있도록 흡착성 표면 특성들을 가지는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내의 상기 멤브레인의 물리적 포맷은 시트(sheet), 권취된(감긴) 시트, 중공형 섬유(hollow fiber) 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡착 서브유닛들의 물리적 포맷은 흡착성 입자들로 충전된 칼럼, 모놀리스(monolith), 하나 또는 그 이상의 흡착성 멤브레인들, 하나 또는 그 이상의 시트 혹은 하나 또는 그 이상의 중공형 섬유들 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서브유닛들에 의해 채용되는 흡착 메커니즘(adsorptive mechanism)은 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, pi-pi 결합, 수소 결합, 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용, 금속 친화도, 생물학적 친화도 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  28. 제 27 항에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환(anion exchange) 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  29. 제 28 항에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민(amine) 모이어티(moiety)들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  30. 제 27 항에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 양이온 교환(cation exchange) 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  31. 제 30 항에 있어서, 단계 B에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 SO3 모이어티들에 의해 제공되는 양이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  32. 제 27 항에 있어서, 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  33. 제 32 항에 있어서, 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  34. 제 27 항에 있어서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  35. 제 34 항에 있어서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  36. 제 27 항에 있어서, 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  37. 제 36 항에 있어서, 단계 C에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 페닐(phenyl) 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  38. 제 27 항에 있어서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  39. 제 38 항에 있어서, 단계 E에서 사용되는 상기 흡착 유닛은 페닐 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  40. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 B는 관류(flow-through) 모드로 수행되며, 단계 C는 결합-용리(bind-elute) 모드로 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  41. 제 10 항에 있어서, 상기 단계 B는 관류 모드로 수행되며, 단계 E는 결합-용리 모드로 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 생성물들은 10㎚ 내지 100 미크론의 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 가지는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 생물학적 생성물은 DNA 플라스미드(plasmid), 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자, 세포 소기관(cellular organelle), 세포, 항체 및 비-항체 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  44. 제 42 항에 있어서, 상기 제제의 소스는 세포 배양 수확물(cell culture harvest) 또는 혈청, 혈장, 젖 및 조직 균질액(homogenate)으로부터의 유체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자연 체액을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제에 단계 A 이전의 분별 또는 정화 프로세스가 수행되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  46. 제 45 항에 있어서, 단계 A 이전의 상기 분별 또는 정화 프로세스는 상기 제제 내의 크로마틴(chromatin)의 양을 적어도 약 95%로 감소시키는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  47. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 상기 제제가 얻어졌던 소스 샘플 내에 머무르는 상기 크로마틴의 5% 이하를 가지는 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  48. 제제로부터 생물학적 생성물을 정화하기 위한 장치에 있어서,
    실제로 모든 상기 생물학적 생성물을 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제1 접선 유동 여과 서브유닛 및 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들을 포함하는 다중 정제 서브유닛들;
    상기 다중 정제 유닛들을 연결하는 다중 도관들;
    상기 다중 도관들을 통해 흐름을 안내하고, 상기 다중 정제 유닛들의 하나 또는 그 이상의 서로로부터의 분리를 허용하는 밸브들;
    흐름을 유도하고, 상기 장치의 하나 또는 그 이상 부분들 내의 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들; 및
    상기 제제를 상기 장치에, 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하는 도관들을 포함하며,
    상기 다중 도관들 및 연관되는 펌프들과 밸브들은 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 하고, 상기 구성들은,
    (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성;
    (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛 에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성; 및
    (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내에 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른(상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고) 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 서브의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  49. 제 48 항에 있어서, 실제로 모든 상기 생물학적 생성물을 유지하기에 충분한 공극률을 갖는 공극들을 가지는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 정제 유닛 및 제2 흡착 유닛을 더 포함하며, 상기 제1 구성, 상기 제2 구성, 상기 제3 구성과,
    (iv) 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제4 구성, 그리고
    (v) 상기 제2 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제5 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 추가적으로 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 장치.
  50. 제제로부터 생물학적 생성물을 정제하기 위한 장치에 있어서,
    약 2.5㎚부터 약 5000㎚까지의 평균 공극 크기를 갖는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제1 접선 유동 여과 서브유닛 및 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들을 포함하는 다중 정제 서브유닛들;
    상기 다중 정제 유닛들을 연결하는 다중 도관들;
    상기 다중 도관들을 통한 흐름을 안내하고, 상기 다중 정제 유닛들의 하나 또는 그 이상의 서로로부터의 분리를 허용하는 밸브들;
    흐름을 유도하고, 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 부분들 내의 차압을 제어하도록 구성되는 펌프들; 및
    상기 제제를 상기 장치에, 바람직하게는 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 공급하기 위한 도관들을 포함하며,
    상기 다중 도관들 및 연관되는 펌프들과 밸브들은 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 가능하게 하고, 상기 구성들은,
    (i) 상기 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제1 구성;
    (ii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 하나 또는 그 이상 흡착 서브유닛들로부터 선택되는 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 서브유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제2 구성; 및
    (iii) 상기 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 구성 내에 선택되는 상기 흡착 서브유닛과 다른(상기 제2 구성 내에서 선택되는 상기 흡착 서브유닛을 통하지 않고) 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 서브의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제3 구성을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  51. 제 50 항에 있어서, 약 2.5㎚부터 약 5000㎚까지의 평균 공극 크기를 갖는 적어도 하나의 다공성 멤브레인을 구비하는 제2 접선 유동 여과 정제 유닛 및 제2 흡착 유닛을 더 포함하며, 상기 다중 도관들은 상기 제1 구성, 상기 제2 구성, 상기 제3 구성과,
    (iv) 상기 제2 접선 유동 여과 서브유닛의 잔류물 라인 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제4 구성, 그리고
    (v) 상기 제2 접선 유동 여과의 잔류물 라인 배출이 상기 제2 흡착 서브유닛에 대한 투입에 연결되어, 이러한 흡착 유닛의 배출이 재생물로서 수집될 수 있고, 상기 제2 접선 유동 여과 유닛의 투입에 돌아갈 수 있도록 연속적인 흐름을 위한 제5 구성을 포함하는 다중의 선택적인 구성들에 따라 상기 장치를 통한 상기 생물학적 생성물의 순환을 추가적으로 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 장치.
  52. 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 약 5㎚부터 약 1000㎚까지의 평균 공극 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 약 10㎚부터 약 500㎚까지의 평균 공극 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 약 25㎚부터 약 100㎚까지의 평균 공극 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  55. 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 그 유체역학적 반경을 기초로 상기 원하는 생물학적 생성물의 적어도 99%를 유지하도록 선택되는 평균 공극 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  56. 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 다공성 멤브레인들은 상기 원하는 생물학적 생성물의 평균 유체역학적 반경 이상으로 선택되는 평균 공극 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  57. 제 49 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는 장치.
  58. 제 49 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 다른 화학적 조성들 및 실질적으로 유사한 공극률들을 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  59. 제 49 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 접선 유동 서브유닛들의 멤브레인들은 다른 화학적 조성들 및 다른 공극률들을 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  60. 제 59 항에 있어서, 하나의 멤브레인은 0.2 미크론의 공극들을 갖는 폴리에테르술폰 멤브레인이며, 다른 하나의 멤브레인은 30kDa의 질량을 갖는 구상 단백질에 대응되는 공극 크기들을 갖는 셀룰로오스 멤브레인인 것을 특징으로 하는 장치.
  61. 제 48 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛들의 하나 또는 그 이상 내의 하나 또는 그 이상의 멤브레인들은 흡착 크로마토그래피를 수행하기 위해 적합할 수 있도록 흡착성 표면 특성들을 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  62. 제 48 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과 서브유닛 내의 멤브레인의 물리적 포맷은 시트, 권취된(감긴) 시트, 증공형 섬유 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  63. 제 48 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡착 서브유닛들의 물리적 포맷은 흡착성 입자들로 충전된 칼럼, 모놀리스, 하나 또는 그 이상의 흡착 멤브레인들, 하나 또는 그 이상의 시트들 또는 하나 또는 그 이상의 중공형 섬유들 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  64. 제 48 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡착 서브유닛들에 의해 채용되는 흡착 메커니즘은 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, pi-pi 결합, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 금속 친화도, 생물학적 친화도 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 제2 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  66. 제 65 항에 있어서, 상기 제2 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  67. 제 64 항에 있어서, 상기 제2 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 양이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 제2 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 SO3 모이어티들에 의해 제공되는 양이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  69. 제 64 항에 있어서, 상기 제3 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  70. 제 69 항에 있어서, 상기 제3 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  71. 제 64 항에 있어서, 상기 제5 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 제5 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 사차 아민 모이어티들에 의해 제공되는 음이온 교환 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  73. 제 64 항에 있어서, 상기 제3 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 제3 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 페닐 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  75. 제 64 항에 있어서, 상기 제5 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  76. 제 75 항에 있어서, 상기 제5 구성 내에 사용되는 상기 흡착 유닛은 페닐 모이어티들에 의해 제공되는 소수성 상호작용 흡착 메커니즘을 갖는 모놀리스인 것을 특징으로 하는 장치.
  77. 제 48 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펌프들을 제어하고, 경로 명령들에 따라 상기 제제를 유체 경로를 통과시키도록 컴퓨터 판독 가능한 명령들에 의해 구성되는 하나 또는 그 이상의 프로세서들을 더 포함하며, 상기 경로 명령들은 정제 유닛들의 순서를 정의하는 것을 특징으로 하는 장치.
  78. 제 77 항에 있어서, 상기 경로 명령들의 사용자에 의한 엔트리 또는 선택을 수용하도록 구성되는 인터페이스(interface)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 인터페이스는 컴퓨터, 메모리, 네트워크, 무선 또는 이들의 결합들인 것을 특징으로 하는 장치.
  80. 제 48 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 멀티-밀리그램(multi-milligram) 규모로 수행되도록 규모가 조절되는 것을 특징으로 하는 장치.
  81. 제 48 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 멀티-그램(multi-gram) 규모로 수행되도록 규모가 조절되는 것을 특징으로 하는 장치.
  82. 제 48 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 멀티-킬로그램(multi-kilogram) 규모로 수행되도록 규모가 조절되는 것을 특징으로 하는 장치.
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