JP2014506873A - 分離方法のための組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は一般に分離及び変換の技術の分野に関するものであり、さらに詳しくは
接線流濾過技法で使用するための材料に関する。接線流材料は、逆浸透、精密濾過、限外濾過又はナノ濾過の半透過性濾過膜に頼るものを含む広範囲の分離及び変換の工程に有用であり、接線流濾過で使用するためのバイオポリマー粒子を含む種々の標的物質を精製する又は作出するための効率的な方法を提供する。
【選択図】図１Ａ

Description

本発明は一般に分離及び変換技術の分野に関するものであり、さらに詳しくは、接線流濾過技法で使用するための材料に関する。接線流材料は、逆浸透、精密濾過、限外濾過又はナノ濾過半透過濾過膜に頼るものを含む広範囲の分離及び変換の方法に有用であり、種々の標的物質を精製する又は作出するための効率的な方法を提供する。
望ましくない物質、たとえば、複雑な組成物からの望ましい標的物質の分離は、食品、化学物質、医薬品、並びにたとえば、細胞、ウイルス、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び代謝産物のような生物製剤を含む多数の重要な物品の作出における基本的な工程である。同様に、たとえば、前駆体物質からの標的物質の濃縮又は分離と任意で併せた、たとえば、酵素変換による１以上の前駆体物質からの標的物質への変換は多数の作出方法の基本的な工程である。
結果として、望ましい標的物質の効率的な分離及び作出を可能にする方法及び技術を開発する大量の支出があった。たとえば、別の脂質又は１以上の溶解した若しくは懸濁した固形物のような第２の成分から１以上の望ましい物質、通常１以上の脂質を分離するための、たとえば、逆浸透（ＲＯ）、精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）及びナノ濾過（ＮＦ）の技法が長年にわたって開発されてきた。
最も一般的に使用されているのは、樹脂粒子が層に充填され、標的分子を含有する溶液がカラムを通過し、標的が樹脂に結合する充填層クロマトグラフィである。この方法の特定の難題は、不規則な流路の形成である。これらの不規則な流路は標的の効率的な精製を妨げると共に樹脂の効率的な清浄化を妨げ、それによって混入の可能性を創ってしまう。
モノクローナル抗体の作出では、たとえば、１０倍過剰の樹脂で層を充填することが不規則な流路の課題に対処し得ることが提案されている。明らかに、そのような提案を採用するにはコストと効率性の結果が存在する。利用可能な媒体すべてにアクセスする系では、必要とされる樹脂の量を減らすことが可能なので、作出コストが下げられる。
不規則な流路のリスクを下げる解決の１つはカラムの操作圧を下げることである。これは流路形成のリスクを下げる所望の効果を有する一方で、加工時間が増すという否定的な結果を有する。
半透過性の膜面の表面を流れが横切り、濃縮した流れが通常供給流路の下流で取り出される接線流（直交流とも呼ばれる）濾過工程はこれらの課題の一部に対処する可能性を有する。これらの及び他の濾過工程で使用するために種々の半透過性の膜が開発されている。
既存の接線流技法は、特定の分離を達成するには満足が行く一方で、複雑な原材料からの、たとえば、ポリペプチドのような特定の標的物質の調製又は分離に適用するにはあまり適していない。高レベルの粒子状物質を有する原料液又は粒子を利用する濾過法は、通常、それらがゲル層を形成し又はさもなければフィルター膜を遮断する若しくはそれに付着し、それによって効率性を下げ得るので、接線流濾過における提供には一般に不向きである。この問題を解決する試みは大型の硬質粒子（１００〜３００ミクロンの桁）の使用に着目した。大きなサイズと硬質性は汚染のリスク又は程度を減らす一方で、体積に対する表面積の比の低下は標的に対する結合部位の低下を提示し、さらに多くの樹脂を必要とする。
本発明の目的は、上記短所の一部を克服し、又は少なくとも改善して、特に接線流濾過による標的物質の調製及び精製のための改善された組成物及び方法を提供し、又は少なくとも有用な選択肢を公衆に提供することである。
本発明の他の目的は例を目的としてのみ提供される以下の記載から明らかになり得る。
本発明は、原料物質から１以上の標的物質を調製する方法に関するものであり、該方法は、非晶性ポリマー粒子が１以上の標的物質又は１以上の標的物質の前駆体又は１以上の混入物質に結合するのを可能にするのに十分な時間、非晶性ポリマー粒子の集団を原料物質と接触させることと、粒子に結合した標的物質若しくはその前駆体から１以上の混入物質を、又は粒子に結合した混入物質から１以上の標的物質若しくはその前駆体を接線流濾過によって分離することと、標的物質を回収することを含む。
一実施形態では、非晶性ポリマー粒子の集団は均質な集団である。別の実施形態では、非晶性ポリマー粒子の集団は不均質な集団である。
一実施形態では、非晶性ポリマー粒子の１以上は、ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択される１以上のバイオポリマーを含む。
一実施形態では、非晶性ポリマー粒子の１以上は、粒子形成タンパク質によって合成される又は合成されることが可能である。一実施形態では、ポリマー粒子の集団の実質的にすべてが粒子形成タンパク質によって合成される又は合成されることが可能である。
一実施形態では、非晶性ポリマー粒子の１以上は、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質を含む。
一実施形態では、標的物質の回収はポリマー粒子からの溶出による。一実施形態では、標的物質の回収は接線流濾過の透過液の回収による。一実施形態では、標的物質の回収は接線流濾過のリテンテートの回収による。
従って、態様の１つでは、本発明は、原料物質から１以上の標的物質を分離する又は精製する方法を提供し、該方法は、１以上のポリマー粒子が１以上の標的物質を結合するのを可能にするのに十分な時間、原料物質をポリマー粒子の集団と接触させることと、粒子に結合した標的物質を接線流濾過によって１以上の混入物質から分離することと、標的物質を回収することを含み、ポリマー粒子の１以上は、
・ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含む。
従って、別の態様では、本発明は、原料物質から１以上の標的物質を分離する又は精製する方法を提供し、該方法は、１以上のポリマー粒子が１以上の混入物質を結合するのを可能にするのに十分な時間、原料物質をポリマー粒子の集団と接触させることと、粒子に結合した混入物質から接線流濾過によって１以上の標的物質を分離することと、標的物質を回収することを含み、ポリマー粒子の１以上は、
・ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含む。
別の態様では、本発明は、１以上の反応生成物を調製する方法を提供し、該方法は、１以上の反応基質の所望の分画に１以上のポリマー粒子が結合するのを可能にするのに十分な時間、１以上の反応基質を含む原料物質を接線流濾過によって１以上のポリマー粒子と接触させることと、任意で、接線流濾過によってポリマー粒子から１以上の混入物質を分離することと、反応生成物を回収することを含み、１以上のポリマー粒子は反応の触媒を含み、ポリマー粒子の１以上は、
・ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含む。
本発明はさらに、原料物質から標的物質を分離するための精製方法を提供し、該方法は、（ａ）原料物質を提供することと、（ｂ）少なくとも１つの半透過性フィルターによって前記原料物質を接線流濾過することと、（ｃ）標的物質を回収することを含み、原料物質の１以上、半透過性フィルター、又は前記接線流濾過で使用される１以上の溶液が１以上のポリマー粒子を含み、１以上のポリマー粒子が標的物質を結合するのが可能であるリガンドを含み、ポリマー粒子の１以上が、
（ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
（ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
（ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
（ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
（ｖ）親和性リガンド；
（ｖｉ）酵素；
（ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
（ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む。
従って、例となる一実施形態では、本発明は、１以上の抗体を精製するための精製方法を提供し、それは、１以上の抗体を含む原料物質を提供することと、１以上のポリマー粒子を含む少なくとも１つの半透過性のフィルターによって前記原料物質を接線流濾過することと、抗体を回収することを含み、１以上のポリマー粒子は抗体を結合することが可能であるリガンドを含む。
従って、例となる別の実施形態では、本発明は、１以上のポリマー粒子を精製するための精製方法を提供し、それは、１以上のポリマー粒子を含む原料物質を提供することと、少なくとも１つの半透過性のフィルターによって前記原料物質を接線流濾過することを含み、ポリマー粒子の１以上は、
・ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含む。
さらなる態様では、本発明は、
・ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含む
ポリマー粒子を提供し、
その際、融合ポリペプチドの１以上は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ由来のプロテインＧのＧＢ１ドメインである又はそれを含む。
ポリマー粒子形成ポリペプチド及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ由来のプロテインＧの１以上のＧＢ１ドメインを含む融合ポリペプチド。
一実施形態では、融合ポリペプチドは配列番号４の１２以上の隣接するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によってコードされるＧＢ１ドメインである又はそれを含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは配列番号４の１２以上の隣接するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドである又はそれを含む。
一実施形態では、前記ポリマー粒子は、ポリマー粒子湿重量のｇ当たり３０ｍｇを超える免疫グロブリンの免疫グロブリン結合能を有する。
一実施形態では、結合能は、少なくとも約３５ｍｇの免疫グロブリン／ポリマー粒子湿重量のｇ、約４０ｍｇの免疫グロブリン／ポリマー粒子湿重量のｇ、約４５ｍｇの免疫グロブリン／ポリマー粒子湿重量のｇ、約５０ｍｇの免疫グロブリン／ポリマー粒子湿重量のｇ、約５５ｍｇの免疫グロブリン／ポリマー粒子湿重量のｇ、又は約６０ｍｇの免疫グロブリン／ポリマー粒子湿重量のｇである。
一実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧである。
さらなる態様では、本発明は接線流濾過で使用するための半透過性フィルターを作製する方法を提供し、該方法は、透過性又は半透過性の支持体を提供することと、１以上のポリマー粒子を支持体に結合させて半透過性フィルターを提供することを含み、ポリマー粒子の１以上は、
・ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含む。
さらなる態様では、本発明は、ポリマー粒子を調製する方法を提供し、ポリマー粒子の１以上は、
・ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含み、
該方法は、ポリマー粒子から１以上の混入物質を接線流濾過によって分離することと、ポリマー粒子を回収することを含む。
別の態様では、本発明は、原料物質から１以上のポリマー粒子を分離する又は精製する方法を提供し、該方法は、ポリマー粒子から１以上の混入物質を接線流濾過によって分離することと、１以上のポリマー粒子を回収することを含み、ポリマー粒子の１以上は、
・ポリエステル、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー又は、
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質、又は
・上記の双方を含む。
本発明はさらに、本明細書で記載されるような１以上のポリマー粒子を含む組成物、膜、フィルター及びフィルター装置（たとえば、フィルターカートリッジ）を提供する。そのような組成物、膜、フィルター及びフィルター装置は接線流濾過での使用に特に好適である。
以下の実施形態は上記態様のいずれかに関係し得る。
種々の実施形態では、ポリマー粒子の１以上は以下：
・ポリマー粒子結合ポリペプチド；
・ポリペプチド融合体の相手；
・親和性リガンド；
・酵素；
・上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
・上記の２以上の組み合わせ
の１以上を含む。
種々の実施形態では、ポリマー粒子の実質的すべてが、
・ポリ−β−ヒドロキシ酸、バイオポリアセテート、バイオポリチオエステル、及びバイオポリエステルのようなバイオポリマー；又は
・たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド、又は
・上記の双方を含む。
一実施形態では、ポリマー粒子形成ポリペプチドは粒子の表面に共有結合する。
一実施形態では、１以上のポリマー粒子はその表面上に提示される１以上のリガンドを含む。
一実施形態では、ポリマー粒子は、たとえば、半透過性の膜、樹脂、接線流フィルター、接線流フィルターカートリッジ等のような半透過性の支持体に結合する、それと会合する、又はそれを含む。
一実施形態では、原料物質は細胞溶解物である又はそれに由来する。一実施形態では、原料物質は試験管内でのタンパク質発現系を含むタンパク質発現系であり、又はそれに由来する。
一実施形態では、原料物質は乳製品又は乳加工ストリーム、ワイン又はビールの発酵を含む発酵物を含む食品である、又はそれに由来する。
一実施形態では、原料物質は、反応溶液、化学合成溶液、化学合成中間体等を含む溶液である。
一実施形態では、標的物質は、たとえば、組換えポリペプチド、抗体、酵素、ホルモン等を含むポリペプチドである。
一実施形態では、標的物質は、たとえば、組換え、ポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、たとえば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｔＲＮＡのようなＲＮＡ分子、又はｃＤＮＡのようなＤＮＡ分子を含むポリヌクレオチドである。
一実施形態では、標的物質は、分泌される代謝産物を含む細胞性の代謝産物である。
種々の実施形態では、ポリマー粒子は、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）から選択されるバイオポリマーを含む。さらに好ましくは、ポリマーはポリヒドロキシアルカノエート、好ましくはポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を含む。
種々の実施形態では、粒子を構成するポリマーは、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）から選択されるバイオポリマーから本質的に成る、又は成る。さらに好ましくは、ポリマーはポリヒドロキシアルカノエート、好ましくはポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を含む。
種々の実施形態では、ポリマー粒子はリン脂質単層によって被包されるポリマー粒子を含む。
種々の実施形態では、ポリマーシンターゼはポリマー粒子又はリン脂質単層に結合し、又は双方に結合する。
種々の実施形態では、ポリマー粒子は２以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
種々の実施形態では、ポリマー粒子はポリマー粒子の表面上で２以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
種々の実施形態では、ポリマー粒子は３以上の異なる融合ポリペプチドを含み、たとえば、ポリマー粒子の表面上で３以上の異なる融合ポリペプチドを含む。
種々の実施形態では、ポリマー粒子はさらに、ポリマー粒子に結合する又はそれに組み入れられる少なくとも１つの物質、又はその組み合わせを含む。
種々の実施形態では、物質は架橋によってポリマー粒子に結合する。
種々の実施形態では、ポリマーシンターゼはポリマー粒子又はリン脂質単層に結合し、又は双方に結合する。
種々の実施形態では、ポリマーシンターゼは、それが形成するポリマー粒子に共有結合する又は非共有結合する。
種々の実施形態では、ポリマーシンターゼは、クラス１の属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｚｏｏｇｌｏｅａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ、Ｔｈｙｏｃｙｓｔｉｓ及びＡｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、クラス２の属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、又はクラス４の属、Ｂａｃｉｌｌｕｓに由来する、さらに好ましくは、クラス１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＲＡ３８４９、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔａ ＦＡ４４０、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ＳＨ−６９、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＤＳＭＺ９２４２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｉａ Ｈ１６、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ ＰＰ２、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ Ｎ１、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ ９１１１、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ Ｄ、Ｔｈｙｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ ２３１１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ４１、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＨＡ、及びＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ２５９０３、クラス２、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｕ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＢＭ０１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｉｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ、並びにクラス４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＩＮＴ００５を含む群に由来するＰＨＡシンターゼである。
他の実施形態では、ポリマーシンターゼは、グラム陰性及びグラム陽性の真正細菌、又は古細菌に由来するＰＨＡポリマーシンターゼである。
種々の例では、ポリマーシンターゼは、それぞれ受入番号ＡＹ８３６６８０、ＡＥ００４０９１、ＡＢ２０５１０４、ＡＦ１０９９０９、ＹＰ１３７３３９、ＡＢ０４９４１３及びＡＦ１５０６７０を有するＣ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａ．ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ又はＰ．ｐｕｔｉｄａに由来するＰＨＡポリマーシンターゼを含み得る。
本発明での使用に適するその他のポリマーシンターゼには、それぞれ以下の生物に由来し、その受入番号で特定されるＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ａ３４３４１）、Ｔ．ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（Ｘ９３５９９）、Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ（Ｏ３２４７２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３（ＡＢ０１４７５７及びＡＢ０１４７５８）、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＡＡＡ７２００４）、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ（ＡＡＣ６９６１５）、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ＳＫ２（ＣＡＬ１７６６２）、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ＳＫ２（ＣＡＬ１６８６６）、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＫＤ１３１（ＡＣＭ０１５７１及びＹＰ００２５２６０７２）、Ｒ．ｏｐａｃｕｓ Ｂ４（ＢＡＨ５１８８０及びＹＰ００２７８０８２５）、Ｂ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ１７６１６（ＹＰ００１９４６２１５及びＢＡＧ４３６７９）、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ＳＫ２（ＹＰ６９３９３４及びＹＰ６９３１３８）、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ（ＡＡＤ５３１７９）、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＴＣＣ５０１５ （ＺＰ０５０６１６６１ ａｎｄ ＥＤＹ８６６０６）、 Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．ＢＨ７２（ＹＰ９３２５２５）、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＡＴＣＣ １２４７２ （ＮＰ９０２４５９）、 Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＭＥＤ１０５（ＺＰ０１９１５８３８及びＥＤＭ８２８６７）、Ｍ．ａｌｇｉｃｏｌａ ＤＧ８９３（ＺＰ０１８９５９２２ ａｎｄ ＥＤＭ４６００４）、 Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ （ＣＡＡ６５８３３）、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＡＴＣＣ １２４７２（ＡＡＱ６０４５７）、Ａ．ｌａｔｕｓ（ＡＡＤ１０２７４、ＡＡＤ０１２０９及びＡＡＣ８３６５８）、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｋ２７９ａ（ＣＡＱ４６４１８及びＹＰ００１９７２７１２）、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＩＰＯ１６０９（ＣＡＱ５９９７５及びＹＰ００２２５８０８０）、Ｂ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ １７６１６（ＹＰ００１９４１４４８及びＢＡＧ４７４５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｇｌ１３（ＡＣＪ０２４００）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｇｌ０６（ＡＣＪ０２３９９）、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｇｌ０１（ＡＣＪ０２３９８）、Ｒ．ｓｐ．ｇｌ３２（ＡＣＪ０２３９７）、Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ｂｖ． ｖｉｃｉａｅ ３８４１ （ＣＡＫ１０３２９ ａｎｄ ＹＰ７７０３９０）、Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．ＢＨ７２（ＣＡＬ９３６３８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＤＣ−５（ＡＡＶ３６５１０）、Ｌ．ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ ２００２（ＺＰ０３６９８１７９）、Ｔｈａｕｅｒａ ｓｐ．ＭＺ１Ｔ（ＹＰ００２８９００９８及びＡＣＲ０１７２１）、Ｍ．ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ ＪＣＭ２８３１（ＹＰ００１７５５０７８及びＡＣＢ２４３９５）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．４−４６（ＹＰ００１７６７７６９及びＡＣＡ１５３３５）、Ｌ．ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ ２００２（ＥＥＧ０８９２１）、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＢＡＡ７７２５７）、Ｍ．ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ（ＡＢＧ２３０１８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＳＭ４−５５（ＡＢＸ６４４３５及びＡＢＸ６４４３４）、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（ＡＡＴ７７２６１及びＡＡＴ７７２５８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＩＮＴ００５（ＢＡＣ４５２３２及びＢＡＣ４５２３０）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（ＡＡＭ６３４０９及びＡＡＭ６３４０７）、Ｇ．ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ（ＡＡＢ９４０５８）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（ＡＡＤ０５２６０）、Ｄ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＢＡＡ３３１５５）、Ｐ．ｓｅｒｉｎｉｐｈｉｌｕｓ（ＡＣＭ６８６６２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１４−３（ＣＡＫ１８９０４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＤＣ−５（ＡＡＸ１８６９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＰＣ１７（ＡＢＶ２５７０６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．３Ｙ２（ＡＡＶ３５４３１、ＡＡＶ３５４２９及びＡＡＶ３５４２６）、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（ＡＡＭ１０５４６及びＡＡＭ１０５４４）、Ｐ．ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ（ＡＡＫ１９６０８）、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＡＫ１９６０５）、Ｐ．ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ（ＡＡＤ２６３６７及びＡＡＤ２６３６５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＳＭ７−７（ＡＣＭ９０５２３及びＡＣＭ９０５２２）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＡＰ５８４８０）並びに他の非培養細菌（ＢＡＥ０２８８１、ＢＡＥ０２８８０、ＢＡＥ０２８７９、ＢＡＥ０２８７８、ＢＡＥ０２８７７、ＢＡＥ０２８７６、ＢＡＥ０２８７５、ＢＡＥ０２８７４、ＢＡＥ０２８７３、ＢＡＥ０２８７２、ＢＡＥ０２８７１、ＢＡＥ０２８７０、ＢＡＥ０２８６９、ＢＡＥ０２８６８、ＢＡＥ０２８６７、ＢＡＥ０２８６、ＢＡＥ０２８６５、ＢＡＥ０２８６４、ＢＡＥ０２８６３、ＢＡＥ０２８６２、ＢＡＥ０２８６１、ＢＡＥ０２８６０、ＢＡＥ０２８５９、ＢＡＥ０２８５８、ＢＡＥ０２８５７、ＢＡＥ０７１４６、ＢＡＥ０７１４５、ＢＡＥ０７１４４、ＢＡＥ０７１４３、ＢＡＥ０７１４２、ＢＡＥ０７１４１、ＢＡＥ０７１４０、ＢＡＥ０７１３９、ＢＡＥ０７１３８、ＢＡＥ０７１３７、ＢＡＥ０７１３６、ＢＡＥ０７１３５、ＢＡＥ０７１３４、ＢＡＥ０７１３３、ＢＡＥ０７１３２、ＢＡＥ０７１３１、ＢＡＥ０７１３０、ＢＡＥ０７１２９、ＢＡＥ０７１２８、ＢＡＥ０７１２７、ＢＡＥ０７１２６、ＢＡＥ０７１２５、ＢＡＥ０７１２４、ＢＡＥ０７１２３、ＢＡＥ０７１２２、ＢＡＥ０７１２１、ＢＡＥ０７１２０、ＢＡＥ０７１１９、ＢＡＥ０７１１８、ＢＡＥ０７１１７、ＢＡＥ０７１１６、ＢＡＥ０７１１５、ＢＡＥ０７１１４、ＢＡＥ０７１１３、ＢＡＥ０７１１２、ＢＡＥ０７１１１、ＢＡＥ０７１１０、ＢＡＥ０７１０９、ＢＡＥ０７１０８、ＢＡＥ０７１０７、ＢＡＥ０７１０６、ＢＡＥ０７１０５、ＢＡＥ０７１０４、ＢＡＥ０７１０３、ＢＡＥ０７１０２、ＢＡＥ０７１０１、ＢＡＥ０７１００、ＢＡＥ０７０９９、ＢＡＥ０７０９８、ＢＡＥ０７０９７、ＢＡＥ０７０９６、ＢＡＥ０７０９５、ＢＡＥ０７０９４、ＢＡＥ０７０９３、ＢＡＥ０７０９２、ＢＡＥ０７０９１、ＢＡＥ０７０９０、ＢＡＥ０７０８９、ＢＡＥ０７０８８、ＢＡＥ０７０５３、ＢＡＥ０７０５２、ＢＡＥ０７０５１、ＢＡＥ０７０５０、ＢＡＥ０７０４９、ＢＡＥ０７０４８、ＢＡＥ０７０４７、ＢＡＥ０７０４６、ＢＡＥ０７０４５、ＢＡＥ０７０４４、ＢＡＥ０７０４３、ＢＡＥ０７０４２、ＢＡＥ０７０４１、ＢＡＥ０７０４０、ＢＡＥ０７０３９、ＢＡＥ０７０３８、ＢＡＥ０７０３７、ＢＡＥ０７０３６、ＢＡＥ０７０３５、ＢＡＥ０７０３４、ＢＡＥ０７０３３、ＢＡＥ０７０３２、ＢＡＥ０７０３１、ＢＡＥ０７０３０、ＢＡＥ０７０２９、ＢＡＥ０７０２８、ＢＡＥ０７０２７、ＢＡＥ０７０２６、ＢＡＥ０７０２５、ＢＡＥ０７０２４、ＢＡＥ０７０２３、ＢＡＥ０７０２２、ＢＡＥ０７０２１、ＢＡＥ０７０２０、ＢＡＥ０７０１９、ＢＡＥ０７０１８、ＢＡＥ０７０１７、ＢＡＥ０７０１６、ＢＡＥ０７０１５、ＢＡＥ０７０１４、ＢＡＥ０７０１３、ＢＡＥ０７０１２、ＢＡＥ０７０１１、ＢＡＥ０７０１０、ＢＡＥ０７００９、ＢＡＥ０７００８、ＢＡＥ０７００７、ＢＡＥ０７００６、ＢＡＥ０７００５、ＢＡＥ０７００４、ＢＡＥ０７００３、ＢＡＥ０７００２、ＢＡＥ０７００１、ＢＡＥ０７０００、ＢＡＥ０６９９９、ＢＡＥ０６９９８、ＢＡＥ０６９９７、ＢＡＥ０６９９６、ＢＡＥ０６９９５、ＢＡＥ０６９９４、ＢＡＥ０６９９３、ＢＡＥ０６９９２、ＢＡＥ０６９９１、ＢＡＥ０６９９０、ＢＡＥ０６９８９、ＢＡＥ０６９８８、ＢＡＥ０６９８７、ＢＡＥ０６９８６、ＢＡＥ０６９８５、ＢＡＥ０６９８４、ＢＡＥ０６９８３、ＢＡＥ０６９８２、ＢＡＥ０６９８１、ＢＡＥ０６９８０、ＢＡＥ０６９７９、ＢＡＥ０６９７８、ＢＡＥ０６９７７、ＢＡＥ０６９７６、ＢＡＥ０６９７５、ＢＡＥ０６９７４、ＢＡＥ０６９７３、ＢＡＥ０６９７２、ＢＡＥ０６９７１、ＢＡＥ０６９７０、ＢＡＥ０６９６９、ＢＡＥ０６９６８、ＢＡＥ０６９６７、ＢＡＥ０６９６６、ＢＡＥ０６９６５、ＢＡＥ０６９６４、ＢＡＥ０６９６３、ＢＡＥ０６９６２、ＢＡＥ０６９６１、ＢＡＥ０６９６０、ＢＡＥ０６９５９、ＢＡＥ０６９５８、ＢＡＥ０６９５７、ＢＡＥ０６９５６、ＢＡＥ０６９５５、ＢＡＥ０６９５４、ＢＡＥ０６９５３、ＢＡＥ０６９５２、ＢＡＥ０６９５１、ＢＡＥ０６９５０、ＢＡＥ０６９４９、ＢＡＥ０６９４８、ＢＡＥ０６９４７、ＢＡＥ０６９４６、ＢＡＥ０６９４５、ＢＡＥ０６９４４、ＢＡＥ０６９４３、ＢＡＥ０６９４２、ＢＡＥ０６９４１、ＢＡＥ０６９４０、ＢＡＥ０６９３９、ＢＡＥ０６９３８、ＢＡＥ０６９３７、ＢＡＥ０６９３６、ＢＡＥ０６９３５、ＢＡＥ０６９３４、ＢＡＥ０６９３３、ＢＡＥ０６９３２、ＢＡＥ０６９３１、ＢＡＥ０６９３０、ＢＡＥ０６９２９、ＢＡＥ０６９２８、ＢＡＥ０６９２７、ＢＡＥ０６９２６、ＢＡＥ０６９２５、ＢＡＥ０６９２４、ＢＡＥ０６９２３、ＢＡＥ０６９２２、ＢＡＥ０６９２１、ＢＡＥ０６９２０、ＢＡＥ０６９１９、ＢＡＥ０６９１８、ＢＡＥ０６９１７、ＢＡＥ０６９１６、ＢＡＥ０６９１５、ＢＡＥ０６９１４、ＢＡＥ０６９１３、ＢＡＥ０６９１２、ＢＡＥ０６９１１、ＢＡＥ０６９１０、ＢＡＥ０６９０９、ＢＡＥ０６９０８、ＢＡＥ０６９０７、ＢＡＥ０６９０６、ＢＡＥ０６９０５、ＢＡＥ０６９０４、ＢＡＥ０６９０３、ＢＡＥ０６９０２、ＢＡＥ０６９０１、ＢＡＥ０６９００、ＢＡＥ０６８９９、ＢＡＥ０６８９８、ＢＡＥ０６８９７、ＢＡＥ０６８９６、ＢＡＥ０６８９５、ＢＡＥ０６８９４、ＢＡＥ０６８９３、ＢＡＥ０６８９２、ＢＡＥ０６８９１、ＢＡＥ０６８９０、ＢＡＥ０６８８９、ＢＡＥ０６８８８、ＢＡＥ０６８８７、ＢＡＥ０６８８６、ＢＡＥ０６８８５、ＢＡＥ０６８８４、ＢＡＥ０６８８３、ＢＡＥ０６８８２、ＢＡＥ０６８８１、ＢＡＥ０６８８０、ＢＡＥ０６８７９、ＢＡＥ０６８７８、ＢＡＥ０６８７７、ＢＡＥ０６８７６、ＢＡＥ０６８７５、ＢＡＥ０６８７４、ＢＡＥ０６８７３、ＢＡＥ０６８７２、ＢＡＥ０６８７１、ＢＡＥ０６８７０、ＢＡＥ０６８６９、ＢＡＥ０６８６８、ＢＡＥ０６８６７、ＢＡＥ０６８６６、ＢＡＥ０６８６５、ＢＡＥ０６８６４、ＢＡＥ０６８６３、ＢＡＥ０６８６２、ＢＡＥ０６８６１、ＢＡＥ０６８６０、ＢＡＥ０６８５９、ＢＡＥ０６８５８、ＢＡＥ０６８５７、ＢＡＥ０６８５６、ＢＡＥ０６８５５、ＢＡＥ０６８５４、ＢＡＥ０６８５３及びＢＡＥ０６８５２）に由来するポリマーシンターゼが挙げられる。
種々の実施形態では、ポリマーシンターゼは、基質（Ｒ）−ヒドロキシアシル-ＣｏＡ又は他のＣｏＡチオエステル又はその誘導体を重合する又はその重合を促進することによって試験管内でポリマー粒子を作出するのに使用することができる。
種々の実施形態では、基質又は基質の混合物は、少なくとも任意で置換されるアミノ酸、乳酸塩、エステル又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸、好ましくはアセチル−ＣｏＡを含む。
種々の実施形態では、触媒は酵素である。代表例では、触媒は酵素であり、前駆体物質は酵素の基質であり、標的物質は酵素によって触媒される反応の生成物である。さらなる実施形態では、ポリマー粒子の集団は１を超える酵素を含み得る。特に熟考されるのは、ポリマー粒子の集団が、別の酵素、たとえば、２以上の酵素によって触媒される反応の生成物が合成経路又は触媒経路の一部又はすべてを含む２以上の酵素を含む実施形態である。
一実施形態では、１以上のポリマー粒子は透過性又は半透過性の支持体と永続的に結合する。別の実施形態では、１以上のポリマー粒子は透過性又は半透過性の支持体と可逆的に結合する。
種々の実施形態では、１以上のポリマー粒子は半透過性フィルターに共有結合又は非共有結合する。たとえば、１以上のポリマー粒子は半透過性の支持体又は膜に吸着される。別の例では、１以上のポリマー粒子は半透過性の支持体又は膜に結合することが可能であるリガンドを含む。
種々の実施形態では、半透過性の支持体は以下：ポリエーテルスルホン、ＰＶＤＦ、ＰＰ、ＰＥＥＳ、ＨＤＰＥ（高密度ポリエチレン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）ＰＥＴ及びＦＥＰ（フッ素化エチレンプロピレン）の１以上を含む。別の実施形態では、半透過性の支持体は、たとえば、セルロース、誘導体化セルロース又は安定化セルロースを含む多糖類を含む。さらに別の実施形態では、半透過性の支持体は、１以上のセラミックを含む。
種々の実施形態では、半透過性フィルターは以下の構成：らせん状にねじれたもの、板及び枠、平坦なシート、中空の繊維、スピン円板、又は管状のものの１つである。その例はカセット又はカートリッジとして好都合に提供され得る。
種々の実施形態では、１以上のポリマー粒子は、以下：界面活性剤、ＰＨ調節剤、１以上の溶媒、１以上のカオトロピック、１以上の酵素及び１以上のチオールの１以上の存在下で接線流濾過によって調製され、分離され、又は精製される。たとえば、接線流濾過には、たとえば、酸又は塩基の処理のような化学処理が含まれる。種々の実施形態では、方法は、本明細書で例示されるような化学処理の１以上、たとえば、実施例１２で例示される処理の１以上を含む。
種々の実施形態では、接線流濾過を用いて１以上の物質又は１以上のポリマー粒子を調製する、分離する又は精製する方法は、均質化、微少溶液操作、超音波処理、遠心分離又はそれらの組み合わせを含む、又はそれに先行する又はそれが続く。
種々の実施形態では、抗体に結合することが可能であるリガンドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、その組換え変異体、たとえば、プロテインＡのＺドメインのようなその機能的な組み合わせ断片を含むその機能的断片、及びたとえば、プロテインＡのＺドメインの隣接反復を含むＺＺドメインのようなその組み合わせを含む群から選択される。
本明細書で開示される数の範囲（たとえば、１〜１０）はまたその範囲内の有理数すべて（たとえば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９及び１０）及びその範囲内の有理数の任意の範囲（たとえば、２〜８、１．５〜５．５及び３．１〜４．７）に対する参照を組み入れるので、本明細書で明らかに開示される範囲すべての下位範囲すべてが本明細書によって明らかに開示されることが意図される。これらは、具体的に意図されるものの例にすぎず、最低値と最高値の間の数値の考えられる組み合わせすべてが同様に本出願で明らかに言及されるとみなされるべきである。
特許明細書、他の外部文書又は他の情報源を参照する本明細書では、これは一般に、本発明の特徴を議論するための背景を提供することを目的とする。具体的に言及されない限り、そのような外部文書に対する参照は、そのような文書又はそのような情報源がいかなる権限においても従来技術である又は当該技術で共通する一般的な知識の一部を形成するという了解として解釈されるべきではない。
本発明のさらなる態様及び利点は、例のみを目的として提供される確かなものにする記載から明らかになるであろう。
接線流濾過膜カートリッジを介して供給リザーバからのシステムにおける透過液の再循環を可能にする供給ポンプを利用する接線流濾過の模式図を示す図である。 例となる単純な接線流濾過システムの模式図を示す図である。 本発明の方法を用いて原料液から１以上の標的物質を精製する又は調製するのに使用され得る一般的な模式図を示す図である。 本発明の方法を用いて原料液から１以上の標的物質を精製する又は調製するのに使用され得る一般的な模式図を示す図である。 本発明の方法を用いて原料液から１以上の標的物質を精製する又は調製するのに使用され得る一般的な模式図を示す図である。 実施例にて本明細書で記載されるようにＩｇＧ免疫グロブリンの接線流濾過精製で使用されるＺＺＰｈａＣポリマー粒子のポリマー粒子タンパク質プロファイル（クマシーブルー染色及び銀染色）のＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析の写真を示す。レーン１：ＭＷマーカー、レーン２：未濾過の顆粒、レーン３：１００ｋＤａ濾過からのリテンテート、レーン４：０．１μｍの濾過からのリテンテート、レーン３：０．２μｍの濾過からのリテンテート。 実施例にて本明細書で記載されるようにＩｇＧ免疫グロブリンの接線流濾過精製で使用されるＺＺＰｈａＣポリマー粒子のポリマー粒子タンパク質プロファイルのＧＣ／ＭＳスペクトルを示す図である。 実施例にて本明細書で記載されるようにＩｇＧ免疫グロブリンの接線流濾過精製で使用されるＺＺＰｈａＣポリマー粒子のポリマー粒子タンパク質プロファイルのＧＣ／ＭＳスペクトルを示す図である。 実施例にて本明細書で記載されるようにＩｇＧ免疫グロブリンの接線流濾過精製で使用されるＺＺＰｈａＣポリマー粒子のポリマー粒子タンパク質プロファイルのＧＣ／ＭＳスペクトルを示す図である。 実施例にて本明細書で記載されるようにＩｇＧ免疫グロブリンの接線流濾過精製で使用されるＺＺＰｈａＣポリマー粒子のポリマー粒子タンパク質プロファイルのＧＣ／ＭＳスペクトルを示す図である。 実施例にて本明細書で記載されるように、原材料による透析濾過前（Ａ）及び後（Ｂ）のＺＺポリマー粒子の透過電子顕微鏡像を示す図である。 ＢＳＡとＩｇＧの混合物のＴＦＦ透析濾過からの透過液分画溶出プロファイルを示すグラフである。Ａ５ＢＳＡはＺドメインを含む本発明のポリマー粒子に結合せず、システムから容易に除かれた。リテンテートビーズを濃縮し、５０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭの生理食塩水ｐＨ３．０で処理する際（分画１３にて）、ＩｇＧはビーズから解放され、リテンテートから容易に透析濾過された。 実施例２にて本明細書で記載されるように、ＢＳＡからのヒトＩｇＧのＴＦＦ分離からの透過液分画のＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析を示す。図９Ａは、最初のＴＦＦ２８０ｎｍピークにおけるＢＳＡ含有分画の溶出を示す（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４洗浄分画）。図９Ｂは、Ｚドメインのビーズを含む本発明のポリマー粒子の透析濾過の後のＩｇＧ含有分画のクエン酸（ｐＨ３．０）による溶出を示す。 実施例２にて本明細書で記載されるように、ＢＳＡからのヒトＩｇＧのＴＦＦ分離からの透過液分画のＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析を示す。図９Ｂは、Ｚドメインのビーズを含む本発明のポリマー粒子の透析濾過の後のＩｇＧ含有分画のクエン酸（ｐＨ３．０）による溶出を示す。 実施例３にて記載するように、プロテインＧ及びＴＦＦからのＧＢ１ドメインを含む本発明のポリマー粒子を用いたヤギ血清からのヤギＩｇＧの精製を示す溶出分析結果を示す図である。１：１０希釈した（ＰＢＳで）ヤギ血清の５０ｍＬ懸濁液を、ＧＢ１ドメイン粒子を含む本発明のポリマー粒子の湿重量５ｇと共にインキュベートし、次いで透析濾過し（５０ｃｍ2カートリッジ、０．１μｍ）、血清タンパク質を除いた。２０ｍＬに濃縮した後、１５０ｍＭのＮａＣｌ中５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０に対して透析濾過する分画１５にてＩｇＧを溶出した。 ヤギ血清からのＩｇＧ精製のＴＦＦ透過液分画のＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析を示す図である。図１１ＡはＴＦＦから溶出した銀染色した血清タンパク質を示す。 ｐＨ３．０でのクエン酸／生理食塩水で透析濾過した後ＴＴＦから溶出されたタンパク質を示すが、溶出分画ではＩｇＧ重鎖及びＩｇＧ軽鎖が優勢なタンパク質として明瞭に目に見えた。 実施例４にて記載するように、ＴＦＦと金結合ドメインを含む本発明のポリマー粒子とを用いた溶液からのコロイド状の金の除去の測定のグラフを示す。９ｍＬ／分の透過流量での２０ｃｍ2、０．２μｍの中空繊維精密濾過カートリッジを伴ったＴＦＦシステムにて０．００５％コロイド状の金の３０ｍＬ懸濁液を再循環させた。８、１３及び２９分にて（＊）、それぞれ３０ｍｇ、３００ｍｇ及び３００ｍｇの金結合ドメインを含む本発明のポリマー粒子がリテンテートに加えられた。透過液におけるコロイド状の金の吸収を５２０ｎｍで測定した。 実施例５にて本明細書で記載するように、ＴＦＦを用いたアミラーゼ結合粒子が介在するデンプンの生体変換からのマルトースの回収のグラフを示す。２ｇのＰｏｌｙＥｎｚＡｍｙビーズを用いて可溶性デンプン（３００ｍＬ、１％、４％及び８％ｗ/ｖ）をマルトースに変換した。ＴＦＦによって懸濁液を濾過し、透過液にてマルトースを回収し、リテンテート分画にビーズを含有した。 実施例７に記載するように、ＴＦＦの間での有機リン酸ヒドロラーゼを結合した粒子によるメチルパラチオンのパラ−ニトロフェノールへの変換を示す図である。２０ｃｍ2で０．２μｍの中空繊維カートリッジを伴ったＴＦＦシステムにてメチルパラチオン（２００μＭ）の３０ｍＬ溶液を再循環させた。同一条件下での生体変換の２サイクルを記録した。 実施例７にて本明細書で記載するように、ＴＦＦ透析濾過を用いた有機リン酸ヒドロラーゼを結合した粒子の懸濁液からのパラ−ニトロフェノールの除去を示す図である。 実施例８にて本明細書で記載するように、細胞ホモジネートから直接採取したＰＨＢポリマー粒子の精製のための簡略化した小型の交差流濾過の方法スキームの説明を示す図である。示量性の微少溶液操作を用いることによって高度に分散するホモジネート懸濁液を可能にするように戦略を設計する。均質化の後、ＤＮＡ分解酵素とＭｇＣｌ2を加えて濾過に先立ってＤＮＡ断片の大きさを小さくする。ＥＤＴＡに大過剰のＭｇＣｌ2を加えてＤＮＡ分解酵素を活性化する。ＴＦＦの間、８容の透析濾過緩衝液にてホモジネート懸濁液を透析濾過して宿主細胞のタンパク質及び核酸を取り除く。 本明細書の実施例９で記載されるように、２５０ｍＬの粗精製の細胞ホモジネートの透過液溶出プロファイルＴＦＦを示す図である。８透析濾過容量の２０％ＥｔＯＨ中ＰＢＳ／ＥＤＴＡを用いて、１１０ｃｍ2で０．１μｍの中空繊維カートリッジにて細胞ホモジネートでＴＦＦ精製を行った。 細胞ホモジネートのＴＦＦ精製からの透過液分画でのＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイのグラフを示す。 透過液分画のＳＤＳ／ＰＡＧＥを示す図である。２０μＬアリコートの透過液分画１〜８（レーン３〜１０）を１５％ゲル上で流した（レーン１：分子量標準、レーン２：２０μＬの最終ビーズ懸濁液）。容積によって試料を負荷し、タンパク質含量について調整しなかった。 本明細書の実施例１０で記載されるように、０．２％のデオキシコレートを伴ったＴＦＦによって精製したＰＨＢ粒子の透過液分析を示す図である。指し示すように、記号は、１２透析濾過容量にわたって回収した透過液分画のＡ２６０（△）及びＡ２８０（■）ｎｍでの吸収測定を表し、測定したｐＨ（○）も示す。８容の１０ｍＭトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のデオキシコレート、ｐＨ１１、次いで４容のｐＢＳ、ｐＨ７．４に対して粒子を透析濾過した。 本明細書の実施例１０で記載されるように、ＴＦＦ精製後のＺドメインを含む本発明のポリマー粒子のＩｇＧ結合能のアッセイを示す図である。透析濾過後、０．２％のデオキシコレートを含有する溶液の範囲内で（表２）、ＰＢＳ、ｐＨ７．４にて室温で３０分間、５０ｍｇアリコートのビーズを５ｍｇのヒトＩｇＧと共にインキュベートした。インキュベート後、ポリマー粒子を遠心して未結合の分画を除き、次いでグリシン緩衝液、ｐＨ２．７で溶出してＺドメインを含む本発明のポリマー粒子からＩｇＧを溶出した。ポリマー粒子を再び遠心し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて溶出上清における回収されたＩｇＧを測定した。 実施例１１にて本明細書で記載するように、開水路ＴＦＦシステムを用いた、ＧＢ１ドメインを含む本発明のポリマー粒子の透過液分析を示す図である。ルブロール抽出したＰＨＢポリマー粒子をミリポアＰｒｏｓｔａｋ−４ｓｔａｋシステムに負荷した。ビーズを懸濁して１．３リットルのリテンテートを創り、１リットルの透過液分画を回収し、解析した。 実施例１１にて本明細書で記載するように、ＴＦＦ精製後のＺドメインを含む本発明のポリマー粒子のＩｇＧ結合能のアッセイを示す図である。グリセロール勾配又はＴＦＦ／ルブロール法のいずれかから精製した後、ＰＢＳ、ｐＨ７．４にて室温で３０分間、５０ｍｇアリコートのビーズを５ｍｇのヒトＩｇＧと共にインキュベートした。インキュベート後、ポリマー粒子を遠心して未結合の分画を除き、次いでグリシン緩衝液、ｐＨ２．７で溶出してポリマー粒子からＩｇＧを溶出した。ポリマー粒子を再び遠心し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて溶出上清における回収されたＩｇＧを測定した。 細胞抽出物におけるＺドメインを含む本発明のポリマー粒子からの宿主細胞のタンパク質／核酸の除去及び残った結合活性に対する種々の抽出剤の効果を示すグラフである。ＰＢＳ、２０％（必要に応じて）で希釈したバッチ洗浄上清におけるＡ２６０ｎｍとＡ２８０ｎｍの吸収結果を示す。 細胞抽出物におけるＺドメインを含む本発明のポリマー粒子からの宿主細胞のタンパク質／核酸の除去及び残った結合活性に対する種々の抽出剤の効果を示すグラフである。ＩｇＧの結合活性を示すが、その際、粗精製のポリマー粒子ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、１５，０００×ｇで２０分間遠心し、水気を切ったペレットを秤量し、重量で標準化したＩｇＧ結合活性を確定した。 細菌バイオマスからＰＨＢポリマー粒子を精製するための自由自在な規模のスキームを示す図である。 実施例１４にて本明細書で記載するように、ＳＤＳ界面活性剤抽出によるＰＨＢポリマー粒子からの宿主細胞バイオマスの除去を示す図である。２つの別々の複製サブバッチのバイオマス（１．１〜１．２ｋｇ）を２．７リットルの０．０８％ＳＤＳ、２５ｍＭトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１１に懸濁し、微少溶液操作を行った。溶解緩衝液、１０ｍＭのチオグリセロール及び０．１ＭのＮａＯＨにて順次化学洗浄を２．７Ｌ、１Ｌ及び１Ｌ容量でそれぞれ行った。各操作工程で粗精製ポリマー粒子の湿重量を測定した。 実施例１４にて本明細書で記載するように、ＳＤＳに基づくＴＦＦ精製工程で精製したＺドメインを含む本発明のポリマー粒子の透過液分析を示す図である。システムにて３.２ｓｔａｋモジュールを伴うミリポアＰｒｏｓｔａｋシステム（０．４１ｍ2）にＳＤＳ抽出したＰＨＢビーズを負荷した。ビーズを懸濁して２リットルのリテンテート分画及び２リットルの透過液分画を創り、次いで回収し、２６０、２８０、６００ｎｍの吸収及びｐＨについて解析した。 実施例１４で記載するように、ＳＤＳに基づいたＴＦＦ工程で精製したＰＨＢビーズのＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析を示す図である。５μＬの試料緩衝液と２０μＬの試料のアリコート（２５μＬ）を８〜１５％勾配のゲルに負荷した。記号を付けた試料は、１：ＭＷマーカー、２：粗精製の細胞溶解物、３：溶解後のポリマー粒子、４：溶解緩衝液（ＳＤＳ）で洗浄した後のポリマー粒子、５：チオグリセロール洗浄後のポリマー粒子、６：ＮａＯＨ洗浄後（ＴＦＦの前）のポリマー粒子、７：ＴＦＦ精製後のポリマー粒子である。
本発明は、接線流濾過技法で使用するための方法及び組成物に関する。接線流濾過は、原材料を膜に向かって接線方向に流す（全量濾過における膜に実質的に垂直であることとは対照的に）分離技術である。接線流は、膜を差次的に横切る圧力を創る。その結果、一部の粒子が膜を通過する一方で、他の粒子は膜を横切って流れ続け（図１を参照）、それは場合によっては膜をきれいにするのに役立つ。全量濾過と比べた場合、接線流は一般に濾過ケーキへの粒子の集積を遅くする。接線流濾過システムによって実現される他の利益は、当業者に周知であり、高い液体体積容量、高い標的物質結合能、ポリマー粒子の再生の容易さが挙げられる。
定義
本明細書で使用されるとき、用語「非晶性ポリマー」は、分子鎖の不規則な配置にもかかわらず、室温で固体であるポリマーとして理解されるべきである。これらのポリマーは本質的に非結晶性であり、結晶性のその程度は、通常２０％未満、好ましくは１５％未満、１０％未満、５％未満、好ましくは２％未満又は０％である。そのガラス転移温度が、０〜６０℃、好ましくは０〜５０℃、好ましくは０〜４０℃、好ましくは０〜３５°及び特に０〜３０℃であるそれらの非晶性ポリマーが特に好適である。
本明細書で使用されるとき、用語「バイオポリマー」は、生物、細胞又はタンパク質のような、しかし、これらに限定されない生物系又は生物実体によって合成され得るポリマーとして理解されるべきである。従って、用語「バイオポリエステル」及び「バイオポリチオエステル」はそれぞれ、生物系又は生物実体によって合成され得るポリエステル及びポリチオエステルとして理解されるべきである。例には、通常、ポリチオエステル及びポリヒドロキシアルカノエートのような、しかし、これらに限定されない炭素又はエネルギーを貯蔵する手段として種々の細菌及び古細菌によって産生されるポリエステル及びポリヒドロキシカルボキシレートが挙げられる。
用語「コーディング領域」又は「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、適切な調節配列の制御下で転写産物及び／又はポリペプチドを作出することが可能であるゲノムＤＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コーディング配列は、５’翻訳開始コドン及び３’翻訳終結コドンの存在によって特定される。遺伝子構築物に挿入されると、それがプロモータ及びターミネータの配列に操作可能に連結される場合、「コーディング配列」が発現されることが可能である。
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は本明細書で使用されるとき、「少なくとも部分的に成る」ことを意味する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を含む本明細書でのそのような表現を解釈する場合、その用語によって前置きされたもの以外の特徴も存在し得る。たとえば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」のような関連用語は同様に解釈されるべきである。
用語「混入物質」は、標的物質とは異なり、望ましくは最終的な標的物質の調製物から排除される、原料物質における物質（単数）又は物質（複数）を指す。生物学的な原料物質の典型的な混入物質には、核酸、タンパク質、ペプチド、エンドトキシン、ウイルス等が挙げられる。本発明の実践によって取り除くことができる混入物質は、所望の生成物とは異なる１以上の特性、たとえば、分子量、電荷、種々のリガンドに対する特異的親和性などを有する。
用語「接線流フィルター」及び文法上の同等物は本明細書では、たとえば、原媒体の選択された成分又は混入物質のフィルター要素を介した透過のために、濾過される原媒体がその表面を横切って接線流方式で流れる多孔性で透過性又は半透過性のフィルター要素を含むフィルターモジュール又はフィルターカセットの型を指す。
用語「カップリング試薬」は本明細書で使用されるとき、一方の側でのカップリング試薬と他方の側での少なくとも１つの物質を結合するのに好適である少なくとも１つの物質又はさらなるカップリング試薬を結合するのに好適である無機化合物又は有機化合物を指す。好適なカップリング試薬の例は、本発明の粒子又は融合タンパク質の化学修飾に好適な方法を含む例となるその使用法と共に、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００４／０２０６２３（Ｂｅｒｎｄ Ｒｅｈｍ）として公表されたＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９にて提示されている。
用語「発現構築物」は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写する、任意で転写物をポリペプチドに翻訳するのを可能にする要素を含む遺伝子構築物を指す。発現構築物は通常、５’から３’方向に
（１）構築物が導入される宿主細胞で機能的なプロモータと
（２）発現されるポリヌクレオチドと
（３）構築物が導入される宿主細胞で機能的なターミネータと
を含む。
本発明の発現構築物は、クローニング又は発現のために複製可能なベクターに挿入され、又は宿主ゲノムに組み入れられる。
本発明での使用に適用できる発現構築物の例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００４／０２０６２３（Ｂｅｒｎｄ Ｒｅｈｍ）として公表されたＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９及びＷＯ２００７／０３７７０６（Ｂｅｒｎｄ Ｒｅｈｍ）として公表されたＰＣＴ／ＮＺ２００６／０００２５１にて提供されている。
用語「ポリマー粒子を形成する」及び「ポリマー粒子の形成」は粒子形成タンパク質と関連して本明細書で使用されるとき、本明細書で議論されるような粒子形成タンパク質の活性を指す。
ポリペプチドの「断片」は、酵素活性又は結合活性に必要とされ、及び／又はポリペプチドの三次構造を提供する機能を実施するポリペプチドの部分配列である。
用語「融合ポリペプチド」は本明細書で使用されるとき、ペプチド結合によってそれぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を介して融合する２以上のアミノ酸配列、たとえば、２以上のポリペプチドドメインを含んで単一の連続するポリペプチドを形成するポリペプチドを指す。２以上のアミノ酸配列はそれぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を介して、直接融合でき、又はリンカー又はスペーサー又は追加のポリペプチドを介して間接的に融合することができることが理解されるべきである。
一実施形態では、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列の一方が粒子形成タンパク質を含む。一実施形態では、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列の一方がポリマーシンターゼを含む。
一実施形態では、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列の一方が融合パートナーを含む。
用語「融合パートナー」は本明細書で使用されるとき、タンパク質のようなポリペプチド、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、単鎖抗体、単一ドメイン抗体（たとえば、ＶＨＨ）、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン（たとえば、ＺＺドメイン）、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、リガンド、阻害剤、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジン、カップリングドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＦＬＡＧエピトープ、システイン残基、ライブラリペプチド、レポーターペプチド、アフィニティ精製ペプチド、又はその任意の２以上の任意の組み合わせを指す。
上記で列記した２以上のポリペプチドは融合パートナーを形成することができることが理解されるべきである。
一実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、リンカー又はスペーサーを介して間接的に融合され、前記融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼ／リンカー／融合パートナー、又は融合パートナー／リンカー／ポリマーシンターゼの順に配置される。他の実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼ／追加のポリペプチド／融合パートナー、又はポリマーシンターゼ／リンカー／融合パートナー／追加のポリペプチドの順で配置される追加のポリペプチドを介して間接的に融合される、又はそれを含む。再び、ポリマーシンターゼのＮ末端伸長が本明細書で明らかに企図される。
例となる一実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、リンカー又はスペーサーを介して間接的に融合され、前記融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼ／リンカー／抗体結合ポリペプチド又は抗体結合ポリペプチド／リンカー／ポリマーシンターゼ、又はポリマーシンターゼ／リンカー／酵素又は酵素／リンカー／ポリマーシンターゼの順に配置される。例となる他の実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマーシンターゼ／追加のポリペプチド／抗体結合ポリペプチド又はポリマーシンターゼ／追加のポリペプチド／酵素、又はポリマーシンターゼ／リンカー／抗体結合ポリペプチド／追加のポリペプチド又はポリマーシンターゼ／リンカー／酵素／追加のポリペプチド順で配置される追加のポリペプチドを介して間接的に融合される、又はそれを含む。再び、ポリマーシンターゼのＮ末端伸長が本明細書で明らかに企図される。
本発明に係る融合ポリペプチドは、別のポリペプチドの配列内に挿入された１以上のポリペプチド配列も含み得る。たとえば、プロテアーゼ認識配列のようなポリペプチド配列が粒子結合ドメインを含むタンパク質の可変領域に挿入される。
好都合なことに、本発明の融合ポリペプチドは、単一の核酸配列によってコードされ、その際、核酸配列は、それぞれポリペプチド又はポリペプチドドメインをコードする少なくとも２つの部分配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つの部分配列は単一のオープンリーディングフレームを含むので本明細書で企図されるような融合ポリペプチドをコードする「インフレーム」で存在する。他の実施形態では、少なくとも２つの部分配列は「フレーム外」に存在し、翻訳の際、融合ポリペプチドが形成されるようにリーディングフレームでシフトを促進するリボソームフレームシフト部位又は他の配列によって分離される。特定の実施形態では、少なくとも２つの部分配列は隣接する。他の実施形態では、少なくとも２つのポリペプチド又はポリペプチドドメインが追加のポリペプチドを介して間接的に融合される上記で議論したように、少なくとも２つの部分配列は隣接しない。
「結合ドメイン」又は「結合することが可能であるドメイン」に対する参照は、相補性の結合対の半分を意味し、上記リストからの結合対を含む。たとえば、抗体／抗原、抗体／抗体結合ドメイン、ビオチン／ストレプトアビジン、受容体／リガンド、酵素／阻害剤の対。標的結合ドメインは試料中の標的分子に結合し、たとえば、抗体又は抗体断片である。ポリペプチド結合ドメインはポリペプチドに結合し、たとえば、抗体又は抗体断片、又は受容体若しくはシグナル伝達タンパク質に由来する結合ドメインである。
結合ドメインによって結合される物質の例には、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、抗体、抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原断片、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、医薬活性剤、生物活性剤、アジュバント又はその任意の２以上の任意の組み合わせが挙げられる。そのような物質は、本発明の方法に従って分析される試料における「標的成分」である。
従って、「標的物質を結合することが可能であるドメイン」及び文法上の同等物は、相補性の結合対の一方の成分を指すと理解され、その際、他方は標的物質である。
用語「遺伝子構築物」は、ｃＤＮＡ分子のような、しかし、これに限定されない別のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）に挿入していてもよいポリヌクレオチド分子、普通、二本鎖ＤＮＡを指す。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写すること、及び任意で転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な要素を含有し得る。種々の実施形態では、挿入ポリヌクレオチド分子は宿主細胞に由来し、又は異なる細胞若しくは生物に由来し、及び／又は組換えポリヌクレオチドである。一実施形態では、宿主細胞に入ると直ちに、遺伝子構築物は、たとえば、宿主染色体ＤＮＡのような宿主ゲノムに組み入れられるようになる。一例では、遺伝子構築物はベクターに連結される。
用語「宿主細胞」は、１）天然のＰＨＡ粒子産生の宿主細胞である、又は２）少なくともチオラーゼ及びレダクターゼ及び任意でファシンをコードする核酸配列を含む発現構築物を運ぶ宿主細胞である細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、又は哺乳類細胞のような動物細胞を指す。ポリマー粒子の形成に宿主細胞が欠くものを増強するのにどの遺伝子が必要とされるかは、宿主細胞の遺伝的性質及びどの基質が培養培地に提供されるかに依存する。
用語「リンカー又はスペーサー」は、本明細書で使用されるとき、２以上のポリペプチド又は２以上のポリペプチドをコードする２以上の核酸配列を間接的に融合するアミノ酸又はヌクレオチドの配列を指す。一部の実施形態では、リンカー又はスペーサーは、長さ約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は約１００のアミノ酸又はヌクレオチドである。他の実施形態では、リンカー又はスペーサーは、長さ約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は約１０００のアミノ酸又はヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、リンカー又はスペーサーは、長さ約１〜約１０００のアミノ酸又はヌクレオチド、約１０〜約１０００、約５０〜約１０００、約１００〜約１０００、約２００〜約１０００、約３００〜約１０００、約４００〜約１０００、約５００〜約１０００、約６００〜約１０００、約７００〜約１０００、約８００〜約１０００、又は約９００〜約１０００のアミノ酸又はヌクレオチドである。
一実施形態では、リンカー又はスペーサーは、制限酵素認識部位を含み得る。別の実施形態では、リンカー又はスペーサーは、エンテロキナーゼ、トロンビン又は因子Ｘａ認識配列、又はインテインのような自己スプライシング要素のようなプロテアーゼ切断認識配列を含み得る。別の実施形態では、リンカー又はスペーサーは、融合ポリペプチドの無関係な折り畳みを促進する。
用語「混合集団」は本明細書で使用されるとき、実体の２以上の集団を指し、混合集団の中での実体の各集団は、混合集団の中での実体の別の集団とは幾つかの点で異なる。たとえば、発現構築物の混合集団に関連して使用される場合、これは、発現構築物の２以上の集団を指し、その際、発現構築物の各集団は、その集団のメンバーによってコードされる融合ポリペプチドという点で、又は構築物に存在するプロモータの同一性という点で異なる。或いは、融合ポリペプチドの混合集団に関連して使用される場合、これは、融合ポリペプチドの２以上の集団を指し、その際、融合ポリペプチドの各集団は、ポリマーシンターゼのようなポリペプチド、抗体結合ドメイン又は酵素のような融合パートナー、集団が含有するメンバーという点で異なる。たとえば、精製抗体の調製における使用という文脈では、融合ポリペプチドの混合集団は融合ポリペプチドの２以上の集団を指し、その際、融合ポリペプチドの各集団は、ポリマーシンターゼ、抗体結合ドメイン、集団が含有するメンバーのようなポリペプチドという点で異なる。同様に、標的物質の調製における使用という文脈では、融合ポリペプチドの混合集団は融合ポリペプチドの２以上の集団を指し、その際、融合ポリペプチドの各集団は、たとえば、ポリマーシンターゼ、酵素、前駆体結合ドメイン、又は酵素／基質結合ドメイン、集団が含有するメンバーのようなポリペプチドという点で異なる。その上さらに、ポリマー粒子の混合集団に関連して使用される場合、これは、ポリマー粒子の２以上の集団を指し、その際、ポリマー粒子の各集団は、融合ポリペプチド（単数）又は融合ポリペプチド（複数）、集団が運ぶメンバーという点で異なる。ポリマー粒子の２以上の部分集団を含み、各部分集団が本明細書で記載される（たとえば、上記のような）融合ポリペプチドの１以上を含み得るポリマー粒子の混合集団は特に企図される。
用語「核酸」は本明細書で使用されるとき、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド塩基、又は天然のヌクレオチドの既知の類似体、その混合物の一本鎖又は二本鎖の高分子を指す。その用語は、指示されない限り、特定の配列と共にそれに相補性の配列への参照を含む。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は本明細書では相互交換可能に使用される。
「操作可能に連結される」は、プロモータ、組織特異的な調節要素、一時的な調節要素、エンハンサ、リプレッサ及びターミネータを含む調節要素の制御下に発現される配列が置かれることを意味する。
用語「過剰発現」は一般に、正常な又は非形質転換の宿主細胞における産生のレベルを超える宿主における遺伝子産物の産生を指す。用語「過剰発現」はメッセンジャーＲＮＡと関連して使用される場合、好ましくは対照での宿主細胞又は非形質転換の細胞で通常見られるものより少なくとも約３倍高い発現レベルを指す。さらに好ましくは、発現のレベルは、対照の宿主細胞又は非形質転換の細胞で通常見られるものより少なくとも約５倍高い、約１０倍高い、約１５倍高い、約２０倍高い、約２５倍高い、約３０倍高い、約３５倍高い、約４０倍高い、約４５倍高い、約５０倍高い、約５５倍高い、約６０倍高い、約６５倍高い、約７０倍高い、約７５倍高い、約８０倍高い、約８５倍高い、約９０倍高い、約９５倍高い、又は約１００倍以上高い。
ｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析及び定量ＲＴ−ＰＣＲを含むＲＴ−ＰＣＲを含むが、これらには限定されない当業者に既知の多数の技法のいずれかを用いて測定される。
用語「粒子結合タンパク質」は本明細書で使用されるとき、粒子に結合することが可能であるタンパク質及びタンパク質ドメインを指す。そのような結合には、たとえば、ポリマーに共有結合したポリマーシンターゼを介した、ポリマーとの相互作用、又はポリマーに結合した部分との相互作用が直接介在し得る。本明細書での使用に好適な粒子結合タンパク質は、たとえば、ＰＨＡシンターゼのＣ末端断片又はポリマーデポリメラーゼの粒子結合ドメインのようなポリマー粒子のコアに結合することが可能であるタンパク質からの１以上の粒子結合ドメインが挙げられる。
用語「粒子形成タンパク質」は本明細書で使用されるとき、粒子の形成に関与するタンパク質を指す。それは、たとえば、ポリマーデポリメラーゼ、ポリマー調節因子、ポリマーシンターゼ及び粒子決定タンパク質を含むタンパク質の群から選択され得る。好ましくは、粒子形成タンパク質は、チオラーゼ、レダクターゼ、ポリマーシンターゼ及びファシンを含む群から選択される。たとえば、シンターゼのような粒子形成タンパク質は、ポリマー粒子を形成する基質又は基質の誘導体を重合することによるポリマー粒子の形成を触媒し得る。或いは、チオラーゼ、レダクターゼ、又はファシンのような粒子形成タンパク質は、重合を促進することによってポリマー粒子の形成を促進し得る。たとえば、チオラーゼ又はレダクターゼは、ポリメラーゼ用の好適な基質の産生を触媒し得る。ファシンは、形成されるポリマー粒子のサイズを制御し得る。好ましくは、粒子形成タンパク質は粒子結合ドメイン及び粒子形成ドメインを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「粒子形成反応混合物」は、宿主細胞又は発現構築物がシンターゼ触媒ドメインを含むのであれば、少なくともポリマーシンターゼの基質を指し、又は宿主細胞又は発現構築物がポリマーシンターゼ触媒ドメインではない別の粒子形成タンパク質若しくは粒子結合タンパク質を含むのであれば、ポリマーシンターゼ及びその基質を指す。
「粒子サイズ決定タンパク質」は、ポリマー粒子のサイズを制御するタンパク質を指す。それは、たとえば、ファシン様タンパク質のファミリー、好ましくは、属Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、さらに好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａに由来するファシン遺伝子ｐｈａＰ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来するファシン遺伝子ｐｈａＦに由来し得る。ファシンは、ポリマー粒子の疎水性表面にしっかり結合する分子量１４〜２８ｋＤａの両親媒性のタンパク質である。それはまた、粒子に結合し、粒子のサイズに影響する他の宿主細胞タンパク質も含み得る。
ポリマーシンターゼは、ポリマーの重合及びシンターゼタンパク質の粒子コアへの連結に介在するシンターゼタンパク質のＣ末端にて少なくともシンターゼ触媒ドメインを含む。本発明で使用するためのポリマーシンターゼは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＲｅｈｍ、２００３に詳細に記載されている。たとえば、ポリマーシンターゼは、クラス１の属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｚｏｏｇｌｏｅａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ、Ｔｈｙｏｃｙｓｔｉｓ及びＡｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、クラス２の属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、又はクラス４の属、Ｂａｃｉｌｌｕｓに由来する、さらに好ましくはクラス１、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＲＡ３８４９、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔａ ＦＡ４４０、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ＳＨ−６９、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＤＳＭＺ９２４２、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｉａ Ｈ１６、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ ＰＰ２、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ Ｎ１、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ ９１１１、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ Ｄ、Ｔｈｙｏｃｙｓｔｉｓ ｖｉｏｌａｃｅａ ２３１１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ ４１、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＨＡ、 ａｎｄ Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ２５９０３、クラス２、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｕ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＢＭ０１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｉｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ、並びにクラス４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＩＮＴ００５を含む群に由来するＰＨＡシンターゼである。
本発明での使用に適する他のポリマーシンターゼには、以下の生物に由来し、以下の受入番号：Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ（ＡＹ８３６６８０）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＥ００４０９１）、Ａ．ｖｉｎｏｓｕｍ（ＡＢ２０５１０４）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（ＡＦ１０９９０９）、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ（ＹＰ１３７３３９）、Ｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ（ＡＢ０４９４１３）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（ＡＦ１５０６７０）、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ａ３４３４１）、Ｔ．ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（Ｘ９３５９９）、Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ（Ｏ３２４７２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３（ＡＢ０１４７５７０及びＡＢ０１４７５８）、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＡＡＡ７２００４、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ（ＡＡＣ６９６１５）、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ＳＫ２（ＣＡＬ１７６６２）、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ＳＫ２（ＣＡＬ１６８６６）、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓＫＤ１３１（ＡＣＭ０１５７１及びＹＰ００２５２６０７２）、Ｒ．ｏｐａｃｕｓＢ４（ＢＡＨ５１８８０及びＹＰ００２７８０８２５）、Ｂ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ１７６１６（ＹＰ００１９４６２１５及びＢＡＧ４３６７９）、Ａ．ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ＳＫ２（ＹＰ６９３９３４及びＹＰ６９３１３８）、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ（ＡＡＤ５３１７９）、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＴＣＣ５０１５（ＺＰ０５０６１６６１及びＥＤＹ８６６０６）、Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．ＢＨ７２（ＹＰ９３２５２５）、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＡＴＣＣ１２４７２（ＮＰ９０２４５９）、Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＭＥＤ１０５（ＺＰ０１９１５８３８及びＥＤＭ８２８６７）、Ｍ．ａｌｇｉｃｏｌａ ＤＧ８９３（ＺＰ０１８９５９２２及びＥＤＭ４６００４）、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＣＡＡ６５８３３）、Ｃ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＡＴＣＣ１２４７２（ＡＡＱ６０４５７）、Ａ．ｌａｔｕｓ（ＡＡＤ１０２７４、ＡＡＤ０１２０９及びＡＡＣ８３６５８）、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｋ２７９ａ（ＣＡＱ４６４１８及びＹＰ００１９７２７１２）、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＩＰＯ１６０９（ＣＡＱ５９９７５及びＹＰ００２２５８０８０）、Ｂ． ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ１７６１６（ＹＰ００１９４１４４８及びＢＡＧ４７４５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｇｌ１３（ＡＣＪ０２４００）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｇｌ０６（ＡＣＪ０２３９９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｇｌ０１（ＡＣＪ０２３９８）、Ｒ．ｓｐ．ｇｌ３２（ＡＣＪ０２３９７）、Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ ｂｖ．ｖｉｃｉａｅ３８４１（ＣＡＫ１０３２９及びＹＰ７７０３９０）、Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．ＢＨ７２（ＣＡＬ９３６３８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＤＣ−５（ＡＡＶ３６５１０）、Ｌ．ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ ２００２（ＺＰ０３６９８１７９）、Ｔｈａｕｅｒａ ｓｐ．ＭＺ１Ｔ（ＹＰ００２８９００９８及びＡＣＲ０１７２１）、Ｍ． ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ ＪＣＭ２８３１（ＹＰ００１７５５０７８及びＡＣＢ２４３９５）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．４−４６（ＹＰ００１７６７７６９及びＡＣＡ１５３３５）、Ｌ．ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ ２００２（ＥＥＧ０８９２１）、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＢＡＡ７７２５７）、Ｍ．ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ（ＡＢＧ２３０１８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＳＭ４−５５（ＡＢＸ６４４３５及びＡＢＸ６４４３４）、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（ＡＡＴ７７２６１及びＡＡＴ７７２５８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＩＮＴ００５（ＢＡＣ４５２３２及びＢＡＣ４５２３０）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（ＡＡＭ６３４０９及びＡＡＭ６３４０７）、Ｇ．ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ（ＡＡＢ９４０５８）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（ＡＡＤ０５２６０）、Ｄ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＢＡＡ３３１５５）、Ｐ．ｓｅｒｉｎｉｐｈｉｌｕｓ（ＡＣＭ６８６６２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１４−３（ＣＡＫ１８９０４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＤＣ−５（ＡＡＸ１８６９０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＰＣ１７（ＡＢＶ２５７０６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．３Ｙ２（ＡＡＶ３５４３１、ＡＡＶ３５４２９及びＡＡＶ３５４２６）、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（ＡＡＭ１０５４６及びＡＡＭ１０５４４）、Ｐ．ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ（ＡＡＫ１９６０８）、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＡＫ１９６０５）、Ｐ．ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ（ＡＡＤ２６３６７及びＡＡＤ２６３６５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＵＳＭ７−７（ＡＣＭ９０５２３及びＡＣＭ９０５２２）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＡＰ５８４８０）並びに他の未培養の細菌（ＢＡＥ０２８８１、ＢＡＥ０２８８０、ＢＡＥ０２８７９、ＢＡＥ０２８７８、ＢＡＥ０２８７７、ＢＡＥ０２８７６、ＢＡＥ０２８７５、ＢＡＥ０２８７４、ＢＡＥ０２８７３、ＢＡＥ０２８７２、ＢＡＥ０２８７１、ＢＡＥ０２８７０、ＢＡＥ０２８６９、ＢＡＥ０２８６８、ＢＡＥ０２８６７、ＢＡＥ０２８６、ＢＡＥ０２８６５、ＢＡＥ０２８６４、ＢＡＥ０２８６３、ＢＡＥ０２８６２、ＢＡＥ０２８６１、ＢＡＥ０２８６０、ＢＡＥ０２８５９、ＢＡＥ０２８５８、ＢＡＥ０２８５７、ＢＡＥ０７１４６、ＢＡＥ０７１４５、ＢＡＥ０７１４４、ＢＡＥ０７１４３、ＢＡＥ０７１４２、ＢＡＥ０７１４１、ＢＡＥ０７１４０、ＢＡＥ０７１３９、ＢＡＥ０７１３８、ＢＡＥ０７１３７、ＢＡＥ０７１３６、ＢＡＥ０７１３５、ＢＡＥ０７１３４、ＢＡＥ０７１３３、ＢＡＥ０７１３２、ＢＡＥ０７１３１、ＢＡＥ０７１３０、ＢＡＥ０７１２９、ＢＡＥ０７１２８、ＢＡＥ０７１２７、ＢＡＥ０７１２６、ＢＡＥ０７１２５、ＢＡＥ０７１２４、ＢＡＥ０７１２３、ＢＡＥ０７１２２、ＢＡＥ０７１２１、ＢＡＥ０７１２０、ＢＡＥ０７１１９、ＢＡＥ０７１１８、ＢＡＥ０７１１７、ＢＡＥ０７１１６、ＢＡＥ０７１１５、ＢＡＥ０７１１４、ＢＡＥ０７１１３、ＢＡＥ０７１１２、ＢＡＥ０７１１１、ＢＡＥ０７１１０、ＢＡＥ０７１０９、ＢＡＥ０７１０８、ＢＡＥ０７１０７、ＢＡＥ０７１０６、ＢＡＥ０７１０５、ＢＡＥ０７１０４、ＢＡＥ０７１０３、ＢＡＥ０７１０２、ＢＡＥ０７１０１、ＢＡＥ０７１００、ＢＡＥ０７０９９、ＢＡＥ０７０９８、ＢＡＥ０７０９７、ＢＡＥ０７０９６、ＢＡＥ０７０９５、ＢＡＥ０７０９４、ＢＡＥ０７０９３、ＢＡＥ０７０９２、ＢＡＥ０７０９１、ＢＡＥ０７０９０、ＢＡＥ０７０８９、ＢＡＥ０７０８８、ＢＡＥ０７０５３、ＢＡＥ０７０５２、ＢＡＥ０７０５１、ＢＡＥ０７０５０、ＢＡＥ０７０４９、ＢＡＥ０７０４８、ＢＡＥ０７０４７、ＢＡＥ０７０４６、ＢＡＥ０７０４５、ＢＡＥ０７０４４、ＢＡＥ０７０４３、ＢＡＥ０７０４２、ＢＡＥ０７０４１、ＢＡＥ０７０４０、ＢＡＥ０７０３９、ＢＡＥ０７０３８、ＢＡＥ０７０３７、ＢＡＥ０７０３６、ＢＡＥ０７０３５、ＢＡＥ０７０３４、ＢＡＥ０７０３３、ＢＡＥ０７０３２、ＢＡＥ０７０３１、ＢＡＥ０７０３０、ＢＡＥ０７０２９、ＢＡＥ０７０２８、ＢＡＥ０７０２７、ＢＡＥ０７０２６、ＢＡＥ０７０２５、ＢＡＥ０７０２４、ＢＡＥ０７０２３、ＢＡＥ０７０２２、ＢＡＥ０７０２１、ＢＡＥ０７０２０、ＢＡＥ０７０１９、ＢＡＥ０７０１８、ＢＡＥ０７０１７、ＢＡＥ０７０１６、ＢＡＥ０７０１５、ＢＡＥ０７０１４、ＢＡＥ０７０１３、ＢＡＥ０７０１２、ＢＡＥ０７０１１、ＢＡＥ０７０１０、ＢＡＥ０７００９、ＢＡＥ０７００８、ＢＡＥ０７００７、ＢＡＥ０７００６、ＢＡＥ０７００５、ＢＡＥ０７００４、ＢＡＥ０７００３、ＢＡＥ０７００２、ＢＡＥ０７００１、ＢＡＥ０７０００、ＢＡＥ０６９９９、ＢＡＥ０６９９８、ＢＡＥ０６９９７、ＢＡＥ０６９９６、ＢＡＥ０６９９５、ＢＡＥ０６９９４、ＢＡＥ０６９９３、ＢＡＥ０６９９２、ＢＡＥ０６９９１、ＢＡＥ０６９９０、ＢＡＥ０６９８９、ＢＡＥ０６９８８、ＢＡＥ０６９８７、ＢＡＥ０６９８６、ＢＡＥ０６９８５、ＢＡＥ０６９８４、ＢＡＥ０６９８３、ＢＡＥ０６９８２、ＢＡＥ０６９８１、ＢＡＥ０６９８０、ＢＡＥ０６９７９、ＢＡＥ０６９７８、ＢＡＥ０６９７７、ＢＡＥ０６９７６、ＢＡＥ０６９７５、ＢＡＥ０６９７４、ＢＡＥ０６９７３、ＢＡＥ０６９７２、ＢＡＥ０６９７１、ＢＡＥ０６９７０、ＢＡＥ０６９６９、ＢＡＥ０６９６８、ＢＡＥ０６９６７、ＢＡＥ０６９６６、ＢＡＥ０６９６５、ＢＡＥ０６９６４、ＢＡＥ０６９６３、ＢＡＥ０６９６２、ＢＡＥ０６９６１、ＢＡＥ０６９６０、ＢＡＥ０６９５９、ＢＡＥ０６９５８、ＢＡＥ０６９５７、ＢＡＥ０６９５６、ＢＡＥ０６９５５、ＢＡＥ０６９５４、ＢＡＥ０６９５３、ＢＡＥ０６９５２、ＢＡＥ０６９５１、ＢＡＥ０６９５０、ＢＡＥ０６９４９、ＢＡＥ０６９４８、ＢＡＥ０６９４７、ＢＡＥ０６９４６、ＢＡＥ０６９４５、ＢＡＥ０６９４４、ＢＡＥ０６９４３、ＢＡＥ０６９４２、ＢＡＥ０６９４１、ＢＡＥ０６９４０、ＢＡＥ０６９３９、ＢＡＥ０６９３８、ＢＡＥ０６９３７、ＢＡＥ０６９３６、ＢＡＥ０６９３５、ＢＡＥ０６９３４、ＢＡＥ０６９３３、ＢＡＥ０６９３２、ＢＡＥ０６９３１、ＢＡＥ０６９３０、ＢＡＥ０６９２９、ＢＡＥ０６９２８、ＢＡＥ０６９２７、ＢＡＥ０６９２６、ＢＡＥ０６９２５、ＢＡＥ０６９２４、ＢＡＥ０６９２３、ＢＡＥ０６９２２、ＢＡＥ０６９２１、ＢＡＥ０６９２０、ＢＡＥ０６９１９、ＢＡＥ０６９１８、ＢＡＥ０６９１７、ＢＡＥ０６９１６、ＢＡＥ０６９１５、ＢＡＥ０６９１４、ＢＡＥ０６９１３、ＢＡＥ０６９１２、ＢＡＥ０６９１１、ＢＡＥ０６９１０、ＢＡＥ０６９０９、ＢＡＥ０６９０８、ＢＡＥ０６９０７、ＢＡＥ０６９０６、ＢＡＥ０６９０５、ＢＡＥ０６９０４、ＢＡＥ０６９０３、ＢＡＥ０６９０２、ＢＡＥ０６９０１、ＢＡＥ０６９００、ＢＡＥ０６８９９、ＢＡＥ０６８９８、ＢＡＥ０６８９７、ＢＡＥ０６８９６、ＢＡＥ０６８９５、ＢＡＥ０６８９４、ＢＡＥ０６８９３、ＢＡＥ０６８９２、ＢＡＥ０６８９１、ＢＡＥ０６８９０、ＢＡＥ０６８８９、ＢＡＥ０６８８８、ＢＡＥ０６８８７、ＢＡＥ０６８８６、ＢＡＥ０６８８５、ＢＡＥ０６８８４、ＢＡＥ０６８８３、ＢＡＥ０６８８２、ＢＡＥ０６８８１、ＢＡＥ０６８８０、ＢＡＥ０６８７９、ＢＡＥ０６８７８、ＢＡＥ０６８７７、ＢＡＥ０６８７６、ＢＡＥ０６８７５、ＢＡＥ０６８７４、ＢＡＥ０６８７３、ＢＡＥ０６８７２、ＢＡＥ０６８７１、ＢＡＥ０６８７０、ＢＡＥ０６８６９、ＢＡＥ０６８６８、ＢＡＥ０６８６７、ＢＡＥ０６８６６、ＢＡＥ０６８６５、ＢＡＥ０６８６４、ＢＡＥ０６８６３、ＢＡＥ０６８６２、ＢＡＥ０６８６１、ＢＡＥ０６８６０、ＢＡＥ０６８５９、ＢＡＥ０６８５８、ＢＡＥ０６８５７、ＢＡＥ０６８５６、ＢＡＥ０６８５５、ＢＡＥ０６８５４、ＢＡＥ０６８５３及びＢＡＥ０６８５２）によってそれぞれ特定されるポリマーシンターゼが挙げられる。
ＰＨＡシンターゼタンパク質のＮ末端断片（アミノ酸ほぼ１〜２００、又は１〜１５０又は１〜１００）は非常に可変性であり、場合によっては、シンターゼを不活化することなく、又はポリマー粒子結合ドメイン（すなわち、Ｃ末端断片）を介したポリマーコアへのシンターゼの結合を妨げることなく、欠失する又は酵素、抗体結合ドメイン若しくは他の融合パートナーによって置き換えられる。シンターゼのポリマー粒子結合ドメインは、ポリマーコアの重合及びポリマー粒子の形成に介在するシンターゼタンパク質の少なくとも触媒ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＰＨＡシンターゼタンパク質のＣ末端断片は、シンターゼを不活化することなく又はシンターゼのポリマー粒子への共有結合を妨げることなく、修飾され、部分的に欠失し、又は酵素、抗体結合ドメイン若しくは別の融合パートナーによって置き換えられる。
特定の場合、酵素、抗体結合ドメイン又は別の融合パートナーは、シンターゼを不活化することなく又はシンターゼのポリマー粒子への共有結合を妨げることなく、ＰＨＡシンターゼタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に融合される。同様に、他の場合では、酵素、抗体結合ドメイン又は別の融合パートナーは、ＰＨＡシンターゼタンパク質の中へ、又は実際、粒子形成タンパク質の中へ挿入される。ＰｈａＣ融合の例は、当該技術で既知であり、本明細書で提示される。
特定の一例では、ＰＨＡシンターゼタンパク質のＮ末端断片（アミノ酸ほぼ１〜２００、又は１〜１５０又は１〜１００）は、シンターゼを不活化することなく又はシンターゼのポリマー粒子への共有結合を妨げることなく、欠失する、又はプロテインＡのＺドメインのような抗体結合ドメイン又はその直列反復によって置き換えられる。
「ポリマーデポリメラーゼ」は本明細書で使用されるとき、ポリマー粒子で見られるように、既存のポリマーを水溶性モノマー及びオリゴマーに加水分解することが可能であるタンパク質を指す。ポリマーデポリメラーゼの例は、多種多様なＰＨＡを分解する細菌及び真菌に存在し、Ｐａｕｃｉｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅｉに由来するＰｈａＺ１〜ＰｈａＺ７細胞外デポリメラーゼ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｓｐ．、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ（株ＡＥ１２２及びＴ１）、Ｄｅｌｆｔｉａ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、株ＹＭ１０６９、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．、株ＨＳ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、株ＧＭ１０１（受入番号ＡＦ２９３３４７）、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、株ＧＫ１３、Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｒ．ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ（株Ａ１及びＫ１、受入番号ＪＯ４２２３、Ｄ２５３１５）、Ｓ．ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ、Ｋ１０及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓに由来するＰｈａＺデポリメラーゼが挙げられる（Jendrossek D., and Handrick, R., Microbial Degredation of Polyhydroxyalkanoates, Annual Review of Microbiology, 2002, 56:403-32を参照）。
用語「ポリペプチド」は本明細書で使用されるとき、完全長のタンパク質を含む、任意の長さの、しかし好ましくは少なくとも５アミノ酸のアミノ酸鎖を包含し、その際、アミノ酸残基は共有ペプチド結合で連結される。本発明のポリペプチドは精製された天然の産物であり、又は組換え法若しくは合成法を用いて部分的に若しくは全体的に作出される。その用語は、ポリペプチド、たとえば、二量体又は他の多量体のようなポリペプチドの凝集体、融合ポリペプチド、ポリペプチドの変異体、又はその誘導体を指し得る。
用語「プロモータ」は、遺伝子の転写を調節するコーディング領域の上流の非転写性のシス調節性要素である。プロモータは、転写開始部位を特定するシス開始要素及びＴＡＴＡボックスのような保存されたボックス及び転写因子が結合するモチーフを含む。
用語「ターミネータ」は、翻訳された配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端に見られる、転写を終了させる配列を指す。ターミネータはｍＲＮＡの安定性の重要な決定基であり、場合によっては、空間調節機能を有することが分っている。
用語「物質」は、ポリマー粒子に結合すること又は吸着すること又はその中に組み入れられることと関連して言及される場合、ポリマー粒子に吸着する又はその中に組み入れられる融合パートナー又は物質が結合する物質を意味するように意図される。
用語「変異体」は本明細書で使用されるとき、具体的に特定された配列とは異なるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を指し、その際、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸が欠失する、置換される、又は付加される。変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体であり、又は天然に存在しない変異体である。変異体は同一種又は他の種に由来し、ホモログ、パラログ及びオルソログを包含し得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体は、野生型のポリヌクレオチド及びポリペプチドと同一の又はそれに類似する生物活性を持つ。ポリヌクレオチド及びポリペプチドを参照した用語「変異体」は本明細書で定義されるようなポリヌクレオチド及びポリペプチドのすべての形態を包含する。
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体
用語「ポリヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、任意の長さの、しかし好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの高分子を意味し、非限定例として、遺伝子のコーディング配列及び非コーディング配列、センス配列及びアンチセンス配列の相補体、エクソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡの配列から単離され、精製された組換えポリペプチド、合成のＲＮＡ及びＤＮＡの配列、核酸のプローブ、プライマー及び断片が挙げられる。多数の核酸類似体が当該技術で周知であり、熟考もされる。
本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列の「断片」は、好ましくは少なくとも長さ１５ヌクレオチドである隣接するヌクレオチドの配列である。本発明の断片は、本発明のポリヌクレオチドの、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド配列の断片は、アンチセンス、遺伝子スプライシング、三重らせん又はリボザイム技術、又はマイクロアレイに関与するプローブに使用することができ、又はポリヌクレオチドに基づいた選抜法に使用することができる。
プロモータポリヌクレオチド配列に関連する用語「断片」は、断片が操作可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現を調節することが可能であるプロモータポリヌクレオチド配列のシス要素及び領域を含む配列を含むように意図される。
好ましくは、本発明のプロモータポリヌクレオチド配列の断片は、本発明のプロモータポリヌクレオチドの少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、さらに好ましくは少なくとも１００、さらに好ましくは少なくとも２００、さらに好ましくは少なくとも３００、さらに好ましくは少なくとも４００、さらに好ましくは少なくとも５００、さらに好ましくは少なくとも６００、さらに好ましくは少なくとも７００、さらに好ましくは少なくとも８００、さらに好ましくは少なくとも９００及び最も好ましくは少なくとも１０００の隣接するヌクレオチドを含む。
用語「プライマー」は、鋳型とハイブリッド形成し、鋳型に相補性のポリヌクレオチドの重合を開始するのに使用される、普通、遊離の３’ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドを指す。そのようなプライマーは好ましくは、長さ少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも６、さらに好ましくは少なくとも７、さらに好ましくは少なくとも９、さらに好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも１１、さらに好ましくは少なくとも１２、さらに好ましくは少なくとも１３、さらに好ましくは少なくとも１４、さらに好ましくは少なくとも１５、さらに好ましくは少なくとも１６、さらに好ましくは少なくとも１７、さらに好ましくは少なくとも１８、さらに好ましくは少なくとも１９、さらに好ましくは少なくとも２０のヌクレオチドである。
用語「プローブ」は、ハイブリッド形成に基づくアッセイにてプローブに相補性であるポリヌクレオチド配列を検出するのに使用される短いポリヌクレオチドを指す。プローブは本明細書で定義されるようなポリヌクレオチドの「断片」から成り得る。好ましくは、そのようなプローブは、長さ少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、さらに好ましくは少なくとも５０、さらに好ましくは少なくとも１００、さらに好ましくは少なくとも２００、さらに好ましくは少なくとも３００、さらに好ましくは少なくとも４００及び最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドである。
用語「変異体」は本明細書で使用されるとき、具体的に特定された配列とは異なるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を指し、その際、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸が欠失する、置換される、又は付加される。変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体であり、又は天然に存在しない変異体である。変異体は同一種又は他の種に由来し、ホモログ、パラログ及びオルソログを包含し得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体は、野生型のポリヌクレオチド及びポリペプチドと同一の又はそれに類似する生物活性を持つ。ポリヌクレオチド及びポリペプチドを参照した用語「変異体」は本明細書で定義されるようなポリヌクレオチド及びポリペプチドのすべての形態を包含する。
ポリヌクレオチドの変異体
変異体ポリヌクレオチド配列は好ましくは、特定されたポリヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、特定されたポリヌクレオチド配列の少なくとも２０ヌクレオチドの位置、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの位置、少なくとも１００ヌクレオチドの位置の比較ウインドウにわたって、又は全体の長さにわたって見い出される。
ポリヌクレオチド配列の同一性は以下の方法で決定することができる。ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に利用できる、ｂｌ２ｓｅｑにおけるＢＬＡＳＴＮ（プログラムのＢＬＡＳＴｓｕｉｔｅ、バージョン２．２．１０［Ｏｃｔ、２００４］）（Ｔａｔｉａｎａ、Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ、Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），“Ｂｌａｓｔ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を用いて主題のポリヌクレオチド配列を候補ポリヌクレオチド配列と比較する。複雑性の低い部分のフィルタリングを止めるべきであることを除いてｂｌ２ｓｅｑの初期設定パラメータを利用する。
ポリヌクレオチド配列の同一性は以下のｕｎｉｘコマンドラインのパラメータを用いて調べることができる：
ｂｌ２ｓｅｑ-ｉ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１-ｊ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２-Ｆ Ｆ-ｐ ｂｌａｓｔｎ
パラメータ−Ｆ Ｆは複雑性の低い区分のフィルタリングを止める。パラメータ-ｐは配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、ライン”Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝”にて同一ヌクレオチドの数及び比率の双方として配列同一性を報告する。
広範囲配列の配置プログラム（たとえば、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453）を用いて、候補と主題のポリヌクレオチド配列の間での重複の長さ全体にわたってポリヌクレオチド配列の同一性を算出することもできる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈの広範囲配置アルゴリズムの完全実施は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ (Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277)のニードルプログラムに見つけることができ、それは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／．から入手することができる。欧州バイオインフォマティクス研究所のサーバも、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／にてオンラインで２つの配列間でＥＭＢＯＳＳニードル広範囲配置を実施するための便宜を提供している。
或いは、末端ギャップにペナルティを科すことなく２つの配列の最適な広範囲配置を計算するＧＡＰプログラムを使用することができる。ＧＡＰは以下の論文：Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０，２２７−２３５に記載されている。
本発明のポリヌクレオチド変異体は、それらの配列の機能的同等性を保存すると思われる特に特定された配列の１以上に類似性を示し、偶然に生じたとは合理的に予想できないものも包含する。ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に利用できるプログラムのＢＬＡＳＴｓｕｉｔｅｓ（バージョン２．２．１０［Ｏｃｔ、２００４］）のｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて決定されるポリヌクレオチドに関するそのような配列類似性。
ポリヌクレオチド配列の類似性は以下のｕｎｉｘコマンドラインのパラメータを用いて調べることができる：
ｂｌ２ｓｅｑ-ｉ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１-ｊ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２-Ｆ Ｆ-ｐ ｔｂｌａｓｔｘ
パラメータ−Ｆ Ｆは複雑性の低い区分のフィルタリングを止める。パラメータ-ｐは配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見つけ出し、そのような各領域について、無作為配列を含有する固定した参照サイズのデータベースにて偶然によってそのような一致を見つけることを予想できた回数の期待数である「Ｅ値」を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおける初期設定によって設定される。１をはるかに下回る小さなＥ値については、Ｅ値は、近似的にそのような無作為一致の確率である。
変異体ポリヌクレオチド配列は、特に特定された配列のいずれか１つと比較した場合、好ましくは、１×１０-10未満、さらに好ましくは１×１０-20未満、１×１０-30未満、１×１０-40未満、１×１０-50未満、１×１０-60未満、１×１０-70未満、１×１０-80未満、１×１０-90未満、１×１０-100未満、１×１０-110未満、１×１０-120未満又は１×１０-123未満のＥ値を示す。
或いは、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で特定されたポリヌクレオチド配列又はその相補体とハイブリッドを形成する。
用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する」及びその文法上の同等物は、温度及び塩濃度の規定された条件下で標的ポリヌクレオチド分子（たとえば、サザンブロット又はノーザンブロットのようなＤＮＡ又はＲＮＡブロットに不動化された標的ポリヌクレオチド分子）とハイブリッド形成するポリヌクレオチド分子の能力を指す。ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する能力は、当初、厳密性の低い条件下でハイブリッド形成させ、次いで所望の厳密性まで厳密性を高めることによって判定することができる。
長さ約１００塩基を超えるポリヌクレオチド分子に関して、典型的なストリンジェントなハイブリッド形成条件は、天然の二本鎖の融解温度（Ｔｍ）未満で２５℃〜３０℃未満（たとえば、１０℃）である（一般にSambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingを参照）。約１００塩基を超えるポリヌクレオチド分子のＴｍは式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ+）によって計算することができる（Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390）。長さ１００塩基を超えるポリヌクレオチドのための典型的なストリンジェントな条件は、たとえば、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中で予備洗浄し、６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで一晩ハイブリッド形成させ、その後、それぞれ１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で３０分間、２回洗浄し、それぞれ０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で３０分間、２回洗浄するハイブリッド形成条件である。
１００塩基未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関して、例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件は、Ｔｍ未満の５〜１０℃である。概して、１００塩基未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍはおよそ（５００／オリゴヌクレオチドの長さ）℃で低下する。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Nielsen et al., Science. 1991 Dec 6;254(5037):1497-500）として知られるＤＮＡ模倣体に関して、Ｔｍ値は、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドよりも高く、Ｇｉｅｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９８、Ｎｏｖ．１；２６（２１）：５００４−６に記載された式を用いて算出することができる。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドの例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件は、Ｔｍ未満の５〜１０℃である。
本発明の変異体ポリヌクレオチドはまた、本発明の配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに類似する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変えない配列の変化は「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）及びＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、場合によっては、当該技術によって承認されている技法によって同一アミノ酸について他のコドンに変更して、たとえば、特定の宿主生物におけるコドンの発現を最適化する。
その生物活性を有意に変えることなく、コードされたポリペプチド配列にて１又は数個のアミノ酸の保存的置換を生じるポリヌクレオチド配列の変化も本発明に含まれる。技能のある熟練者は表現型上サイレントなアミノ酸置換を行う方法に気付くであろう（たとえば、Bowie et al., 1990, Science 247, 1306を参照）。
コードされたポリペプチド配列におけるサイレント変異及び保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、以前記載されたｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムを介して、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）からのプログラムのＢＬＡＳＴｓｕｉｔｅｓ（バージョン２．２．１０［Ｏｃｔ、２００４］）の公的に利用できるｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて決定することができる。
ポリペプチド変異体
ポリペプチドを参照した用語「変異体」は、天然に存在する、組換えで及び合成して作出されるポリペプチドを包含する。変異ポリペプチド配列は、本発明の配列に対して好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、少なくとも２０アミノ酸の位置、好ましくは少なくとも５０アミノ酸の位置、少なくとも１００アミノ酸の位置の比較ウインドウにわたって、又は本発明のポリペプチド全体の長さにわたって見い出される。
ポリペプチド配列の同一性は以下の方法で決定することができる。ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に利用できる、ｂｌ２ｓｅｑにおけるＢＬＡＳＴＮ（プログラムのＢＬＡＳＴｓｕｉｔｅ、バージョン２．２．１０［Ｏｃｔ、２００４］）を用いて主題のポリペプチド配列を候補ポリペプチド配列と比較する。複雑性の低い部分のフィルタリングを止めるべきであることを除いてｂｌ２ｓｅｑの初期設定パラメータを利用する。
ポリペプチド配列の同一性は、広範囲配列の配置プログラムを用いて、候補と主題のポリペプチド配列の間での重複の長さ全体にわたって算出することもできる。上記で議論したようなＥＭＢＯＳＳ−ニードル（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/で利用可能）及びＧＡＰ（Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.）もポリペプチド配列の同一性を算出するための好適な広範囲配列配置プログラムである。
本発明のポリペプチド変異体は、それらの配列の機能的同等性を保存すると思われる特に特定された配列の１以上に類似性を示し、偶然に生じたとは合理的に予想できないものも包含する。ポリペプチドに関するそのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）からのプログラムのＢＬＡＳＴｓｕｉｔｅｓ（バージョン２．２．１０［Ｏｃｔ、２００４］）から公的に利用できるｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて決定される。ポリペプチド配列の類似性は以下のｕｎｉｘコマンドラインのパラメータを用いて調べることができる：
ｂｌ２ｓｅｑ-ｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１-ｊ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２−Ｆ Ｆ-ｐ ｂｌａｓｔｐ
変異体ポリペプチド配列は、特に特定された配列のいずれか１つと比較した場合、好ましくは、１×１０-10未満、さらに好ましくは１×１０-20未満、１×１０-30未満、１×１０-40未満、１×１０-50未満、１×１０-60未満、１×１０-70未満、１×１０-80未満、１×１０-90未満、１×１０-100未満、１×１０-110未満、１×１０-120未満又は１×１０-123未満のＥ値を示す。
パラメータ−Ｆ Ｆは複雑性の低い区分のフィルタリングを止める。パラメータ-ｐは配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見つけ出し、そのような各領域について、無作為配列を含有する固定した参照サイズのデータベースにて偶然によってそのような一致を見つけることを予想できた回数の期待数である「Ｅ値」を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおける初期設定によって設定される。１をはるかに下回る小さなＥ値については、Ｅ値は、近似的にそのような無作為一致の確率である。
その生物活性を有意に変えることのない、記載されるポリペプチド配列の１又は数個のアミノ酸の保存的置換も本発明に含まれる。技能のある熟練者は表現型上サイレントなアミノ酸置換を行う方法に気付くであろう（たとえば、Bowie et al., 1990, Science 247, 1306を参照）。
本発明のポリペプチド変異体は、ポリペプチドをコードする核酸から作出されるが、それが変化したアミノ酸配列を有するように異なってプロセッシングされるという点で野生型のポリペプチドとは異なるものも包含する。たとえば、野生型のポリペプチドを作出するものに対する一次ＲＮＡ転写物の選択的スプライシングパターンによって変異体が作出される。
用語「ベクター」は、遺伝子構築物を宿主細胞に輸送するのに使用されるポリヌクレオチド分子、普通、二本鎖ＤＮＡを指す。特定の例では、ベクターは、たとえば、大腸菌のような少なくとも１つの追加の宿主系で複製可能である。
接線流濾過
一般に、本発明は接線流濾過技法に適用がある。たとえば、一実施形態では、本発明は、原料液から１以上の標的物質を調製する方法に関するものであり、該方法は、接線流濾過システムに添加中に又は添加に先立ってバイオポリマー粒子の集団に原料液を接触させることを含み、その際、以下の工程の１以上が実施される：
−ポリマー粒子の集団を濃縮すること、
−たとえば、透析濾過によって、１以上のポリマー粒子に結合した標的物質又はポリマー粒子に結合したその前駆体から１以上の混入物質を分離すること、
−ポリマー粒子から標的物質を溶出すること、
−標的物質を回収すること。
標的物質の粒子結合前駆体に関連する実施形態では、ポリマー粒子の１以上は前駆体の標的物質への、又は標的物質へのさらなる前駆体への変換を触媒することが可能である１以上の酵素を含む。たとえば、一実施形態では、標的物質の前駆体は基質の標的物質への変換を触媒することが可能である酵素の基質であり、ポリマー粒子の１以上が酵素を含む。別の例では、標的物質の前駆体は、標的物質へのさらなる前駆体への基質の変換を触媒することが可能である酵素の基質であり、それはそれ自体、標的物質へのさらなる前駆体の変換を触媒することが可能である第２の酵素の基質であり、ポリマー粒子の１以上が第１の酵素、第２の酵素、又は第１と第２双方の酵素を含む。適切に選択された酵素を含む１以上のポリマー粒子を提供することによって、標的物質への前駆体の変換における一連の触媒工程を採用することができることが十分に理解されるであろう。
別の実施形態では、本発明は、原料液から１以上の標的物質を調製する方法に関するものであり、該方法は、接線流濾過システムに添加中に又は添加に先立ってバイオポリマー粒子の集団に原料液を接触させることを含み、その際、以下の工程の１以上が実施される：
−ポリマー粒子の集団を濃縮すること、
−たとえば、透析濾過によって、１以上のポリマー粒子に結合した混入物質から１以上の標的物質又はその前駆体を分離すること、
−標的物質を回収すること。
一実施形態では、バイオポリマー粒子の集団に原料液を接触させることは、接線流濾過システムにてバイオポリマー粒子及び原料液を循環させることによる。
別の実施形態では、本発明は、原料液から１以上の標的物質を調製する方法に関するものであり、該方法は、バイオポリマー粒子の集団及び任意で１以上の標的物質又はその前駆体及び／又は１以上の混入物質を含む原料液を接線流濾過システムに添加することと、ポリマー粒子の集団を濃縮することと、及び／又はポリマー粒子から１以上の標的物質又はその前駆体及び／又は１以上の混入物質を分離することと、ポリマー粒子、標的物質又は混入物質を回収することを含む。
本発明の組成物、方法及びポリマー粒子は既存の接線流システム及び技法と併せた適用を有する。他種多様なそのようなシステムが存在する。接線流濾過システムでは、液体媒体の流れによるフィルター要素上で発揮される剪断力はフィルター要素の表面上での固体の蓄積に対向する傾向がある。
接線流フィルターには、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過及び逆浸透のフィルター系が挙げられる。例となる一実施形態では、接線流フィルターは操作可能に積み重ねられた配置にて非常に多くのフィルターシート（濾過膜）を含み、たとえば、フィルターシートは透過シート及びリテンテートシートと交互にあり、濾過される液体がフィルターシートを横切って流れるにつれて、非透過の種、たとえば、フィルターシートの孔サイズより大きな直径の固体又は高分子種は保持され、リテンテートの流れに入り、透過種を伴った液体はフィルターシートを介して拡散し、透過流に入る。
十分に理解されるように、多数の接線流技法（交差流技法とも呼ばれる）が現在利用可能であり、本発明と併せた使用に好適である。接線流膜フィルターを含む市販の接線流技法には、たとえば、ＶｉｖａｓｃｉｅｎｃｅからのＶｉｖａｆｌｏｗフィルター（たとえば、Ｖｉｖａｆｌｏｗ２００、１００，０００ＭＷＣＯ、ＰＥＳ、ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅを含む）、並びにＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＨｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）及びポリエーテルスルホンの精密濾過及び限外濾過の膜が挙げられるが、そのような型の好適な接線流フィルターのモジュール及びカセットは、米国特許第４，８６７，８７６号；同第４，８８２，０５０号；同第５，０３４，１２４号；同第５，０３４，１２４号；同第５，０４９，２６８号；同第５，２３２，５８９号；同第５，３４２，５１７号；同第５，５９３，５８０号；同第５，８６８，９３０号、及びＷＯ２０１０／１０７６７７として公表されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／０２７２６６に様々に記載されており、その開示すべては、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
本発明に適用可能な例となる接線流工程の一般的な概略を図１〜４に示す。接線流濾過（ＴＦＦ）又は交差流濾過（本明細書では相互交換可能に使用される）は、濾過媒体の表面に平行な溶液流路又は懸濁液流路を走らせることによって濾過を達成する方法である（４図１Ａ）。例となる単純なＴＦＦシステムは、ＴＦＦ膜カートリッジを介して供給リザーバからシステムにおける透過液の再循環を可能にする供給ポンプを利用する（図１Ｂ）。小さな化合物及び溶液は透過液としてフィルターを通過する。このようにリテンテートにおける大きな化合物を濃縮することができる。追加の溶液リザーバを加えることによって濾過によってリテンテートを透析することができる（透析濾過される）。従って、特定の実施形態では透析濾過を工程として使用して小さな化合物から大きな化合物（懸濁液中の分子、細胞、固形物）を分離する。ミクロン以下の範囲、たとえば、０．１〜０．６μｍでのＴＦＦフィルターの使用は一般に精密濾過として知られる。図２に示す一般スキームを参照して、原料液を任意で前処理して粒子状又は固形状のものを取り除き（たとえば、当該技術で周知の遠心又は濾過の技法によって）、その後の精製に必要とされるように濃縮し、又は希釈し得る。次いで粒子／標的の複合体の形成を可能にするのに十分な時間、バイオポリマー粒子の集団に原料液を接触させる。
一般に、標的の望ましい比率がバイオポリマー粒子と結合するのに十分な時間、原料液をバイオポリマー粒子と接触させる。たとえば、撹拌又は接線流濾過システムを介した処理による原料液とバイオポリマー粒子の混合は通常、最適な接触及び標的の結合を保証するのに有利である。
粒子：標的の複合体は接線流濾過システムを介して循環するので、接線流フィルターを介して、（ａ）複合体が濃縮され、（ｂ）透析濾過液（通常、粒子：標的の複合体から非特異的に結合した混入物質を解離するように選択される）に対して複合体が透析濾過され、（ｃ）標的物質が粒子から溶出され（通常、粒子／標的物質複合体を解離する第２の透析濾過液による透析濾過によって）、（ｄ）次いで標的物質がバイオポリマー粒子から分離され（たとえば、標的物質が透析濾過される）、それによって精製された標的物質を回収する。標的物質は任意でさらに、たとえば、濃縮によって（ｅ）処理され得る。
図３に示すさらなる例となる実施形態では、原料液は標的物質の前駆体、たとえば、その生成物が所望の標的物質である、酵素の基質を含む。この実施形態では、前駆体物質を含む原料液を、前駆体の標的物質への変換を触媒することが可能である１以上の酵素を含む１以上のバイオポリマー粒子と接触させる。上述したように、複合体、この場合、粒子：酵素／基質複合体を形成するのに十分な時間、原料液とバイオポリマー粒子を接触させる。バイオポリマー粒子が結合する前駆体の所望の比率を可能にする、及び前駆体分子の標的物質への変換を可能にするのに十分な時間、原料液とバイオポリマー粒子の混合を維持する。
図４は、本発明の方法を用いた標的物質の精製のための一般スキームを示し、その際、バイオポリマー粒子を用いて１以上の混入物質の除去によって標的物質を濃縮する。この場合、原料液に存在する１以上の混入物質を結合することが可能であるポリマー粒子の１以上の集団と原料液を接触させる。ここでは、粒子：混入物質の複合体の形成が、次いでさらに処理され得る（たとえば、本明細書で記載されるような本発明の１以上の接線流法を介して）標的物質の透析濾過を可能にする。透析濾過（通常、第２の透析濾過液による）は、粒子：混入物質の複合体の解離を可能にし、その際、バイオポリマー粒子はさらなる使用のために再循環され得る。
従って、当業者は、本発明の種々の実施形態（上記で概説したそれら代表的な例を含む）が、使用される特定の遠心又はポリマー粒子の特定の集団に応じて、リテンテート又は透過液のいずれかで接線流濾過システムから所望の標的物質を溶出することを企図することを認識するであろう。
原料物質
本発明は原料物質からの標的物質の調製に関する。「原料物質」は本明細書で使用されるとき、少なくとも１、頻繁には１を超える物質、普通、生物物質、又は原料物質に存在する他の物質から抽出される又は精製されることが求められる価値ある生成物を含有する物質、通常、液体を指す。一般に、原料物質は、たとえば、水溶液、有機溶媒系、又は水性／有機系の溶媒混合物又は溶液であり得る。原料物質は、たとえば、タンパク質、抗体、ホルモン、及びウイルスと同様にたとえば、塩、糖、脂質等のような小分子のような多数の生体分子を含有する複雑な混合物又は溶液であることが多い。生体起源の典型的な原料物質が水性の溶液又は懸濁液として始まる一方で、それはまた、溶媒沈殿や抽出等のような前の分離工程で使用した有機溶媒も含有し得る。本発明の精製方法に適する有益な生体物質を含有し得る原料液の例には、生体反応器に由来する培養上清、均質化した細胞浮遊液、血漿、血漿分画、及び乳、初乳、たとえば、チーズ乳清のような乳清のような乳加工ストリームが挙げられるが、これらに限定されない。
種々の実施形態では、原料物質は、血清、血漿、血漿分画、全血、乳、初乳、乳清、細胞流体、組織培養流体、植物細胞流体、植物細胞ホモジネート及び組織ホモジネートから成る群から選択される１以上の液体を含む。たとえば、原料物質は、たとえば、果実ジュース又は野菜ジュースのような植物抽出物である。発酵物は、培養物又は培養上清、特にたとえば、１以上のモノクローナル抗体のような１以上の組換えタンパク質を発現する培養物のもののように特に熟考される。
他の実施形態では、原料物質は本発明のポリマー粒子を含む、生体反応器からの培養上清を含む。当業者は、そのような原料物質が特定の状況では混入物質とみなされ得る有意な量の他の生体材料を含むことを認識するであろう。たとえば、例となる一実施形態では、原料物質は本発明のポリマー粒子を作出するのに使用される細菌を含む培養上清又は細胞調製物である。別の例となる一実施形態では、原料物質は本発明のポリマー粒子を産生する細胞からの及び１以上の標的物質又はその前駆体を産生する細胞からの培養上清又は細胞調製物である。特定の実施形態では、原料物質は、本発明のポリマー粒子及び１以上の標的物質又はその前駆体の双方を産生する細胞の集団を含む培養上清又は細胞調製物である。
標的物質
上記のように、本発明は、標的物質の前駆体を含む原料物質を含む原料物質からの標的物質の調製に関する。用語「標的物質」は本明細書で使用されるとき、原料液から調製される若しくは精製される１以上の所望の生成物（単数）又は生成物（複数）を指す。標的物質は通常、価値ある生体生成物、たとえば、免疫グロブリン、凝固因子、ワクチン、抗原、抗体、選択されたタンパク質又は糖タンパク質、ペプチド、酵素、代謝産物等である。
種々の実施形態では、標的物質は、ワクチン、凝固因子、免疫グロブリン、抗原、抗体、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、糖類、炭水化物及び酵素から成る群から選択される。
種々の実施形態では、１以上の親和性リガンドは、タンパク質、核酸、ウイルス、糖類、炭水化物、免疫グロブリン、凝固因子、糖タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、ホルモン又はポリヌクレオチドから成る群から選択される標的種の少なくとも１つを結合する。
しかしながら、本発明は、本明細書で記載されるポリマー粒子と会合し得る機能性部分の多様性の認識の際、十分に理解されるように、通常「生物学的」とみなされるもの以外の他種多様な標的物質の調製に適用を見つけている。たとえば、本発明のポリマー粒子は、たとえば、ポリマーシンターゼ：金属結合ポリペプチドの融合ポリペプチドの発現によって、金属又は金属イオン配位ポリペプチドのような金属又は金属イオン結合部分によって好都合に官能化され得る。実際、ポリマー粒子を含むポリマー形成タンパク質又はポリマー結合タンパク質に１以上のタンパク質官能性を融合する能力は、非常に多様な範囲の標的物質の調製における適用を可能にする。
１以上の発現構築物の使用を含む、当該技術で周知のバイオテクノロジー法を用いて本発明のバイオポリマー粒子を含む融合ポリペプチドを好都合に作出し得る。特定の実施形態では、本発明のバイオポリマー粒子を含む融合ポリペプチド及びバイオポリマー粒子それ自体が本明細書で企図されるような標的物質である。
発現構築物
微生物、植物細胞又は動物細胞（細胞発現系）又は無細胞発現系にて融合ポリペプチドの発現のための発現構築物を作出し、使用する方法、及び本発明での使用のためのポリマー粒子を形成するのに有用な発現構築物を含む宿主細胞は当該技術で周知である（たとえば、Sambrook et al., 1987; Ausubel et al., 1987）。
本発明の方法で使用するための発現構築物は、一実施形態では、クローニング用の若しくは発現用の複製可能なベクターに挿入され、別の実施形態では、宿主のゲノムに組み入れられる。種々のベクターが公的に利用可能である。ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態である。種々の手順によって適当な核酸配列をベクターに挿入することができる。一般に、当該技術で既知の技法を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位にＤＮＡを挿入する。ベクター成分には一般に、シグナル配列の１以上、複製開始点、１以上の選抜可能なマーカー遺伝子、エンハンサ要素、プロモータ及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。これら成分の１以上を含有する好適なベクターの構築は当該技術で既知の標準のライゲーション法を採用する。
発現ベクター及びクローニングベクターは双方とも、１以上の選択された宿主細胞でベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含有する。そのような配列は種々の細菌、酵母及びウイルスについて周知である。
一実施形態では、発現構築物はコピー数の多いベクターで存在する。
一実施形態では、コピー数の多いベクターは宿主細胞当たり２０〜３００コピーで存在するものから選択される。
一実施形態では、コピー数の多いベクターは、たとえば、ＣｏｌＥ１又はＣｏｌＥ１に由来する複製開始点のようなコピー数の多い複製開始点（ｏｒｉ）を含有する。たとえば、ＣｏｌＥ１に由来する複製開始点はｐＵＣ１９の複製開始点を含み得る。
本発明のベクターで使用するのに好適な膨大なコピー数の複製開始点は当業者に既知である。これらには、ｐＢＲ３２２からのＣｏｌＥ１に由来する複製開始点と同様にＭ１３ＦＲｏｒｉ又はｐ１５Ａｏｒｉのような他のコピー数の複製開始点が挙げられる。２μのプラスミド開始点が酵母に好適であり、種々のウイルス（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）の開始点は哺乳類細胞でベクターをクローニングするのに有用である。
好ましくは、コピー数の多い複製開始点は、ＣｏｌＥ１由来のｐＵＣ１９の複製開始点を含む。
制限部位は、制限部位への挿入物のクローニングが開始点を不活化し、ベクターの複製の方向付けを不可能にするように複製開始点にて位置づけられる。或いは、少なくとも１つの制限部位は、制限部位への挿入物のクローニングがベクターのコピー数の少ない又は単一コピー数の複製のみを支えるのを可能にするように開始点の中に位置づけられる。
発現ベクター及びクローニングベクターは通常、選抜可能なマーカーとも呼ばれる選抜遺伝子を含有して形質転換した宿主細胞におけるベクターの存在を検出する。典型的な選抜遺伝子は、（ａ）たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メソトレキセート又はテトラサイクリンのような抗生剤又は他の毒素に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性の欠損を補う、又は（ｃ）複雑な培地からは利用できない決定的な栄養、たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓに対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
植物の形質転換に一般に使用される選抜可能なマーカーには、ネオマイシン、カナマイシン耐性を付与するホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンへの耐性を付与するａａｄＡ遺伝子、Ｉｇｎｉｔｅ（ＡｇｒＥｖｏ）に対するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ遺伝子）及びＢａｓｔａ（ヘキスト）耐性、及びハイグロマイシン耐性用のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）が挙げられる。
哺乳類細胞用の好適な選抜可能なマーカーの例は、たとえば、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼのような発現構築物を取り上げるのに適した細胞の特定を可能にするものである。野生型ＤＨＦＲが採用される場合、適当な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら、１９８０が調製し、普及させた、ＤＨＦＲ活性を欠損したＧＨＯ細胞株である。酵母で使用するのに好適な選抜可能なマーカーは酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンで増殖する能力を欠いている酵母の変異株、たとえば、ＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１ [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]のための選抜マーカーを提供する。
ポリマー粒子を形成するのに有用な発現構築物には好ましくは、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質又は融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸の発現を制御するプロモータが含まれる。
種々の考えられる宿主細胞によって認識されるプロモータは周知である。原核細胞宿主での使用に好適なプロモータには、β−ラクタマーゼ及びラクトースのプロモータ系（Chang et al., 1978; Goeddel et al., 1979）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）のプロモータ系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776）及びｔａｃプロモータのようなハイブリッドプロモータ（deBoer et al., 1983）が挙げられる。細菌系で使用するプロモータも、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質又は融合ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結されるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
酵母宿主で使用するのに好適なプロモータ配列の例には、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzeman et al., 1980）又は他の解糖酵素（Hess et al., 1968; Holland, 1978）、たとえば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモータが挙げられる。
増殖条件によって制御される転写の追加の利点を有する誘導可能なプロモータである他の酵母のプロモータは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、及びマルトースとガラクトースの利用に関与する酵素のためのプロモータ領域である。
単子葉植物及び双子葉植物の組織及び器官を含む植物宿主細胞での使用に好適なプロモータの例には、細胞−、組織−及び器官−特異的なプロモータ、細胞周期特異的なプロモータ、一時的なプロモータ、誘導可能なプロモータ、ほとんどの植物細胞で活性がある構成的プロモータ、及び組換えプロモータが挙げられる。プロモータの選択はそのように所望されるクローニングしたポリヌクレオチドの時間的な及び空間的な発現に左右される。プロモータは、宿主細胞に由来するもの、又は他の植物、ウイルス及び植物に病原性の細菌及び真菌の遺伝子に由来するプロモータである。当業者は、過度の実験を行うことなく、本発明のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を用いた発現構築物を修飾する及び調節することに使用するのに好適であるプロモータを選択することができるであろう。構成的な植物プロモータの例には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、ノパリンシンターゼのプロモータ、及びオクトピンシンターゼのプロモータ、トウモロコシ由来のＵｂｉ１プロモータが挙げられる。特定の組織で活性があり、内部の発生シグナル又は外部の生命のない若しくは生命のあるストレスに応答する植物プロモータは科学文献に記載されている。例となるプロモータは、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ０２／００８９４に記載されている。
哺乳類宿主細胞で使用するのに好適なプロモータの例は、そのようなプロモータが宿主細胞系で適合性であるという条件で、たとえば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（たとえば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるもの、非相同の哺乳類プロモータ、たとえば、アクチンプロモータ又は免疫グロブリンプロモータに由来するもの、及び熱ショックプロモータに由来するものを含む。
高等真核細胞による発現構築物の転写は、場合によっては、ベクターにエンハンサ配列を挿入することによって高められる。エンハンサは、プロモータに作用してその転写を高める普通、約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性の要素である。多数のエンハンサ配列が哺乳類遺伝子から今や知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、及びインスリン）。しかしながら、通常、ヒトは真核細胞ウイルス由来のエンハンサを使用するであろう。例には、複製開始点の後ろ側のＳＶ４０エンハンサ（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルスの早期プロモータのエンハンサ、複製開始点の後ろ側のポリオーマエンハンサ及びアデノウイルスエンハンサが挙げられる。通常、エンハンサは、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質又は融合ポリペプチドをコードする配列に対して５’位又は３’位でベクターにスプライスされるが、好ましくはプロモータから５’部位に位置する。
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物に由来する有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＡＮを安定化させるのに必要な配列も含有する。そのような配列は真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び時には３’の非翻訳領域から一般に入手できる。これらの領域は、ポリマーシンターゼ、粒子形成タンパク質又は融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳領域にてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチド断片を含有する。
一実施形態では、発現構築物はアラビノースによって誘導されるＢＡＤプロモータのような上流で誘導可能なプロモータを含む。
一実施形態では、発現構築物は、構成的な又は調節可能なプロモータ系を含む。
一実施形態では、調節可能なプロモータ系は誘導可能な又は抑制可能なプロモータ系である。
組換えタンパク質の産生では強力なプロモータを使用することが望ましい一方で、非相同のタンパク質の構成的な過剰産生は増殖率、プラスミドの安定性及び培養物の生存率の低下につながるので、それらプロモータの調節は必須である。
リプレッサタンパク質のオペレータ（プロモータから下流の領域）との相互作用によって多数のプロモータが調節される。最も周知のオペレータはｌａｃオペロンに由来するもの及びバクテリオファージＡに由来するものである。大腸菌における調節されたプロモータの概説は、Ｆｒｉｅｈｓ及びＲｅａｒｄｏｎ、１９９１の表１に提供されている。
標準の細菌培養と組換え大腸菌が関与するものとの間の主な差異は、増殖相と産生相又は誘導相の分離である。組換えタンパク質の産生は、増殖相（プロモータが「オフ」であり、宿主細胞への代謝負荷が軽い）にて高い細胞密度及び次いで誘導相（誘導に続いてプロモータを「オン」にする）にて非相同タンパク質の産生の高い比率を達成する調節されたプロモータを利用することが多い。
一実施形態では、調節可能なプロモータ系はＬａｃＩ、Ｔｒｐ、ファージγ及びファージＲＮＡポリメラーゼから選択される。
一実施形態では、プロモータ系はｌａｃ又はＰｔａｃプロモータ及びｌａｃＩリプレッサ、又はｔｒｐプロモータ及びＴｒｐＲリプレッサから選択される。
一実施形態では、活性のあるリプレッサに結合してオペレータからの解離を生じ、発現を可能にするイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によってＬａｃＩリプレッサを不活化する。
一実施形態では、ｔｒｐプロモータ系は、濃度が閾値レベルを下回ると、系が自己誘導性になるように、規定されたトリプトファン濃度の合成培地を使用する。一実施形態では、３−β−インドール−アクリル酸を添加してＴｒｐＲリプレッサを不活化する。
一実施形態では、プロモータ系は、バクテリオファージγのリプレッサｃＩを使用し得る。このリプレッサは、γプロファージを使用し、ＯＬ及びＯＲと呼ばれる２つのオペレータと相互作用することによって溶解遺伝子すべての発現を妨害する。これらのオペレータはそれぞれ、２つの強力なプロモータＰＬ及びＰＲと重複する。ｃＩリプレッサの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼの結合が妨害される。ＵＶ照射又はマイトマイシンＣによる細胞の処理によってｃＩリプレッサを不活化することができる。組換えポリペプチドの発現を可能にするさらに好都合な方法は、ｃＩリプレッサｃＩ８５７の温度感受性版の適用である。γに基づく発現系を持つ宿主細胞は、低温で指数関数増殖期の中間まで増殖することができ、次いで高温に移して組換えポリペプチドの発現を誘導する。
広く使用されている発現系は、Ｔ７ＤＮＡ上で見られるプロモータのみを認識し、宿主細胞の染色体に存在するプロモータを認識しないファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する。従って、発現構築物は組換え遺伝子が融合されるＴ７プロモータ（通常、遺伝子１０の前に存在するプロモータ）の１つを含有し得る。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は発現構築物に存在するか、第２の適合性の発現構築物に存在するか、又は宿主細胞の染色体に統合される。３つの場合すべてにおいて、遺伝子は誘導可能なプロモータに融合されて発現相の間、その転写及び翻訳を可能にする。
大腸菌の株、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（カリフォルニア州、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を運ぶ宿主細胞の例である（たとえば、ＫＲＸ及びＸＪ（自己融解）のようなＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を抱く、さらに２、３の非常に好適な、市販の大腸菌の株がある）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を運ぶ他の細胞株、たとえば、ゲノムに統合されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を抱くＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＤＤ１９７６（Brunschwig & Darzins, 1992）、及びｐｈａＰプロモータの制御下（Barnard et al., 2004）でゲノムに統合されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を抱くＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）が当該技術で既知である。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、宿主細胞の酵素に対して３つの利点を提供する。第１にそれはたった１つのサブユニットから成り、第２にそれは高い処理能力を発揮し、第３にそれはリファンピシンに対して非感受性である。後者の特徴を特に用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の誘導後、約１０分にこの抗生剤を加えることによって融合ポリペプチドの量を高めることができる。その時間の間、十分なポリメラーゼが合成されて融合ポリペプチドの高レベルの発現を可能にし、宿主細胞の酵素の阻害はプラスミド及び染色体双方に存在する他の遺伝子すべてのさらなる発現を妨げる。たとえば、ストレプトリジギン及びストレプトバリシンのような細菌ＲＮＡポリメラーゼを阻害するが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害しない他の抗生剤は当該技術で既知である。
プロモータ系はすべて漏れやすいので、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の低レベルの発現は、組換えポリペプチドが毒性タンパク質をコードする場合、細胞に有害であり得る。増殖相の間に存在するこれらのポリメラーゼ分子はリゾチームに対してＴ７をコードする遺伝子を発現させることによって阻害することができる。この酵素は、宿主細胞における細胞壁の結合を切断し、それに結合することによって、Ｔ７感染の間転写の制御されたバーストを保証するフィードバック機構によってＴ７ＲＮＡポリメラーゼを選択的に阻害する二官能性タンパク質である。大腸菌株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳはＴ７リゾチームを構成的に発現するプラスミドｐＬｙｓＳを運ぶ宿主細胞の例である。
一実施形態では、プロモータ系は、温度シフトによって誘導され、又はスイッチが入れられ誘導サイクルを開始する、たとえば、約３０〜３７℃から４２℃に温度を上げることによって誘導サイクルを開始するＡＰＩ又はＡＰＲのようなプロモータを使用する。
強力なプロモータは生体内産生の間、粒子の表面で融合ポリペプチドの密度を高め得る。
本発明の一実施形態で使用される好まれる融合ポリペプチドは、（ｉ）ポリマーシンターゼ及び（ｉｉ）少なくとも１つの抗体結合ドメインを含む融合パートナーを含む。
本明細書で使用するための（ｉ）及び（ｉｉ）双方をコードする核酸配列は、ポリマーシンターゼをコードする核酸と少なくとも１つの抗体結合ドメインを含む融合パートナーをコードする核酸を含む。いったん発現されると、融合ポリペプチドはポリマー粒子を形成することができ、又はポリマー粒子の形成を促進することができる。
一実施形態では、少なくとも１つのポリマーシンターゼをコードする核酸配列は、所望の長さのポリヌクレオチドのリンカー又はスペーサーの配列を介して、粒子形成タンパク質をコードする核酸配列又は融合パートナーをコードする核酸配列と間接的に融合される。
一実施形態では、少なくとも１つ融合パートナーをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列はポリマーシンターゼを含むアミノ酸配列のＣ末端に隣接する。
一実施形態では、少なくとも１つ融合パートナーを含む融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの無関係な折り畳みを促進する所望の長さのペプチドのリンカー又はスペーサーを介してポリマーシンターゼ断片を含むアミノ酸配列のＮ末端に間接的に融合される。
一実施形態では、少なくとも１つ融合パートナーをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、粒子形成タンパク質を含むアミノ酸配列のＮ末端、又はＣ末端シンターゼ断片と隣接する。
一実施形態では、少なくとも１つ融合パートナーをコードする融合タンパク質のアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの無関係な折り畳みを促進する所望の長さのペプチドのリンカー又はスペーサーを介して、粒子形成タンパク質を含むアミノ酸配列のＣ末端、又はＮ末端シンターゼ断片に間接的に融合される。
一実施形態では、少なくとも１つ融合パートナーをコードする融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、デポリメラーゼをコードするアミノ酸配列のＮ末端、又はＣ末端デポリメラーゼ断片と隣接する。
本発明に係る融合ポリペプチドの利点の１つは、ポリマー粒子の表面に結合するタンパク質の修飾がポリマー粒子の形成に関与するタンパク質の官能性に影響を及ぼさないことである。たとえば、組換えポリペプチドがそのＮ末端に融合して粒子の表面に組換えポリペプチドを生じたとしてもポリマーシンターゼの官能性は保持される。それにもかかわらず、タンパク質の官能性が融合によって損なわれるのであれば、この欠点は同じ機能を実行し、活性状態で存在する追加の粒子形成タンパク質の存在によって相殺される。
この方法で、粒子形成タンパク質を介してポリマー粒子に結合する組換えポリペプチドの安定した結合を保証すること可能である。
融合ポリペプチドにおけるタンパク質の配置は、プラスミドに含有される核酸の遺伝子配列の順に左右されることが十分に理解されるべきである。
たとえば、融合パートナーがポリマーシンターゼに間接的に融合される融合ポリペプチドを作出することが望ましくてもよい。用語「間接的に融合される」は、融合ポリペプチドで発現されることが望まれるタンパク質であり得る追加のタンパク質によって分離される、粒子形成タンパク質、好ましくはポリマーシンターゼ及び少なくとも１つの融合パートナーを含む融合ポリペプチドを指す。
一実施形態では、追加のタンパク質は、粒子形成タンパク質、又は融合ポリペプチド、又は上記で議論したような融合ポリペプチドの無関係な折り畳みを促進するリンカー又はスペーサーから選択される。この実施形態では、プラスミドにおける遺伝子の配列を順に並べて融合ポリペプチドの所望の配置を反映することは必要である。
一実施形態では、融合パートナーはポリマーシンターゼに直接融合される。用語「直接融合される」は、２以上のペプチドがペプチド結合を介して連結されることを示すように本明細書で使用される。
粒子がポリマー粒子に結合する少なくとも２つの異なる融合ポリペプチドを含む粒子を形成することが可能であってもよい。ポリマーシンターゼに融合された少なくとも１つの酵素を結合することが可能である結合ドメインを含む第１の融合ポリペプチドが、ポリマー粒子に結合すればよく、酵素を含む第２の融合ポリペプチドがポリマー粒子に結合すればよい。
一実施形態では、発現構築物は生体内で発現される。好ましくは、発現構築物は、微生物、好ましくは大腸菌で発現されるプラスミドである。
一実施形態では、発現構築物は試験管内で発現される。好ましくは、発現構築物は、無細胞発現系を用いて試験管内で発現される。
一実施形態では、１以上の遺伝子を単一の発現構築物に挿入することができ、又は１以上の遺伝子を宿主細胞ゲノムに統合することができる。あらゆる場合、発現は上述したようなプロモータを介して制御することができる。
一実施形態では、発現構築物はさらに、細胞介在性の免疫応答を誘発することが可能である抗原又は細胞介在性の免疫応答を誘発することが可能である少なくとも１つの抗原を結合することが可能である結合ドメイン、及び粒子形成タンパク質、好ましくは上記で議論したようなポリマーシンターゼを含む少なくとも１つの追加の融合ポリペプチドをコードする。
本明細書で有用なプラスミドは実施例で示され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００４／０２０６２３（Ｂｅｒｎｄ Ｒｅｈｍ）として公表されたＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９及びＷＯ２００７／０３７７０６（Ｂｅｒｎｄ Ｒｅｈｍ）として公表されたＰＣＴ／ＮＺ２００６／０００２５１に詳細に記載されている。
粒子作出用の宿主
本発明の粒子は、本明細書で記載されるような１以上の発現構築物を用いて宿主細胞にて好都合に作出される。本発明のポリマー粒子は宿主細胞が発現構築物を発現するのを可能にすることによって作出される。これは、先ず、たとえば、宿主細胞又は宿主細胞の前駆細胞を形質転換する又はそれに形質移入することにより宿主細胞又は宿主細胞の前駆細胞に発現構築物を導入すること、又はさもなければ、発現構築物が宿主細胞に存在することを確実にすることによって達成することができる。
形質転換に続いて、発現構築物からの融合ポリペプチドの発現及びポリマー粒子の形成に好適な条件下で形質転換した宿主細胞を維持する。そのような条件は、当該技術で知られるように好適な生物におけるプラスミドのような選択された発現構築物の発現に好適なものを含む。たとえば、及び特に、高い収率又は過剰発現が望ましい場合、培養培地における好適な基質の提供は融合ポリペプチドの粒子形成タンパク質成分がポリマー粒子を形成するのを可能にする。
好ましくは、宿主細胞は、たとえば、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は動物細胞であり、好ましくは単離された又は非ヒト宿主細胞である。組換えポリマー粒子の作出のための当該技術（たとえば、Sambrook et al., 1987; Ausubel et al., 1987）で周知の方法にて有用な宿主細胞は、本明細書で議論される考慮を念頭に置いて、本発明の方法での使用に好適であることが多い。
好適な原核生物宿主細胞は、たとえば、グラム陰性又はグラム陽性の生物、たとえば、大腸菌のようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのような真正細菌を含む。たとえば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）のような種々の大腸菌株が公的に利用可能である。他の好適な原核生物宿主細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．のような他のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、たとえば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、たとえば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、並びにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのようなＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｕｃｈ、並びにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのようなＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｕｃｈ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ並びにＭｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍが挙げられる。
一部の実施形態では、たとえば、それが組換えＤＮＡ産物の発酵用の一般的な宿主株であるので、大腸菌株Ｗ３１１０を使用してもよい。好ましくは、宿主細胞は最少限の量のタンパク質分解酵素を分泌する。たとえば、Ｗ３１１０株は、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子にて遺伝子変異を達成するように修飾され、そのような宿主の例には、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５、２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を伴った株３７Ｄ６である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４が挙げられる。
好まれる一部の実施形態では、たとえば、リポ多糖類エンドトキシンを産生しない Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株を使用してもよい。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株の例にはＭＧ１３６３及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓＮＺ９０００が挙げられる。
原核生物に加えて、たとえば、糸状菌又は酵母のような真核微生物は本発明の方法で使用するのに好適なクローニング宿主又は発現宿主である。例には、一般に使用される下等真核宿主微生物であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる。他の例には、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Beach and Nurse, 1981; EP 139,383）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ（米国特許第４，９４３，５２９号; Fleer et al., 1991）たとえば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４; Louvencourt et al., 1983）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６；Van den Berg et al, 1990)，Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０; Sreekrishna et al., 1988）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Case et al., 1979）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、たとえば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日に公開されたＥＰ３９４，５３８）；糸状菌、たとえば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ９１／００３５７）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、たとえば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ballance et al., 1983; Tilburn et al., 1983; Yelton et al., 1984)）及びＡ．ｎｉｇｅｒ（Kelly and Hynes, 1985）が挙げられる。メタノール資化性酵母は本明細書で好適であり、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａから成る属から選択されるメタノールで増殖することが可能である酵母を含む。酵母のこの部類の例となる具体的な種のリストはＡｎｔｈｏｎｙ、１９８２で見つけられ得る。
非脊椎動物宿主細胞の例には、たとえば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９のような昆虫細胞、並びにたとえば、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養のような植物細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び、たとえば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのような宿主からの種々の、相当する許容できる宿主細胞が特定されている。たとえば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株のような形質移入用の種々のウイルス株は公的に利用可能であり、そのようなウイルスは、本発明に係る本明細書のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の形質移入に使用され得る。
哺乳類の宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（浮遊培養での増殖のために継代した２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ：ＣＣＬ３４）；スイギュウネズミ肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ：ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
真核生物細胞株、たとえば、哺乳類細胞株は、たとえば、酵素又は抗体結合ドメインのような融合パートナーが、たとえば、糖化のような１以上の翻訳後修飾を必要とする場合、好まれるであろう。たとえば、１以上の酵素は最適に活性があるように翻訳後修飾を必要としてもよいので、普通、そのような翻訳後修飾が可能である発現宿主で発現され得る。
一実施形態では、宿主細胞は酸化する細胞質ゾルを伴った細胞、たとえば、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
別の実施形態では、宿主細胞は還元する細胞質ゾルを伴った細胞、好ましくは大腸菌である。
宿主細胞は、たとえば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ａｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びＨａｌｏｂｉｆｏｒｍａを含む属から選択され得る。好ましくは使用される微生物は、たとえば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、及びＨａｌｏｂｉｆｏｒｍａ ｈａｌｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉsを含む群から選択される。この群は、生体適合性で生分解性の粒子を天然に産出する微生物及びたとえば、大腸菌のようにその遺伝的性質のためにそのようにすることができない微生物双方を含む。後者の状態の微生物が粒子を産出するのを可能にするのに必要とされる遺伝子は上述のように導入される。
例となる好塩性古細菌は、タンパク質の低レベルで非特異的な結合を伴うポリマー粒子を産出し、細胞からの粒子のさらに容易な単離及び精製を可能にする。
原則として、宿主細胞が異なる代謝のためにポリマー粒子を形成するのに必要とされる基質を産生できないとしても上述の方法によってポリマー粒子を産出するのに任意の培養可能な宿主細胞を使用し得る。そのような場合、必要な基質を培養培地に加え、次いで細胞に導入しておいた遺伝子によって発現されているタンパク質によってポリマー粒子に変換する。
後者の状態の宿主細胞がポリマー粒子を産出するのを可能にするのに利用される遺伝子には、たとえば、チオラーゼ、レダクターゼ又はポリマーシンターゼ、たとえば、ｐｈａＡチオラーゼ、ケトアシルレダクターゼ又はＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈａＣシンターゼが挙げられる。ポリマー粒子の形成のために宿主細胞が欠いているものを増強するのにどの遺伝子を使用するかは、宿主細胞の遺伝的性質及びどの基質が培養培地に提供されるかに左右される。
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）粒子の形成に関与する遺伝子とタンパク質、及び粒子形成についての一般的な検討は、Ｍａｄｉｓｏｎら、１９９９；公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ２００４／０２０６２３（Ｂｅｒｎｄ Ｒｅｈｍ）；及びＲｅｈｍ，２００３；Ｂｒｏｃｋｅｌｂａｎｋ、ＪＡ．ら、２００６；Ｐｅｔｅｒｓ及びＲｅｈｍ，２００６；Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、（２００６）並びにＲｅｈｍ，（２００６）で報告されており、そのすべてを参照によって本明細書に組み入れる。
基質として（Ｒ）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ又は他のＣｏＡチオエステル又はその誘導体を伴う任意の宿主細胞ではポリマーシンターゼのみを使用することができる。
ポリマー粒子はまた試験管内でも形成することができる。好ましくは、たとえば、無細胞発現系を使用する。そのような系では、ポリマーシンターゼが提供される。組換え生産から、又はタンパク質の翻訳が可能な無細胞系にて入手可能なもの、ポリマーシンターゼをコードする発現構築物の導入によって無細胞系自体にて入手可能なもののような精製されたポリマーシンターゼが好まれるであろう。試験管内での粒子の形成を可能にする環境を作るためにポリマー粒子の形成に必要な基質は培地に含まれるべきである。
たとえば、（Ｒ）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ又は他のＣｏＡチオエステルを基質として用いた官能化されたポリマー粒子の試験管内作出のためにポリマーシンターゼを使用することができる。
ポリマー粒子の試験管内作出に先立って、セルソーター、遠心、濾過又はアフィニティクロマトグラフィを用いて、溶解した細胞から融合ポリペプチドを精製することができる。
ポリマー粒子の試験管内での形成によって、融合ポリペプチドの被覆率のレベル、リン脂質の組成等を含む表面組成の最適な制御が可能になる。
ポリマー粒子を作出する条件を制御することによってポリマー粒子の特徴に影響を与え得る又はそれを制御し得ることが十分に理解されるであろう。これには、たとえば、宿主細胞の遺伝的性質、たとえば、Ｐｅｔｅｒｓ及びＲｅｈｍ，２００５で議論されたような大型の顆粒を産生する細胞分裂変異が含まれる。宿主細胞が維持される条件、たとえば、温度、基質の存在、１以上の粒子サイズ決定タンパク質のような粒子形成タンパク質の存在、ポリマー調節因子の存在など。
一実施形態では、ポリマー粒子の望ましい特徴は、それが永続性であるということである。用語「永続性」は、選択された環境で分解に耐性であるポリマー粒子の能力を指す。ポリマー粒子の追加の望ましい特徴は、それがポリマーシンターゼ又は粒子形成タンパク質から形成され、粒子の集合の間、ポリマーシンターゼ又は粒子形成タンパク質のＣ末端又はＮ末端に結合することである。
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞における発現構築物の過剰発現を達成することが望ましい。特定の発現構築物を過剰に発現するメカニズムは当該技術で周知であり、構築物自体、それが発現されるべき宿主、及び望まれる又は必要とされる過剰発現の程度を含む他の因子に左右される。たとえば、過剰発現は、（ｉ）原核生物宿主における強力なプロモータ系、たとえば、Ｔ７ＲＮＡプロモータ系の使用、（ｉｉ）コピー数の多いプラスミド、たとえば、ＣｏｌＥ１複製開始点を含有するプラスミドの使用、又は（ｉｉｉ）たとえば、融合配列の使用を介したメッセンジャーＲＮＡの安定化、又は（ｉｖ）リボゾーム結合部位又は終結部位等のコドン使用頻度の最適化を介した翻訳の最適化によって達成することができる。過剰発現の利益によってさらに多数のポリマー粒子の産生が望ましい場合、さらに小さな粒子の産生を可能にする。
ポリマー粒子を形成するポリマーの組成はポリマー粒子の機械的な特性又は物理化学的な特性に影響を及ぼし得る。たとえば、そのポリマーの組成が異なるポリマー粒子は、半減期が異なり得るし、又は生物学的に活性のある物質、特に医薬活性成分を異なった速度で放出し得る。たとえば、Ｃ6〜Ｃ14の３−ヒドロキシ脂肪酸で構成されたポリマー粒子はポリマーの結晶度が低いので速い速度のポリマー分解を示す。ポリマー主鎖上での相対的に大きな側鎖を伴うポリマー成分のモル比の上昇は普通、結晶度を低下させ、さらに顕著なエラストマー特性を生じる。本明細書で記載され、当該技術で既知の方法に従ってポリマー組成を制御することによって、ポリマー粒子の生分解性に影響を与えるので、ポリマー粒子の持続時間に影響を及ぼす（及び存在する場合、１以上の融合パートナーは、たとえば、接線流濾過システムにて、又は結合、触媒に影響を及ぼすように、又は１以上の標的物質又はポリマー粒子に対する、その上の若しくはそれからのその前駆体を放出するように維持される）。
官能性の側基を持つ少なくとも１つの脂肪酸がポリマー粒子の形成のための基質として培養培地に好ましくは導入され、少なくとも１つのヒドロキシ脂肪酸及び／又は少なくとも１つのメルカプト脂肪酸及び／又は少なくとも１つのβ−アミノ脂肪酸が特に好ましくは導入される。「官能性の側基を持つ脂肪酸」は飽和又は不飽和の脂肪酸を意味するように解釈されるべきである。これらにはまた、メチル基、アルキル基、ヒドロキシル基、フェニル基、スルホヒドリル基、１級、２級及び３級のアミノ基、アルデヒド基、ケト基、エーテル基、カルボキシル基、Ｏ−エステル基、チオエステル基、カルボン酸アミド基、ヘミアセタール基、アセタール基、リン酸一エステル基、及びリン酸二エステル基を含む群から選択される官能性の側基を含有する脂肪酸が挙げられる。ポリマー粒子所望の組成及び所望の特性によって基質の使用が決定される。
基質及び基質混合物は、少なくとも１つの任意で置換されたアミノ酸、乳酸塩、エステル又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸、好ましくはアセチル−ＣｏＡを含み得る。
一実施形態では、基質混合物にて１以上の物質が提供され、ポリマー粒子の形成の間にポリマー粒子に導入され、又はポリマー粒子に拡散するのを可能にされる。
ポリマー粒子は、たとえば、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリアセテート、ポリチオエステル及びポリエステルから選択されるポリマーを含む。最も好ましくは、ポリマーはポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、好ましくはポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を含む。
ポリマーシンターゼ又はポリマー粒子は、好ましくはポリマー粒子を被包するリン脂質単層を含む。好ましくは、前記粒子形成タンパク質は前記脂質単層を跨ぐ。
ポリマーシンターゼ又は粒子形成タンパク質は好ましくはポリマー粒子又はリン脂質単層に結合し、又は双方に結合する。
粒子形成タンパク質は好ましくは、それが形成するポリマー粒子に共有結合する又は非共有結合する。
ポリマー粒子の表面積の好ましくは少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％が融合ポリペプチドによって被覆される。
特定の状況では、本発明の方法で作出される粒子のサイズを制御して、たとえば、所与の適用に特に適する粒子を作出することが望ましくてもよい。たとえば、相対的に大きなサイズの１以上の融合パートナーを含むポリマー粒子を作出して、たとえば、堅牢な耐久性を支えることが望ましくてもよい。たとえば、１以上の抗体を調製するのに使用する粒子の文脈で、相対的に大きなサイズの１以上の抗体結合ドメインを含むポリマー粒子を作出して接線流濾過システムにおける耐久性及び機能性を確保することが望ましくてもよい。他の例では、たとえば、標的物質に対する酵素基質の触媒において、相対的に小さなサイズの１以上の酵素を含むポリマー粒子を作出して接線流濾過システムにおける酵素の相対的に高い濃度を可能にすることが望ましくてもよい。ポリマー粒子のサイズを制御する方法は、ＷＯ２００４／０２０６２３として公開されたＰＣＴ／ＤＥ２００３／００２７９９及びＷＯ２００７／０３７７０６として公開されたＰＣＴ／ＮＺ２００６／０００２５１に記載されている。
一部の実施形態では、たとえば、粒子形成タンパク質の発現を制御することによって、又は存在するならば、粒子サイズ決定タンパク質の発現を制御することによって、粒子サイズを制御する。
本発明の他の実施形態では、たとえば、粒子サイズの制御は、基質の利用性、たとえば、培養培地における基質の利用性を制御することによって達成され得る。特定の例では、それがポリマー粒子のサイズの制御を確保するのに十分であるような量で培養培地に基質が加えられ得る。
そのような方法の組み合わせを使用して粒子サイズに一層さらに効果的な制御を発揮する可能性を可能にすることが十分に理解されるであろう。
種々の実施形態では、たとえば、粒子サイズは、約１０ｎｍ〜３μｍ、好ましくは約１０ｎｍ〜約９００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、及び特に好ましくは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する粒子を作出するように制御され得る。
他の実施形態では、たとえば、粒子サイズは、約１０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍ、又は約１０ｎｍ〜約２０ｎｍの直径を有する粒子を作出するように制御され得る。
たとえば、約５０〜約５００ｎｍ、約１５０〜約２５０ｎｍ、又は約１００〜約５００ｎｍ等の直径を有するポリマー粒子のような、上記で言及した範囲の範囲内での範囲を含む平均ポリマーサイズの他の範囲は特に熟考される。
種々の実施形態では、たとえば、作出される粒子の９０％は、約２００ｎｍ以下の直径を有し、８０％は約１５０ｎｍ以下の直径を有し、６０％は約１００ｎｍ以下の直径を有し、４５％は約８０ｎｍ以下の直径を有し、４０％は約６０ｎｍ以下の直径を有し、２５％は約５０ｎｍ以下の直径を有し、５％は約３５ｎｍ以下の直径を有する。
種々の実施形態では、たとえば、方法は約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、又は約１１０ｎｍ未満の平均直径を持つポリマー粒子を作出する。
本発明は、上述にあり、実施例のみを提供するその以下の構成も想定する。
実施例
実施例１：接線流濾過によるＩｇＧの精製
本実施例は、種々の市販の接線流膜と併せて抗体結合ポリペプチドドメインを提示するポリマー粒子を使用してＩｇＧ免疫グロブリンを精製することを記載する。
材料及び方法
濾過はすべてＳａｒｔｏｒｉｕｓ交差流スライス２００システムにて実施した。以下の膜を使用した：それぞれＳａｒｔｏｒｉｕｓ製の０．１μｍのポリエーテルスルホン、０．２μｍのＨｙｄｒｏｓａｒｔ及び１００ｋＤａのＨｙｄｒｏｓａｒｔ。
圧力モニタリング
シグナルを記録し、各点から中央制御装置に送る圧力変換器にＰ１、Ｐ２及びＰ３を接続する。Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は当初、管類の締め付けによって制御し、試行全体を通してそのままにした（水流動及び透析濾過）。従って、膜貫通圧（ＴＭＰ）はポンプ給水速度の自動的な変動によって維持した。
粒子の調製
ｐＥＴ１４ｂ−ＺＺ（−）ｐｈａＣプラスミドを持つ培養大腸菌ＢＬ２１細菌（Brockelbank et al., 2006）によって生物反応器にてＺＺＰｈａＣポリマー粒子を調製した。バイオマスはすべてＢｕｇＢｕｓｔｅｒプロトコールによって溶解し、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５にて３回洗浄した。
５０ｍＬの５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５に２．６９ｇのポリマー粒子を懸濁し、５３．８ｇ／Ｌのポリマー粒子懸濁液を生じた。
５３．８ｇ／Ｌのポリマー粒子懸濁液１５ｍＬを５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５で１００ｍＬにし、８．０７ｇ／Ｌのポリマー粒子懸濁液を生じた。
この８．０７ｇ／Ｌのポリマー粒子懸濁液１００ｍＬを接線流濾過の間で透析濾過に使用した。
浄水透過液流速
ポリマー粒子懸濁液の透析濾過の前後で浄水透過液流速を実施し、フィルター膜の品質をモニターした。
０．０１μｍのフィルター：
透析濾過の前：ＴＭＰ＝１バール、透過液流速＝２７２ｍＬ／分
透析濾過の後、１ＭのＮａＯＨ（４０℃）で１５分間、膜を殺菌し、次いで再び３０分間殺菌し、ＭＱ水ですすいだ。０．１ＭのＮａＯＨを保存のために膜で循環させた。
ＴＭＰ＝１バール、透過液流速＝２４８ｍＬ／分。
０．０２μｍのフィルター：
透析濾過の前：ＴＭＰ＝１．１バール、透過液流速＝２８４ｍＬ／分
透析濾過の後、１ＭのＮａＯＨ（４０℃）で３０分間、膜を殺菌し、次いで再び５０分間、次いで３０分間殺菌し、ＭＱ水ですすいだ。０．１ＭのＮａＯＨを保存のために膜で循環させた。
ＴＭＰ＝１．１バール、透過液流速＝２２８ｍＬ／分。
１００ｋＤａのフィルター：
透析濾過の前：ＴＭＰ＝１．３バール、透過液流速＝１３６ｍＬ／分
透析濾過の後、１ＭのＮａＯＨ（４０℃）で１５分間、膜を殺菌し、ＭＱ水ですすいだ。０．１ＭのＮａＯＨを保存のために膜で循環させた。
ＴＭＰ＝１．３バール、透過液流速＝１２０ｍＬ／分。
透析濾過
２Ｌの５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５で８．０７ｇ／Ｌのポリマー粒子懸濁液１００ｍＬを透析濾過した。２Ｌにおける最後の容量を使い切るまで（およそ１８〜２０分間）、濾過を行った。変動するポンプ給水流速によってＴＭＰを一定に維持した。
結果
リテンテートの解析
ポリマー粒子タンパク質のプロファイルのＳＤＳ／ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色、図５を参照）、ＩｇＧの精製、ＧＣ／ＭＳ（図６を参照）及びＴＥＭ（図７を参照）の解析は、元々の原料物質（それぞれ図６Ａ及び図７Ａ）及び接線流濾過のリテンテート（それぞれ図６Ｂ及び図７Ｂ）で実施した。
見て分かるように、本発明のポリマー粒子によって優れた流速、透過液回収率、及びＩｇＧ免疫グロブリンの最終的に効率の高い精製が達成された。ＧＣ／ＭＳ解析は脂肪酸混入物質の除去を示した。
これらのデータは、本発明のポリマー粒子が、接線流濾過に通常使用される条件下で変形（図７Ｂ参照）又は損傷（図６Ｂ及び図７Ｂ）を受けないことを示している。ＧＣ／ＭＳの解析は、ポリマーの分解産物の証拠を示さなかった。これらのデータは、本発明のポリマー粒子を用いた接線流濾過の技術（膜、フィルター及びフィルター装置を含む）が損傷及び汚染に耐性であるので、標的物質を汚染せず、再利用のために容易に再生できることを示している。
考察
本実施例は、接線流濾過法にて本明細書で記載されるようなポリマー粒子を採用する本発明の方法は、複雑な混合物から価値ある標的分子を分離し、調製するのによく適合することを明瞭に明らかにしている。
実施例２．混合溶液からのヒトＩｇＧの精製
序論
本実施例は混合溶液からのヒトＩｇＧの精製におけるポリマー粒子を含むＺドメイン及びＴＦＦの使用を記載する。
材料及び方法
Ｚドメイン（上記実施例１で記載したような）を含む本発明のポリマー粒子５ｇをＢＳＡ及びＩｇＧの溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４における５０ｍＬ懸濁液）に加えた。設定した時間（３０分間）ＩｇＧをポリマー粒子に結合させた。予備インキュベートの後、ポリマー粒子／ＩｇＧ／ＢＳＡの懸濁液を幾つかの透析濾過容量についてＴＦＦ（０．１μｍの膜）にて透析濾過した。回収した透過液分画に存在するタンパク質を２８０ｎｍでの吸収で測定し（Ａ２８０、５０ｍＬ分画）、溶出プロファイルをプロットした（ＢＳＡの除去を観察するために）。Ａ２８０がゼロに達した際、クエン酸塩、ｐＨ３．０を添加することによってＩｇＧが溶出され、Ａ２８０及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ（銀染色を伴う）による透過液分画の解析によって透過液にてＩｇＧの溶出が追跡された。
結果
図８に示すように、ＢＳＡは最初のＡ２８０の吸収の主要因であった。分画１３では、透過液分画の吸収がゼロであった際、透析濾過緩衝液としてクエン酸塩を加え、使用した一方でＩｇＧが溶出された。それぞれのモル吸光係数を用いてＩｇＧ及びＢＳＡの相対量を算出した。この算出は、元々の溶液でそれらが調製された比率で透過液分画にＩｇＧとＢＳＡの定量的回収があることを示した。
Ａ２８０の第１のピーク及び第２のピークがそれぞれＢＳＡ及びＩｇＧであることを確認するために、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを行い、透過液分画のそれぞれにおけるタンパク質を調べた。図９Ａにおけるゲルは元々の溶液及びＴＦＦ解析からの各透過液分画１〜１３を示す。ゲルは、溶出前の透過液分画に主としてＢＳＡが存在することを裏付けている（微量の未結合のＩｇＧの存在と共に）。図９Ｂに示す第２のゲルは、透過液分画１４〜２６におけるタンパク質を観察するために流した。これらの分画はクエン酸塩（ｐＨ３．０）の添加及び結果として起きるＩｇＧの溶出の直後に回収された。
これらの結果は、ＩｇＧは主としてポリマー粒子から透過液に溶出されることを示した。
考察
この結果は、ＴＦＦにてＺドメインを含むポリマー粒子を利用する本発明の方法が混入するタンパク質（ＢＳＡ）を含む溶液からＩｇＧを精製するのに有効であるという明瞭な実証である。同様に、本発明の方法は、ＩｇＧが取り除かれている溶液を調製するのにも有効であるということは、たとえば、免疫グロブリンを含まない血清の調製における本発明の方法の有用性を明らかにしている。
実施例３．ヤギ血清からヤギＩｇＧを精製するためのＧＢ１ドメインポリマー粒子及びＴＦＦの使用
序論
本実施例は、複雑な混合物からヤギＩｇＧを精製するためのプロテインＧのＧＢ１ドメインを含むポリマー粒子の調製及びＴＦＦにおけるその使用を記載する。
材料及び方法
発現プラスミドの構築
プラスミドｐＥＴ−１４ｂＰｈａＣ−（ＧＢ１）３を以下のように構築した。それぞれリンカー領域（ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号３）によって分離されたＮ末端リンカー（ＬＥＶＬＡＶＩＤＫＲＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧ、配列番号２）とプロテインＧ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来の３つのＧＢ１結合をコードするＤＮＡ配列（添付の配列ＩＤ表における配列番号１）はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社によって合成された。導入されたＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位を用いて、プラスミドｐＥＴ１４ｂＰｈａＣ−ＭａｌＥ（Jahns and Rehm, 2009）においてＭａｌＥをコードするＤＮＡ領域を置き換えた。これによって添付の配列ＩＤ表における配列番号４として示されるＤＮＡ配列を持つプラスミドｐＥＴ−１４ｂＰｈａＣ−（ＧＢ１）３を生じた。
プラスミドｐＭＣＳ６９（Amara and Rehm, 2003）を抱く大腸菌株へのプラスミドｐＥＴ−１４ｂＰｈａＣ−（ＧＢ１）３の導入は（ＧＢ１）３を提示するＰＨＢポリマー粒子の産生を可能にした。
ＩｇＧの精製
ＴＦＦに基づくＩｇＧの結合と精製のプロトコールを用いてＩｇＧを結合し、ヤギ血清から精製した。ＧＢ１ドメインを含む本発明のポリマー粒子（５ｇ）３５．５ｍＬの懸濁液に５ｍＬのヤギ血清を加えた。ポリマー粒子はＩｇＧの総結合（たとえば、５ｇのポリマー粒子懸濁液の湿重量＞２２０ｍｇのＩｇＧの結合能）を可能にするように計算したレベルで加え、ＰＢＳにて５０ｍＬの最終容量に調整し、１：１０の最終血清希釈を創った。Ａ２８０（図１０）及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ（図１１）によって測定した際、血清が完全に除かれるまで、ＰＢＳに対して混合物を透析濾過した。透析濾過は０．１ｎｍの孔サイズを持つ５０ｃｍ2の中空繊維カートリッジで実施した。いったん血清タンパク質が取り除かれると、リテンテートは２０ｍＬに濃縮され、次いで、５０ｍＬのリテンテートにてｐＨ３．０のクエン酸ナトリウム／生理食塩水を用いてヤギＩｇＧを溶出した。
結果
図１０及び図１１に示したデータは、ＩｇＧがヤギ血清から上手く取り除かれたのでＩｇＧを含まないヤギ血清が作られ、精製されたＩｇＧは次いでリテンテートにおけるポリマー粒子から溶出し、低ｐＨ緩衝液における透析濾過によって透過液から解放することができたことを明らかにしている。
考察
この結果は、ＴＦＦにてＧＢ１ドメインを含むポリマー粒子を利用する本発明の方法は、先ず、ＩｇＧを含まない血清タンパク質調製物を精製し、次いで複雑な混合物からＩｇＧを精製するのに有効であったことを明らかにしている。従って、適当な透析濾過条件を選択することによって、本発明は複雑な混合物から所望の成分分画を順次提供することができる。
実施例４．水から無機コロイド状の金を精製するための金結合ペプチドポリマー粒子及びＴＦＦの使用
序論
本実施例は溶液から無機物（コロイド状の金）を取り除くことにおける、ＴＦＦと、金結合ドメインを含む本発明のポリマー粒子の使用を記載する。
方法
金結合ペプチド（Jahns, A. C et al., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2072-2080を参照）を含むポリマー粒子を記載するように調製した。３０ｍＬの脱イオン水にて１０ｎｍのコロイド状の金粒子の０．００５％溶液を調製し、２０ｃｍ2、０．２μｍの中空繊維精密濾過カートリッジで平衡化した。完全な再循環のもとでシステムを走らせ、透過液をリテンテート容器に供給し戻した。５２０ｎｍでの吸収によって金粒子の量を測定した。透過液のコロイド状の金溶液の吸収を測定した後、３０ｍｇ（最終的に１ｍｇ／ｍＬ）のポリマー粒子をリテンテートリザーバに加えた。４分間隔で供給流から透過液の分画を採取した。８分及び２９分にて、追加の３００ｍｇのポリマー粒子をリテンテートに加え、溶液中の残留する金をさらに結合した。
結果
透過流におけるコロイド状の金のレベルの低下は図１２で容易に見られ、溶液から金粒子を隔離することにおけるＴＦＦと金結合ドメインを含むポリマー粒子の有効性を明らかに実証している。
考察
本実施例は、無機化合物の回収及び溶液からのその除去における本発明の方法の有効性を明らかに実証している。そのような方法は、無機化合物が有益であり、その回収が望ましい状況、及び無機化合物が混入化合物であり、溶液から又は溶液に存在する他の成分からそれを取り除くことが望ましい状況の双方で有用性を有する。
実施例５．可溶性デンプンからのマルトースの生産及び回収のためのアミラーゼ連結ポリマー粒子及びＴＦＦの使用
序論
本実施例は、生体分子の生物学的処理におけるＴＦＦと酵素を含むポリマー粒子の使用を記載する。ここで、可溶性デンプン懸濁液をマルトースに変換するのにアミラーゼを含むポリマー粒子を用いた。
方法
アミラーゼを含むポリマー粒子（Rasiah, I., Rehm, B.H.A., (2009) One-step production of immobilised a-amylase in recombinant Escherichia coli. Appl Environ. Microbiol. 75:2012-2016を参照）を記載するように調製した。振盪しながら５０℃にて、２ｇのポリマー粒子と共に１％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ及び８％ｗ／ｖの可溶性デンプンのＰＢＳ懸濁液（３００ｍＬ）をインキュベートした（作出したバッチ）。インキュベートの２時間後、１１０ｃｍ2、０．１μｍの精密濾過カートリッジに適合させたＴＦＦシステムで１％デンプン／ポリマー粒子懸濁液を透析濾過した。透過液分画を回収し（５０ｍＬ）、その後、マルトース濃度を測定した。さらに、２００ｍＬのＰＢＳ緩衝液を介して透析濾過することによってポリマー粒子からマルトースを洗浄した。
１％溶液を完全に回収した後、４％のデンプン／ポリマー粒子懸濁液を同じリテンテートに加え、システムを介して透析濾過し、同様に８％懸濁液からマルトースを回収した。いったんＴＦＦが終了すると、透過液に回収されたマルトースの量を測定した（図１３）。
結果
図１３にて明らかに分かるように、ポリマー粒子に結合したアミラーゼ酵素がＴＦＦシステムにてマルトースの生産を触媒することができたということは、粒子に連結した触媒を高温適用で使用することができ、生成物（マルトース）を反応懸濁液から容易に回収することができることを明らかにしている。
考察
本実施例では、ポリマー粒子及び高分子量のデンプンがリテンテート分画に残って加水分解が起きるのを可能にする一方で、低分子量の生成物マルトースを透過液分画に連続的に分離することができる。
本実施例は、ポリマー粒子に結合した酵素活性が介在する出発物質の所望の生成物への変換及び溶液からのその生成物の回収における本発明の方法の有効性を明瞭に実証している。
実施例６．水の除染及び解毒のためにＴＦＦで使用するための触媒ポリマー粒子の作出
序論
本実施例は、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒに由来するオルガノホスホヒドロラーゼ（ＯｐｄＡ）を含むポリマー粒子の産生及び大腸菌におけるその粒子の発現のためのベクターの調製を記載する。ＯｐｄＡは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａのポリマー粒子形成酵素ＰｈａＣ（Blatchford et al., in press Biotech. Bioeng.を参照）のＣ末端に設計されたリンカー領域を介してそのＮ末端を融合した。
材料及び方法
細菌株及び増殖培地
この試験で使用した細菌株を以下の表１に列記する。特に言及されない限り、大腸菌はすべて３７℃で増殖させた。必要に応じて、以下の濃度で抗生剤を加えた：アンピシリン（７５μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍＬ）、及びテトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍＬ）。ポリマー粒子の産生のために、３７℃にて０．４５のＯＤ600まで細胞を増殖させ、次いで１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導した。誘導の後、振盪フラスコにて培養物を３０℃で４４時間培養した。
Ｔｃr−テトラサイクリン耐性、Ａｐr−アンピシリン耐性、Ｃｍr−クロラムフェニコール耐性
プラスミド及びオリゴヌクレオチド
この試験で使用したプラスミドは上記表１に列記する。当該技術で一般に知られる方法を用いて一般的なクローニング手順及びＤＮＡの単離を行った。ＤＮＡプライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑポリメラーゼはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州）から購入した。化学薬品はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
機能的なＯｐｄＡポリエステル顆粒を産生するためのプラスミドの構築
有機リン酸分解タンパク質をコードするｏｐｄＡＤＮＡは、プラスミドｐＥＴＭＣＳＩの中の挿入物としてオーストラリア、キャンベラのＣＳＩＲＯから入手した。操作した５’及び３’の制限部位によってプライマーを設計した。５’プライマー（５’−ＸｈｏＩ［配列番号５］）はＸｈｏＩ制限部位を抱き、３’プライマー（３’−ＢａｍＨＩ［配列番号６］）はＢａｍＨＩ制限部位を抱く。Ｓｉｇｍａが作出したプライマーによってｐｆｘＰＣＲを行い、ＯｐｄＡをコードする領域を増幅した。断片末端にポリＡを付け、プラスミドｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙに連結した。標識プレート上で青／白選抜によって形質転換体をスクリーニングした。配列決定によってｏｐｄＡ挿入物について組換え白色コロニーをスクリーニングした。ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素による加水分解によってプラスミドｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙからｏｐｄＡ配列を切断した。ＯｐｄＡタンパク質のＮ末端の疎水性解析の後、リンカー領域を含めることが必要であると思われれば、好適なベクターとしてプラスミドｐＥＴ１４ｂＰｈａＣ／リンカー／ＭａｌＥを用いた。ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによってプラスミドｐＥＴ１４ｂＰｈａＣ／リンカー／ＭａｌＥを加水分解してプラスミドからＭａｌＥ領域を切断した。プラスミド主鎖ｐＥＴ１４ｂＰｈａＣ／リンカーのＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩの部位にｏｐｄＡ配列をクローニングしてプラスミドｐＥＴ１４ｂＰｈａＣ／リンカー／ＯｐｄＡを生じた。これを用いて、プラスミドｐＭＣＳ６９を抱く大腸菌ＢＬ２１λ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換したが、それは、ポリマー粒子の形成に必要とされるＲ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａ（ＣｏＡ）の合成に介在する。ＤＮＡ配列決定によって新しいプラスミド構築物のＤＮＡ配列を確認した。ＯｐｄＡ活性を示さない対照のポリマー粒子を産生するために、プラスミドｐＭＣＳ６９の存在下で大腸菌ＢＬ２１λ（ＤＥ３）にてＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａの野生型ＰｈａＣのみをコードするプラスミドｐＥＴＣを用いた。
タンパク質の解析
Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０で記載されたようなドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってポリエステルタンパク質のプロファイルを解析した。バクテリオファージＴ４の頭部の集合の間での構造タンパク質の切断。Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０−５。クマシーブリリアントブルーＧ２５０でゲルを染色した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量法を用いて決定した。
ＭＡＬＤＬ／ＴＯＦ質量分光法を用いたトリプシンによるペプチドフィンガープリント解析
ＰｈａＣ／ＯｐｄＡ融合タンパク質を特定するために、当該タンパク質バンドをゲルから切り出し、トリプシン消化に供し、次いで以前記載されたように（１５）、得られたトリプシン消化ペプチドのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分光解析を行った。
ポリエステルの解析
Ｂｒａｎｄｌ，Ｈ．，Ｒ．Ａ．Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．Ｗ．Ｌｅｎｚ，及びＲ．Ｃ．Ｆｕｌｌｅｒ．１９８８，生分解性ポリエステルとしての考えられる適用のためのポリ（β−ヒドロキシアルカノエートの供給源としてのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１９７７−１９８２で記載されたようなガスクロマトグラフィ／質量分光法（ＧＣ／ＭＳ）によって、ポリエステルシンターゼの生体内活性を示すポリエステル、ポリヒドロキシブチレートの産生を定性的に且つ定量的に測定した。
ポリマー粒子
Ｊａｈｎｓ，Ａ．Ｃ．，Ｒ．Ｇ．Ｈａｖｅｒｋａｍｐ，及びＢ．Ｈ．Ｒｅｈｍ．２００８．操作した細菌の内部へ自己集合する多官能性無機結合ポリマー粒子。Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１９：２０７２−８０で記載されたように機械的な細胞破砕及びグリセロール勾配における超遠心を用いて組換え大腸菌からポリマー粒子を単離した。ｐＭＣＳ６９及びｐＥＴＣを抱く大腸菌ＢＬ２１λ（ＤＥ３）から対照のポリマー粒子を作製した。
顕微鏡
Ｐｅｔｅｒｓ，Ｖ．，及びＢ．Ｈ．Ｒｅｈｍ．２００５，ＧＦＰ標識したＰＨＡシンターゼを用いたＰＨＡ顆粒形成の生体内モニタリング。ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４８：９３−１００で記載されたようにナイルレッド染色に続く蛍光顕微鏡によって細菌細胞の内部で産生されるポリエステル粒子を視覚化した。
酵素アッセイ
基質としてメチルパラチオン（Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−（４−ニトロフェニル）ホスホロチオエート；Ｓｉｇｍａ）を用いて、Ｄｕｍａｓ及び共同研究者（Dumas, D. P., S. R. Caldwell, J. R. Wild, and F. M. Raushel. 1989、Purification and properties of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. J. Biol. Chem. 264:19659-19665）及びＨａｒｃｏｕｒｔら（Harcourt, R. L., I. Horne, T. D. Sutherland, B. D. Hammock, R. J. Russell, and J. G. Oakeshott. 2002. Development of a simple and sensitive fluorimetric method for isolation of coumaphos-hydrolysing bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 34:263-268）によって記載された方法を用いて、ポリマー粒子を結合したＰｈａＣ／ＯｐｄＡ及びポリエステルを結合したＰｈａＣのホスホトリエステラーゼ活性を測定した。
Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ１９０分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、パラ−ニトロフェノールの遊離により生じる４０５ｎｍでの吸収の上昇によってメチルパラチオンの加水分解の速度をモニターした。酵素活性の単位は１分当たり代謝回転したメチルパラチオンのマイクロモルとして定義する。
結果
ポリエステルシンターゼＰｈａＣのＣ末端に翻訳時融合した完全長のＯｐｄＡをコードするプラスミドｐＥＴ１４ｂ／ＰｈａＣ／リンカー／ＯｐｄＡは、組換え大腸菌ＢＬ２１λ（ＤＥ３）におけるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）ポリマー粒子の形成に介在し、野生型のポリエステルシンターゼのみを発現する組換え大腸菌ＢＬ２１λ（ＤＥ３）によって産生された５９％の含量に比べてやや少ない約４８％のバイオマスにわたる全体的なポリエステル含量を生じた。細胞内部における球状粒子の形成はナイルレッドで染色した細胞の蛍光顕微鏡によってさらに確認された（データは示さず）。単離したポリマー粒子に結合したタンパク質の解析は、ＰｈａＣ／ＯｐｄＡ融合タンパク質の過剰産生を明瞭に示し、その特定はトリプシン消化ペプチドのフィンガープリント解析によって確認された（データは示さず）。
メチルパラチオンを基質として用いてＰｈａＣ及びＰｈａＣ／ＯｐｄＡの融合を示すポリマー粒子をホスホトリエステラーゼ活性について調べた。ＰｈａＣポリマー粒子は検出可能なホスホトリエステラーゼ活性を有さなかった一方で、ＰｈａＣ／ＯｐｄＡ融合タンパク質を提示するポリマー粒子はポリマー粒子の湿質量のグラム当たり約１，８４０Ｕの活性を有した。
考察
本実施例は、酵素、この場合ＯｐｄＡがポリエステルシンターゼＰｈａＣのＣ末端への融合によって高い密度と機能性で効率的に不動化されている場合、触媒ポリマー粒子を作出することができることを示している。これらポリマー粒子は標準的な細菌発酵法を用いて工業規模で生産することができ、ＴＦＦでの使用に好適である。
実施例７．ＴＦＦに基づく変換及び解毒への触媒ポリマー粒子の使用
本実施例では、低分子量の有機化合物を触媒し、ＴＦＦを用いて酵素部分を含むポリマー粒子の使用を介して溶液から分離した。さらに、この工程では酵素活性を再利用できることを明らかにした。
ＣＨＥＳ緩衝液中２００μＭのメチルパラチオンの５０ｍＬ溶液がリテンテート溶液を形成した。０．２μｍ、２０ｃｍ2のＰＢＡ精密濾過カートリッジを用いたＴＦＦシステムを採用し、５分毎に回収する０．５ｍＬ分画（約３０ｍＬ又は１ＤＶ）を伴った完全再循環のもとで５０ｍＬのＴＦＦリテンテートを流し、吸収を測定し、リテンテートに戻した。１０分間流した後、５００ｍｇのポリマー粒子を懸濁液に加え、４０５ｎｍにてＭＰのＰＮＰへの変換を観察した（図１４）。反応が完了した後、リテンテートを透析濾過し、回収した５０ｍＬ分画と共にＰＮＰをすべて除いた（図１５）。ＰＮＰすべてを除いた後、残ったポリマー粒子を４５ｍＬに再懸濁し、５ｍＬのＭＰ濃縮物を加え、２００μＭのメチルパラチオン濃度を創り、完全な再循環のもとでバッチ変換工程を反復し、５２０ｎｍにて５分間隔で反応の進行を測定した（図１４）。
結果
図１４及び図１５から明らかに分かるように、複数サイクルの触媒工程を介して低分子量の有機化合物を取り除くのに本発明の方法を利用することができる。図１４はＴＦＦの間でポリマー粒子との接触にてメチルパラチオンのパラ−ニトロフェノールへの迅速な変換を示す。図１４から続いて、メチルパラチオンのパラ−ニトロフェノールへの触媒変換の完了後、ポリマー粒子の３０ｍＬ懸濁液をＣＨＥＳ緩衝液で透析濾過した。４０５ｎｍでの吸収について透過液の分画を測定することによってパラ−ニトロフェノールの除去をモニターした。いったんパラ−ニトロフェノールが除かれると、さらなる回数の解毒のためにポリマー粒子を再利用することができた。
実施例８．ＰＨＢポリマー粒子の精製における接線流濾過の使用
本実施例は、様々な規模及び様々な適用におけるＰＨＢポリマー粒子の精製へのＴＦＦの一般化された使用を記載する。例となる一実施形態では、ＴＦＦを用いて細胞ホモジネートから宿主細胞混入物を除去する。リゾチーム及びＥＤＴＡ（菌体壁を不安定化するための）のような工程賦形剤を含む緩衝溶液に細菌バイオマスを懸濁し、超音波処理、フレンチ圧力セル又は微少溶液操作を含む当該技術で周知の様々な方法によって溶解する。いったん溶解すると、所望の孔サイズ（たとえば、０．１μｍ〜０．４５μｍ）での精密濾過を用いてポリマー粒子から細胞より小さい成分を分離する。代表的な工程スキームを図１６に示す。
実施例９．中空繊維の交差流フィルターを用いたＴＦＦによる宿主細胞混入物の除去−透過液解析
この調製実施例で実施例９における代表的な工程スキームを採用したが、それは、ＴＦＦを用いたポリマー粒子組成物の調製を記載する。
方法
１ｍＭのＥＤＴＡを伴った２５０ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にてＰＨＢポリマー粒子を含有するおよそ２０ｍｇの大腸菌バイオマスを微少溶液操作した。０．１μｍの孔を持つ１１０ｃｍ2のＴＦＦカートリッジの中空フィルターＴＦＦシステムに２５０ｍＬのホモジネートを直接加え、２０％エタノール中８容のＰＢＳ（８×２５０ｍＬ）を用いて透析濾過した（図１７）。
結果
図１７で分かるように、２６０、２８０及び６００ｎｍでの吸収による透過液分画の含量（図１７Ａ）、透過液分画のタンパク質濃度（図１７Ｂ）を観察することによって及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ上での透過液分画の解析（図１７Ｃ）によって明らかにされたように宿主細胞混入物の除去は容易に達成された。従って、精製は、ポリマー粒子から透過液への可溶性タンパク質（Ａ280）と核酸（Ａ260）の除去として明らかにされた。
実施例１０．中空繊維の接線流濾過を用いたＰＨＢポリマー粒子の精製における界面活性剤（デオキシコール酸）の使用
本実施例は、界面活性剤、この実施例ではデオキシコール（ＤＯＣ）酸の使用によって宿主細胞タンパク質と膜の解離がさらに高められることを明らかにする。
方法
様々な緩衝液を用いて、それぞれ０．２％のＤＯＣを含有する宿主細胞を均質化した（ＰＨＢポリマー粒子を放出するように）。使用したホモジネート緩衝液の組成は以下の表２に概説する。これらの同一緩衝液を中空繊維ＴＦＦ工程における透析濾過にも用いてポリマー粒子懸濁液を精製した（図１８）。２５０ｍＬの種々の緩衝液で大腸菌バイオマス（約２０ｇ）を微少溶液操作した。８容の同一緩衝液（８×２５０ｍＬ）で１１０ｃｍ2の中空繊維接線流カートリッジ（ＧＥ Ｅｘａｍｐｌｅｒ ＣＦＰ−１−Ｅ−３ＭＡ）にてその後ホモジネートを透析濾過した。２０％エタノール中のＰＢＳに対する追加のＴＦＦ透析濾過の後、ＩｇＧ結合活性についてポリマー粒子を評価した。
結果
図１９で分かるように、様々な厳しさが増す条件下でＴＦＦ透析濾過で処理した後、ＩｇＧ結合活性は保存される。
実施例１１．開水路接線流濾過を用いたＰＨＢポリマー粒子の精製における界面活性剤（ルブロール）の使用
パイロット試験規模の精製のために設計された開水路交差流システムを用いて、界面活性剤で高めたＰＨＢポリマー粒子のＴＦＦ精製の使用も大規模に開発した。たとえば、デオキシコール酸塩、ルブロール及びＳＤＳのような界面活性剤は、これらポリマー粒子の精製を高めるのに有効であることが明らかにされた。
方法
０．５％のルブロール、５０ｍＭのトリス−１０ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ１０における微少溶液操作によって、Ｚドメインを含む本発明のポリマー粒子を含有する３２５ｇの大腸菌バイオマスを均質化した。１６，０００×ｇで３０分間、細胞ホモジネートを遠心することによって粗精製のポリマー粒子を回収し、宿主細胞のＤＮＡ、タンパク質及び脂質を含む上清を除いた。
開水路の総表面積０．３４ｍ2を持つミリポアＰｒｏｓｔａｋ−４ｓｔａｋ膜カートリッジに粗精製のポリマー粒子ホモジネートを適用した。８容の０．１％ルブロール、２０ｍＭトリス／１０ｍＭのＥＤＴＡナトリウム、ｐＨ１０、８容の２５ｍＭクエン酸ナトリウム／生理食塩水、ｐＨ３．０、及び８容の２０％エタノール中のＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して粗精製のポリマー粒子懸濁液を透析濾過した。ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液による処理は、ポリマー粒子の溶出条件を模倣し、酸性条件下で溶出され得る残留する宿主細胞タンパク質を除くように設計した。ＰＢＳ／２０％エタノールは微生物の増殖を支えない環境で最終生成物のｐＨ及び塩分濃度を制御するために使用した。
結果
図２０に示した透過液解析は、大部分はＴＦＦに先立つ粗精製のポリマー粒子の遠心を介したこれら混入物質の除去による実質的に除去されたタンパク質及び核酸を示した。
リテンテートから回収したＧＢ１ドメインを含む本発明のポリマー粒子をＩｇＧ結合活性について解析し、元々の宿主細胞バイオマスをグリセロール勾配精製した試料の結合活性と比較した（図２１）。結合データは、これらのポリマー粒子に由来して得られたＩｇＧは、規模変更可能ではないグリセロール勾配法と規模変更可能なＴＦＦ／界面活性剤抽出法の双方で類似していた。従って、ＰＨＢポリマー粒子の機能性が保存されただけでなく、粒子調製に使用されたＴＦＦに基づく方法は大規模生産に適している。
実施例１２．ポリマー粒子のＴＦＦ精製を高める化学的手法
本実施例は、ポリマー粒子精製の向上が化学抽出剤の使用を介して達成されることを明らかにする。この手順では、種々の化学的条件のいずれか１つで細菌ホモジネートを処理して細胞残渣の分散及び混入物質の除去による精製を高める。化学的条件の範囲は、化学抽出マトリクスで構成することができる。加えて、化学的処理を調べて化学的処理がポリマー粒子の活性に影響を及ぼすかどうか判定した。
方法
本発明の方法にてＰＨＢポリマー粒子からの混入物質の抽出を高めるのに使用した様々な化学的条件を以下の表３に概説する。
バッチ洗浄試験
Ｚドメインを含む本発明のポリマー粒子（ＩｇＧ結合ＰＨＢポリマー粒子）を含有する粗精製のバイオマスホモジネートを、酸及び塩基処理、高塩、キレータ、界面活性剤及びカオトロピックを含む様々な化学的処理によって抽出した。ポリマー粒子／ホモジネートを遠心した（１５，０００×ｇ、２０分間）後、上清の吸収を測定することによって混入物質除去の程度を定量した。粗精製のポリマー粒子ペレットをＰＢＳ、ｐＨ７．４に再懸濁し、残ったＩｇＧ結合（ＰＢＳ対照に比べた）の程度についてアッセイした。
結果
図２２Ａで分かるように、Ａ２６０及びＡ２８０で定量したとき、混入物質除去の程度は採用した化学的処理に実質的に応じて変化した。さらに、図２２Ｂに示すように、残ったＩｇＧ結合の程度は調製方法で使用した化学的方法に実質的に応じて変化した。
実施例１３．ＰＨＢポリマー粒子の精製についての自由自在な規模での工程
化学抽出とＴＦＦを組み入れるポリマー粒子の精製のための規模変更可能な工程を図２３で説明する。この工程は２０ｇのバイオマスの量から数キログラム規模で実行することができる。加えて、化学抽出条件は、本明細書で具体的に例示したもの−界面活性剤の種類、濃度の双方に限定されず、化学的処理はポリマー粒子の調製工程の特定の要件に合うように修正することができる。
化学抽出の後、要件に応じて、０．１７ｍ2〜数ｍ2の規模変更可能な膜表面を負荷したＰｒｏｓｔａｋシステムに精製したポリマー粒子塊を適用する。
ＴＦＦ透析濾過に続いて、Ｐｒｏｓｔａｋシステムから回収した際、ＰＢＳ／エタノールで保存する、又はさらに小さな規模の中空繊維システムにて特定の「スラリー」濃度に濃縮する。様々な分析測定を実施して最終的なポリマー粒子の調製又は必要に応じて工程全体を通してポリマー粒子の性状分析を行う。
実施例１４．大腸菌バイオマスからのＰＨＢポリマー粒子のパイロット試験規模での抽出
本実施例では、上記実施例１３で記載した自由自在な規模の工程を用いて、ＰＨＢポリマー粒子（１１００〜１２００ｇ）を含有する大腸菌バイオマスのパイロット試験規模の量を処理した。
方法
ＳＤＳ／トリス／ＥＤＴＡアルカリ溶液にてポリマー粒子を微少溶液操作し、細胞を均質化し、粗精製のポリマー粒子を回収した。第２の相では、溶解工程で激しく減量した（図２４を参照）粗精製のポリマー粒子塊を、溶解界面活性剤、チオグリセロール及び０．１ＮのＮａＯＨで順次洗浄した。各工程間で１６，０００×ｇにて３０分間でポリマー粒子を回収した。
抽出後、粗精製のポリマー粒子を中和し、０．４１ｍ2の膜面積の規模変更可能な膜表面を負荷したＰｒｏｓｔａｋシステムに負荷し、２０容の０．０４％ＳＤＳ／トリス／ＥＤＴＡ、７容のクエン酸生理食塩水緩衝液、ｐＨ３．０及び１０容までの２０％エタノール中リン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌで、懸濁液のｐＨがｐＨ７．４になるまで透析濾過した（図２５）。
結果
本実施例で採用した精製方法の有効性は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析（図２６を参照）及び以下の表３で示すようなポリマー粒子懸濁液でのエンドトキシン低下の評価の双方によって明瞭に示されている。
考察
本実施例は、ＴＦＦによるポリマー粒子のパイロット試験規模の調製は本明細書で記載される方法の使用を介して容易に達成されたことを明らかにしている。混入するタンパク質の実質的な除去は、エンドトキシンレベルの実質的な低下と共に、粗精製バイオマスからのＴＦＦ分離を介して達成された。従って、本発明の方法はＴＦＦ法を利用して精製されたポリマー粒子の規模変更可能な作出に適している。
産業上の利用
本発明のポリマー粒子及び方法は、複雑な組成物からの標的物質の分離及び１以上の反応基質を含む組成物からの反応生成物の調製を含む広範囲の精製法及び調製法で適用を有する。

Claims (52)

  1. 原料物質から標的物質を分離する精製方法であって、（ａ）原料物質を提供することと、（ｂ）少なくとも１つの半透過性フィルターによって前記原料物質を接線流濾過することと、（ｃ）標的物質を回収することを含み、原料物質又は半透過性フィルターが１以上のポリマー粒子を含み、原料物質の１以上、半透過性フィルター、又は前記接線流濾過で使用される１以上の溶液が１以上のポリマー粒子を含み、ポリマー粒子の１以上が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む方法。
  2. ポリマー粒子の１以上が、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー及び
    （ｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｉｉ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｉｖ）親和性リガンド；
    （ｖ）酵素；
    （ｖｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む請求項１の方法。
  3. １以上のポリマー粒子が、標的物質を結合することが可能であるリガンドを含む請求項１の方法。
  4. 標的物質が１以上の抗体である請求項１又は２の精製方法。
  5. 標的物質が１以上のポリマー粒子である請求項１の精製方法。
  6. 原料物質から標的物質を調製する方法であって、非晶性ポリマー粒子が１以上の標的物質又は１以上の標的物質の前駆体又は１以上の混入物質に結合するのを可能にするのに十分な時間、非晶性ポリマー粒子の集団を原料物質と接触させることと、粒子に結合した標的物質若しくはその前駆体から１以上の混入物質を、又は粒子に結合した混入物質から１以上の標的物質若しくはその前駆体を接線流濾過によって分離することと、標的物質を回収することを含む方法。
  7. 非晶性ポリマー粒子の集団が均質な集団である請求項６の方法。
  8. 非晶性ポリマー粒子の集団が不均質な集団である請求項６の方法。
  9. 非晶性ポリマー粒子の１以上が、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択される１以上のバイオポリマーを含む請求項６の方法。
  10. 非晶性ポリマー粒子の１以上が、粒子形成タンパク質によって合成される又は合成されることが可能である請求項６の方法。
  11. ポリマー粒子の集団の実質的にすべてが粒子形成タンパク質によって合成される又は合成されることが可能である請求項１０の方法。
  12. 非晶性ポリマー粒子の１以上が、たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成タンパク質を含む請求項６の方法。
  13. 標的物質の回収がポリマー粒子の溶出による請求項６の方法。
  14. 標的物質の回収が接線流濾過の透過液の回収による請求項６の方法。
  15. 標的システムの回収が接線流濾過のリテンテートの回収による請求項６の方法。
  16. 原料物質から１以上の標的物質を分離する又は精製する方法であって、ポリマー粒子の１以上が１以上の標的物質を結合するのを可能にするのに十分な時間、ポリマー粒子集団に原料物質を接触させることと、接線流濾過によって粒子結合標的物質から１以上の混入物質を分離することと、標的物質を回収することを含み、ポリマー粒子の１以上が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む方法。
  17. 原料物質から１以上の標的物質を分離する又は精製する方法であって、ポリマー粒子の１以上が１以上の混入物質を結合するのを可能にするのに十分な時間、ポリマー粒子集団に原料物質を接触させることと、接線流濾過によって粒子結合混入物質から１以上の標的物質を分離することと、標的物質を回収することを含み、ポリマー粒子の１以上が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む方法。
  18. １以上の反応生成物を調製する方法であって、１以上の反応基質の所望の分画に１以上のポリマー粒子が結合するのを可能にするのに十分な時間、１以上の反応基質を含む原料物質を接線流濾過によって１以上のポリマー粒子と接触させることと、任意で、接線流濾過によってポリマー粒子から１以上の混入物質を分離することと、反応生成物を回収することを含み、１以上のポリマー粒子は反応の触媒を含み、ポリマー粒子の１以上が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む方法。
  19. ポリマー粒子を調製する方法であって、ポリマー粒子の１以上が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含み、
    方法が、接線流濾過によってポリマー粒子から１以上の混入物質を分離することと、ポリマー粒子を回収することを含む方法。
  20. 原料物質から１以上のポリマー粒子を分離する又は精製する方法であって、接線流濾過によってポリマー粒子から１以上の混入物質を分離することと、１以上のポリマー粒子を回収することを含み、ポリマー粒子の１以上が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む方法。
  21. １以上の抗体を精製する精製方法であって、１以上の抗体を含む原料物質を提供することと、少なくとも１つの半透過性フィルターで前記原料物質を接線流濾過することと、抗体を回収することとを含み、原料物質の１以上、半透過性フィルター、又は前記接線流濾過で使用される１以上の溶液が１以上のポリマー粒子を含み、１以上のポリマー粒子が抗体を結合するのが可能であるリガンドを含む精製方法。
  22. 接線流濾過で使用するための半透過性フィルターを作製する方法であって、透過性又は半透過性の支持体を提供することと、１以上のポリマー粒子を支持体に結合させて半透過性フィルターを提供することを含み、ポリマー粒子の１以上が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む方法。
  23. 接線流濾過で使用するための組成物、膜、フィルター又はフィルター装置であって、前記組成物、膜、フィルター又はフィルター装置が、
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含む１以上のポリマー粒子を含む組成物、膜、フィルター又はフィルター装置。
  24. ポリマー粒子であって
    （ｉ）ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエートから選択されるバイオポリマー；又は
    （ｉｉ）たとえば、ポリマーシンターゼ又はポリマーシンターゼ融合体のようなポリマー粒子形成ポリペプチド；又は
    （ｉｉｉ）ポリマー粒子結合ポリペプチド；
    （ｉｖ）ポリペプチド融合パートナー；
    （ｖ）親和性リガンド；
    （ｖｉ）酵素；
    （ｖｉｉ）上記の２以上を含む融合ポリペプチド；又は
    （ｖｉｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）の２以上の任意の組み合わせを含み、
    ポリペプチドの１以上が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐに由来するプロテインＧのＧＢ１ドメインである又はそれを含むポリマー粒子。
  25. ポリマー粒子形成ポリペプチド及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐに由来するプロテインＧの１以上のＧＢ１ドメインを含む融合ポリペプチド。
  26. ポリペプチドが、配列番号４の１２以上の隣接するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によってコードされるＧＢ１ドメインである又はそれを含む請求項２４の粒子又は請求項２５のポリペプチド。
  27. ポリペプチドが、配列番号４の１２以上の隣接するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドである又はそれを含む請求項２４の粒子又は請求項２５のポリペプチド。
  28. ポリマー粒子が、ポリマー粒子の湿重量ｇ当たり３０ｍｇを超える免疫グロブリンの免疫グロブリン結合能を有する請求項２４〜２７のいずれか１項の粒子。
  29. 結合能が、ポリマー粒子の湿重量ｇ当たり少なくとも約３５ｍｇの免疫グロブリン、ポリマー粒子の湿重量ｇ当たり少なくとも約４０ｍｇの免疫グロブリン、ポリマー粒子の湿重量ｇ当たり少なくとも約４５ｍｇの免疫グロブリン、ポリマー粒子の湿重量ｇ当たり少なくとも約５０ｍｇの免疫グロブリン、ポリマー粒子の湿重量ｇ当たり少なくとも約５５ｍｇの免疫グロブリン、又はポリマー粒子の湿重量ｇ当たり少なくとも約６０ｍｇの免疫グロブリンである請求項２８の粒子。
  30. 免疫グロブリンがＩｇＧである請求項２８又は２９の粒子。
  31. 原料物質が細胞溶解物である若しくはそれに由来する、又はタンパク質の発現系である若しくはそれに由来する請求項１〜１８、２０又は２１のいずれか１項の方法。
  32. 原料物質が、乳製品又は乳加工ストリーム、ワイン又はビールの発酵物を含む発酵物を含む食品である又はそれに由来する請求項１〜１８、２０又は２１のいずれか１項の方法。
  33. 原料物質が、反応溶液、化学合成溶液、化学合成中間体を含む溶液である請求項１〜１８、２０又は２１のいずれか１項の方法。
  34. 標的物質が、たとえば、組換えポリペプチド、抗体、酵素、ホルモンを含むポリペプチドである請求項１〜１８、２０又は２１のいずれか１項の方法。
  35. 標的物質が、たとえば、組換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、たとえば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｔＲＮＡのようなＲＮＡ分子又は、たとえば、ｃＤＮＡのようなＤＮＡ分子である請求項１〜１８、２０又は２１のいずれか１項の方法。
  36. 標的物質が、分泌された代謝産物を含む細胞性代謝産物である請求項１〜１８、２０又は２１のいずれか１項の方法。
  37. ポリマー粒子が、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）から選択されるバイオポリマーを含む請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  38. ポリマーが、ポリヒドロキシアルカノエート、好ましくはポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を含む請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  39. 粒子を構成するポリマーが、ポリエステル、ポリチオエステル又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）から選択されるバイオポリマーから本質的に成る、又は成る請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  40. ポリマー粒子がリン脂質単層によって被包されるポリマー粒子を含む請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  41. 存在する場合、ポリマーシンターゼはポリマー粒子又はリン脂質単層に結合し、又は双方に結合する上記請求項のいずれか１項。
  42. ポリマー粒子が、２以上の異なる融合ポリペプチドを含む上記請求項のいずれか１項。
  43. 存在する場合、ポリマーシンターゼはそれが形成するポリマー粒子に共有結合する又は非共有結合する上記請求項のいずれか１項。
  44. 存在する場合、ポリマーシンターゼはグラム陰性及びグラム陽性の真正細菌に由来する又は古細菌に由来するＰＨＡポリマーシンターゼである上記請求項のいずれか１項。
  45. 存在する場合、ポリマーシンターゼは、それぞれ受入番号ＡＹ８３６６８０、ＡＥ００４０９１、ＡＢ２０５１０４、ＡＦ１０９９０９、ＹＰ１３７３３９、ＡＢ０４９４１３及びＡＦ１５０６７０を有するＣ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａ．ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、又はＰ．ｐｕｔｉｄａに由来するＰＨＡポリマーシンターゼである上記請求項のいずれか１項。
  46. ポリマー粒子の１以上が、透過性又は半透過性の支持体に永続的に結合する請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  47. ポリマー粒子の１以上が、透過性又は半透過性の支持体に可逆的に結合する請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  48. ポリマー粒子の１以上が、半透過性フィルターに又はそれを共有結合する又は非共有結合する請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  49. ポリマー粒子の１以上が、半透過性の支持体又は膜に又はそれを吸着する請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  50. ポリマー粒子の１以上が、半透過性の支持体又は膜に又はそれを結合することが可能であるリガンドを含む請求項１〜２２のいずれか１項の方法、請求項２３の組成物、膜、フィルター又はフィルター装置、又は請求項２４又は２６〜３０のいずれか１項の粒子。
  51. 実施例及び図面を参照して本質的に本明細書に記載されたように原料物質から１以上の標的物質又はポリマー粒子を分離する又は精製する方法。
  52. 実施例及び図面を参照して本質的に本明細書に記載されたような組成物、膜、フィルター、フィルター装置又はポリマー粒子。
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