WO2023085374A1 - ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents

ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 Download PDF

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WO2023085374A1
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pha
enzyme
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microorganism
cells
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佳弘 毛利
尚志 有川
俊輔 佐藤
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株式会社カネカ
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid.
  • microorganisms a substance production by microorganisms is also applied to the production of protein pharmaceuticals and nucleic acids for gene therapy.
  • substance production by microorganisms is also applied to the production of protein pharmaceuticals and nucleic acids for gene therapy.
  • the production of ethanol, acetic acid, and proteins for medical use using microorganisms such as yeast and bacteria is actively applied industrially.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • Non-Patent Document 1 PHA is a biodegradable thermoplastic polyester that is produced and accumulated in the cells of many microbial species as an energy storage substance.
  • non-petroleum-derived plastics are attracting attention due to growing environmental awareness.
  • PHA which is produced and accumulated in the cells of microorganisms, is taken into the carbon cycle process of the natural world and has an adverse effect on the ecosystem. It is expected to be small, and its practical application is earnestly desired.
  • Non-Patent Document 2 In PHA production using microorganisms, for example, it is known that PHA is produced by supplying sugar, vegetable oil or fatty acid as a carbon source to bacteria of the genus Capriavidus and accumulating PHA in cells (Non-Patent Document 2). and 3).
  • PHAs produced by microorganisms are usually accumulated in the form of granules within the cells of the microorganisms. Therefore, in order to use PHAs as plastics, it is necessary to separate and recover the PHAs from the cells of the microorganisms. be. Further, in order to use PHA as a plastic, it is desirable to increase the purity of PHA and reduce the content of contaminants such as bacterial cell constituents as much as possible.
  • Patent Literatures 1 and 2 disclose a method of combining a treatment for crushing PHA-containing microbial cells and a surfactant treatment, a method of adding an alkali and performing a heat treatment followed by a crushing treatment, and the like.
  • Patent Document 3 discloses a method for obtaining PHA by treating an aqueous suspension of microbial cells with sodium hypochlorite, an enzyme, or the like to solubilize biological components other than PHA.
  • methods for recovering PHA from the resulting aqueous suspension include, for example, separation operations such as centrifugation and filtration, and spraying.
  • separation operations such as centrifugation and filtration, and spraying.
  • a drying operation using a dryer, a drum dryer, or the like can be mentioned.
  • the PHA concentration of the aqueous suspension is high in order to dry efficiently.
  • the higher the PHA concentration the lower the fluidity of the aqueous suspension and the more difficult the drying operation.
  • Patent Document 4 discloses a method of achieving good dispersibility by adding polyvinyl alcohol as a dispersant to a PHA aqueous dispersion.
  • the addition of dispersants may affect the processability of the recovered PHA, so addition of large amounts is undesirable.
  • Optimizing the shape of the particles contained in the aqueous suspension is conceivable as a means of improving the fluidity of the aqueous suspension while maintaining the concentration of the aqueous suspension at a high level.
  • the particle shape that provides the highest fluidity of the aqueous suspension is spherical.
  • the fluidity of the aqueous suspension tends to decrease as the surface area per unit volume of the particles increases, such as elliptical, plate-like, rod-like, and rod-like.
  • the shape of PHA particles depends on the shape of the microbial cells that accumulate the particles. In many cases, the shape of microbial cells with sufficient PHA accumulation is spherical. For example, when PHA is accumulated to about 90% in the KNK-005 strain, the cells become spherical, and the PHA particles obtained by crushing the cells are also spherical (see Reference Example 1 described later).
  • the shape of PHA-accumulating cells may not be spherical.
  • the cell division inhibitory enzyme minCD is overexpressed or some cell wall degrading enzyme genes are disrupted as in Patent Documents 5 and 6, PHA-accumulating cells become rod-shaped. PHA particles that accumulate in rod-shaped cells tend to be rod-shaped. Therefore, an aqueous PHA suspension obtained from rod-shaped PHA-accumulating cells tends to have low fluidity.
  • the object of the present invention is to provide a method for producing PHA that enables the collection of PHA particles that are more nearly spherical from rod-shaped PHA-accumulating cells.
  • the present inventors have discovered that when rod-shaped microbial cells that accumulate PHA are treated with a specific enzyme, the PHA particles become spherical, leading to the present invention.
  • the present invention comprises a step of culturing a polyhydroxyalkanoic acid-producing microorganism to obtain microbial cells that have accumulated polyhydroxyalkanoic acid, and a step of treating the microbial cells with an enzyme, wherein the microbial cells have a cell diameter of
  • the present invention relates to a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid having a number average aspect ratio of 2.0 or more, wherein the enzyme includes a cell wall degrading enzyme.
  • aqueous suspension containing the PHA particles can exhibit relatively high fluidity even if the PHA concentration is high because the PHA particles are nearly spherical. Therefore, the efficiency in the subsequent drying process and the like can be enhanced.
  • An embodiment of the present invention relates to a method for producing PHA, comprising the steps of culturing a PHA-producing microorganism to obtain microbial cells of a specific shape that accumulate PHA, and treating the microbial cells with an enzyme.
  • PHA The type of PHA is not particularly limited as long as it is a PHA that can be produced by microorganisms. It may be a homopolymer composed of one hydroxyalkanoic acid, or composed of two or more hydroxyalkanoic acids. It may be a copolymer to be used.
  • a homopolymer of one monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms, one monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms, and other of hydroxyalkanoic acid e.g., 2-hydroxyalkanoic acid, 4-hydroxyalkanoic acid, 5-hydroxyalkanoic acid, 6-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, etc.
  • hydroxyalkanoic acid e.g., 2-hydroxyalkanoic acid, 4-hydroxyalkanoic acid, 5-hydroxyalkanoic acid, 6-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, etc.
  • 4 to 16 carbon atoms and copolymers of two or more monomers selected from 3-hydroxyalkanoic acids e.g., 2-hydroxyalkanoic acid, 4-hydroxyalkanoic acid, 5-hydroxyalkanoic acid, 6-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, etc.
  • homopolymers or copolymers containing 3-hydroxybutyric acid as a monomer unit are preferred.
  • polymers include P(3HB), which is a homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (abbreviation: 3HB), and P(3HB-co), a copolymer of 3HB and 3-hydroxyvaleric acid (abbreviation: 3HV).
  • the type of PHA to be produced is appropriately selected according to the purpose, depending on the type of PHA synthase gene possessed by the microorganism to be used or separately introduced, the type of metabolic system gene involved in its synthesis, culture conditions, etc. I can.
  • the PHA-producing microorganism may be any microorganism capable of producing PHA.
  • the microorganism may be a microorganism having a PHA synthase gene.
  • the microorganism may be a wild strain that originally has a PHA synthase gene, a mutant strain obtained by artificially mutating such a wild strain, or a gene It may be a strain into which an exogenous PHA synthase gene has been introduced by engineering techniques.
  • the PHA-producing microorganism has a non-spherical cell shape, preferably a rod-like shape, when it accumulates PHA.
  • the PHA-producing microorganism may be a wild strain whose cell shape is non-spherical when PHA is accumulated, or may be a wild strain whose cell shape is non-spherical when PHA is accumulated by artificial mutation treatment or genetic engineering techniques. It may be a strain mutated to be non-spherical.
  • Examples include gene recombination and gene recombination that reduces the expression of the A1386 gene and/or the 2405 gene, which is a gene presumed to be a peptidoglycan hydrolase. These genetically modified strains can change the cell shape to non-spherical. However, gene recombination in which the cell shape changes to non-spherical is not limited to these examples.
  • the effect of the invention can be obtained by interrupting the culture at the stage when the cell shape is non-spherical and performing the enzymatic treatment according to the present disclosure.
  • the PHA-producing microorganism or the host of the microorganism is not particularly limited, but is preferably a bacillus, more preferably a Gram-negative bacillus.
  • the bacilli include bacteria belonging to the family Burkholderiaceae, such as the genus Ralstonia, the genus Cupriavidus, the genus Wautersia, and the genus Burkholderia, and Pseudomonas.
  • Preferable examples include bacteria belonging to the genus, bacteria belonging to the genus Halomonas, and bacteria belonging to the genus Escherichia.
  • bacteria belonging to the genus Ralstonia, Capriavidus, or Escherichia are more preferred, bacteria belonging to the genus Capriavidus or Escherichia are more preferred, and Capriavidus necator is particularly preferred. (Cupriavidus necator) or Escherichia coli.
  • PHA synthase gene The PHA synthase gene retained by the PHA-producing microorganism is not particularly limited, but PHAs derived from organisms belonging to the genus Ralstonia, Capriavidus, Woutersia, Alcaligenes, Aeromonas, Pseudomonas, Norcadia, and Chromobacterium. Examples include synthase genes and variants thereof. As the variant, a base sequence encoding a PHA synthase in which one or more amino acid residues have been deleted, added, inserted, or substituted can be used.
  • a gene having a nucleotide sequence encoding a polypeptide represented by an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5, and an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more to the amino acid sequence and a gene having a base sequence encoding a polypeptide having PHA synthase activity is preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, still more preferably 97% or higher, and particularly preferably 99% or higher.
  • the step of culturing the PHA-producing microorganism can be carried out by a person skilled in the art based on common technical knowledge, and the medium composition, carbon source addition method, culture scale, aeration and stirring conditions, culture temperature, culture time, etc. are particularly limited. not.
  • PHA can be accumulated in the cells of the PHA-producing microorganism.
  • PHA-producing microorganisms that have accumulated PHA in their cells are also referred to as PHA-accumulating cells.
  • the shape of PHA-accumulating cells which are non-spherical, preferably rod-shaped, can be confirmed by microscopic observation.
  • the shape of PHA-accumulating cells is defined by the number-average aspect ratio of the cell diameter of PHA-accumulating cells observed with a microscope.
  • the aspect ratio is the ratio (Lb/La) of the shortest minor axis length (La) and the longest major axis length (Lb) of the straight line passing through the center of the PHA-accumulating cell.
  • the number average aspect ratio is the number average value of the aspect ratios.
  • the number average aspect ratio of the cell diameter of PHA-accumulating cells is preferably 2.0 or more, more preferably 2.5 or more.
  • the upper limit of the number-average aspect ratio of the cell diameter is not particularly limited, it may be, for example, 10 or less, or 5 or less.
  • the method for calculating the number-average aspect ratio of the cell diameter of PHA-accumulating cells is as follows. In the image observed with an optical microscope, for each of 50 or more PHA-accumulating cells, the shortest short axis length (La) and the longest long axis length (Lb ) to calculate the aspect ratio (Lb/La). Then, by calculating the number average value of the obtained aspect ratios, the number average aspect ratio of the cell diameter of the PHA-accumulating cells can be obtained.
  • PHA particles are usually contained within a PHA-accumulating cell.
  • the number of PHA particles in the PHA-accumulating cells according to this embodiment is not particularly limited. However, if the total amount of PHA is the same, the larger the PHA particle size, the more fluid the aqueous suspension becomes. preferably.
  • Means for aggregating PHA particles in PHA-accumulating cells include heat or alkali treatment as disclosed in Appl Microbial Biotechnol (2019 Feb; 103(4): 1905-1917.). In particular, a method of treating with heat is preferred.
  • the heat treatment conditions are not particularly limited, but the treatment is preferably such that the PHA-accumulating cells are held at 50 to 90° C. for about 10 minutes to 7 hours.
  • a step of treating PHA-accumulating cells satisfying the above-mentioned number-average aspect ratio of cell diameter with an enzyme is carried out.
  • the enzyme it is preferable to use at least a cell wall degrading enzyme, and it is more preferable to use a protease in addition to the cell wall degrading enzyme.
  • the cell wall degrading enzyme is not particularly limited as long as it degrades the cell wall of bacteria, but examples include lysozyme, amylase, cellulase, maltase, saccharase, ⁇ and ⁇ -glycosinase. Lysozyme is particularly preferred.
  • cell wall-degrading enzymes examples include “egg white lysozyme” (manufactured by Nagase Chemtex Co., Ltd.), “lysozyme” (manufactured by Shandong Huayuan Jingmao), “biozyme A”, and “cellulase A “Amano” 3". , “Cellulase T “Amano” 4”, “ ⁇ -Glucosidase “Amano”” (manufactured by Amano Enzymes), “Termamyl”, “Cellsoft” (manufactured by Novozymes) and the like.
  • an enzyme composition containing a stabilizing agent for the enzyme, a surfactant, an anti-redeposition agent, and the like may also be used.
  • protease examples include, but are not limited to, alcalase, pepsin, trypsin, papain, chymotrypsin, aminopeptidase, carboxypeptidase, and the like.
  • proteolytic enzymes examples include “Protease A”, “Protease P”, “Protease N” (manufactured by Amano Enzyme), “Alcalase”, “Esperase”, “Zavinase”, and “Evarase”. (above, manufactured by Novozymes) and the like. These commercial products can be suitably used from the viewpoint of decomposition activity.
  • an enzyme composition containing a stabilizing agent for the enzyme, a surfactant, an anti-soil redeposition agent, etc. may also be used.
  • the temperature and pH conditions for enzyme treatment are preferably within the optimum range of the enzyme used.
  • Alcalase manufactured by Novozymes
  • the enzyme treatment is preferably carried out at a temperature of 50-60°C and a pH of 8-9.
  • Esperase manufactured by Novozymes
  • egg white lysozyme manufactured by Nagase ChemteX Corporation
  • it is preferable to carry out enzymatic treatment at a temperature of 40-50°C and a pH of 6-7.
  • the enzymatic treatment time can be set as appropriate in consideration of the effects of the invention, and is not particularly limited, but may be, for example, within the range of 0.5 to 8 hours.
  • the amount of enzyme used is not particularly limited, and may be set appropriately in consideration of the effects of the invention depending on the type and activity of the enzyme used. It is preferably in the range of 0.001 to 10 parts by weight, more preferably 0.001 to 5 parts by weight.
  • a cell wall-degrading enzyme as an enzyme. Sphericalization is possible.
  • a cell wall-degrading enzyme and a proteolytic enzyme are used in combination, one of the enzymes may be used for enzymatic treatment and then the other enzyme may be used for enzymatic treatment, or both enzymes may be used simultaneously for enzymatic treatment. processing may be performed.
  • the cell wall-degrading enzyme itself is a protein and can be degraded by the protease, it is necessary to perform the enzymatic treatment using the cell wall-degrading enzyme, and then add the protease to perform the enzymatic treatment with the protease. is preferred.
  • Cell crushing step and PHA recovery step After the enzymatic treatment, a crushing step of crushing the microbial cells to obtain a cell lysate and a recovery step of recovering the PHA particles from the cell lysate can be performed by well-known methods.
  • the PHA recovery step may be performed directly after the enzyme treatment. It is preferable to implement the PHA recovery process after the crushing process.
  • a known method can be applied, and is not particularly limited. method, a method using a surfactant, an alkali, or the like. By carrying out such a crushing step, the PHA-accumulating cells are further crushed, and a cell lysate in which cell components other than PHA are dissolved in water can be obtained.
  • PHA particles can be recovered as an aqueous PHA suspension in which the components are diluted.
  • the PHA aqueous suspension can be used as it is for processing.
  • PHA particles can also be recovered as powder by separating the PHA particles from the PHA aqueous suspension by filtration or centrifugation and drying.
  • the PHA particles are spherical, the fluidity of the aqueous suspension is relatively good even when the PHA particles are contained at a high concentration, and the concentration step or drying step described above can be efficiently performed. be able to.
  • the spheroidization of PHA particles by the enzyme treatment described above can be evaluated by the particle diameter span value obtained from the measurement results of a laser diffraction particle size distribution meter. Specifically, the degree of decrease in the particle diameter span value of PHA obtained by crushing PHA-accumulating cells after enzyme treatment compared to the particle diameter span value of PHA obtained by crushing PHA-accumulating cells before enzyme treatment. , the spheronization of PHA particles by enzymatic treatment can be evaluated.
  • the particle size span value of PHA after enzyme treatment is preferably 10% or more smaller than the particle size span value of PHA before enzyme treatment, and is preferably 15% or more. is more preferred. In a specific formula, it is calculated by 100 ⁇ (particle size span value of PHA before enzyme treatment ⁇ particle size span value of PHA after enzyme treatment)/(particle size span value of PHA before enzyme treatment). The value is preferably 10% or more, more preferably 15% or more. Although the upper limit is not particularly limited, it may be 70% or less, or 50% or less.
  • the particle size span value indicates the particle size distribution width, and indicates the value defined by the formula (D90-D10)/D50.
  • D10, D50, and D90 represent the particle diameters corresponding to the integrated values of the particle diameter distribution of 10%, 50%, and 90%, respectively.
  • the principle of evaluating changes in the shape of PHA particles based on changes in the particle size span value uses the properties of a laser diffraction particle size distribution analyzer.
  • a laser diffraction particle size distribution meter is premised on measuring spherical particles, when measuring non-spherical particles, the particle size distribution width tends to be larger than the actual particle size distribution width.
  • the particle size distribution width naturally changes depending on the variation in particle volume. Therefore, the particle size distribution width in a laser diffraction type particle size distribution analyzer depends on the variation in volume of the particles to be measured and the shape of the particles. That is, the smaller the variation in the volume of the particles and the closer the shape of the particles to a sphere, the smaller the particle diameter span value.
  • the absolute value of the particle size span of the PHA after the enzyme treatment cannot be univocally defined because the variation in the volume of the PHA particles accumulated in the microbial cells varies depending on the type of microorganism used and the method of culturing the microorganism. Although difficult, it is usually preferably 0.85 or less, more preferably 0.70 or less. Although the lower limit of the absolute value of the grain span is not particularly limited, it may be, for example, 0.3 or more, 0.4 or more, or 0.5 or more.
  • more spherical PHA particles can be recovered from rod-shaped microbial cells that accumulate PHA.
  • the step of concentrating or drying the PHA aqueous suspension can be carried out easily and efficiently.
  • the production method according to item 9, wherein the microorganism is a transformed microorganism of Escherichia coli.
  • Method of manufacture as described.
  • [Item 13] 13 The production method according to any one of items 1 to 12, wherein the polyhydroxyalkanoic acid is a polymer containing 3-hydroxybutyric acid as a monomer unit.
  • the polyhydroxyalkanoic acid is a copolymer of two or more hydroxyalkanoic acids.
  • a plasmid vector pCUP2-REP-phaCAB for expressing the phaCAB gene was constructed.
  • the gene expression plasmid vector pCUP2-REP-phaCAB was introduced into Escherichia coli BW25113 strain by the heat shock method.
  • KNK-005 strain was cultured under the following conditions to accumulate PHA in the cells, and then the shapes of the cells and PHA particles were evaluated.
  • the KNK-005 strain is a transformant in which a PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae (a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) is introduced onto the chromosome of the Capriavidus necator H16 strain. and can be produced according to the method described in US Pat. No. 7,384,766.
  • composition of the seed medium is 1 w/v % Meat-extract, 1 w/v % Bacto-Tryptone, 0.2 w/v % Yeast-extract, 0.9 w/v % Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.15 w. /v% KH2PO4 , (pH 6.8).
  • the composition of the pre-culture medium is 1.1 w/v% Na 2 HPO 4 .12H 2 O, 0.19 w/v% KH 2 PO 4 , 1.29 w/v% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 w.
  • Palm olein oil was added all at once at a concentration of 10 g/L as a carbon source.
  • the composition of the PHA production medium is 0.385 w/v% Na2HPO4.12H2O , 0.067 w/v% KH2PO4 , 0.291 w/v% ( NH4 ) 2SO4 , 0.1 w/v% v% MgSO4.7H2O , 0.5v/v% trace metal salt solution ( 1.6w/ v % FeCl3.6H2O , 1w/v% CaCl2.2H2O , 0.5v/v% in 0.1N hydrochloric acid ) .02 w/v% CoCl 2 .6H 2 O, 0.016 w/v% CuSO 4 .5H 2 O, and 0.012 w/v% NiCl 2 .6H 2 O).
  • the ratio of accumulated PHA to dry cells (hereinafter also referred to as PHA content) was measured as follows. Cells were collected from the culture medium by centrifugation, washed with ethanol, and freeze-dried to obtain dried cells. 100 ml of chloroform was added to 1 g of the obtained dried cells, and the mixture was stirred at room temperature for a whole day and night to extract PHA in the cells. After removing the bacterial cell residue by filtration, it was concentrated with an evaporator until the total volume reached 30 ml, and then 90 ml of hexane was gradually added and allowed to stand for 1 hour while slowly stirring. After the precipitated PHA was separated by filtration, it was vacuum-dried at 50° C. for 3 hours. The weight of the dry PHA was measured, and the ratio of the dry PHA weight to the dry cell weight was calculated as the PHA content.
  • the PHA particle size span was measured as follows. After the bacterial cell inactivation treatment described later, the culture solution before the enzyme treatment or after the enzyme treatment was suspended in an aqueous sodium dodecyl sulfate solution with a final concentration of 3.3%, and the cells were crushed by ultrasonication.
  • the particle size (D10, D50, D90) of the PHA particles was measured by analysis using a laser diffraction/scattering particle size distribution analyzer (Microtrac MT3300EXII manufactured by Microtrac Bell). Measurements were performed with standard settings (particle permeability: transparent, particle refractive index: 1.81, particle shape: aspherical, solvent refractive index: 1.333). From the measured D10, D50, and D90 values, (D90-D10)/D50 was calculated as the PHA particle size span.
  • PHA production culture PHA production culture was performed as follows. First, the KNK-005 strain glycerol stock (50 ⁇ l) was inoculated into a seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours to perform seed culture. Next, 1.0 v/v % of the seed culture was inoculated into a 3 L jar fermenter (MDL-300 manufactured by Marubishi Bioengineering Co., Ltd.) containing 1.8 L of preculture medium. The operating conditions were culture temperature of 33° C., agitation rate of 500 rpm, aeration rate of 1.8 L/min, and pH was controlled between 6.7 and 6.8 for 28 hours of culture for pre-culture. A 14% ammonium hydroxide aqueous solution was used for pH control.
  • 5.0 v/v % of the preculture solution was inoculated into a 5 L jar fermenter (MDS-U50 model manufactured by Marubishi Bioengineering Co., Ltd.) containing 2.5 L of PHA production medium.
  • the operating conditions were culture temperature of 33° C., stirring speed of 420 rpm, aeration rate of 2.1 L/min, and pH was controlled between 6.7 and 6.8.
  • a 25% ammonium hydroxide aqueous solution was used for pH control.
  • the carbon source was added intermittently. Palm olein oil was used as the carbon source. Culture was continued until the PHA content reached about 90%. After completion of the culture, the culture solution was heat-treated at 70° C.
  • FIG. 1 shows a photograph taken during the observation of the cells with an optical microscope as described above.
  • the KNK-005 strain had a number-average aspect ratio of the cell diameter after PHA accumulation of 1.55 and a spherical cell shape.
  • the minCD gene derived from Capriavidus necator (the gene encoding the cell division inhibitory enzyme described in SEQ ID NO: 7) was introduced onto the chromosome of the KNK-005 strain, and the A2405 gene (SEQ ID NO: 8 gene encoding the cell wall-degrading enzyme described in 1) is disrupted, and can be produced according to the method described in WO2021/049207.
  • the number average aspect ratio of cell diameter, and PHA particle size span were measured as described above. Table 1 shows the results.
  • FIG. 2 shows microscopic photographs of the cells observed as described above.
  • the number average aspect ratio of the cell diameter after PHA accumulation was 3.51, and the cell shape was rod-shaped.
  • the PHA particle size span was 46% or more larger.
  • Example 1 Shape evaluation of PHA particles of minCD-expressing A2405-disrupted strain after cell wall-degrading enzyme treatment After cooling the culture solution after the bacterial cell inactivation treatment in Comparative Example 1 to 50°C, egg white, which is a cell wall-degrading enzyme, Lysozyme (manufactured by Nagase Chemtex Co., Ltd.) was added in an amount corresponding to 0.0036% by weight of the bacterial cell components contained in the culture medium, and the mixture was stirred for 2 hours while controlling the pH at 6-7. PHA particle size span was measured as described above. Table 1 shows the results.
  • Example 1 compared with Comparative Example 1, the PHA particle size span was reduced by 13% or more, indicating that the PHA particles were sphericalized by the treatment with the cell wall-degrading enzyme.
  • Example 2 Shape evaluation of PHA particles of minCD-expressing A2405-disrupted strain after cell wall-degrading enzyme treatment and proteolytic enzyme treatment Alcalase (manufactured by Novozyme) was added in an amount corresponding to 1.1% by weight of the amount of bacterial cells contained in the culture solution, and stirred for 2 hours while controlling the pH at 8.2 to 8.8. PHA particle size span was measured as described above. Table 1 shows the results.
  • Example 2 compared with Comparative Example 1, the PHA particle diameter span was reduced by 32% or more, and the PHA particles were further sphericalized by the treatment using the cell wall-degrading enzyme and the proteolytic enzyme. I understand.
  • composition of the pre-culture medium was 1 w/v% Bacto-Tryptone, 0.5 w/v% Yeast-extract, and 1 w/v% NaCl12H 2 O (pH 6.8).
  • the composition of the PHA production medium was 1 w/v% Bacto-Tryptone, 0.5 w/v% Yeast-extract, 1 w/v% NaCl12H 2 O (pH 6.8), and 2% Glucose.
  • PHA production culture PHA production culture was performed as follows. First, a glycerol stock (50 ⁇ l) of the BW25113 phaCAB expressing strain was inoculated into a preculture medium (5 ml) and cultured at 37° C. for 18 hours to perform seed culture. Next, 1.0 v/v % of the preculture was inoculated into a 500 mL Sakaguchi flask containing 100 mL of PHA production medium. Culturing was performed at a culture temperature of 37° C. and a shaking speed of 120 rpm. Culture was continued until the PHA content reached about 60%. After completion of the culture, the culture solution was heat-treated at 60° C.
  • FIG. 3 shows a photograph taken during microscopic observation of the cells as described above.
  • the number average aspect ratio of the cell diameter after PHA accumulation was 3.02, and the cell shape was rod-shaped.
  • Example 3 Shape evaluation of PHA particles of BW25113 phaCAB expressing strain after treatment with cell wall-degrading enzyme After cooling the culture solution after the bacterial cell inactivation treatment in Comparative Example 2 to 50°C, egg white lysozyme, which is a cell wall-degrading enzyme, was added. (manufactured by Nagase Chemtex Co., Ltd.) was added in an amount corresponding to 0.0036% by weight of the amount of bacterial cells contained in the culture solution, and the mixture was stirred for 2 hours while controlling the pH at 6-7. PHA particle size span was measured as described above. Table 1 shows the results.
  • Example 3 compared with Comparative Example 2, the PHA particle size span was reduced by 11% or more, indicating that the PHA particles were spheroidized by the treatment using the cell wall-degrading enzyme.
  • Example 4 Shape evaluation of BW25113 phaCAB-expressing strain cells and PHA particles after cell wall degrading enzyme treatment and proteolytic enzyme treatment Alcalase (manufactured by Novozyme), an enzyme, was added in an amount corresponding to 1.1% by weight of the bacterial cell component contained in the culture solution, and the mixture was stirred for 2 hours while controlling the pH at 8.2 to 8.8. . PHA particle size span was measured as described above. Table 1 shows the results.
  • Example 4 compared with Comparative Example 2, the PHA particle diameter span was reduced by 17% or more, and the PHA particles were further sphericalized by the treatment with the cell wall-degrading enzyme and the proteolytic enzyme. I understand.

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Abstract

ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法は、ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養して、ポリヒドロキシアルカン酸を蓄積した微生物細胞を得る工程、及び前記微生物細胞を酵素で処理する工程を含む。前記微生物細胞は、細胞径の数平均アスペクト比が２．０以上であり、前記酵素が、細胞壁分解酵素を含む。前記酵素が、さらに、蛋白質分解酵素を含んでもよい。

Description

ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
　本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、天然又は自然志向の高まりなどを背景に、微生物を利用した物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義及び重要性が益々高まっており、タンパク質医薬品や遺伝子治療用の核酸などの製造にも、微生物による物質生産が応用されている。例えば、酵母やバクテリアなどの微生物を利用したエタノール、酢酸、医療用タンパク質の生産などが活発に産業応用されている。
　その一例として、生分解性プラスチックとしての産業利用が期待されているポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の微生物による生産が挙げられる（非特許文献１を参照）。ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生、蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されている。微生物を利用したＰＨＡ生産では、例えば、カプリアビダス属細菌に炭素源として糖、植物油脂や脂肪酸を与え、細胞内にＰＨＡを蓄積させることでＰＨＡを生産することが知られている（非特許文献２及び３を参照）。
　微生物が生成するＰＨＡは、通常顆粒体の形態でその微生物の菌体内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体からＰＨＡを分離して回収する工程が必要である。また、プラスチックとして使用するためにはＰＨＡの純度を高くし、菌体構成成分等の夾雑物の含有量をできるだけ低くすることが望まれる。
　ＰＨＡ以外の生物由来成分を分解及び／又は除去する方法として、ＰＨＡ以外の生物由来成分を物理的処理、化学的処理又は生物学的処理によって可溶化させて除去する方法が提案されている。例えば、特許文献１や２には、ＰＨＡ含有微生物菌体を破砕する処理と界面活性剤処理を組み合わせる方法、アルカリを添加し加熱処理を行った後に破砕処理を行う方法などが開示されている。また、特許文献３では、微生物菌体の水性懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムや酵素などで処理してＰＨＡ以外の生物由来成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が開示されている。
　ＰＨＡ含有微生物の菌体を破砕もしくはＰＨＡ以外の生物由来成分を可溶化した後、得られた水性懸濁液からＰＨＡを回収する手段としては、例えば、遠心分離やろ過などの分離操作や、スプレードライヤーやドラムドライヤーなどを用いた乾燥操作等が挙げられる。
特表平０８－５０２４１５号公報 国際公開第２００４／０６５６０８号 特開２００５－３４８６４０号公報 特開２０１９－９７５１８号公報 国際公開第２０２０／１７４９８８号 国際公開第２０２１／０４９２０７号
Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＡＪ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，２０１－１０５（１９９０） Ｓａｔｏ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２０（３），２４６－２５１（２０１５） Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ　Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２７，３８－４５（２０１５）
　前記水性懸濁液の乾燥操作においては、乾燥を効率よく行うため、水性懸濁液のＰＨＡ濃度が高いことが望ましい。しかし、ＰＨＡ濃度が高くなるほど水性懸濁液の流動性は低下し、乾燥操作は困難になる。つまり、水性懸濁液のＰＨＡ濃度に関して、乾燥工程の効率と容易さはトレードオフの関係にあり、水性懸濁液のＰＨＡ濃度を高位で維持したまま、該水性懸濁液の流動性を向上させることは困難であった。
　特許文献４では、ＰＨＡ水性分散液に対して、分散剤としてポリビニルアルコールを加えることで良好な分散性を達成する方法が開示されている。しかし、分散剤の添加は、回収したＰＨＡの加工性に影響し得るため、多量の添加は望ましくない。
　水性懸濁液の濃度を高位で維持しつつ該水性懸濁液の流動性を向上させる手段として、該水性懸濁液に含まれる粒子の形状の最適化が考えられる。一般的に、水性懸濁液の流動性が最も高くなる粒子形状は球状である。粒子形状が楕円球状、板状、桿状、棒状と同一体積あたりの表面積が大きくなるほど、水性懸濁液の流動性は低下する傾向がある。
　ＰＨＡ粒子の形状は、該粒子を蓄積する微生物細胞の形状に左右される。多くの場合、ＰＨＡを十分に蓄積した微生物細胞の形状は球状である。例えば、ＫＮＫ－００５株にＰＨＡを９０％程度蓄積させると、細胞は球状となり、該細胞を破砕処理して得られるＰＨＡ粒子も球状である（後述する参考例１を参照）。
　しかし、ＰＨＡを生産する微生物の種類や、導入する遺伝子組換えの種類によっては、ＰＨＡ蓄積細胞の形状が球状にならない場合がある。例えば、特許文献５や特許文献６のように細胞分裂阻害酵素であるｍｉｎＣＤを過剰発現したり、一部の細胞壁分解酵素遺伝子を破壊したりするなどした場合、ＰＨＡ蓄積細胞は桿状となる。桿状の細胞で蓄積されるＰＨＡ粒子は桿状となる傾向がある。そのため、桿状のＰＨＡ蓄積細胞から得られるＰＨＡ水性懸濁液は、流動性が低下しやすい。
　本発明は、上記現状に鑑み、桿状のＰＨＡ蓄積細胞から、より球形に近いＰＨＡ粒子を回収することが可能な、ＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＰＨＡを蓄積した桿状の微生物細胞を特定の酵素で処理すると、ＰＨＡ粒子が球状化することを見出し、本発明に至った。
　すなわち本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養して、ポリヒドロキシアルカン酸を蓄積した微生物細胞を得る工程、及び前記微生物細胞を酵素で処理する工程を含み、前記微生物細胞は、細胞径の数平均アスペクト比が２．０以上であり、前記酵素が、細胞壁分解酵素を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　本発明によれば、桿状のＰＨＡ蓄積細胞から、より球形に近いＰＨＡ粒子を回収することが可能になる。該ＰＨＡ粒子を含む水性懸濁液は、ＰＨＡ粒子が球形に近いため、ＰＨＡ濃度が高くても比較的高い流動性を示すことが可能となる。そのため、後の乾燥工程などにおける効率を高めることができる。
参考例１で得たＰＨＡ蓄積細胞を撮影した顕微鏡写真 比較例１で得たＰＨＡ蓄積細胞を撮影した顕微鏡写真 比較例２で得たＰＨＡ蓄積細胞を撮影した顕微鏡写真
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本発明の実施形態は、ＰＨＡ生産微生物を培養して、ＰＨＡを蓄積した特定形状の微生物細胞を得る工程、及び、前記微生物細胞を酵素で処理する工程を含む、ＰＨＡの製造方法に関する。
　（ＰＨＡ）
　前記ＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、１種のヒドロキシアルカン酸から構成される単独重合体であってもよいし、２種以上のヒドロキシアルカン酸から構成される共重合体であってもよい。具体的には、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸など）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体などが挙げられる。
　なかでも、３－ヒドロキシ酪酸をモノマーユニットとして含有する単独重合体又は共重合体が好ましい。そのような重合体としては、例えば、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。
　生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
　（ＰＨＡ生産微生物）
　前記ＰＨＡ生産微生物は、ＰＨＡを生産する能力を有する微生物であればよい。該微生物はＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物であってよい。該微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株であってもよいし、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された菌株であってもよい。
　本実施形態において、前記ＰＨＡ生産微生物は、ＰＨＡを蓄積した時に、その細胞形状が、非球形、好ましくは桿状となるものである。該ＰＨＡ生産微生物は、ＰＨＡを蓄積した時の細胞形状が非球形となる野生株であってもよいし、人工的な突然変異処理や遺伝子工学的手法によって、ＰＨＡを蓄積した時の細胞形状が非球形となるように変異した菌株であってもよい。
　人工的な突然変異処理や遺伝子工学的手法によるＰＨＡ蓄積細胞の形状変化は、意図の有無に関わらない。例えば、ＰＨＡ蓄積細胞やＰＨＡ粒子を濾過や遠心分離により回収する工程の効率向上を目的として、ＰＨＡ蓄積細胞が大型化するような形質転換を行い、その結果として、ＰＨＡ蓄積細胞の形状が非球形になるように変異した菌株であっても良い。ＰＨＡ蓄積細胞を大型化する手法としては、例えば、特許文献５又は特許文献６に開示されているような、細胞分裂を制御するタンパク質であるＭｉｎＣ及び／又はＭｉｎＤをコードする遺伝子の発現を強化する遺伝子組換えや、ペプチドグリカンの加水分解酵素と推定されている遺伝子である、Ａ１３８６遺伝子及び／又は２４０５遺伝子の発現を低下させる遺伝子組換えなどが挙げられる。これらの遺伝子組換えを行った菌株では細胞形状が非球形に変化し得る。但し、細胞形状が非球形に変化する遺伝子組換えは、これらの例に限定されない。
　また、ＰＨＡを十分に蓄積した時の細胞形状が球状になるような菌株であっても、蓄積の途上では細胞形状が非球状を呈する場合も想定される。そのような菌株については、細胞形状が非球状である段階で培養を中断して、本開示に係る酵素処理を行うことで、発明の効果を得ることが可能である。
　前記ＰＨＡ生産微生物、又は、当該微生物の宿主は、特に限定されないが、好ましくは桿菌であり、より好ましくはグラム陰性の桿菌である。当該桿菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属などバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する細菌類や、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌類、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ属に属する細菌類、エスシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。
　安全性及びＰＨＡ生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、又はエスシェリキア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属、又はエスシェリキア属に属する細菌であり、特に好ましくは、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）、又は、エスシェリキア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）
　前記ＰＨＡ生産微生物が保持するＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、ラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アルカリゲネス属、アエロモナス属、シュードモナス属、ノルカディア属、クロモバクテリウム属に類する生物に由来するＰＨＡ合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体としては、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。例えば、配列番号１～５のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で示され、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。前記配列同一性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
　（培養）
　前記ＰＨＡ生産微生物を培養する工程は、当業者が技術常識に基づいて実施することができ、培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。培養を適切な時間行うことで、ＰＨＡ生産微生物の菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。以下では、菌体内にＰＨＡを蓄積したＰＨＡ生産微生物を、ＰＨＡ蓄積細胞ともいう。
　（ＰＨＡ蓄積細胞の形状）
　非球形、好ましくは桿状であるＰＨＡ蓄積細胞の形状は、顕微鏡観察によって確認することができる。定量的には、顕微鏡観察したＰＨＡ蓄積細胞の細胞径の数平均アスペクト比によって、ＰＨＡ蓄積細胞の形状を定義する。ここで、アスペクト比とは、ＰＨＡ蓄積細胞の中心を通る直線のうち、最も短い短軸方向の長さ（Ｌａ）と、最も長い長軸方向の長さ（Ｌｂ）の比（Ｌｂ／Ｌａ）であり、数平均アスペクト比とは、前記アスペクト比の数平均値である。数平均アスペクト比が１に近いほど、ＰＨＡ蓄積細胞の形状が球形に近く、数平均アスペクト比が大きくなるほど、ＰＨＡ蓄積細胞の形状が細長い桿状であることを意味する。本実施形態において、ＰＨＡ蓄積細胞の細胞径の数平均アスペクト比は、２．０以上であることが好ましく、２．５以上であることがより好ましい。前記細胞径の数平均アスペクト比の上限値は特に限定されないが、例えば、１０以下であってよく、また、５以下であってもよい。
　ＰＨＡ蓄積細胞の細胞径の数平均アスペクト比の算出方法は次の通りである。光学顕微鏡で観察した画像において、５０個以上のＰＨＡ蓄積細胞それぞれについて、細胞の中心を通る直線のうち、最も短い短軸方向の長さ（Ｌａ）と、最も長い長軸方向の長さ（Ｌｂ）を測定し、アスペクト比（Ｌｂ／Ｌａ）を算出する。その後、得られたアスペクト比の数平均値を算出することで、ＰＨＡ蓄積細胞の細胞径の数平均アスペクト比を求めることができる。
　（任意の凝集工程）
　ＰＨＡ蓄積細胞内には、通常、１個又は複数個のＰＨＡ粒子が包含されている。本実施形態に係るＰＨＡ蓄積細胞内のＰＨＡ粒子の個数は特に限定されない。しかし、ＰＨＡの総量が同じであればＰＨＡ粒子径が大きいほど水性懸濁液の流動性が向上するので、酵素処理の前に、ＰＨＡ蓄積細胞内の複数個のＰＨＡ粒子を凝集させる処理を実施することが好ましい。ＰＨＡ蓄積細胞内のＰＨＡ粒子を凝集させる手段としては、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１９　Ｆｅｂ；１０３（４）：１９０５－１９１７．）に開示されているような、熱又はアルカリで処理する方法が挙げられる。特に、熱で処理する方法が好ましい。熱処理の条件は特に限定されないが、ＰＨＡ蓄積細胞を、５０～９０℃で、１０分間～７時間程度保持するような処理であることが好ましい。
　（酵素処理）
　本実施形態では、上述した細胞径の数平均アスペクト比を満足するＰＨＡ蓄積細胞を、酵素で処理する工程を実施する。当該酵素としては、少なくとも細胞壁分解酵素を用いることが好ましく、細胞壁分解酵素に加えて、蛋白質分解酵素を用いることがより好ましい。
　前記細胞壁分解酵素としては、細菌の細胞壁を分解する酵素であれば特に限定されないが、例えば、リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α及びβ－グリコシナーゼなどが挙げられる。特に、リゾチームが好ましい。
　前記細胞壁分解酵素の市販品としては、例えば、「卵白リゾチーム」（ナガセケムテックス社製）、「リゾチーム」（山東省華源経貿製）、「ビオザイムＡ」、「セルラーゼＡ「アマノ」３」、「セルラーゼＴ「アマノ」４」、「α－グルコシダーゼ「アマノ」」（以上、天野エンザイム社製）、「ターマミル」、「セルソフト」（以上、ノボザイムズ社製）等が挙げられる。また、細胞壁分解酵素に加えて、該酵素の安定化剤や、界面活性化剤、再汚染防止剤なども含有する酵素組成物を使用してもよい。
　前記蛋白質分解酵素としては、特に限定されないが、例えば、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどが挙げられる。
　前記蛋白質分解酵素の市販品としては、例えば、「プロテアーゼＡ」、「プロテアーゼＰ」、「プロテアーゼＮ」（以上、天野エンザイム社製）、「アルカラーゼ」、「エスペラーゼ」、「ザビナーゼ」、「エバラーゼ」（以上、ノボザイムズ社製）等が挙げられる。これら市販品は分解活性の点からも好適に使用できる。また、蛋白質分解酵素に加えて、該酵素の安定化剤や、界面活性化剤、再汚染防止剤なども含有する酵素組成物を使用してもよい。
　酵素処理の温度とｐＨ条件は、使用する酵素の至適値の範囲内であることが好ましい。例えば、アルカラーゼ（ノボザイムズ社製）を使用する場合は、温度：５０～６０℃、ｐＨ：８～９の範囲内で酵素処理を実施することが好ましい。また、エスペラーゼ（ノボザイムズ社製）を使用する場合は、温度：５５～６５℃、ｐＨ：８～１０の範囲内で酵素処理を実施することが好ましい。卵白リゾチーム（ナガセケムテックス社製）を使用する場合は、温度：４０～５０℃、ｐＨ：６～７の範囲内で酵素処理を実施することが好ましい。
　酵素処理の時間は、発明の効果を勘案して適宜設定することができ、特に限定されないが、例えば、０．５～８時間の範囲内にあればよい。
　酵素の使用量は、使用する酵素の種類及び活性に依存して、発明の効果を勘案して適宜設定すればよく、特に限定されないが、例えば、菌体成分量１００重量部に対して、０．００１～１０重量部の範囲内にあることが好ましく、０．００１～５重量部がより好ましい。
　本実施形態に係る酵素処理では、酵素として細胞壁分解酵素のみを用いても、ＰＨＡ粒子を球状化することは可能であるが、細胞壁分解酵素と蛋白質分解酵素を併用することにより、ＰＨＡ粒子をより球状化することが可能になる。
　細胞壁分解酵素と蛋白質分解酵素を併用する時には、一方の酵素を用いて酵素処理を実施してから、他方の酵素を用いた酵素処理を実施しても良いし、双方の酵素を同時に用いて酵素処理を実施しても良い。しかしながら、細胞壁分解酵素自体が蛋白質であり、蛋白質分解酵素により分解され得るため、細胞壁分解酵素を用いた酵素処理を実施した後に、蛋白質分解酵素を添加して蛋白質分解酵素による酵素処理を実施することが好ましい。
　（細胞の破砕工程及びＰＨＡの回収工程）
　前記酵素処理を実施した後、周知の方法で、微生物細胞を破砕して細胞破砕液を得る破砕工程と、前記細胞破砕液からＰＨＡ粒子を回収する回収工程を実施することができる。
　前記酵素処理によっても微生物細胞はある程度破砕され得るため、当該酵素処理実施後に直接、ＰＨＡの回収工程を実施しても良いが、細胞成分をより取り除くために、前記酵素処理とは別に破砕工程を実施し、その破砕工程の後にＰＨＡの回収工程を実施することが好ましい。そのような破砕工程としては、公知の方法を適用することができ、特に限定されないが、例えば、細胞壁分解酵素と蛋白質分解酵素以外の酵素を用いて処理する方法や、機械的なせん断力を加える方法、界面活性剤やアルカリなどを用いる方法などが挙げられる。このような破砕工程を実施することで、ＰＨＡ蓄積細胞がより破砕され、ＰＨＡ以外の細胞成分が水に溶解した細胞破砕液を得ることができる。
　ＰＨＡの回収工程としても公知の方法を適用することができ、特に限定されないが、例えば、前記細胞破砕液の濾過や遠心分離によるＰＨＡ粒子の濃縮と水系への再懸濁を繰り返すことにより、細胞成分が希釈されたＰＨＡ水性懸濁液としてＰＨＡ粒子を回収することができる。当該ＰＨＡ水性懸濁液をそのまま加工に使用することもできる。
　また、濾過や遠心分離によりＰＨＡ水性懸濁液からＰＨＡ粒子を分離し、乾燥させることで、粉体としてＰＨＡ粒子を回収することもできる。
　本発明によると、ＰＨＡ粒子が球状化しているため、ＰＨＡ粒子を高濃度で含む場合においても水性懸濁液の流動性が比較的良好であり、上述した濃縮工程又は乾燥工程を効率よく実施することができる。
　（ＰＨＡ粒子の球状化）
　前述した酵素処理によるＰＨＡ粒子の球状化は、レーザー回折式の粒度分布計の測定結果から得られる粒子径スパン値により評価することができる。具体的には、酵素処理前のＰＨＡ蓄積細胞を破砕して得られるＰＨＡの粒子径スパン値と比較した、酵素処理後のＰＨＡ蓄積細胞を破砕して得られるＰＨＡの粒子径スパン値の減少度合に基づいて、酵素処理によるＰＨＡ粒子の球形化を評価することができる。
　本実施形態において、酵素処理後のＰＨＡの粒子径スパン値は、酵素処理前のＰＨＡの粒子径スパン値と比較して１０％以上小さい値であることが好ましく、１５％以上小さい値であることがより好ましい。具体的な式で示すと、１００×（酵素処理前のＰＨＡの粒子径スパン値－酵素処理後のＰＨＡの粒子径スパン値）／（酵素処理前のＰＨＡの粒子径スパン値）で算出される値が１０％以上であることが好ましく、１５％以上であることがより好ましい。上限値は特に限定されないが、７０％以下であってよく、また、５０％以下であってもよい。
　ここで、粒子径スパン値は、粒子径分布幅を示し、（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０の式で定義される値を示す。ここで、Ｄ１０、Ｄ５０、Ｄ９０は、それぞれ、粒子径分布の積算値が１０％、５０％、９０％に相当する粒子径を表す。尚、粒子径スパン値を算出するにあたっては、培養後で酵素処理前の培養液を７０℃で１時間処理して、菌体細胞不活化と細胞内のＰＨＡ粒子の凝集を行うことが望ましい。
　粒子径スパン値の変化によりＰＨＡ粒子の形状の変化を評価する原理は、レーザー回折式の粒度分布計の性質を利用する。一般的に、レーザー回折式の粒度分布計は球形粒子を測定することを前提としているため、非球形粒子を測定すると粒子径分布幅が実際の粒子径分布幅より大きくなる性質がある。また、当然ながら粒子径分布幅は、粒子の体積のばらつきによっても変化する。従って、レーザー回折式の粒度分布計における粒子径分布幅は、測定対象である粒子の体積のばらつきと、粒子の形状に依存する。すなわち、粒子の体積のばらつきが小さいほど、粒子の形状が球形に近いほど、粒子径スパン値が小さくなる。
　前記酵素処理後のＰＨＡの粒子径スパンの絶対値は、使用する微生物の種類や微生物を培養する方法により微生物細胞に蓄積されるＰＨＡ粒子の体積のばらつきが異なるため、一義的に規定することは困難であるが、通常、０．８５以下であることが好ましく、０．７０以下がより好ましい。前記粒子スパンの絶対値の下限は特に限定されないが、例えば、０．３以上であってよく、また、０．４以上であってもよく、０．５以上であってもよい。
　本発明によると、ＰＨＡを蓄積した桿状の微生物細胞から、より球形に近いＰＨＡ粒子を回収することができる。その結果、ＰＨＡ水性懸濁液の濃縮又は乾燥工程を容易に効率よく実施することができる。
　以下の各項目では、本開示における好ましい態様を列挙するが、本発明は以下の項目に限定されるものではない。
［項目１］
　ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養して、ポリヒドロキシアルカン酸を蓄積した微生物細胞を得る工程、及び
　前記微生物細胞を酵素で処理する工程を含み、
　前記微生物細胞は、細胞径の数平均アスペクト比が２．０以上であり、
　前記酵素が、細胞壁分解酵素を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
［項目２］
　前記酵素が、さらに、蛋白質分解酵素を含む、項目１に記載の製造方法。
［項目３］
　前記酵素で処理する工程後のポリヒドロキシアルカン酸の粒子径スパン値は、前記酵素で処理する工程前のポリヒドロキシアルカン酸の粒子径スパン値と比較して１０％以上小さい値である、項目１または２に記載の製造方法。
［項目４］
　前記酵素で処理する工程後のポリヒドロキシアルカン酸の粒子径スパン値は、０．８５以下である、項目１～３のいずれかに記載の製造方法。
［項目５］
　前記微生物が桿菌の形質転換微生物である、項目１～４のいずれかに記載の製造方法。
［項目６］
　前記微生物がグラム陰性細菌の形質転換微生物である、項目１～５のいずれかに記載の製造方法。
［項目７］
　前記微生物がカプリアビダス属に属する、項目６に記載の製造方法。
［項目８］
　前記微生物がカプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物である、項目７に記載の製造方法。
［項目９］
　前記微生物がエスシェリキア属に属する、項目６に記載の製造方法。
［項目１０］
　前記微生物がエスシェリキア・コリーの形質転換微生物である、項目９に記載の製造方法。
［項目１１］
　前記微生物細胞を得る工程の後で、前記酵素で処理する工程の前に、前記微生物細胞を熱処理する工程をさらに含む、項目１～１０のいずれかに記載の製造方法。
［項目１２］
　前記酵素で処理する工程の後に、前記微生物細胞を破砕して細胞破砕液を得る工程と、前記細胞破砕液からポリヒドロキシアルカン酸粒子を回収する工程をさらに含む、項目１～１１のいずれかに記載の製造方法。
［項目１３］
　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸をモノマーユニットとして含有する重合体である、項目１～１２のいずれかに記載の製造方法。
［項目１４］
　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、項目１～１３のいずれかに記載の製造方法。
［項目１５］
　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、項目１４に記載の製造方法。
［項目１６］
　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、項目１５に記載の製造方法。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　（製造例１）ＢＷ２５１１３　ｐｈａＣＡＢ発現株の作製
　まず、遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プロモーター配列、ＰＨＡ合成に関連する３つの遺伝子であるｐｈａＣＡＢ遺伝子の配列、およびターミネーターの塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号６）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＭｕｎＩおよびＳｐｅＩ消化した特許第５６５０３６８号に記載のベクターｐＣＵＰ２とＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＣＡＢ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ＲＥＰ－ｐｈａＣＡＢを作製した。次に遺伝子発現用プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ＲＥＰ－ｐｈａＣＡＢを、ヒートショック法により、エスシェリキア・コリー　ＢＷ２５１１３株に導入した。
　（参考例１）ＫＮＫ－００５株の細胞およびＰＨＡ粒子の形状評価
　下記の条件でＫＮＫ－００５株を培養して細胞内にＰＨＡを蓄積させた後、細胞およびＰＨＡ粒子の形状評価を行なった。
　ＫＮＫ－００５株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体であり、米国特許第７３８４７６６号明細書に記載の方法に準じて作製することができる。
　（培地）
　種母培地の組成は１ｗ／ｖ％　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％　Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ　、０．１５ｗ／ｖ％　ＫＨ2ＰＯ4、（ｐＨ６．８）とした。
　前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％　Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ2ＰＯ4、１．２９　ｗ／ｖ％（ＮＨ4）2ＳＯ4　、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．５ｗ／ｖ％　パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源としてパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
　ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％　Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％　ＫＨ2ＰＯ4、０・２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ4）2ＳＯ4　、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏを溶かしたもの）とした。
　（乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合の測定方法）
　乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合（以下、ＰＨＡ含量ともいう）は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、乾燥菌体重量に対する乾燥ＰＨＡ重量の割合を算出して、ＰＨＡ含量とした。
　（細胞の顕微鏡観察および細胞径の数平均アスペクト比の算出方法）
　細胞の顕微鏡観察は次のように行った。培養液を適宜希釈し、スライドガラスにのせて乾燥させた後、フクシンによって染色した。光学顕微鏡によって染色された細胞を観察した。観察した細胞から無作為に５０個の細胞を選出し、細胞のＬａおよびＬｂをそれぞれ測定し、Ｌａ／Ｌｂを算出した。Ｌａ／Ｌｂの平均値を細胞径の数平均アスペクト比とした。また、Ｌａ、Ｌｂのそれぞれの平均値を測定した。
　（ＰＨＡ粒子径スパンの測定方法）
　ＰＨＡ粒子径スパンは次のように測定した。後述する菌体細胞不活化処理後で酵素処理前、または酵素処理後の培養液を終濃度３．３％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕した後、完全レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル社製Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ　ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）により解析し、ＰＨＡ粒子の粒子径（Ｄ１０、Ｄ５０、Ｄ９０）を測定した。測定は標準的な設定（粒子透過性：透過、粒子屈折率：１．８１、粒子形状：非球形、溶媒屈折率：１．３３３）で行った。測定したＤ１０、Ｄ５０、Ｄ９０の値から（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０を算出し、ＰＨＡ粒子径スパンとした。
　（ＰＨＡ生産培養）
　ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、種母培養を行なった。次に、種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。培養はＰＨＡ含量が９０％程度に達するまで行った。
　培養終了後、培養液を７０℃で１時間熱処理して菌体細胞不活化および細胞内のＰＨＡ粒子の熱凝集を行った。
　細胞径の数平均アスペクト比、およびＰＨＡ粒子径スパンは前述のように測定した。結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の光学顕微鏡観察時に撮影した写真を図１に示す。
　検討の結果、ＫＮＫ－００５株は、ＰＨＡ蓄積後の細胞径の数平均アスペクト比が１．５５であり、細胞形状は球状だった。
　（比較例１）ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株の細胞およびＰＨＡ粒子の形状評価
　参考例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株を培養して細胞内にＰＨＡを蓄積させた後、培養液を７０℃で１時間熱処理して菌体細胞不活化および細胞内のＰＨＡ粒子の熱凝集を行った。
　ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株は、ＫＮＫ－００５株の染色体上にカプリアビダス・ネカトール由来のｍｉｎＣＤ遺伝子（配列番号７に記載の細胞分裂阻害酵素をコードする遺伝子）が導入され、かつ、Ａ２４０５遺伝子（配列番号８に記載の細胞壁分解酵素をコードする遺伝子）を破壊した形質転換体であり、国際公開第２０２１／０４９２０７号に記載の方法に準じて作製することができる。
　細胞径の数平均アスペクト比、およびＰＨＡ粒子径スパンは前述のように測定した。結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図２に示す。
　検討の結果、ＰＨＡ蓄積後の細胞径の数平均アスペクト比は３．５１であり、細胞形状は桿状だった。また、参考例１と比較して、ＰＨＡ粒子径スパンが４６％以上大きい値だった。
　（実施例１）細胞壁分解酵素処理後のｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株のＰＨＡ粒子の形状評価
　比較例１の菌体細胞不活化処理後の培養液を５０℃に冷却した後、細胞壁分解酵素である卵白リゾチーム（ナガセケムテックス社製）を、培養液に含まれる菌体成分量の０．００３６重量％にあたる量を添加して、ｐＨを６～７にコントロールしながら、２時間撹拌した。ＰＨＡ粒子径スパンは前述のように測定した。結果を表１に示す。
　検討の結果、実施例１では、比較例１と比較して、ＰＨＡ粒子径スパンが１３％以上減少しており、細胞壁分解酵素を用いた処理によってＰＨＡ粒子が球状化したことが分かる。
　（実施例２）細胞壁分解酵素処理および蛋白質分解酵素処理後のｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株のＰＨＡ粒子の形状評価
　実施例１の細胞壁分解酵素処理後の培養液を５０℃に維持したまま、蛋白質分解酵素であるアルカラーゼ（ノボザイム製）を、培養液に含まれる菌体成分量の１．１重量％にあたる量を添加して、ｐＨを８．２～８．８にコントロールしながら、２時間撹拌した。ＰＨＡ粒子径スパンは前述のように測定した。結果を表１に示す。
　検討の結果、実施例２では、比較例１と比較して、ＰＨＡ粒子径スパンが３２％以上減少しており、細胞壁分解酵素と蛋白質分解酵素を用いた処理によってＰＨＡ粒子がさらに球状化したことが分かる。
　なお、参考例１、比較例１、及び実施例１～２によって生産されたＰＨＡはＰＨＢＨであることをＨＰＬＣ分析にて確認した。
　（比較例２）ＢＷ２５１１３　ｐｈａＣＡＢ発現株の細胞およびＰＨＡ粒子の形状評価
　下記の条件でＢＷ２５１１３　ｐｈａＣＡＢ発現株を培養して細胞内にＰＨＡを蓄積させた後、細胞およびＰＨＡ粒子の形状評価を行なった。
　（培地）
　前培養培地の組成は１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　ＮａＣｌ１２Ｈ2Ｏ（ｐＨ６．８）とした。
　ＰＨＡ生産培地の組成は１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　ＮａＣｌ１２Ｈ2Ｏ（ｐＨ６．８）、２％　Ｇｌｕｃｏｓｅとした。
　（ＰＨＡ生産培養）
　ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＢＷ２５１１３　ｐｈａＣＡＢ発現株のグリセロールストック（５０μｌ）を前培養培地（５ｍｌ）に接種して３７℃で１８時間培養し種母培養を行なった。次に、前培養液を、１００ｍＬのＰＨＡ生産培地を入れた５００ｍＬ坂口フラスコに１．０ｖ／ｖ％接種した。培養温度３７℃、振盪速度１２０ｒｐｍで培養した。培養はＰＨＡ含量が６０％程度に達するまで行った。
　培養終了後、培養液を６０℃で１時間熱処理して菌体細胞不活化および細胞内のＰＨＡ粒子の熱凝集を行った。
　細胞径の数平均アスペクト比、およびＰＨＡ粒子径スパンは前述のように測定した。結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察時に撮影した写真を図３に示す。
　検討の結果、ＰＨＡ蓄積後の細胞径の数平均アスペクト比は３．０２であり、細胞形状は桿状だった。
　（実施例３）細胞壁分解酵素処理後のＢＷ２５１１３　ｐｈａＣＡＢ発現株のＰＨＡ粒子の形状評価
　比較例２の菌体細胞不活化処理後の培養液を５０℃に冷却した後、細胞壁分解酵素である卵白リゾチーム（ナガセケムテックス社製）を、培養液に含まれる菌体成分量の０．００３６重量％にあたる量を添加して、ｐＨを６～７にコントロールしながら、２時間撹拌した。ＰＨＡ粒子径スパンは前述のように測定した。結果を表１に示す。
　検討の結果、実施例３では、比較例２と比較して、ＰＨＡ粒子径スパンが１１％以上減少しており、細胞壁分解酵素を用いた処理によってＰＨＡ粒子が球状化したことが分かる。
　（実施例４）細胞壁分解酵素処理および蛋白質分解酵素処理後のＢＷ２５１１３　ｐｈａＣＡＢ発現株の細胞およびＰＨＡ粒子の形状評価
　実施例３の細胞壁分解酵素処理後の培養液を５０℃に維持したまま、蛋白質分解酵素であるアルカラーゼ（ノボザイム製）を、培養液に含まれる菌体成分量の１．１重量％にあたる量を添加して、ｐＨを８．２～８．８にコントロールしながら、２時間撹拌した。ＰＨＡ粒子径スパンは前述のように測定した。結果を表１に示す。
　検討の結果、実施例４では、比較例２と比較して、ＰＨＡ粒子径スパンが１７％以上減少しており、細胞壁分解酵素と蛋白質分解酵素を用いた処理によってＰＨＡ粒子がさらに球状化したことが分かる。
　なお、比較例２、及び実施例３～４によって生産されたＰＨＡはＰ（３ＨＢ）であることをＨＰＬＣ分析にて確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (16)

  1. 　ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養して、ポリヒドロキシアルカン酸を蓄積した微生物細胞を得る工程、及び
    　前記微生物細胞を酵素で処理する工程を含み、
    　前記微生物細胞は、細胞径の数平均アスペクト比が２．０以上であり、
    　前記酵素が、細胞壁分解酵素を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  2. 　前記酵素が、さらに、蛋白質分解酵素を含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記酵素で処理する工程後のポリヒドロキシアルカン酸の粒子径スパン値は、前記酵素で処理する工程前のポリヒドロキシアルカン酸の粒子径スパン値と比較して１０％以上小さい値である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記酵素で処理する工程後のポリヒドロキシアルカン酸の粒子径スパン値は、０．８５以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  5. 　前記微生物が桿菌の形質転換微生物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  6. 　前記微生物がグラム陰性細菌の形質転換微生物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  7. 　前記微生物がカプリアビダス属に属する、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記微生物がカプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物である、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記微生物がエスシェリキア属に属する、請求項６に記載の製造方法。
  10. 　前記微生物がエスシェリキア・コリーの形質転換微生物である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記微生物細胞を得る工程の後で、前記酵素で処理する工程の前に、前記微生物細胞を熱処理する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
  12. 　前記酵素で処理する工程の後に、前記微生物細胞を破砕して細胞破砕液を得る工程と、前記細胞破砕液からポリヒドロキシアルカン酸粒子を回収する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
  13. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸をモノマーユニットとして含有する重合体である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  14. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  15. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項１５に記載の製造方法。
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