JP6313708B2 - 高分子量pha生産微生物とそれを用いた高分子量phaの製造方法 - Google Patents
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Description
(a)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(b)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び/又は付加されることにより、該遺伝子がコードするPHA分解酵素活性が低下又は失われている微生物を培養することを特徴とする、共重合PHAの製造方法に関する。
(c)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(d)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
であることが好ましい。
(e)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列をコードするPHA合成酵素遺伝子、
(f)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を導入して得られる微生物であることが好ましい。
(g)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(h)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び/又は付加されることにより、該遺伝子がコードするPHA分解酵素活性が低下又は失われており、さらに、他のPHA分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び/又は付加されている微生物に関する。
(i)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(j)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
であることが好ましい。
(k)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列をコードするPHA合成酵素遺伝子、
(l)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を導入して得られる微生物であることが好ましい。
先ず、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
先ず、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
先ず、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
製造例2の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、KNK005ΔphaZ6株を親株としてpNS2X−phaZ1(−+)を用いて、染色体上のphaZ6遺伝子とphaZ1遺伝子のそれぞれの、開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株KNK005ΔphaZ1,6株を作製した。
製造例3の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、KNK005ΔphaZ6株を親株としてpNS2X−phaZ2(−+)を用いて、染色体上のphaZ6遺伝子とphaZ2遺伝子のそれぞれの、開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株KNK005ΔphaZ2,6株を作製した。
種母培地の組成は1w/v% Meat−extract、1w/v% Bacto−Trypton、0.2w/v% Yeast−extract、0.9w/v% Na2HPO4・12H2O、0.15w/v% KH2PO4とした。
KNK005ΔphaZ6株に代えて製造例4で作製したKNK005ΔphaZ1,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表1に示した。
KNK005ΔphaZ6株に代えて製造例5で作製したKNK005ΔphaZ2,6株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表1に示した。
KNK005ΔphaZ6株に代えて製造例2で作製したKNK005ΔphaZ1株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表1に示した。
KNK005ΔphaZ6株に代えて製造例3で作製したKNK005ΔphaZ2株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表1に示した。
KNK005ΔphaZ6株に代えてPHA分解酵素未破壊のKNK005株を用いて、実施例1と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表1に示した。
各形質転換体により生産されたPHAの組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥PHAの20mgに2mLの硫酸−メタノール混液(15:85)と2mLのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでPHA分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに1.5gの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。4mLのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のPHA分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所社製GC−17A、キャピラリーカラムはGLサイエンス社製NEUTRA BOND−1(カラム長25m、カラム内径0.25mm、液膜厚0.4μm)を用いた。キャリアガスとしてHeを用い、カラム入口圧100kPaとし、サンプルは1μLを注入した。温度条件は、初発温度100〜100℃まで8℃/分の速度で昇温、さらに200〜290℃まで30℃/分の速度で昇温した。
種母培地の組成は1w/v% Meat−extract、1w/v% Bacto−Trypton、0.2w/v% Yeast−extract、0.9w/v% Na2HPO4・12H2O、0.15w/v% KH2PO4とした。
KNK005ΔphaZ6株に代えて製造例4で作製したKNK005ΔphaZ1,6株を用いて、実施例5と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表2に示した。
製造例2と同様の方法で、KNK005ΔphaZ2,6株を親株としてpNS2X−phaZ1(−+)を用いて、染色体上のphaZ2遺伝子、phaZ6遺伝子及びphaZ1遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株KNK005ΔphaZ1,2,6株を作製した。
KNK005ΔphaZ6株に代えて製造例6で作製したKNK005ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例5と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表2に示した。
KNK005ΔphaZ6株に代えてPHA分解酵素未破壊のKNK005株を用いて、実施例5と同様の方法を用いてPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表2に示した。
実施例4に記載の方法により、PHAの組成分析を行った。その結果、配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するPHA合成酵素をコードするPHA合成酵素遺伝子を導入した形質転換体である、KNK005株、KNK005ΔphaZ6株、KNK005ΔphaZ1,6株、及びKNK005ΔphaZ1,2,6株は、いずれもP(3HB−co−3HH)を合成することを確認した。
Claims (12)
- 下記(a)又は(b)の遺伝子:
(a)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(b)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び/又は付加されることにより、該遺伝子がコードするPHA分解酵素活性が低下又は失われているCupriavidus属に属する微生物を培養することを特徴とする、3HH、3HV、および4HBからなる群から選択される1種以上に由来する構成単位と、3HBに由来する構成単位とを含む共重合PHAの製造方法。 - 前記微生物において、さらに、他のPHA分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び/又は付加されている、請求項1に記載の共重合PHAの製造方法。
- 前記他のPHA分解酵素遺伝子が、下記(c)又は(d)の遺伝子:
(c)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(d)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
である、請求項2に記載の共重合PHAの製造方法。 - 前記微生物が、下記(e)又は(f)の遺伝子:
(e)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列をコードするPHA合成酵素遺伝子、
(f)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を導入して得られる微生物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の共重合PHAの製造方法。 - 前記微生物がCupriavidus necatorである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の共重合PHAの製造方法。
- 前記PHAが、3−ヒドロキシヘキサン酸に由来する構成単位を含む共重合PHAである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の共重合PHAの製造方法。
- 炭素源として、遊離脂肪酸含有量が50%以上の油脂を使用することを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の共重合PHAの製造方法。
- 遊離脂肪酸中のパルミチン酸含有量が40〜60%である、請求項7に記載の共重合PHAの製造方法。
- 下記(g)又は(h)の遺伝子:
(g)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(h)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び/又は付加されることにより、該遺伝子がコードするPHA分解酵素活性が低下又は失われており、さらに、他のPHA分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び/又は付加されている、
3HH、3HV、および4HBからなる群から選択される1種以上に由来する構成単位と、3HBに由来する構成単位とを含む共重合PHAを生産するCupriavidus属に属する微生物。 - 前記他のPHA分解酵素遺伝子が、下記(i)又は(j)の遺伝子:
(i)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列をコードするPHA分解酵素遺伝子、
(j)配列表の配列番号17及び/又は19に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
である、請求項9に記載の微生物。 - 前記微生物が、下記(k)又は(l)の遺伝子:
(k)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列をコードするPHA合成酵素遺伝子、
(l)配列表の配列番号15に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の配列同一性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を導入して得られる微生物である、請求項9又は10に記載の微生物。 - 前記微生物がCupriavidus necatorである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の微生物。
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