JP6313708B2 - 高分子量ｐｈａ生産微生物とそれを用いた高分子量ｐｈａの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（以下ＰＨＡ）を産生可能な微生物において、より高分子量の生分解性ＰＨＡを製造する技術に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＰＨＡ分解酵素遺伝子を破壊した微生物を用いた、高分子量のＰＨＡ製造方法に関する。

ＰＨＡは、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されうることから、環境調和型素材又は生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。

このＰＨＡを構成するモノマー単位は一般名ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸、４−ヒドロキシ酪酸が例示され、これらが単重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成される。

このようなＰＨＡの例として、３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）が挙げられる。また、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと略す）の共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）が挙げられる。さらに、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）の共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）が挙げられる。ほかにも、３ＨＢと４−ヒドロキシ酪酸（以下、４ＨＢと略す）の共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）と略す）が挙げられる。

ＰＨＡはその分子量によって特性が変化するが、例えば繊維などに加工する際にはできるだけ高分子量であることが望ましい。よって、発酵生産工程におけるＰＨＡの分子量制御技術、特に分子量をより高めるための技術開発はＰＨＡの産業利用に必須である。

ＰＨＡの分子量制御技術に関しては以下の報告が挙げられる。

Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＡ合成に関する遺伝子を組み込んだ大腸菌を用い、培養時のｐＨ及びグルコース濃度をコントロールすることにより重量平均分子量が１０００万を超えるＰ（３ＨＢ）の生産方法が示された。その中で高分子量Ｐ（３ＨＢ）では繊維状等への加工時に重要な物性（例えば引張り強度や再延伸性）が向上することが明らかにされている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。

また、誘導性プロモーターにより制御されたＰＨＡ合成酵素遺伝子等を有する発現ベクターを用いた大腸菌によるＰ（３ＨＢ）の生産では、誘導剤添加量で発現する酵素量を制御した結果、重量平均分子量を７８万〜４００万の間でコントロール可能であることが開示されている（特許文献１）。

ＰＨＡ合成酵素遺伝子をバクテリアの染色体上に組み込んで発現させると、組み込み部位によって異なる分子量のＰＨＡを生産できることが開示されている（特許文献２）。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａの染色体上にＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子と基質モノマーを供給する遺伝子を組み込んだ例では４０万から１０００万の分子量を有する３−ヒドロキシヘキサン酸と３−ヒドロキシオクタン酸の共重合ＰＨＡが蓄積された。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の分子量制御技術も報告されている。

ＰＨＡの生産に関与する酵素をコードする大腸菌由来の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ遺伝子（ｆａｂＧ）を導入したＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを、植物油脂を炭素源として培養し、重量平均分子量５１０万のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する技術が開示されている（特許文献３）。

上記のように、ＰＨＡの分子量を制御するために、従来、培養条件、ＰＨＡ合成酵素活性の調節やＰＨＡ生産関連遺伝子の導入などの方法が示されている。

一方、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒにおいてＰＨＡ分解酵素は少なくとも９つあると報告されている（非特許文献４）。これまでにＰＨＡ分解酵素遺伝子を破壊した微生物はいくつか報告されているが、酵素の特性や蓄積されたＰＨＡの分解利用に関する報告であり、ＰＨＡの分子量に与える影響は知られていなかった。例えば、配列番号１６記載の塩基配列を有し、配列番号１７記載のアミノ酸配列をコードするｐｈａＺ１遺伝子や、配列番号１８記載の塩基配列を有し、配列番号１９記載のアミノ酸配列をコードするｐｈａＺ２遺伝子を破壊することで、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒが細胞内に蓄積したＰ（３ＨＢ）の分解が抑制されることが報告されている（非特許文献５）。

また、同じくＰＨＡ分解酵素遺伝子の１種であるｐｈａＺｄ遺伝子（ｐｈａＺ６遺伝子）に関しては、この遺伝子を破壊しても、ＰＨＡの分解利用になんら影響はないという報告がなされており、ｐｈａＺ６遺伝子が、菌体内でどのような役割を担っているのかは不明であった（非特許文献６）。

米国特許第５８１１２７２号明細書 米国特許第６５９３１１６号明細書 国際公開第２００６／１０１１７６号

Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４７：１４０−３（１９９７） Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，Ａ３５：３１９−３５（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５：８７−９４（１９９９） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１５６：２１３６−５２（２０１０） Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８５：３７８８−９４（２００３） Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８７：６９８２−９０（２００５）

本発明は、高分子量のＰＨＡを蓄積する微生物株を利用したＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、高分子量のＰＨＡを蓄積する微生物を育種するための検討を鋭意行った。その結果、ＰＨＡ産生微生物、特にはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒにおいて、特定のＰＨＡ分解酵素遺伝子を破壊することにより、高分子量のＰＨＡを合成する方法を見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより、該遺伝子がコードするＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われている微生物を培養することを特徴とする、共重合ＰＨＡの製造方法に関する。

前記微生物において、さらに、他のＰＨＡ分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されていることが好ましい。

前記他のＰＨＡ分解酵素遺伝子が、下記（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子：
（ｃ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
（ｄ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
であることが好ましい。

前記微生物が、下記（ｅ）又は（ｆ）の遺伝子：
（ｅ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、
（ｆ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を導入して得られる微生物であることが好ましい。

前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物であることが好ましい。

前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒであることが好ましい。

前記ＰＨＡが、３−ヒドロキシヘキサン酸に由来する構成単位を含む共重合ＰＨＡであることが好ましい。

炭素源として、遊離脂肪酸含有量が５０％以上の油脂を使用することを含むことが好ましい。

遊離脂肪酸中のパルミチン酸含有量が４０〜６０％であることが好ましい。

また、本発明は、下記（ｇ）又は（ｈ）の遺伝子：
（ｇ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
（ｈ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより、該遺伝子がコードするＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われており、さらに、他のＰＨＡ分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されている微生物に関する。

前記他のＰＨＡ分解酵素遺伝子が、下記（ｉ）又は（ｊ）の遺伝子：
（ｉ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
（ｊ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
であることが好ましい。

前記微生物が、下記（ｋ）又は（ｌ）の遺伝子：
（ｋ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、
（ｌ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を導入して得られる微生物であることが好ましい。

前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物であることが好ましい。

前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒであることが好ましい。

本発明により、産業上有用である、より高分子量のＰＨＡを生産することが可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の特徴の一つは、下記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより、該遺伝子がコードするＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われている微生物を培養することを特徴とする、共重合ＰＨＡの製造方法である。

配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする、配列番号１に記載の塩基配列を有するＰＨＡ分解酵素遺伝子は、ｐｈａＺｄ遺伝子又はｐｈａＺ６遺伝子と呼ばれている。本発明においては、複数存在するＰＨＡ分解酵素遺伝子のうち、少なくともｐｈａＺ６遺伝子、又はｐｈａＺ６遺伝子と同等の生理学的機能を有する遺伝子の少なくとも一部が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより破壊されている微生物を用いることが重要である。後述の実施例が示すとおり、ＰＨＡ分解酵素遺伝子であるｐｈａＺ１やｐｈａＺ２をそれぞれ単独で破壊した場合に比べて、ｐｈａＺ６遺伝子を単独であるいはｐｈａＺ６遺伝子とその他のＰＨＡ分解酵素遺伝子を併せて破壊した場合に、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒにおいて、非常に高分子量のＰＨＡを得られることが、本発明で初めて見いだされた。なお、上記ｐｈａＺ６遺伝子と同等の生理学的機能を有する遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性は、ｐｈａＺ６遺伝子と同等の生理学的機能を有する蓋然性が高くなるため、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。また、当該遺伝子の、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対する配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

遺伝子の少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、当業者に周知の方法により行うことができる。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２：１０６８−１０７４（１９８５））や相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：１９７−２１７（１９８７））などがあり、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５−１２０４（１９９２）、Ｌｅｎｚ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：４３８５−４３９３（１９９４））も利用することができる。染色体上のＰＨＡ分解酵素遺伝子を部位特異的に破壊、又は不活性化できればその方法は特に制限されない。具体的には、例えば、染色体上のＰＨＡ分解酵素遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失させる方法、開始コドンから終始コドンまでの遺伝子配列の一部を欠失させる方法、遺伝子配列内に終始コドンを導入する方法、開始コドンを欠失させる方法、欠失又は挿入によりフレームシフトを起こさせる方法が挙げられる。さらに当該ＰＨＡ分解酵素遺伝子のプロモーターを破壊することでもＰＨＡ分解酵素の発現を抑えることができる。

本発明において、ＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われているとは、上記のように遺伝子の少なくとも一部を置換、欠失、挿入及び／又は付加されたＰＨＡ分解酵素遺伝子のコードするＰＨＡ分解酵素活性が、上記置換、欠失、挿入及び／又は付加される前のＰＨＡ分解酵素活性よりも低下するか、完全に失われることで、本発明の目的であるＰＨＡの高分子化が達成できる限り特に限定されない。具体的には当該ＰＨＡ分解酵素活性が２０％以下に低下していることが好ましく、１５％以下に低下していることがより好ましく、１０％以下に低下していることがさらに好ましく、完全に失われていることが最も好ましい。なお、ここでいうＰＨＡ分解酵素活性の低下の割合は、当該ＰＨＡ分解酵素活性そのものを測定することでも求められるが、例えば、後述するフラスコスケールのＰＨＡ製造評価法において求められるＰＨＡの分子量の低下抑制の程度から推定することも可能である。

本発明において使用する微生物では、さらに他のＰＨＡ分解酵素遺伝子についても、その少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加され、当該遺伝子がコードするＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われていることが好ましい。すなわち、２個以上のＰＨＡ分解酵素遺伝子について、それぞれその少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されていることにより、これらの遺伝子がコードするＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われている微生物を使用することが好ましい。他のＰＨＡ分解酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１７に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号１６に記載の塩基配列を有するｐｈａＺ１遺伝子や、配列番号１９に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号１８に記載の塩基配列を有するｐｈａＺ２遺伝子を含め、Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ等が挙げているＰＨＡ分解酵素（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１５６：２１３６−５２（２０１０））等を挙げることができる。本発明の微生物では、ｐｈａＺ６遺伝子とｐｈａＺ１遺伝子が破壊されていること、又はｐｈａＺ６遺伝子とｐｈａＺ２遺伝子が破壊されていることが好ましく、ｐｈａＺ６遺伝子、ｐｈａＺ１遺伝子、及びｐｈａＺ２遺伝子が破壊されていることがより好ましい。

さらに、他のＰＨＡ分解酵素遺伝子としては、前記遺伝子以外であっても、同等の生理学的機能を有している遺伝子であればよく、例えば、配列表の配列番号１７又は１９に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。配列表の配列番号１７又は１９に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性は、当該他のＰＨＡ分解酵素がＰＨＡ分解酵素活性を有する蓋然性が高くなるため、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。また、当該遺伝子の、配列表の配列番号１６又は１８に記載の塩基配列に対する配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。遺伝子の少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加の方法は、上述した通りである。

本発明に用いる微生物としては、ＰＨＡ分解酵素遺伝子を有するＰＨＡ合成菌を使用しうる。例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属が挙げられる。Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物の中では、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒに属する微生物を好適に用いることができ、特にＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株を最も好適に用いることが出来る。勿論、前記微生物を人工的に突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された菌株も使用できる。

本発明に用いる微生物は、宿主微生物にＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入して得られる微生物であってもよい。３−ヒドロキシ酪酸に由来する構成単位を含む共重合ＰＨＡを生産するために、３−ヒドロキシ酪酸以外の他の３−ヒドロキシアルカン酸や、４−ヒドロキシアルカン酸の構成単位を合成する酵素の遺伝子や、これらを含むＰＨＡの合成に関与する酵素の遺伝子を適切に選択して導入した微生物を用いることができる。特に、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産するために、例えばＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属など、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産細菌由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子やそれらの改変体遺伝子を導入して作製した菌株を用いることが好ましい。ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、配列番号１５に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を例示することができるが、これに限られるものではない。配列番号１５に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性は、ＰＨＡ合成酵素活性を有するために、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。

本発明の方法で製造されるＰＨＡは、微生物が生産するＰＨＡであれば特に限定されないが、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される１以上の３−ヒドロキシアルカン酸を含む組成物を重合して得られるＰＨＡや、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される１以上の３−ヒドロキシアルカン酸を含む組成物を共重合して得られる共重合ＰＨＡが好ましい。例えば炭素数４の３−ヒドロキアルカン酸を重合して得られるポリヒドロキシブチレートＰ（３ＨＢ）、炭素数４と６の３−ヒドロキシアルカン酸を共重合して得られるポリヒドロキシブチレートヘキサノエートＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）、炭素数４と５の３−ヒドロキシアルカン酸を共重合して得られるポリヒドロキシブチレートバレレートＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）、炭素数４〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸を重合或いは共重合して得られるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）などが挙げられる。製造するＰＨＡの種類は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ等の宿主微生物に、公知のＰＨＡ合成に関する遺伝子を導入することで、適宜選択できる。

ｐｈａＺ６遺伝子を含むＰＨＡ分解酵素遺伝子を破壊したＣ．ｎｅｃａｔｏｒには３−ヒドロキシ酪酸を含むＰＨＡの分子量上昇効果が認められることから、本発明におけるＰＨＡは、酵素の基質特異性を考慮して、３−ヒドロキシ酪酸成分を含むＰＨＡであることが好ましく、そのなかでも３−ヒドロキシ酪酸成分を含む共重合ＰＨＡであることがより好ましい。本発明は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）等、３−ヒドロキシ酪酸に由来する構成単位に加えて３−ヒドロキシヘキサン酸に由来する構成単位を含む共重合ＰＨＡの製造に特に好適に利用できる。

微生物は、公知の方法により培養することにより、ＰＨＡを製造できる。炭素源としては、微生物が資化可能であればよく、例えば、アルコール、糖、油脂、及び／又は脂肪酸等、通常微生物培養に用いられる炭素源が挙げられる。特に、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、ヘキサン酸、オクタン酸、ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体などを好適に使用することができる。より好ましくは、パーム油、パーム核油などの植物油脂のほか、パーム核油を分別した低融点分画であるパーム核油オレイン、また特に食糧との競合を避ける観点から、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸蒸留物）やＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸蒸留物）、菜種油の脂肪酸蒸留物といった油脂の精製副産物等が挙げられる。なお、通常は、炭素源として安価なＰＦＡＤ等の油脂の精製副産物を使用すると、生産されるＰＨＡの分子量が低下する傾向があるが、本発明の方法では、炭素源としてＰＦＡＤ等を使用しても、分子量の低下を抑制することができる。

炭素源として脂肪酸、油脂、及び／又はそれらの混合物を使用する場合、脂肪酸、油脂、及び／又はそれらの混合物は、リン酸塩類及びタンパク質と混合して乳化してから使用することもできる。リン酸塩類としては、リン酸水素２Ｎａ、リン酸２水素Ｋなどの正リン酸塩類、ピロリン酸Ｎａなどのピロリン酸塩類、ヘキサメタリン酸Ｎａなどのメタリン酸塩類、ポリリン酸Ｎａなどのポリリン酸塩類などが挙げられる。タンパク質としては、乳タンパク質や大豆タンパク質、グルテン部分分解物のようなタンパク質やその塩類が挙げられる。乳タンパク質としては、カゼイン、カゼインＮａ、ホエーなどが挙げられる。

炭素源として上記油脂の精製副産物を使用する場合、油脂中の遊離脂肪酸含量は、５０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。

ここで、遊離脂肪酸とは、他の化合物と結合していない脂肪酸を指す。長鎖の遊離脂肪酸として、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸などが挙げられる。

遊離脂肪酸中のパルミチン酸含有量は４０〜６０％であることが好ましく、４５〜５５％であることがより好ましい。

ＰＨＡは、微生物を前培養培地で増殖させた後、ＰＨＡ生産培地で培養することにより、微生物内に蓄積させることができる。前培養培地は、微生物を増殖可能な培地であれば特に限定されない。

ＰＨＡ生産培地は、上記炭素源を含み、その他に、窒素源、無機塩類等を含んでいてもよい。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。培地には、遺伝子発現プラスミドが含む薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加してもよい。

培養温度は、微生物が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１から１０日間程度でよい。

本発明の方法により製造されたＰＨＡは、周知の方法を用いて菌体から回収できる。周知の方法として、例えば、次の方法が挙げられる。微生物の培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。

微生物菌体の生産量は吸光度法や乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定でき、また、微生物が産生する物質の生産量はＧＣ法、ＨＰＬＣ法などの公知の方法で測定できる。細胞中に蓄積されたＰＨＡの含量は、加藤らの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４５：３６３（１９９６）、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６９：５１５（１９９６））に従い、培養細胞からクロロホルムなどの有機溶媒を用いて抽出し、乾燥することで測定出来る。

本発明において、フラスコスケールのＰＨＡ製造評価法とは、下記の一連の方法で行う微生物の培養方法、ＰＨＡの抽出方法、ＰＨＡ生産量評価方法、ＰＨＡ重量分子量評価方法のすべてを指す。

種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４とする。

ＰＨＡ生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１３ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）とする。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用いる。

評価する微生物のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（１０ｍＬ）に接種して２４時間培養し、培養液を種母とする。

ＰＨＡ生産培養は５０ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前培養種母を１．０ｖ／ｖ％接種して行う。培養温度３０℃で２１〜２５時間振とう培養を行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定する。

得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出する。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍＬになるまで濃縮後、９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置する。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥する。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出する。

次に、得られたＰＨＡの分子量を測定する。ＰＨＡの重量平均分子量分析はゲル・パーミッション・クロマトグラフィー法により行う。抽出したＰＨＡ１５ｍｇを１０ｍＬのクロロホルムに溶解し、０．２μｍのフィルターで濾過して測定用サンプルとし、その０．０５ｍＬを用いて分析する。測定システムはＳＬＣ−１０Ａ（島津製作所社製）、カラムはＳｈｏｄｅｘ ＧＰＣ Ｋ−８０６Ｌ（昭和電工社製）を２本直列に接続し、４０℃で測定する。移動層は１．０ｍＬ／分のクロロホルムとし、ＲＩ検出器（ＲＩＤ−１０Ａ、島津製作所社製）を用いる。標準品としては同様に処理したポリスチレン（昭和電工社製、重量平均分子量：約７００万、約１０７万、１５万、３万）を用い、検量線によりＰＨＡの重量平均分子量を算出する。

本発明の方法で製造されるＰＨＡの、フラスコスケールのＰＨＡ製造評価法における重量平均分子量は、３，５００，０００以上であることが好ましく、４，０００，０００以上であることがより好ましい。

以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。

（製造例１）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株の作製
先ず、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。

Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号３及び配列番号４で示されるプライマー１及び２を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号５及び配列番号６で示されるプライマー３及び４を用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、プライマー１及び４を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。

このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ６構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ６（−＋）を作製した。

次に、遺伝子破壊株の作製を行った。遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ６（−＋）で大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、ＫＮＫ００５株（米国特許第７３８４７６６号明細書参照）とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。なお、ＫＮＫ００５株は配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を導入したＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株である。

培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＣ．ｎａｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。

さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株と命名した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された株である。

（製造例２）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１株の作製
先ず、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。

Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号７及び配列番号８で示されるプライマー５及び６を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号９及び配列番号１０で示されるプライマー７及び８を用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、プライマー５及び８を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。

このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ１構造遺伝子より上流及び下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を作製した。

製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ００５株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を用いて、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１株を作製した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１株はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された株である。

（製造例３）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２株の作製
先ず、遺伝子置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。

Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１１及び配列番号１２で示されるプライマー９及び１０を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号１３及び配列番号１４で示されるプライマー１１及び１２を用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、プライマー９及び１２を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。

このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ２構造遺伝子より上流及び下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ２（−＋）を作製した。

製造例１の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ００５株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ２（−＋）を用いて、染色体上のｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２株を作製した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２株はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された株である。

（製造例４）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株の作製
製造例２の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を用いて、染色体上のｐｈａＺ６遺伝子とｐｈａＺ１遺伝子のそれぞれの、開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株を作製した。

（製造例５）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株の作製
製造例３の遺伝子破壊株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ２（−＋）を用いて、染色体上のｐｈａＺ６遺伝子とｐｈａＺ２遺伝子のそれぞれの、開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株を作製した。

（実施例１）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株によるＰＨＡの生産
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４とした。

ＰＨＡ生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１３ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用いた。

製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（１０ｍＬ）に接種して２４時間培養し、培養液を種母とした。

ＰＨＡ生産培養は５０ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前培養種母を１．０ｖ／ｖ％接種した。培養温度３０℃で２１〜２５時間振とう培養を行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍＬになるまで濃縮後、９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出した。結果を表１に示した。

次に、得られたＰＨＡの分子量を測定した。ＰＨＡの重量平均分子量分析はゲル・パーミッション・クロマトグラフィー法により行った。抽出したＰＨＡ １５ｍｇを１０ｍＬのクロロホルムに溶解し、０．２μｍのフィルターで濾過して測定用サンプルとし、その０．０５ｍＬを用いて分析した。測定システムはＳＬＣ−１０Ａ（島津製作所社製）、カラムはＳｈｏｄｅｘ ＧＰＣ Ｋ−８０６Ｌ（昭和電工社製）を２本直列に接続し、４０℃で測定した。移動層は１．０ｍＬ／分のクロロホルムとし、ＲＩ検出器（ＲＩＤ−１０Ａ、島津製作所社製）を用いた。標準品としては同様に処理したポリスチレン（昭和電工社製、重量平均分子量：約７００万、約１０７万、１５万、３万）を用い、検量線によりＰＨＡの重量平均分子量を算出した。結果を表１に示した。

（実施例２）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えて製造例４で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表１に示した。

（実施例３）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えて製造例５で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表１に示した。

（比較例１）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えて製造例２で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表１に示した。

（比較例２）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えて製造例３で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表１に示した。

（比較例３）ＫＮＫ００５株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えてＰＨＡ分解酵素未破壊のＫＮＫ００５株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表１に示した。

その結果、実施例１ではｐｈａＺ６遺伝子の破壊により、比較例３のＫＮＫ００５株に対してＰＨＡの重量平均分子量を２倍以上に向上できた。実施例１では、ｐｈａＺ６遺伝子以外のＰＨＡ分解酵素遺伝子を破壊した比較例１及び２に対しても、ＰＨＡの重量平均分子量を大幅に向上できた。実施例２及び３では、ｐｈａＺ６遺伝子に加えてｐｈａＺ１遺伝子、又はｐｈａＺ２遺伝子の破壊により、ＰＨＡの重量平均分子量は３５０万以上に達し、特に実施例２のＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株については４００万以上に達した。

（実施例４）ＰＨＡの組成分析
各形質転換体により生産されたＰＨＡの組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＡの２０ｍｇに２ｍＬの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍＬのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍＬのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＡ分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所社製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μＬを注入した。温度条件は、初発温度１００〜１００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。

上記条件にて分析した結果、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体である、ＫＮＫ００５株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株、及びＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株は、いずれもＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を合成することを確認した。

（実施例５）炭素源としてＰＦＡＤを使用し、ジャーファーメンターを用いた、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株によるＰＨＡの生産
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４とした。

前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）とした。

ＰＨＡ生産培地の組成は０．５７８ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１０１ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、０・４３７ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１５ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．７５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源はＰａｌｍ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ（ＰＦＡＤ）（ＭＡＬＡＹＳＩＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＳＤＮ ＢＤＨより入手。遊離脂肪酸含量９５．０％；脂肪酸組成 Ｃ１２：０ ０．２％、Ｃ１４：０ １．２％ Ｃ１６：０ ４７．６％、Ｃ１６：１ ０．３％、Ｃ１８：１ ３５．７％、Ｃ１８：２ ９．７％ Ｃ１８：３ ０．４％ Ｃ２０：０ ０．４％；融点 ４３．８℃）を以下の手順で乳化したものを用いた。

ＰＦＡＤを５５０ｇ及び水を４５０ｇ量りとり、それぞれ６０℃に加熱後、水に４．７ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、及び２．７５ｇのカゼインＮａを溶解させた。溶解後、ＰＦＡＤと混合し、ホモミキサー（ＳＩＬＶＥＲＳＯＮ社製、ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＩＸＥＲ ＥＭＵＬＳＩＦＩＥＲ）を用いて攪拌数２５００ｒｐｍにて予備乳化を行った。さらに、この予備乳化液を高圧ホモジナイザー（ＰＡＮＤＡ２Ｋ型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力１０ｂａｒｒにて乳化操作を行い、乳化物を得た。

製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

ＰＨＡ生産培養は２Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を２５ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３２℃、攪拌速度４５０ｒｐｍ、通気量３．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は４５〜５４時間行い、培養経時及び培養終了後、培養ブロスをサンプリングし、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。実施例１に記載の方法によりＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表２に示した。

（実施例６）炭素源としてＰＦＡＤを使用し、ジャーファーメンターを用いた、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えて製造例４で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株を用いて、実施例５と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表２に示した。

（製造例６）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製
製造例２と同様の方法で、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を用いて、染色体上のｐｈａＺ２遺伝子、ｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株を作製した。

（実施例７）炭素源としてＰＦＡＤを使用し、ジャーファーメンターを用いた、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えて製造例６で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例５と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表２に示した。

（比較例４）炭素源としてＰＦＡＤを使用し、ジャーファーメンターを用いた、ＫＮＫ００５株によるＰＨＡの生産
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株に代えてＰＨＡ分解酵素未破壊のＫＮＫ００５株を用いて、実施例５と同様の方法を用いてＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び重量平均分子量を測定した。結果を表２に示した。

培養約４５時間でのＰＨＡ生産量及び重量平均分子量分析の結果を表２に示した。その結果、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株においてＫＮＫ００５株に対して重量平均分子量の向上が認められた。重量平均分子量は、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株においてより向上し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株においてさらに向上することが明らかとなった。

（実施例８）ＰＨＡの組成分析
実施例４に記載の方法により、ＰＨＡの組成分析を行った。その結果、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体である、ＫＮＫ００５株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，６株、及びＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株は、いずれもＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を合成することを確認した。

Claims (12)

1. 下記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：
   （ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
   （ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
   の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより、該遺伝子がコードするＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われているＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物を培養することを特徴とする、３ＨＨ、３ＨＶ、および４ＨＢからなる群から選択される１種以上に由来する構成単位と、３ＨＢに由来する構成単位とを含む共重合ＰＨＡの製造方法。
2. 前記微生物において、さらに、他のＰＨＡ分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されている、請求項１に記載の共重合ＰＨＡの製造方法。
3. 前記他のＰＨＡ分解酵素遺伝子が、下記（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子：
   （ｃ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
   （ｄ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
   である、請求項２に記載の共重合ＰＨＡの製造方法。
4. 前記微生物が、下記（ｅ）又は（ｆ）の遺伝子：
   （ｅ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、
   （ｆ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
   を導入して得られる微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の共重合ＰＨＡの製造方法。
5. 前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の共重合ＰＨＡの製造方法。
6. 前記ＰＨＡが、３−ヒドロキシヘキサン酸に由来する構成単位を含む共重合ＰＨＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の共重合ＰＨＡの製造方法。
7. 炭素源として、遊離脂肪酸含有量が５０％以上の油脂を使用することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の共重合ＰＨＡの製造方法。
8. 遊離脂肪酸中のパルミチン酸含有量が４０〜６０％である、請求項７に記載の共重合ＰＨＡの製造方法。
9. 下記（ｇ）又は（ｈ）の遺伝子：
   （ｇ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
   （ｈ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
   の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより、該遺伝子がコードするＰＨＡ分解酵素活性が低下又は失われており、さらに、他のＰＨＡ分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されている、
   ３ＨＨ、３ＨＶ、および４ＨＢからなる群から選択される１種以上に由来する構成単位と、３ＨＢに由来する構成単位とを含む共重合ＰＨＡを生産するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物。
10. 前記他のＰＨＡ分解酵素遺伝子が、下記（ｉ）又は（ｊ）の遺伝子：
    （ｉ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ分解酵素遺伝子、
    （ｊ）配列表の配列番号１７及び／又は１９に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    である、請求項９に記載の微生物。
11. 前記微生物が、下記（ｋ）又は（ｌ）の遺伝子：
    （ｋ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、
    （ｌ）配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、且つＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    を導入して得られる微生物である、請求項９又は１０に記載の微生物。
12. 前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の微生物。