ES2952673T3 - Microbio productor de PHA de alto peso molecular y método de producción de PHA de alto peso molecular usando el mismo - Google Patents
Microbio productor de PHA de alto peso molecular y método de producción de PHA de alto peso molecular usando el mismo Download PDFInfo
- Publication number
- ES2952673T3 ES2952673T3 ES13848540T ES13848540T ES2952673T3 ES 2952673 T3 ES2952673 T3 ES 2952673T3 ES 13848540 T ES13848540 T ES 13848540T ES 13848540 T ES13848540 T ES 13848540T ES 2952673 T3 ES2952673 T3 ES 2952673T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- pha
- gene
- microorganism
- seq
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 76
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 43
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 38
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 35
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 claims description 26
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 20
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 claims description 15
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims description 9
- HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCC(O)CC(O)=O HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001528480 Cupriavidus Species 0.000 claims description 5
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 162
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 description 143
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 15
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 15
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000010558 Gene Alterations Effects 0.000 description 11
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 11
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 11
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000481518 Ralstonia eutropha H16 Species 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101150104605 phaZ2 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 8
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 8
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 8
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 8
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000003346 palm kernel oil Substances 0.000 description 8
- 235000019865 palm kernel oil Nutrition 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 101150051591 phaZ1 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 5
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 4
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 4
- NDPLAKGOSZHTPH-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyoctanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)CC(O)=O NDPLAKGOSZHTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 3
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100506339 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) phaZ2 gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 2
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 2
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 2
- 235000019830 sodium polyphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229940006015 4-hydroxybutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 241000588881 Chromobacterium Species 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000221089 Jatropha Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150070497 accC gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000003965 capillary gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 101150090981 fabG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 101150068528 mabA gene Proteins 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000005341 metaphosphate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001020 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) Polymers 0.000 description 1
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H sodium hexametaphosphate Chemical compound [Na]OP1(=O)OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])O1 GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 235000019982 sodium hexametaphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
El propósito de la presente invención es proporcionar una cepa microbiana que acumule PHA de alto peso molecular y proporcionar un método para producir PHA usando la misma. Se proporciona un método de producción de copolímero de PHA caracterizado por cultivar microbios en el que, mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición de al menos una parte del gen (a) o (b), la actividad enzimática degradante de PHA codificada por el El gen disminuye o se pierde: (a) un gen de la enzima degradante de PHA que codifica una secuencia de aminoácidos en la secuencia número 2 del listado de secuencias, (b) un gen que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con la secuencia de aminoácidos en secuencia número 2 en el listado de secuencias y que tiene actividad enzimática degradante de PHA. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Microbio productor de PHA de alto peso molecular y método de producción de PHA de alto peso molecular usando el mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a una técnica para producir un polihidroxialcanoato biodegradable con un mayor peso molecular mediante un microorganismo productor de polihidroxialcanoato (a continuación en el presente documento, denominado PHA). Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para producir un PHA de alto peso molecular mediante un microorganismo con una alteración en un gen para una enzima de degradación de PHA tal como se menciona en las reivindicaciones adjuntas.
Antecedentes de la técnica
Los polihidroxialcanoatos son polímeros orgánicos de tipo poliéster producidos por diversos microorganismos. En la actualidad, los PHA son polímeros termoplásticos biodegradables y también pueden producirse a partir de recursos renovables. Por tanto, se han realizado algunos intentos de producir a nivel industrial un PHA como material respetuoso con el medioambiente o material biocompatible para diversas aplicaciones industriales.
Los PHA consisten en unidades de monómeros generalmente denominados ácidos hidroxialcanoicos que están ejemplificados específicamente por ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxivalérico, ácido 3-hidroxihexanoico, ácido 3-hidroxioctanoico, otros ácidos 3-hidroxialcanoicos con una cadena de alquilo más larga y ácido 4-hidroxibutírico. Las moléculas de polímero se forman mediante la homopolimerización o copolimerización de estos ácidos hidroxialcanoicos.
Los ejemplos de PHA incluyen ácido poli-3-hidroxibutírico (a continuación en el presente documento, abreviado como P(3HB)) que es un homopolímero de ácido 3-hidroxibutírico (a continuación en el presente documento, abreviado como 3HB); un copolímero de 3HB y ácido 3-hidroxivalérico (a continuación en el presente documento, abreviado como 3HV) (a continuación en el presente documento, el copolímero se abrevia como P(3HB-co-3HV)); y un copolímero de 3HB y ácido 3-hidroxihexanoico (a continuación en el presente documento, abreviado como 3HH) (a continuación en el presente documento, el copolímero se abrevia como P(3HB-co-3HH)). 0tros ejemplos incluyen un copolímero de 3HB y ácido 4-hidroxibutírico (a continuación en el presente documento, abreviado como 4HB) (a continuación en el presente documento, el copolímero se abrevia como P(3HB-co-4HB)).
Las propiedades de los PHA dependen del peso molecular. Para el procesamiento de fibras se prefieren los PHA que tienen un peso molecular lo más alto posible. Por tanto, el desarrollo de técnicas para controlar el peso molecular de los PHA, particularmente para aumentar el peso molecular de los PHA, en un procedimiento de producción fermentativa es esencial para lograr el uso de los PHA en aplicaciones industriales.
Tal como se describe a continuación, se han notificado varias técnicas para controlar el peso molecular de los PHA. Los documentos no de patente 1, 2 y 3 enseñan un método de producción para P(3HB) con un peso molecular promedio en peso mayor de 10.000.000 cultivando células de Escherichia coli en las que se han introducido genes derivados de Ralstonia eutropha implicados en la síntesis de PHA al tiempo que se controla el pH y la concentración de glucosa. Estas referencias muestran que el P(3HB) de alto peso molecular presenta mejores propiedades físicas (por ejemplo, resistencia a la tracción y capacidad de reestiramiento) que son importantes para el procesamiento de fibras u otros.
El documento de patente 1 muestra que, en la producción de P(3HB) usando células de Escherichia coli que portan un vector de expresión que contiene un gen de PHA sintasa cuya expresión está bajo el control de un promotor inducible, la regulación de la expresión de enzimas variando la cantidad de inductor permite el control del peso molecular promedio en peso entre 780.000 y 4.000.000.
El documento de patente 2 muestra que la expresión de un gen de PHA sintasa integrado en un cromosoma bacteriano da como resultado PHA que tienen pesos moleculares variables en función del sitio de integración. En el caso en que se integraron en el cromosoma de Ralstonia eutropha un gen de PHA sintasa derivado de Aeromonas caviae y genes para suministrar monómeros de sustrato, se acumularon copolímeros de PHA incluyendo 3-hidroxihexanoato y 3-hidroxioctanoato que tienen un peso molecular de 400.000 a 10.000.000.
También existen algunos informes de estudio sobre el control del peso molecular de P(3HB-co-3HH).
El documento de patente 3 divulga una técnica para producir P(3HB-co-3HH) con un peso molecular promedio en peso de 5.100.000 cultivando células de Ralstonia eutropha en las que se ha introducido un gen de 3-cetoacil ACP reductasa derivado de Escherichia coli (fabG) que codifica para una enzima implicada en la producción de PHA, en presencia de un aceite vegetal como fuente de carbono.
Tal como se mencionó anteriormente, se han notificado varias técnicas para controlar el peso molecular de los PHA, tales como el control de las condiciones de cultivo y la actividad de PHA sintasas y la introducción de un gen implicado en la síntesis de PHA.
El documento no de patente 4 muestra que C. necatortiene al menos 9 enzimas de degradación de PHA. Aunque se han publicado algunos informes de estudio sobre microorganismos con alteraciones en cualquiera de los genes para estas enzimas de degradación de PHA, lo que revelan estos informes son las características de las enzimas y la descomposición y utilización de PHA acumulados, y se desconoce la influencia de la alteración sobre el peso molecular de los PHA. Por ejemplo, el documento no de patente 5 muestra que la alteración del gen phaZ1 (que tiene la secuencia de base de SEQ ID N0:16 y codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17) o el gen phaZ2 (que tiene la secuencia de base de SEQ ID N0:18 y codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19) está asociada con una descomposición reducida de P(3HB) acumulado en células de C. necator.
En cuanto al gen phaZd (gen phaZ6), que es un miembro de la familia de genes de enzima de degradación de PHA, el documento no de patente 6 muestra que la alteración de este gen no afecta a la descomposición y utilización de los PHA. Por tanto, se desconoce cómo funciona el gen phaZ6 en las células.
Lista de referencias
Documentos de patente
Documento de patente 1: patente estadounidense n.° 5811272
Documento de patente 2: patente estadounidense n.° 6593116
Documento de patente 3: documento W02006/101176
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Appl. Microbiol. Biotechnol., 47: 140-3 (1997)
Documento no de patente 2: J. Macromol. Sci., Pure Appl. Chem., A 35: 319-35 (1998)
Documento no de patente 3: Int. J. Biol. Macromol., 25: 87-94 (1999)
Documento no de patente 4: Microbiology., 156: 2136-52 (2010)
Documento no de patente 5: J Bacteriol., 185: 3788-94 (2003)
Documento no de patente 6: J Bacteriol., 187: 6982-90 (2005)
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir un PHA usando una cepa de microorganismo capaz de acumular un PHA de alto peso molecular.
Solución al problema
Los presentes inventores llevaron a cabo estudios sobre cómo hacer crecer microorganismos capaces de acumular PHA de alto peso molecular. Como resultado, hallaron que la alteración de un(os) gen(es) de enzima de degradación de PHA particular(es) de un microorganismo productor de PHA, en particular de Cupriavidus necator, permite la síntesis de PHA de alto peso molecular. La presente invención se completó basándose en este hallazgo. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para producir un copolímero de PHA que incluye cultivar un microorganismo, en el que al menos una porción de cualquiera de los siguientes genes (a) y (b) del microorganismo se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen:
(a) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias; y
(b) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de
degradación de PHA,
y
en el que el microorganismo es un microorganismo en el que se ha introducido cualquiera de los siguientes genes (e) y (f):
(e) un gen de PHA sintasa que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias;
y
(f) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias y que tiene actividad de PHA sintasa;
y
en el que el microorganismo es Cupriavidus necator.
Preferiblemente, al menos una porción de un gen de enzima de degradación de PHA adicional del microorganismo también se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición.
El gen de enzima de degradación de PHA adicional es preferiblemente cualquiera de los siguientes genes (c) y (d): (c) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 y/o un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias; y
(d) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de s Eq ID N0:17 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA, y/o un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA.
El microorganismo es un microorganismo en el que se ha introducido cualquiera de los siguientes genes (e) y (f): (e) un gen de PHA sintasa que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias; y
(f) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias y que tiene actividad de PHA sintasa, y en el que al menos una porción de un gen de enzima de degradación de PHA adicional del microorganismo también se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de la enzima de degradación de PHA codificada por el gen;
y
en el que el microorganismo es un microorganismo en el que se ha introducido cualquiera de los siguientes genes (k) y (l):
(k) un gen de PHA sintasa que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias;
y
(l) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias y que tiene actividad de PHA sintasa.
El microorganismo es preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Cupriavidus.
El microorganismo es preferiblemente Cupriavidus necator.
El PHA es preferiblemente un copolímero de PHA que contiene unidades derivadas de ácido 3-hidroxihexanoico. El método incluye preferiblemente usar una grasa/aceite que tiene un contenido de ácidos grasos libres de al menos
el 50 % como fuente de carbono.
Preferiblemente, el ácido palmítico representa del 40 al 60 % del contenido de ácidos grasos libres.
La presente invención se refiere además a un microorganismo,
en el que al menos una porción de cualquiera de los siguientes genes (g) y (h) del microorganismo se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen:
(g) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias; y
(h) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA, y
al menos una porción de un gen de enzima de degradación de PHA adicional del microorganismo también se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición.
El gen de enzima de degradación de PHA adicional es preferiblemente cualquiera de los siguientes genes (i) y (j): (i) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 y/o un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0: 19 en la lista de secuencias; y
(j) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA, y/o un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA.
El microorganismo es preferiblemente un microorganismo en el que se ha introducido cualquiera de los siguientes genes (k) y (l):
(k) un gen de PHA sintasa que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias; y
(l) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias y que tiene actividad de PHA sintasa.
El microorganismo es preferiblemente un microorganismo perteneciente al género Cupriavidus.
El microorganismo es preferiblemente Cupriavidus necator.
Efectos ventajosos de la invención
La presente invención hace posible producir PHA de alto peso molecular, que son útiles a nivel industrial.
Descripción de realizaciones
La siguiente descripción se ofrece para demostrar la presente invención en detalle.
Un aspecto de la presente invención es un método para producir un copolímero de PHA que incluye cultivar un microorganismo, en el que al menos una porción de cualquiera de los siguientes genes (a) y (b) del microorganismo se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen: (a) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias; y (b) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0: 2 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA.
El gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 y que tiene la secuencia de base de SEQ ID N0:1 se denomina gen phaZd o gen phaZ6. Una característica importante de la presente invención es usar un microorganismo que se ha manipulado para alterar al menos una porción de al menos el gen phaZ6 o un gen que tiene funciones fisiológicas equivalentes al gen phaZ6, entre los genes de enzima de degradación de PHA existentes, mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición. Tal como se muestra
específicamente en los ejemplos a continuación, en comparación con la alteración de sólo uno de los genes phaZI y phaZ2, que son ambos genes de enzima de degradación de PHA, la alteración del gen phaZ6 solo o del gen phaZ6 y un gen de enzima de degradación de PHA adicional de C. necator da como resultado PHA con un peso molecular mucho mayor. La presente invención es la primera en mostrar este hecho. Los ejemplos del gen que tiene funciones fisiológicas equivalentes al gen phaZ6 incluyen un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n0:2 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA. La identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias es preferiblemente de al menos el 90 %, más preferiblemente de al menos el 95 %, en cuanto a aumentar la probabilidad de que el gen tenga funciones fisiológicas equivalentes al gen phaZ6. La identidad de secuencia del gen con la secuencia de base de SEQ ID N0: 1 en la lista de secuencias es preferiblemente de al menos el 85 %, más preferiblemente de al menos el 90 %, todavía más preferiblemente de al menos el 95 %.
La alteración de al menos una porción de un gen particular mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición puede lograrse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Los ejemplos típicos incluyen un método que usa los mecanismos de transposones y recombinación homóloga (0hman et al., J. Bacteriol., 162: 1068-1074 (1985)); un método basado en los principios de integración específica de sitio que puede producirse como resultado de recombinación homóloga y eliminación que puede producirse como resultado del segundo acontecimiento de recombinación homóloga (Noti et al., Methods Enzymol., 154: 197-217 (1987)); y un método en el que se permite que el gen sacB derivado de Bacillus subtilis coexista en una cepa de microorganismo, y luego se elimina el gen mediante el segundo acontecimiento de recombinación homóloga, y de ese modo se aísla fácilmente la cepa de microorganismo como cepa resistente a un medio al que se le ha añadido sacarosa (Schweizer, Mol. Microbiol., 6: 1195-1204 (1992), Lenz et al., J. Bacteriol., 176: 4385-4393 (1994)). Puede usarse cualquier método sin limitación particular siempre que se desactive o altere de manera específica de sitio un gen de enzima de degradación de PHA diana en el cromosoma. Específicamente, puede mencionarse, por ejemplo, un método de deleción desde el codón de inicio hasta el codón de parada de un gen de enzima de degradación de PHA diana en el cromosoma; un método de deleción de una porción de la secuencia génica desde el codón de inicio hasta el codón de parada; un método de introducción del codón de parada en la secuencia génica; un método de deleción del codón de inicio; y un método de inducción de una mutación de desplazamiento del marco de lectura mediante deleción o inserción. Un ejemplo adicional es la alteración del promotor de un gen de enzima de degradación de PHA diana, que da como resultado una expresión reducida de la enzima de degradación de PHA.
La expresión “para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA” tal como se usa en el presente documento significa que, como resultado de la alteración de al menos una porción de un gen particular mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición, se reduce o se elimina por completo la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen de enzima de degradación de PHA en comparación con la actividad de enzima de degradación de PHA antes de la sustitución, deleción, inserción y/o adición, y no está limitada particularmente siempre que se proporcione un PHA con un peso molecular aumentado, que es un objeto de la presente invención. Específicamente, la actividad de enzima de degradación de PHA se reduce preferiblemente hasta el 20 % o inferior, más preferiblemente hasta el 15 % o inferior, todavía más preferiblemente hasta el 10 % o inferior. Lo más preferibles es la eliminación completa de la actividad. El porcentaje de reducción de la actividad de enzima de degradación de PHA puede medirse midiendo directamente la actividad de enzima de degradación de PHA o, alternativamente, puede estimarse basándose en la eficacia para suprimir la reducción del peso molecular de PHA mediante un método descrito más adelante para evaluar la producción de PHA a escala de matraz, por ejemplo.
Preferiblemente, al menos una porción de un gen de enzima de degradación de PHA adicional del microorganismo usado en la presente invención también se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen. Concretamente, es preferible usar un microorganismo en el que dos o más genes de enzima de degradación de PHA se han alterado al menos parcialmente mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición de tal manera que se reduce o elimina la actividad de las enzimas de degradación de PHA codificadas por estos genes. Los ejemplos del gen de enzima de degradación de PHA adicional incluyen las enzimas de degradación de PHA mencionadas por Steinbuchel et al. (Microbiology., 156: 2136-52 (2010)) incluyendo el gen phaZ1 (que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 y tiene la secuencia de base de SEQ ID N0:16) y el gen phaZ2 (que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 y tiene la secuencia de base de SEQ ID N0:18). El microorganismo usado en la presente invención contiene preferiblemente alteraciones en el gen phaZ6 y el gen phaZ1, o en el gen phaZ6 y el gen phaZ2, más preferiblemente en el gen phaZ6, el gen phaZ1 y el gen phaZ2.
Además de los genes mencionados anteriormente, otros ejemplos del gen de enzima de degradación de PHA adicional incluyen un gen que tiene funciones fisiológicas equivalentes. Puede mencionarse, por ejemplo, un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0: 19 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA. La identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0: 17 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias es preferiblemente de al menos el 90 %, más preferiblemente de al menos el 95 %, en cuanto a aumentar la probabilidad de que la enzima
de degradación de PHA codificada tenga actividad de enzima de degradación de PHA. La identidad de secuencia del gen con la secuencia de base de SEQ ID N0:16 o la secuencia de base de SEQ ID N0:18 en la lista de secuencias es preferiblemente de al menos el 85 %, más preferiblemente de al menos el 90 %, todavía más preferiblemente de al menos el 95 %. El método para alterar al menos una porción del gen mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición es tal como se describió anteriormente.
El microorganismo usado en la presente invención puede ser una bacteria de síntesis de PHA que contiene genes de enzima de degradación de PHA. Los ejemplos incluyen aquellos pertenecientes al género Cupriavidus. Entre los géneros Cupriavidus son preferibles las cepas de Cupriavidus necator y en particular Cupriavidus necator H16 es el más preferido. Naturalmente, también pueden usarse una cepa mutante que puede obtenerse mediante la mutación artificial del microorganismo y una cepa recombinante obtenida mediante la mutación del microorganismo a través de ingeniería genética.
El microorganismo usado en la presente invención puede ser un microorganismo que puede obtenerse mediante la introducción de un gen de PHA sintasa en un microorganismo huésped. En el caso de producir un copolímero de PHA que contiene unidades derivadas de ácido 3-hidroxibutírico, puede usarse un microorganismo en el que se han introducido genes seleccionados de manera apropiada, tales como un gen para la síntesis de unidades derivadas de un ácido 3-hidroxialcanoico distinto de ácido 3-hidroxibutírico o de ácido 4-hidroxialcanoico, y/o un gen que codifica para una enzima implicada en la síntesis de PHA que contienen tales unidades. En particular, en el caso de producir P(3HB-co-3HH), es preferible usar una cepa en la que se ha introducido un gen de PHA sintasa derivado de una bacteria productora de P(3HB-co-3HH), tal como Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila o la especie Chromobacterium, o un gen alterado del mismo. Los ejemplos del gen de PHA sintasa incluyen, pero no se limitan a, una PHA sintasa que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15, y un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos y que tiene actividad de PHA sintasa. La identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 es preferiblemente de al menos el 90 %, más preferiblemente de al menos el 95 %, en cuanto a garantizar la actividad de PHA sintasa.
El PHA producido mediante el método de la presente invención puede ser cualquier PHA que pueda producirse por un microorganismo, pero es preferiblemente un PHA preparado mediante polimerización de una composición que incluye al menos un ácido 3-hidroxialcanoico seleccionado de ácidos 3-hidroxialcanoicos C4 a C16, o un copolímero de PHA preparado mediante copolimerización de una composición que incluye al menos un ácido 3-hidroxialcanoico seleccionado de ácidos 3-hidroxialcanoicos C4 a C16. Los ejemplos específicos incluyen polihidroxibutirato P(3HB) preparado mediante polimerización de un ácido 3-hidroxialcanoico C4; poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) P(3HB-co-3HH) preparado mediante copolimerización de ácidos 3-hidroxialcanoicos C4 y C6; poli(3-hidroxibutiratoco-3-hidroxivalerato) P(3HB-co-3HV) preparado mediante copolimerización de ácidos 3-hidroxialcanoicos C4 y C5; y polihidroxialcanoatos (PHA) preparados mediante polimerización o copolimerización de ácidos 3-hidroxialcanoicos C4 a C14. El tipo de PHA que va a producirse puede seleccionarse de manera adecuada mediante la introducción de un gen conocido implicado en la síntesis de PHA en, por ejemplo, C. necator usado como microorganismo huésped.
Se observa que la alteración de genes de enzima de degradación de PHA que incluyen el gen phaZ6 de C. necator es eficaz para aumentar el peso molecular de los PHA que contienen ácido 3-hidroxibutírico. Teniendo en cuenta la especificidad de sustrato de la enzima, el PHA en la presente invención es preferiblemente un PHA que contiene unidades de ácido 3-hidroxibutírico, más preferiblemente un copolímero de p Ha que contiene unidades de ácido 3-hidroxibutírico, entre otras. La presente invención es particularmente útil para producir un copolímero de PHA que contiene unidades derivadas de ácido 3-hidroxihexanoico además de las unidades derivadas de ácido 3-hidroxibutírico, tal como P(3HB-co-3HH).
El PHA puede producirse cultivando el microorganismo mediante un método conocido. Puede usarse cualquier fuente de carbono asimilada por el microorganismo, y los ejemplos incluyen fuentes de carbono generalmente usadas para el cultivo de microorganismos, tales como alcoholes, azúcares, grasas/aceites y/o ácidos grasos. Se prefieren azúcares tales como glucosa, fructosa y sacarosa; alcoholes tales como glicerol; aceites/grasas tales como aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de maíz, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de colza y aceite de Jatropha, y aceites fraccionados de los mismos; y ácidos grasos tales como ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido láurico, ácido oleico, ácido esteárico, ácido palmítico y ácido mirístico, y derivados de los mismos. Como ejemplo más preferido puede mencionarse la oleína de palmiste que puede obtenerse como fracción de bajo punto de fusión a partir del aceite de palmiste, además de aceites vegetales tales como aceite de palma y aceite de palmiste. Con el motivo de evitar competiciones con los alimentos, también pueden mencionarse subproductos del refino de grasas/aceites, tales como destilado de ácido graso de aceite de palma (PFAD), destilado de ácido graso de aceite de palmiste (PKFAD) y destilado de ácido graso de aceite de colza. En general, el uso de una fuente de carbono rentable tal como PFAD tiende a dar como resultado un PHA con un peso molecular bajo. Por el contrario, el método de la presente invención puede suprimir la reducción del peso molecular incluso cuando se usa PFAD o similar como fuente de carbono.
En el caso de usar un ácido graso, una grasa/aceite y/o una mezcla de los mismos como fuente de carbono, el ácido
graso, la grasa/aceite y/o la mezcla de los mismos puede emulsionarse con una sal de ácido fosfórico o una proteína antes de su uso. Los ejemplos de sales de ácido fosfórico incluyen ortofosfatos tales como hidrogenofosfato de disodio y dihidrogenofosfato de potasio, pirofosfatos tales como pirofosfato de sodio, metafosfatos tales como hexametafosfato de sodio, y polifosfatos tales como polifosfato de sodio. Los ejemplos de proteínas incluyen lactoproteínas, proteínas de soja y productos de la descomposición parcial de gluten, y sales de los mismos. Los ejemplos de lactoproteínas incluyen caseína, caseinato de sodio y suero de leche.
En el caso de usar un subproducto del refino de grasa/aceite como fuente de carbono, la grasa/aceite tiene un contenido de ácidos grasos libres preferiblemente de al menos el 50 %, más preferiblemente de al menos el 80 %, todavía más preferiblemente de al menos el 90 %.
El término “ácido graso libre” tal como se usa en el presente documento se refiere a ácidos grasos que no están unidos a otros compuestos. Los ejemplos de ácidos grasos libres de cadena larga incluyen ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido araquídico y ácido palmitoleico.
Preferiblemente, el ácido palmítico representa del 40 al 60 %, más preferiblemente del 45 al 55 %, del contenido de ácidos grasos libres.
El PHA puede acumularse en el microorganismo cultivando el microorganismo en un medio productor de PHA después de que el microorganismo prolifere en un medio de precultivo. El medio de precultivo no está limitado particularmente siempre que el microorganismo pueda proliferar en el medio.
El medio productor de PHA contiene una fuente de carbono tal como se describió anteriormente, y puede contener componentes adicionales tales como una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas. Los ejemplos de fuentes de nitrógeno incluyen amoniaco y sales de amonio tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio y fosfato de amonio. Los ejemplos de sales inorgánicas incluyen dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de disodio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio y cloruro de sodio. El medio puede contener además un antibiótico (por ejemplo, kanamicina) que corresponde a un gen de resistencia a fármacos contenido en un plásmido de expresión génica.
La temperatura de cultivo puede ser cualquier temperatura a la que pueda crecer el microorganismo, y es preferiblemente de 20 °C a 40 °C. El periodo de cultivo no está limitado particularmente, y puede ser de aproximadamente 1 día a 10 días.
El PHA producido mediante el método de la presente invención puede recogerse a partir de células mediante un método conocido. Por ejemplo, puede usarse el siguiente método. Después de cultivar el microorganismo, se separan las células cultivadas a partir del medio de cultivo usando una centrífuga o similar, y se lavan las células con agua destilada y metanol, y luego se secan. A partir de las células secas, se extrae el PHA en un disolvente orgánico tal como cloroformo. Se filtra la disolución que contiene el PHA obtenido para retirar los componentes celulares, y se mezcla el filtrado con un disolvente deficiente tal como metanol o hexano para provocar la precipitación del PHA. Se filtra o centrifuga adicionalmente la mezcla para retirar el sobrenadante, y se seca el residuo. Por tanto, puede recogerse el PHA.
La productividad de las células de microorganismos puede medirse mediante un método conocido tal como absorciometría o determinación de peso celular en seco. El rendimiento de la sustancia producida por el microorganismo puede determinarse mediante un método conocido tal como CG o HPLC. El contenido de PHA acumulado en las células puede medirse después de extraer el PHA a partir de las células cultivadas en un disolvente orgánico tal como cloroformo, y secando el extracto, según el método de Kato et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 363 (1996); Bull. Chem. Soc., 69, 515 (1996)).
El término “método para evaluar la producción de PHA a escala de matraz” tal como se usa en el presente documento se refiere a una serie de métodos descritos más adelante para el cultivo de microorganismos, la extracción de PHA, la evaluación del rendimiento de PHA y la evaluación del peso molecular de PHA.
La composición del medio de cultivo simiente es la siguiente: 1 % (p/v) de extracto de carne, 1 % (p/v) de Bacto-Trypton, 0,2 % (p/v) de extracto de levadura, 0,9 % (p/v) de Na2HP04-12H20, 0,15 % (p/v) de KH2P04.
La composición del medio productor de PHA es la siguiente: 1,1 % (p/v) de Na2HP04'12H20, 0,19% (p/v) de KH2P04, 0,13 % (p/v) de (NH4)2S04, 0,1 % (p/v) de MgS04'7H20, 0,1 % (v/v) de disolución salina de oligoelementos (una disolución del 1,6% (p/v) de F e C h ^ 0 , el 1 % (p/v) de C a C h ^ 0 , el 0,02% (p/v) de C o C h ^ 0 , el 0,016 % (p/v) de CuS04'5H20 y el 0,012 % (p/v) de NiCl2-6H20 en ácido clorhídrico 0,1 N). La fuente de carbono es una única fuente de carbono de oleína de aceite de palmiste que es una fracción de bajo punto de fusión del aceite de palmiste.
Se inocula una reserva de glicerol (50 |il) del microorganismo de interés en el medio de cultivo simiente (10 ml) y se
incuba en el mismo durante 24 horas. El cultivo resultante se usa como cultivo simiente.
El cultivo para la producción de PHA se realiza de la siguiente manera: se inocula el cultivo simiente en un matraz de agitación que contiene el medio productor de PHA (50 ml) hasta una concentración del 1,0% (v/v); y se incuba el matraz a 30 °C durante de 21 a 25 horas con agitación. Después de la incubación, se recogen las células mediante centrifugación, se lavan con metanol, se liofilizan, y se mide el peso celular en seco.
A las células secas obtenidas (1 g) se les añade cloroformo (100 ml). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante un día y una noche completos, y se extrae el PHA en las células. Se filtra la disolución extraída para retirar los residuos celulares, y se concentra en un evaporador hasta un volumen total de aproximadamente 30 ml. A la disolución concentrada se le añade gradualmente hexano (90 ml), y se deja reposar la mezcla durante una hora con agitación lenta. Se elimina por filtración el precipitado de PHA, y se seca a vacío a 50 °C durante tres horas. Se pesa el PHA seco y se calcula el rendimiento de PHA.
A continuación, se mide el peso molecular del PHA obtenido. Se usa cromatografía de permeación en gel para analizar el peso molecular promedio en peso del PHA. Se disuelve el PHA extraído (15 mg) en cloroformo (10 ml), y se filtra la disolución a través de un filtro de 0,2 |im para proporcionar una muestra de medición. Se analiza una cantidad de 0,05 ml de la muestra. El análisis se realiza a 40 °C usando un sistema de medición SLC-10A (disponible de SHIMADZU C0RP0RATI0N) y dos columnas Shodex GPC K-806L (disponibles de Showa Denko K.K.) conectadas en serie. La fase móvil es cloroformo (1,0 ml/min), y se usa un detector RI (RID-10A, disponible de SHIMADZU C0RP0RATI0N). Como muestras patrón se usan poliestirenos tratados de la misma manera (disponibles de Showa Denko K.K., peso molecular promedio en peso: aproximadamente 7.000.000, aproximadamente 1.070.000, 150.000, 30.000), y se determina el peso molecular promedio en peso del PHA a partir de la curva de calibración.
El peso molecular promedio en peso de los PHA producidos mediante la presente invención es preferiblemente de al menos 3.500.000, más preferiblemente de al menos 4.000.000, tal como se determina mediante el método para evaluar la producción de PHA a escala de matraz.
Ejemplos
La presente invención se describe en detalle a continuación con referencia a ejemplos, pero la presente invención no se limita a estos ejemplos. La manipulación génica general puede llevarse a cabo tal como se describe en Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Las enzimas, los huéspedes de clonación y otros materiales que van a usarse en la manipulación génica pueden adquirirse a partir de proveedores disponibles comercialmente y pueden usarse según las instrucciones proporcionadas por los proveedores. Las enzimas no están limitadas particularmente siempre que puedan usarse en la manipulación génica.
(Preparación 1) Preparación de KNK005 AphaZ6
En primer lugar, se preparó un plásmido para sustitución génica. Específicamente, el procedimiento de preparación fue de la siguiente manera.
Se realizó PCR usando el ADN cromosómico de C. necator H16 como molde y los cebadores 1 y 2 de las SEQ ID N0:3 y 4. La PCR consistió en (1) 98 °C durante 2 minutos; y 25 ciclos de: (2) 98 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 2 minutos. La polimerasa usada fue K0D-plus-(disponible de T0Y0B0 C0., LTD.). Posteriormente, se realizó PCR usando los cebadores 3 y 4 de las SEQ ID N0:5 y 6 de la misma manera. Usando los dos fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR como moldes, junto con los cebadores 1 y 4, se realizó PCR en las mismas condiciones, y se digirió el fragmento de ADN resultante con la enzima de restricción SwaI.
Se ligó el fragmento de ADN al vector digerido con SwaI pNS2X-sacB divulgado en el documento JP 2007-259708 A con una ADN ligasa (alta ligación, disponible de T0Y0B0 C0., LTD.) para proporcionar un vector plasmídico para la alteración génica pNS2X-phaZ6 (-+) que porta las secuencias de base en el sentido de 5' y en el sentido de 3' del gen estructural phaZ6.
A continuación, se prepararon células con una alteración génica. Específicamente, se transformó Escherichia coli S17-1 (ATCC47055) con el vector plasmídico para la alteración génica pNS2X-phaZ6(-+), y se cultivaron con KNK005 (véase el documento US7384766) en agar nutritivo (disponible de Difco) para permitir la transferencia conjugativa. KNK005 es una cepa derivada de Cupriavidus necator H16 en la que se ha introducido un gen que codifica para una PHA sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias. Se inoculó el cultivo en medio de agar de Simmons que contenía kanamicina (250 mg/l) (citrato de sodio 2 g/l, cloruro de sodio 5 g/l, sulfato de magnesio heptahidratado 0,2 g/l, dihidrogenofosfato de amonio 1 g/l, dihidrogenofosfato de potasio 1 g/l, agar 15 g/l, pH 6,8), y se seleccionaron las células hechas crecer en el medio de agar, y se recogieron como cepa en la que el plásmido se había integrado en el cromosoma de C. necator H16. Se
cultivó la cepa durante dos generaciones en caldo nutritivo (disponible de Difco), y luego se diluyó y se sembró en placa en un medio de agar nutritivo que contenía sacarosa al 15 %. Se recogieron las células hechas crecer como cepa sin el plásmido.
Además, se realizó análisis de PCR para aislar una cepa en la que se había delecionado desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ6 en el cromosoma. Esta cepa con una alteración génica se denominó KNK005 AphaZ6. La cepa obtenida KNK005 AphaZ6 es una cepa en la que se ha delecionado desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ6 en el cromosoma de Cupriavidus necator H16, y en la que se ha introducido en el cromosoma un gen que codifica para una PHA sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias.
(Preparación 2) Preparación de KNK005 AphaZ1
En primer lugar, se preparó un plásmido para sustitución génica. Específicamente, el procedimiento de preparación fue de la siguiente manera.
Se realizó PCR usando el ADN cromosómico de C. necator H16 como molde y los cebadores 5 y 6 de las SEQ ID N0:7 y 8. La PCR consistió en (1) 98 °C durante 2 minutos; y 25 ciclos de: (2) 98 °C durante l5 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 2 minutos. La polimerasa usada fue K0D-plus-(disponible de T0Y0B0 C0., LTD.). Posteriormente, se realizó PCR usando los cebadores 7 y 8 de las SEQ ID n0:9 y 10. Usando los dos fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR como moldes junto con los cebadores 5 y 8, se realizó PCR en las mismas condiciones, y se digirió el fragmento de ADN resultante con la enzima de restricción SwaI.
Se ligó el fragmento de ADN al vector digerido con Swal pNS2X-sacB divulgado en el documento JP 2007-259708 A con una ADN ligasa (alta ligación, disponible de T0Y0B0 C0., LTD.) para proporcionar un vector plasmídico para la alteración génica pNS2X-phaZ1(-+) que porta las secuencias de ADN en el sentido de 5' y en el sentido de 3' del gen estructural phaZI.
Siguiendo el mismo procedimiento que para preparar una cepa con alteración génica en la preparación 1 y usando KNK005 como cepa parental y pNS2X-phaZ1(-+), se obtuvo una cepa (KNK005 AphaZI) con una alteración génica cromosómica en la que se había delecionado desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZI en el cromosoma. KNK005 AphaZI obtenida es una cepa en la que se ha delecionado desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZI en el cromosoma de Cupriavidus necator H16, y en la que se ha introducido en el cromosoma un gen que codifica para una PHA sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias.
(Preparación 3) Preparación de KNK005 AphaZ2
En primer lugar, se preparó un plásmido para sustitución génica. Específicamente, el procedimiento de preparación fue de la siguiente manera.
Se realizó PCR usando el ADN cromosómico de C. necator H16 como molde y los cebadores 9 y 10 de las SEQ ID N0:11 y 12. La PCR consistió en (1) 98 °C durante 2 minutos; y 25 ciclos de: (2) 98 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 2 minutos. La polimerasa usada fue K0D-plus-(disponible de T0Y0B0 C0., LTD.). Posteriormente, se realizó PCR usando los cebadores 11 y 12 de las SEQ ID N0:13 y 14 de la misma manera. Usando los dos fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR como moldes junto con los cebadores 9 y 12, se realizó PCR en las mismas condiciones, y se digirió el fragmento de ADN resultante con la enzima de restricción SwaI.
Se ligó el fragmento de ADN digerido con SwaI al vector pNS2X-sacB divulgado en el documento JP 2007-259708 A con una ADN ligasa (alta ligación, disponible de T0Y0B0 C0., LTD.) para proporcionar un vector plasmídico para la alteración génica pNS2X-phaZ2 (-+) que porta las secuencias de base en el sentido de 5' y en el sentido de 3' del gen estructural phaZ2.
Siguiendo el mismo procedimiento que para preparar una cepa con alteración génica en la preparación 1 y usando KNK005 como cepa parental y pNS2X-phaZ2(-+), se obtuvo una cepa (KNK005 AphaZ2) con una alteración génica cromosómica en la que se había delecionado desde el 16° codón hasta el codón de parada del gen phaZ2 en el cromosoma. KNK005 AphaZ2 obtenida es una cepa en la que se ha delecionado desde el 16° codón hasta el codón de parada del gen phaZ2 en el cromosoma de Cupriavidus necator H16, y en la que se ha introducido en el cromosoma un gen que codifica para una PHA sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias.
(Preparación 4) Preparación de KNK005 AphaZ1,6
Siguiendo el mismo procedimiento que para preparar una cepa con alteración génica en la preparación 2 y usando
KNK005 AphaZ6 como cepa parental y pNS2X-phaZ1(-+), se obtuvo una cepa (KNK005 AphaZ1,6) con alteraciones génicas cromosómicas en la que se había delecionado desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ6 y desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ1 en el cromosoma.
(Preparación 5) Preparación de KNK005 AphaZ2,6
Siguiendo el mismo procedimiento que para preparar una cepa con alteración génica en la preparación 3 y usando KNK005 AphaZ6 como cepa parental y pNS2X-phaZ2(-+), se obtuvo una cepa (KNK005 AphaZ2,6) con alteraciones génicas cromosómicas en la que se había delecionado desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ6 y desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ2 en el cromosoma.
(Ejemplo 1) Producción de PHA por KNK005 AphaZ6
La composición del medio de cultivo simiente usado fue la siguiente: 1 % (p/v) de extracto de carne, 1 % (p/v) de Bacto-Trypton, 0,2 % (p/v) de extracto de levadura, 0,9 % (p/v) de Na2HP04-12H20, 0,15 % (p/v) de KH2P04.
La composición del medio productor de PHA usado fue la siguiente: 1,1 % (p/v) de Na2HP04-12H20, 0,19 % (p/v) de KH2P04, 0,13 % (p/v) de (NH4)2S04, 0,1 % (p/v) de MgS04-7H20, 0,1 % (v/v) de disolución salina de oligoelementos (una disolución del 1,6% (p/v) de FeC h^^0 , el 1 % (p/v) de C aC h^^0 , el 0,02% (p/v) de C oC h^^0 , el 0,016 % (p/v) de CuS04'5H20 y el 0,012 % (p/v) de N iC h^^0 en ácido clorhídrico 0,1 n ). La fuente de carbono usada fue una única fuente de carbono de oleína de aceite de palmiste que es una fracción de bajo punto de fusión del aceite de palmiste.
Se inoculó una reserva de glicerol (50 |il) de KNK005 AphaZ6 preparado en la preparación 1 en el medio de cultivo simiente (10 ml) y se incubó durante 24 horas. El cultivo se usó como cultivo simiente.
El cultivo para la producción de PHA se realizó de la siguiente manera: se inoculó el cultivo simiente en un matraz de agitación que contenía el medio productor de PHA (50 ml) hasta una concentración del 1,0 % (v/v); y se incubó el matraz a 30 °C durante de 21 a 25 horas con agitación. Después de la incubación, se recogieron las células mediante centrifugación, se lavaron con metanol, se liofilizaron, y se midió el peso celular en seco.
A las células secas obtenidas (1 g) se les añadió cloroformo (100 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas, y se extrajo el PHA en las células. Se filtró la disolución extraída para retirar los residuos celulares, y se concentró en un evaporador hasta un volumen total de aproximadamente 30 ml. A la disolución concentrada se le añadió gradualmente hexano (90 ml), y se dejó reposar la mezcla durante una hora con agitación lenta. Se eliminó por filtración el precipitado de PHA, y se secó a vacío a 50 °C durante tres horas. Se pesó el PHA seco y se calculó el rendimiento de PHA. La tabla 1 muestra los resultados.
A continuación, se midió el peso molecular del PHA obtenido. Se usó cromatografía de permeación en gel para analizar el peso molecular promedio en peso del PHA. Se disolvió el PHA extraído (15 mg) en cloroformo (10 ml), y se filtró la disolución a través de un filtro de 0,2 |im para proporcionar una muestra de medición. Se analizó una cantidad de 0,05 ml de la muestra. El análisis se realizó a 40 °C usando un sistema de medición SLC-10A (disponible de SHIMADZU C0RP0RATI0N) y dos columnas Shodex GPC K-806L (disponibles de Showa Denko K.K.) conectadas en serie. La fase móvil fue cloroformo (1,0 ml/min), y se usó un detector RI (RID-10A, disponible de SHIMADZU C0RP0RATI0N). Como muestras patrón se usaron poliestirenos tratados de la misma manera (disponibles de Showa Denko K.K., peso molecular promedio en peso: aproximadamente 7.000.000, aproximadamente 1.070.000, 150.000, 30.000), y se determinó el peso molecular promedio en peso del PHA a partir de la curva de calibración. La tabla 1 muestra los resultados.
(Ejemplo 2) Producción de PHA por KNK005 AphaZ1,6
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 1 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 AphaZ1,6 preparado en la preparación 4, se produjo un PHA. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se determinaron de la misma manera. La tabla 1 muestra los resultados.
(Ejemplo 3) Producción de PHA por KNK005 AphaZ2,6
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 1 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 AphaZ2,6 preparado en la preparación 5, se produjo un PHA. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se determinaron de la misma manera. La tabla 1 muestra los resultados.
(Ejemplo comparativo 1) Producción de PHA por KNK005 AphaZ1
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 1 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 AphaZ1 preparado en la preparación 2, se produjo un PHA. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA
también se determinaron de la misma manera. La tabla 1 muestra los resultados.
(Ejemplo comparativo 2) Producción de PHA por KNK005 AphaZ2
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 1 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 AphaZ2 preparado en la preparación 3, se produjo un p Ha . El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se determinaron de la misma manera. La tabla 1 muestra los resultados.
(Ejemplo comparativo 3) Producción de PHA por KNK005
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 1 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 sin una alteración en los genes de enzima de degradación de PHA, se produjo un PHA. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se determinaron de la misma manera. La tabla 1 muestra los resultados.
Los resultados muestran que el peso molecular promedio en peso del PHA logrado mediante la alteración del gen phaZ6 en el ejemplo 1 fue más del doble que el del ejemplo comparativo 3 usando KNK005. Además, se aumentó notablemente el peso molecular promedio en peso del PHA del ejemplo 1 en comparación con los ejemplos comparativos 1 y 2 en los que se había alterado un gen de enzima de degradación de PHA distinto del gen phaZ6. La alteración del gen phaZ1 o phaZ2 además del gen phaZ6 en los ejemplos 2 y 3 dio como resultado pesos moleculares promedio en peso del PHA de 3.500.000 o más, en particular, el uso de KNK005 AphaZ1,6 en el ejemplo 2 dio como resultado un peso molecular promedio en peso de 4.000.000 o más.
[Tabla 1]
(Ejemplo 4) Análisis composicional de los PHA
Se analizó mediante cromatografía de gases la composición de los PHA producidos por los transformantes. Cada uno de los PHA secos (20 mg) se mezcló con una mezcla de ácido sulfúrico/metanol (15:85, 2 ml) y cloroformo (2 ml), y se selló herméticamente el sistema. Se calentó la mezcla a 100 °C durante 140 minutos, de modo que el PHA se descompuso para dar el éster metílico. Se enfrió el éster metílico, y se añadió gradualmente hidrogenocarbonato de sodio (1,5 g) al éster metílico enfriado para la neutralización. Se dejó reposar esta mezcla hasta que se detuvo la producción de gas de dióxido de carbono. A la mezcla se le añadió diisopropil éter (4 ml), y se agitó exhaustivamente la mezcla resultante, seguido de centrifugación. La composición de unidades monoméricas del producto de descomposición de PHA en el sobrenadante se determinó mediante cromatografía de gases capilar. El cromatógrafo de gases fue GC-17A disponible de SHIMADZU C0RP0RATI0N, y la columna capilar fue NEUTRA B0ND-1 disponible de GL Sciences Inc. (longitud de columna: 25 m, diámetro interno de columna: 0,25 mm, grosor de membrana líquida: 0,4 μm). El gas portador fue helio, la presión de entrada de columna fue de 100 kPa, y la muestra se usó en una cantidad de 1 |il. La temperatura se aumentó desde una temperatura inicial de 100 °C hasta 100 °C a 8 °C/min, y se aumentó adicionalmente desde 200 °C hasta 290 °C a 30 °C/min.
El análisis realizado en las condiciones anteriormente mencionadas reveló que los PHA producidos por los transformantes KNK005, KNK005 AphaZ6, KNK005 AphaZ1, KNK005 AphaZ2, KNK005 AphaZ1,6 y KNK005 AphaZ2,6 en los que se había introducido un gen de PHA sintasa que codifica para una PHA sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 fueron todos P(3HB-co-3HH).
(Ejemplo 5) Producción de PHA por KNK005 AphaZ6 en fermentador de frasco con PFAD como fuente de carbono La composición del medio de cultivo simiente fue la siguiente: 1 % (p/v) de extracto de carne, 1 % (p/v) de Bacto-Trypton, 0,2 % (p/v) de extracto de levadura, 0,9 % (p/v) de Na2HP04-12^0, 0,15 % (p/v) de KH2P04.
La composición del medio de precultivo fue la siguiente: 1,1 % (p/v) de Na2HP04-12H20, 0,19 % (p/v) de KH2P04, 1,29 % (p/v) de (NH4)2S04, 0,1 % (p/v) de MgS04'7H20, 2,5 % (p/v) de aceite oleico de palma W, 0,5 % (v/v) de disolución salina de oligoelementos (una disolución del 1,6% (p/v) de FeCl3-6H20, el 1 % (p/v) de C aC h^^0 , el
0,02 % (p/v) de C0Cl26H20, el 0,016 % (p/v) de CUS045H20 y el 0,012 % (p/v) de NÍCl26H20 en ácido clorhídrico 0,1 N).
La composición del medio productor de PHA fue la siguiente: 0,578 % (p/v) de Na2HP04-12H20, 0,101 % (p/v) de KH2P04, 0,437 % (p/v) de (NH4)2S04, 0,15% (p/v) de MgS04'7H20, 0,75% (v/v) de disolución salina de oligoelementos (una disolución del 1,6% (p/v) de FeCl3'6H20, el 1 % (p/v) de C aC h^^0 , el 0,02% (p/v) de CoCl2'6H20, el 0,016 % (p/v) de CuS04-5^0 y el 0,012 % (p/v) de N iC h^^0 en ácido clorhídrico 0,1 N). La fuente de carbono fue el destilado de ácido graso de palma (pFAD) (disponible de MALAYSIAN BI0TECHN0L0GY C0RP0RATI0N SDN BHD; contenido de ácidos grasos libres del 95,0%; composición de ácidos grasos C12:0 0,2%, C14:0 1,2% C16:0 47,6%, C16:1 0,3%, C18:1 35,7%, C18:2 9,7%, C18:3 0,4%, C20:0 0,4 %; punto de fusión de 43,8 °C) que se emulsionó de la manera descrita a continuación antes de su uso.
Se pesaron PFAD (550 g) y agua (450 g) y se calentaron individualmente hasta 60 °C. En el agua se disolvieron Na2HP04'12H20 (4,7 g) y caseinato de sodio (2,75 g). Después de disolverse, se combinó la disolución con PFAD, y se preemulsionó la mezcla con una homomezcladora (LAB0RAT0RY MIXER EMULSIFIER, disponible de SILVERS0N) a una velocidad de agitación de 2500 rpm. Se emulsionó adicionalmente la emulsión resultante con una homogeneizadora de alta presión (modelo: PANDA2K, disponible de GEA Niro Soavi) a una presión de 10 bar para proporciona una emulsión.
Se inoculó una reserva de glicerol (50 p l) de KNK005 AphaZ6 preparado en la preparación 1 en el medio de cultivo simiente (10 ml) y se incubó durante 24 horas, y luego se inoculó hasta una concentración del 1,0 % (v/v) en un fermentador de frasco de 3 l (MDL-300, disponible de B. E. Marubishi Co., Ltd.) que contenía el medio de precultivo (1,8 l). Se incubó el fermentador durante 28 horas en las siguientes condiciones de funcionamiento: temperatura de cultivo de 30 °C, velocidad de agitación de 500 rpm, tasa de aireación de 1,8 l/min y pH controlado en el intervalo de 6,7 a 6,8. El pH se controló usando una disolución acuosa de hidróxido de amonio al 7 %.
El cultivo para la producción de PHA se realizó de la siguiente manera. Se inoculó el cultivo simiente hasta una concentración del 25 % (v/v) en un fermentador de frasco de 10 l (MDL-1000, disponible de B. E. Marubishi Co., Ltd.) que contenía el medio de producción (2 l). Se incubó el fermentador en las siguientes condiciones de funcionamiento: temperatura de cultivo de 32 °C, velocidad de agitación de 450 rpm y tasa de aireación de 3,0 l/min, y pH controlado en el intervalo de 6,7 a 6,8. El pH se controló usando una disolución acuosa de hidróxido de amonio al 7 %. La incubación se continuó durante de 45 a 54 horas, y se tomaron muestras del caldo de cultivo durante y al final de la incubación. Las muestras se centrifugaron para recoger las células, y las células se lavaron con metanol, se liofilizaron, y se midió el peso celular seco. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se determinaron de la misma manera que en el ejemplo 1. La tabla 2 muestra los resultados.
(Ejemplo 6) Producción de PHA por KNK005 AphaZ1,6 usando PFAD como fuente de carbono
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 AphaZ1,6 preparado en la preparación 4, se produjo un PHA. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se midieron de la misma manera. La tabla 2 muestra los resultados.
(Preparación 6) Preparación de KNK005 AphaZ1,2,6
Siguiendo el mismo procedimiento que en la preparación 2 y usando KNK005 AphaZ2,6 como cepa parental y pNS2X-phaZ1(-+), se preparó una cepa (KNK005 AphaZ1,2,6) con alteraciones génicas cromosómicas en la que se había delecionado desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ2, desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ6 y desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen phaZ1 en el cromosoma.
(Ejemplo 7) Producción de PHA por KNK005 AphaZ1,2,6 en fermentador de frasco usando PFAD como fuente de carbono
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 AphaZ1,2,6 preparado en la preparación 6, se produjo un PHA. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se determinaron de la misma manera. La tabla 2 muestra los resultados.
(Ejemplo comparativo 4) Producción de PHA por KNK005 en fermentador de frasco usando PFAD como fuente de carbono
Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5 y reemplazando KNK005 AphaZ6 por KNK005 sin una alteración en los genes de enzima de degradación de PHA, se produjo un PHA. El rendimiento y el peso molecular promedio en peso del PHA también se determinaron de la misma manera. La tabla 2 muestra los resultados.
La tabla 2 muestra el rendimiento y el peso molecular promedio en peso analizados aproximadamente 45 horas
Claims (7)
1. Método para producir un copolímero de PHA, que comprende cultivar un microorganismo,
en el que al menos una porción de cualquiera de los siguientes genes (a) y (b) del microorganismo se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen:
(a) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias; y
(b) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA,
y
en el que el microorganismo es un microorganismo en el que se ha introducido cualquiera de los siguientes genes (e) y(f):
(e) un gen de PHA sintasa que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias; y
(f) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias y que tiene actividad de PHA sintasa; y
en el que el microorganismo es Cupriavidus necator.
2. Método para producir un copolímero de PHA según la reivindicación 1,
en el que al menos una porción de un gen de enzima de degradación de PHA adicional del microorganismo también se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de la enzima de degradación de PHA.
3. Método para producir un copolímero de PHA según la reivindicación 2,
en el que el gen de enzima de degradación de PHA adicional es cualquiera de los siguientes genes (c) y (d):
(c) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 y/o un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias; y
(d) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA, y/o un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA.
4. Método para producir un copolímero de PHA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
en el que el PHA es un copolímero de PHA que contiene unidades derivadas de ácido 3-hidroxihexanoico.
5. Método para producir un copolímero de PHA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
en el que el método incluye usar una grasa/aceite que tiene un contenido de ácidos grasos libres de al menos el 50 % como fuente de carbono.
6. Método para producir un copolímero de PHA según la reivindicación 5,
en el que el ácido palmítico representa del 40 al 60 % del contenido de ácidos grasos libres.
7. Microorganismo,
en el que al menos una porción de cualquiera de los siguientes genes (g) y (h) del microorganismo se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen:
(g) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias; y
(h) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA, y
al menos una porción de un gen de enzima de degradación de PHA adicional del microorganismo también se ha alterado mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición para reducir o eliminar la actividad de una enzima de degradación de PHA codificada por el gen;
y
en el que el microorganismo es un microorganismo en el que se ha introducido cualquiera de los siguientes genes (k) y (l):
(k) un gen de PHA sintasa que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias; y
(l) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:15 en la lista de secuencias y que tiene actividad de PHA sintasa. Microorganismo según la reivindicación 7,
en el que el gen de enzima de degradación de PHA adicional es cualquiera de los siguientes genes (i) y (j): (i) un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:17 y/o un gen de enzima de degradación de PHA que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias; y
(j) un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SeQ ID N0:17 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA, y/o un gen que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:19 en la lista de secuencias y que tiene actividad de enzima de degradación de PHA.
Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8,
en el que el microorganismo es un microorganismo perteneciente al género Cupriavidus.
Microorganismo según la reivindicación 9,
en el que el microorganismo es Cupriavidus necator.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012232694 | 2012-10-22 | ||
| JP2012232695 | 2012-10-22 | ||
| PCT/JP2013/078520 WO2014065253A1 (ja) | 2012-10-22 | 2013-10-22 | 高分子量ｐｈａ生産微生物とそれを用いた高分子量ｐｈａの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2952673T3 true ES2952673T3 (es) | 2023-11-03 |
Family
ID=50544632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES13848540T Active ES2952673T3 (es) | 2012-10-22 | 2013-10-22 | Microbio productor de PHA de alto peso molecular y método de producción de PHA de alto peso molecular usando el mismo |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10233468B2 (es) |
| EP (1) | EP2910641B1 (es) |
| JP (1) | JP6313708B2 (es) |
| ES (1) | ES2952673T3 (es) |
| MY (1) | MY170467A (es) |
| WO (1) | WO2014065253A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180371509A1 (en) * | 2015-12-16 | 2018-12-27 | Kaneka Corporation | Pha-producing microorganism having sucrose assimilability, and method for producing pha using said microorganism |
| CN111032727B (zh) * | 2017-08-29 | 2022-09-09 | 三菱瓦斯化学株式会社 | 含有4－羟基丁酸酯单元的聚酯 |
| TWI806893B (zh) * | 2017-08-29 | 2023-07-01 | 日商三菱瓦斯化學股份有限公司 | 聚酯之製造方法 |
| CN111615555A (zh) | 2018-01-17 | 2020-09-01 | 株式会社钟化 | 生产包含高组成比率的3hh单体单元的共聚pha的转化微生物、以及基于该转化微生物的pha的制造方法 |
| CN112771171A (zh) * | 2018-09-27 | 2021-05-07 | 住友林业株式会社 | 嗜盐菌产生的pha共聚物的分子量控制技术 |
| TW202104343A (zh) | 2019-05-13 | 2021-02-01 | 日商三菱瓦斯化學股份有限公司 | 脂肪族聚酯共聚物 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5811272A (en) | 1996-07-26 | 1998-09-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for controlling molecular weight of polyhydroxyalkanoates |
| JP3369421B2 (ja) * | 1996-12-18 | 2003-01-20 | 理化学研究所 | ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）からなるフィルム |
| CA2339421C (en) | 1998-08-18 | 2011-10-11 | Metabolix, Inc. | Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers |
| JP2001275675A (ja) * | 2000-03-30 | 2001-10-09 | Canon Inc | ポリヒドロキシ酪酸合成系酵素群及び該酵素群をコードする遺伝子 |
| US20050239998A1 (en) | 2004-03-04 | 2005-10-27 | Koichi Kinoshita | Method for producing polyhydroxyalkanoate |
| WO2005085460A1 (ja) * | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Kaneka Corporation | ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 |
| US20090130731A1 (en) | 2005-03-24 | 2009-05-21 | Kaneka Corporation | Microorganism capable of accumulating ultra high molecular weight polyester |
| JP4995469B2 (ja) * | 2006-03-01 | 2012-08-08 | 株式会社カネカ | 遺伝子組み換え微生物及びそれを用いたポリエステルの製造方法 |
| JP2007259708A (ja) | 2006-03-27 | 2007-10-11 | Kaneka Corp | 新規生分解性ポリエステルの製造方法 |
| US7384766B2 (en) | 2006-07-26 | 2008-06-10 | Kaneka Corporation | Gene-substituted microorganisms, and production method of polyesters using the same |
| CA2853171A1 (en) * | 2010-12-01 | 2012-06-07 | University Of Manitoba | Microbial production of polyhydroxyalkanoates |
| JP5969395B2 (ja) * | 2011-01-27 | 2016-08-17 | 株式会社カネカ | 高分子量ｐｈａ生産微生物 |
| EP2836601A1 (en) * | 2012-04-11 | 2015-02-18 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Pha-producing genetically engineered microorganisms |
-
2013
- 2013-10-22 EP EP13848540.4A patent/EP2910641B1/en active Active
- 2013-10-22 WO PCT/JP2013/078520 patent/WO2014065253A1/ja active Application Filing
- 2013-10-22 US US14/437,672 patent/US10233468B2/en active Active
- 2013-10-22 ES ES13848540T patent/ES2952673T3/es active Active
- 2013-10-22 MY MYPI2015701247A patent/MY170467A/en unknown
- 2013-10-22 JP JP2014543293A patent/JP6313708B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MY170467A (en) | 2019-08-02 |
| EP2910641A1 (en) | 2015-08-26 |
| JP6313708B2 (ja) | 2018-04-18 |
| US20160237462A1 (en) | 2016-08-18 |
| EP2910641A4 (en) | 2016-04-20 |
| EP2910641B1 (en) | 2023-07-26 |
| US10233468B2 (en) | 2019-03-19 |
| JPWO2014065253A1 (ja) | 2016-09-08 |
| WO2014065253A1 (ja) | 2014-05-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Poltronieri et al. | Polyhydroxyalkanoates (PHAs) in industrial applications | |
| ES2952673T3 (es) | Microbio productor de PHA de alto peso molecular y método de producción de PHA de alto peso molecular usando el mismo | |
| Meng et al. | Production and characterization of poly (3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate) with fully controllable structures by recombinant Escherichia coli containing an engineered pathway | |
| JP6860489B2 (ja) | Ｐｈａ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物、およびそれを用いたｐｈａの製造方法 | |
| Tan et al. | Production of polyhydroxyalkanoates | |
| JP2020058391A (ja) | Ｐｈａ合成酵素をコードする遺伝子を複数有する微生物、およびそれを用いたｐｈａの製造方法 | |
| US10072255B2 (en) | Microorganism having regulated expression of (R)-specific enoyl-coa hydratase gene and method for producing polyhydroxyalkanoate copolymer using same | |
| US9175317B2 (en) | Method for producing a polyhydroxyalkanoate using a microorganism belonging to the genus Cupriavidus | |
| US11268113B2 (en) | PHA-producing microorganism in which glycerol kinase activity is enhanced, and PHA production method using same | |
| TWI806893B (zh) | 聚酯之製造方法 | |
| WO2019044836A1 (ja) | ４－ヒドロキシブチレート単位を含むポリエステル | |
| US10876140B2 (en) | Method for producing polyhydroxyalkanoic acid, and microbes | |
| US20210388324A1 (en) | Transformed microorganism and method of producing polyhydroxyalkanoate | |
| Pramanik et al. | Comparative analysis of different properties of polyhydroxyalkanoates isolated from two different bacterial strains: Alkaliphilus oremlandii OhILAs and recombinant Escherichia coli XL1B | |
| US20090130731A1 (en) | Microorganism capable of accumulating ultra high molecular weight polyester | |
| WO2017033652A1 (ja) | 遊離のヒドロキシ基を有するポリヒドロキシアルカン酸樹脂組成物、およびその製造方法 | |
| WO2021172559A1 (ja) | ブロック共重合体、及びその製造方法 | |
| Shah | BIOPOLYMER (PHA) PRODUCING MICROBES AND ITS APPLICATION | |
| US20180346943A1 (en) | Polyhydroxyalkanoic acid having functional group at terminal carboxy group and method for producing the same | |
| US20230265468A1 (en) | Method for producing poly(3-hydroxyalkanoate) | |
| Bhat | Department of Biotechnology | |
| JP2021108581A (ja) | 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 | |
| US20140378647A1 (en) | UTILIZATION OF THE NOVEL, ENVIRONMENTAL ISOLATE PSEUDOMONAS sp. IPB-A36 FOR THE EFFICIENT PRODUCTION OF mcl/lcl-PHAs and SPECIALTY-PHAs | |
| Reeta | Studies on the molecular mechanism of polyhydroxyalkanoate biosynthesis in Pseudomonas species |