JPWO2014042076A1 - 改質油脂組成物を用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、加工特性に優れた高分子量のポリヒドロキシアルカノエートを製造するために改質された植物由来の炭素源を提供すること、さらにそれを利用したポリエステルの製造方法を提供することを課題とする。植物油脂由来の炭素源の高遊離脂肪酸画分を活性白土により処理することで、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸が効率よく除去可能であること、及び、当該処理後の炭素源を用いて微生物を培養することで、より高分子量のポリヒドロキシアルカノエートを製造できることを見出した。ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭ以下であり、遊離脂肪酸含有量が２０重量％以上である植物由来の炭素源を用いて、微生物を培養することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を提供する。
Description
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（以下ＰＨＡ）の製造方法の技術に関する。
環境問題、食糧問題、健康・安全に対する意識の高まり、天然／自然志向の高まりなどを背景に、微生物の生産や微生物による物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義・重要性が益々高まっている。
微生物の生産や微生物による物質の製造においては、微生物によって好適に資化される炭素源（培養、発酵などのための炭素源）が必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質、油脂（例えば、植物油脂）、脂肪酸（例えば、植物由来の脂肪酸）などが挙げられる。近年、これらの炭素源として、環境問題などを背景に、再生可能な炭素源（特に非石油由来炭素源）、さらに、食糧と競合しない炭素源（所謂、非可食の炭素源）が望まれている。
この観点から、脂肪酸（例えば、植物由来の脂肪酸）は、好適な炭素源の候補の一つとして考えられている。これらの脂肪酸は、例えば、やし、パーム（パーム核を含む）などから得られる。これらの植物に由来する代表的な脂肪酸としては、炭素数１２のラウリン酸、炭素数１４のミリスチン酸、炭素数１６のパルミチン酸などの長鎖飽和脂肪酸や炭素数１８のオレイン酸などの長鎖不飽和脂肪酸といった長鎖脂肪酸が挙げられる。
脂肪酸等の炭素源により広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーとして、ＰＨＡが挙げられる。ＰＨＡは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。例えば、パーム油精製工程由来の脂肪酸混合物であるＰＦＡＤ（Ｐａｌｍ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ）やパーム核油由来の脂肪酸混合物ＰＫＡＯ（Ｐａｌｍ ｋｅｒｎｅｌ ａｃｉｄ ｏｉｌ）を用いてＰＨＡを生産する研究が行われている（非特許文献１）。
ＰＨＡはその分子量によって特性が変化し、繊維などに加工する際にはできるだけ高分子量であることが望ましい。発酵生産工程におけるＰＨＡの分子量制御、特に、分子量を高めるための技術が必要とされている。
これまでに、微生物が産生するＰＨＡの分子量に強く影響する物質が報告されている。例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（現在の分類はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）に炭素源としてグルコースと種々の有機化合物を添加したところ、１−プロパノールや１−ブタノール、１，４ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコールなどのヒドロキシル基を有する化合物に分子量を低下させる効果があることが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、油脂精製副産物である脂肪酸混合物中にそのようなヒドロキシル基を保有した物質が含まれているとは考えにくく、産業上有用な植物由来の脂肪酸混合物を利用して、分子量の低下を抑制しながらＰＨＡを生産する技術には課題が残されていた。
植物油由来の脂肪酸混合物の１つとして、産業上重要なパーム核油由来である組成物（以後、ＰＫＦＡＤ（Ｐａｌｍ ｋｅｒｎｅｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ、ＰＫＡＯと同義）と記載）（非特許文献３）が存在するが、微生物によるＰＨＡの製造における有用性は知られていない。
Appl Microbiol Biotechnol, 89: 1373-1386 (2011)
Biological Macromolecules, 25: 43-53 (1999)
Journal of Oleo Science 56(1):13-17 (2007)
本発明は、微生物を使用した、高分子量のＰＨＡの生産方法を提供することを課題とする。さらに、改質された植物由来の炭素源を提供すること、およびそれを利用したＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。具体的には、植物由来の炭素源中に存在し、微生物によって合成されるＰＨＡの分子量を低下させている物質を除去して得られる炭素源、及び、当該炭素源によるＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、パーム核油由来であり、遊離脂肪酸含量の高いＰＫＦＡＤ（Ｐａｌｍ ｋｅｒｎｅｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ）を用いてＰＨＡの生産研究を行った結果、遊離脂肪酸含量の低いパーム核油（ＰＫＯ）と比較して、分子量の低いＰＨＡが生産されることを見出した。さらに、白土処理した植物由来の炭素源を用いると、微生物によって生産されるＰＨＡの分子量が向上することを見出し、さらに、白土処理で選択的に除去されている物質がブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸であることを見出し、それらが実際に分子量低下を引き起こしていることを見出して本発明を完成させた。
本発明は、ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭ以下であり、遊離脂肪酸含有量が２０重量％以上である植物由来の炭素源を用いて、微生物を培養することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。
さらに、ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭを超え、遊離脂肪酸含有量が２０重量％以上である植物由来の炭素源から、ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭ以下である植物由来の炭素源を調製する工程を含むことが好ましい。
植物由来の炭素源中のブタン酸の含有量が６ｍＭ以下であることが好ましい。
植物由来の炭素源中のヘキサン酸の含有量が３５ｍＭ以下であることが好ましい。
植物由来の炭素源が、活性白土により処理されたものであることが好ましい。
植物由来の炭素源がパーム核油であることが好ましい。
微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌であることが好ましい。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、又はその遺伝子組み換え体であることが好ましい。
ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートヘキサノエートであることが好ましい。
また、本発明は、植物由来の炭素源を活性白土と接触させることを特徴とする、微生物培養のための炭素源の製造方法に関する。
本発明は、産業上有意義な、植物油脂製造工程で生産される炭素源を利用し、高分子量のＰＨＡを生産することを可能とする。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるＰＨＡの種類としては、微生物が生産するＰＨＡであれば特に限定されないが、好ましくは、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される構成成分を重合して得られるＰＨＡや、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される構成成分を共重合して得られる共重合ＰＨＡである。
本発明におけるＰＨＡの種類としては、微生物が生産するＰＨＡであれば特に限定されないが、好ましくは、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される構成成分を重合して得られるＰＨＡや、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される構成成分を共重合して得られる共重合ＰＨＡである。
例えば、炭素数４の３−ヒドロキアルカン酸を重合して得られるポリヒドロキシブチレートＰ（３ＨＢ）、炭素数４と６の３−ヒドロキシアルカン酸を共重合して得られるポリヒドロキシブチレートヘキサノエートＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）、炭素数４と５の３−ヒドロキシアルカン酸を共重合して得られるポリヒドロキシブチレートバレレートＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）、炭素数４〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸を重合或いは共重合して得られるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）などが挙げられる。製造するＰＨＡは、例えば、宿主微生物として用いるＣ．ｎｅｃａｔｏｒに、公知のＰＨＡ合成に関する遺伝子を導入する際に、適宜選択することができる。
本発明では、微生物の培養において、植物由来の炭素源を使用する。植物由来の炭素源は脂肪酸混合物を含むものであってもよい。脂肪酸混合物とは、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、及び遊離脂肪酸などの脂溶性有機物の混合物を指す。
植物由来の炭素源は、ＰＨＡ生産微生物が資化可能であればいずれの植物に由来する炭素源でも使用可能である。植物は限定されないが、例えば、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂の製造工程にて蒸留除去された遊離脂肪酸を多く含む植物由来の炭素源が好ましい。より短鎖の脂肪酸を構成脂肪酸として含むという理由から、植物油脂であるパーム核油、ヤシ油などがより好ましい。
植物由来の炭素源中のブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計は、５０ｍＭ以下であり、好ましくは４２ｍＭ以下、より好ましくは４０ｍＭ以下、さらに好ましくは２０ｍＭ以下である。ブタン酸、ペンタン酸に関しては好ましくは６ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、さらに好ましくは２ｍＭ以下である。ヘキサン酸に関しては、好ましくは３５ｍＭ以下、より好ましくは３０ｍＭ以下、さらに好ましくは２５ｍＭ以下である。
非可食の有用炭素源として期待されるＰＦＡＤやＰＫＦＡＤは、有機酸であるブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭを超える場合がある。植物由来の炭素源中のブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が多い場合には、当該炭素源から、ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭ以下である植物由来の炭素源を調製して使用することができる。調製法としては、例えば、該炭素源から前記有機酸を除去する方法が挙げられる。除去方法は、除去が可能であればその方法を選ばないが、例えば、活性白土処理法、活性炭処理法、水等の水溶性成分を用いた抽出法や、それらの併用が挙げられる。また、前記有機酸の含有量の合計が５０ｍＭを超える炭素源を、ＰＫＯ（Ｐａｌｍ Ｋｅｒｎｅｌ Ｏｉｌ）やＰＯＯ（Ｐａｌｍ Ｏｌｅｉｎ Ｏｉｌ）等の他の炭素源と混合（希釈）することで、炭素源全体における遊離脂肪酸含有量を２０重量％以上に維持しつつ、上記有機酸の含有量の合計が５０ｍＭ以下である植物由来の炭素源を調製してもよい。これらの調製法の中でも、上記有機酸を除去する方法が好ましく、特に、植物由来の炭素源を活性白土と接触させることによる、活性白土処理法が好ましい。
植物由来の炭素源中の、長鎖の遊離脂肪酸含有量は、遊離脂肪酸を多く含む非可食成分の産業利用という観点から、２０重量％以上であり、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは８０重量％以上である。ここで、遊離脂肪酸とは、他の化合物と結合していない脂肪酸を指す。長鎖の遊離脂肪酸として、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸などが挙げられる。
ＰＨＡの製造に使用する微生物は、ＰＨＡを合成可能な微生物やその遺伝子組み換え体であれば、特に限定されないが、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等が挙げられ、この中でもＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌が好ましい。Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌の中では、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒがより好ましい。勿論、前記微生物を人工的に突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された遺伝子組み換え体も使用できる。
宿主微生物に導入するための、ＰＨＡ合成に関わる遺伝子としては、３ＨＢの供給系であるチオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢ合成酵素であるＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡ合成酵素であるＰＨＡシンターゼ、β酸化の酵素であるアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。チオラーゼとしては、β−ケトチオラーゼ等が挙げられ、レダクターゼとしては、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ等が挙げられ、ＰＨＡシンターゼとしては、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡシンターゼ変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体等が挙げられ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、３−ヒドロキシアシルＡＣＰ−ＣｏＡトランスフェラーゼ等が挙げられる。これらの遺伝子は、例えばＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などのＰＨＡ生産細菌由来であることが好ましい。これらの遺伝子に変異を導入して使用することも可能である。
遺伝子を宿主微生物に導入するためにプラスミドを使用する場合、プラスミドは、選択圧が存在しない条件でも宿主微生物内において安定に複製及び維持されることが好ましい。このようなプラスミドとしては、国際公開公報ＷＯ２００７／０４９７１６号公報に記載のｐＣＵＰ２等が挙げられる。ｐＣＵＰ２にはＣ．ｎｅｃａｔｏｒと近縁であるカプリアビダス・メタリデュランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８由来のプラスミドの複製や安定維持に必要な領域が含まれている。一方、ベクターは、宿主微生物内における安定的な複製及び維持のために、薬剤耐性遺伝子を含んでいてもよい。
宿主微生物に遺伝子を導入して形質転換体を作製する方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。例えば、エレクトロポレーション法や、カルシウム法、接合伝達法などを用いることができる。
ＰＨＡは、微生物を前培養培地で増殖させた後、ＰＨＡ生産培地で培養することにより、微生物内に蓄積させることができる。前培養培地は、微生物を増殖可能な培地であれば特に限定されない。
ＰＨＡ生産培地は、植物由来の炭素源を含み、その他に、窒素源、無機塩類等を含んでいてもよい。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。培地には、遺伝子発現プラスミドが含む薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加してもよい。
培養温度は、微生物が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１日から１０日間程度でよい。
微生物からのＰＨＡの回収は、例えば、次の方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する方法が挙げられる。
微生物菌体の生産量は吸光度法や乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定でき、また、微生物が産生する物質の生産量はＧＣ法、ＨＰＬＣ法などの公知の方法で測定できる。細胞中に蓄積されたＰＨＡの含量は、加藤らの方法（Ａｐｐｌ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４５巻、３６３頁、（１９９６）；Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６９巻、５１５頁（１９９６））に従い、培養細胞からクロロホルムなどの有機溶媒を用いて抽出し、乾燥することで測定できる。
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
（実施例１）
（１）ＰＫＦＡＤの白土処理による改質
炭素源ＰＫＦＡＤはＭＡＬＡＹＳＩＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＳＤＮ ＢＤＨより入手した。ＰＫＦＡＤを１ｋｇ計量し、９０℃にて１０分間、エバポレーター（ＥＹＥＬＡ製、Ｎ−１２００型）にて高温減圧処理を行った。その後、ＰＫＦＡＤに対して１０ｗｔ％の活性白土（水澤化学工業社製）を添加し、再度９０℃、３０分間、同様のエバポレーターにて高温減圧処理を行うことで、ＰＫＦＡＤ中のブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸等の脂肪酸成分を白土に吸着させた。その後、ろ過によって白土を分離除去することで改質した植物油脂（以下、改質ＰＫＦＡＤ）を作製した。
（１）ＰＫＦＡＤの白土処理による改質
炭素源ＰＫＦＡＤはＭＡＬＡＹＳＩＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＳＤＮ ＢＤＨより入手した。ＰＫＦＡＤを１ｋｇ計量し、９０℃にて１０分間、エバポレーター（ＥＹＥＬＡ製、Ｎ−１２００型）にて高温減圧処理を行った。その後、ＰＫＦＡＤに対して１０ｗｔ％の活性白土（水澤化学工業社製）を添加し、再度９０℃、３０分間、同様のエバポレーターにて高温減圧処理を行うことで、ＰＫＦＡＤ中のブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸等の脂肪酸成分を白土に吸着させた。その後、ろ過によって白土を分離除去することで改質した植物油脂（以下、改質ＰＫＦＡＤ）を作製した。
（２）ＰＫＦＡＤ、及び改質ＰＫＦＡＤ中の脂肪酸分析
ＰＫＦＡＤ、改質ＰＫＦＡＤ、トリオレイン（和光純薬工業社製：参考例１にて標準炭素源として利用）中の脂肪酸を定量分析した。脂肪酸量は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を用いた有効炭素数法によって解析した。
ＰＫＦＡＤ、改質ＰＫＦＡＤ、トリオレイン（和光純薬工業社製：参考例１にて標準炭素源として利用）中の脂肪酸を定量分析した。脂肪酸量は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を用いた有効炭素数法によって解析した。
（２−１）サンプル調製
ＰＫＦＡＤおよび改質ＰＫＦＡＤをφ０．４５μｍ ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過した。それぞれ５００μＬを１．５ｍＬバイアル管中でヘキサン５００μＬ（内標準）と混合し、８ｍｍ ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。
ＰＫＦＡＤおよび改質ＰＫＦＡＤをφ０．４５μｍ ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過した。それぞれ５００μＬを１．５ｍＬバイアル管中でヘキサン５００μＬ（内標準）と混合し、８ｍｍ ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。
（２−２）測定条件
ＧＣ測定は、以下の条件下で行った。
・装置
ＧＣ装置：ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所社製）
キャピラリーカラム：
１００％ メチルポリシロキサン無極性カラム１０１０−１１１４３
（架橋タイプ、内径０．２５ｍｍ×３０ｍｍ、膜厚０．４μｍ）（ジーエルサイエンス社製）
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
オートインジェクタ：ＡＯＣ−２０ｉオートインジェクタ２２１−４４５２７−３０（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＯＣ−２０ｓオートサンプラ２２１−４４８８０−３０（島津製作所社製）
解析装置：クロマトパックＣ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ（島津製作所社製）
ＧＣ測定は、以下の条件下で行った。
・装置
ＧＣ装置：ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所社製）
キャピラリーカラム：
１００％ メチルポリシロキサン無極性カラム１０１０−１１１４３
（架橋タイプ、内径０．２５ｍｍ×３０ｍｍ、膜厚０．４μｍ）（ジーエルサイエンス社製）
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
オートインジェクタ：ＡＯＣ−２０ｉオートインジェクタ２２１−４４５２７−３０（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＯＣ−２０ｓオートサンプラ２２１−４４８８０−３０（島津製作所社製）
解析装置：クロマトパックＣ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ（島津製作所社製）
ガス圧力を、表１に示す。
温度設定を、表２に示す。
（２−３）ＧＣ測定データの解析
ＦＩＤを用いた有効炭素数法とは、炭化水素では相対モル感度が炭素原子数に比例し、また炭化水素の水素原子が他の原子や官能基と置換した誘導体では、これらが結合する炭素原子に一定の補正値を増減して算出されるいわゆる有効炭素原子数の総和に比例すると考え、その物質のモル濃度を算出する方法である。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｇａｌｌａｗａｙ，Ｗ．Ｅ．，ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．Ｌ．：Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２０７（１９６２））によれば、各型の炭素１原子あたりの有効炭素原子数および結合各原子による補正値は表３に示す。
ＦＩＤを用いた有効炭素数法とは、炭化水素では相対モル感度が炭素原子数に比例し、また炭化水素の水素原子が他の原子や官能基と置換した誘導体では、これらが結合する炭素原子に一定の補正値を増減して算出されるいわゆる有効炭素原子数の総和に比例すると考え、その物質のモル濃度を算出する方法である。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｇａｌｌａｗａｙ，Ｗ．Ｅ．，ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．Ｌ．：Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２０７（１９６２））によれば、各型の炭素１原子あたりの有効炭素原子数および結合各原子による補正値は表３に示す。
有効炭素原子数および補正値
例えばヘキサン酸のモル濃度を算出しようとした場合、ヘキサン酸の有効炭素原子数は、（飽和脂肪族）＋（カルボニル）−（第一アルコール）であり、１．０×５ ＋０．０−０．６＝４．４となる。
解析結果を表４に示す。
（参考例１）ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸添加培養
実施例１の結果、改質ＰＫＦＡＤでは、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸の濃度が低下していることが明らかとなった。そこで、上記脂肪酸の添加によるＰＨＡの分子量低下効果について検討を行った。
実施例１の結果、改質ＰＫＦＡＤでは、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸の濃度が低下していることが明らかとなった。そこで、上記脂肪酸の添加によるＰＨＡの分子量低下効果について検討を行った。
（１）菌株
使用した菌株を以下に示す。
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎ， Ｒ．，Ｐｒｉｅｆｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．：Ａｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：７８４−７９１（１９８３）：参照）
・ｄ１（特開２００７−２５９７０８号公報参照）
使用した菌株を以下に示す。
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎ， Ｒ．，Ｐｒｉｅｆｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．：Ａｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：７８４−７９１（１９８３）：参照）
・ｄ１（特開２００７−２５９７０８号公報参照）
（２）プラスミド
使用したプラスミドを以下に示す。
・ｐＢＢＲＥＥ ３２ｄ１３ｄＰＢ ＮＳＤＧ
（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，Ｉｃｈｉｎｏｍｉｙａ，Ｙ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｄ．，Ｓａｉｋａ．Ａ．，Ａｂｅ，Ｈ．，Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．：Ｄｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＨＰＬＣ−ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．１１３：２８６−２９２（２０１１）：参照）
使用したプラスミドを以下に示す。
・ｐＢＢＲＥＥ ３２ｄ１３ｄＰＢ ＮＳＤＧ
（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，Ｉｃｈｉｎｏｍｉｙａ，Ｙ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｄ．，Ｓａｉｋａ．Ａ．，Ａｂｅ，Ｈ．，Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．：Ｄｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＨＰＬＣ−ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．１１３：２８６−２９２（２０１１）：参照）
（３）培地
すべての培地は１２１℃、２気圧、２０分のオートクレーブ処理により滅菌した。また、培地組成中のオートクレーブ後に加える試薬については、０．２０μｍフィルターによりフィルター滅菌を行った。寒天プレート培地を作成する場合には、１．５％（ｗ／ｖ）の割合で寒天を添加した。抗生物質を添加する場合においては、オートクレーブ後の培地に、カナマイシンを終濃度５０μｇ／ｍＬになるよう添加した。
すべての培地は１２１℃、２気圧、２０分のオートクレーブ処理により滅菌した。また、培地組成中のオートクレーブ後に加える試薬については、０．２０μｍフィルターによりフィルター滅菌を行った。寒天プレート培地を作成する場合には、１．５％（ｗ／ｖ）の割合で寒天を添加した。抗生物質を添加する場合においては、オートクレーブ後の培地に、カナマイシンを終濃度５０μｇ／ｍＬになるよう添加した。
（３−１）Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地
遺伝子の接合伝達に使用したＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株はＬＢ培地で培養した。ＬＢ培地の組成を表５に示す。オートクレーブ後に抗生物質を添加した。
遺伝子の接合伝達に使用したＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株はＬＢ培地で培養した。ＬＢ培地の組成を表５に示す。オートクレーブ後に抗生物質を添加した。
（３−２）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ−Ｒｉｃｈ（ＮＲ）培地
接合伝達および前培養に使用したｄ１株はＮＲ培地で培養した。ＮＲ培地の組成を表６に示す。オートクレーブ後に抗生物質を添加した。
接合伝達および前培養に使用したｄ１株はＮＲ培地で培養した。ＮＲ培地の組成を表６に示す。オートクレーブ後に抗生物質を添加した。
（３−３）シモンズクエン酸培地
接合伝達におけるｄ１株のスクリーニングにはシモンズクエン酸培地を使用した。シモンズクエン酸培地の組成を表７に示す。オートクレーブ後に抗生物質を添加した。
接合伝達におけるｄ１株のスクリーニングにはシモンズクエン酸培地を使用した。シモンズクエン酸培地の組成を表７に示す。オートクレーブ後に抗生物質を添加した。
（３−４）Ｍｉｎｅｒａｌ ｓａｌｔ（ＭＳ）培地
ＰＨＡ生合成におけるｄ１株はＭＳ培地で培養した。ＭＳ培地の組成を表８〜９に示す。トリオレインを炭素源として培養する場合には、トリオレインを２０ｇ／Ｌ添加してからオートクレーブした。また、微量金属成分、硫酸マグネシウム、連鎖移動剤は、それぞれオートクレーブ後に添加した。なお、脂肪酸は培地全体中の終濃度が１ｍＭ、トリオレイン中の濃度が５０ｍＭとなるよう添加した。
ＰＨＡ生合成におけるｄ１株はＭＳ培地で培養した。ＭＳ培地の組成を表８〜９に示す。トリオレインを炭素源として培養する場合には、トリオレインを２０ｇ／Ｌ添加してからオートクレーブした。また、微量金属成分、硫酸マグネシウム、連鎖移動剤は、それぞれオートクレーブ後に添加した。なお、脂肪酸は培地全体中の終濃度が１ｍＭ、トリオレイン中の濃度が５０ｍＭとなるよう添加した。
（３−５）ＳＯＣ培地
塩化カルシウム法での形質転換にＳＯＣ培地を使用した。ＳＯＣ培地の組成を表１０に示す。
塩化カルシウム法での形質転換にＳＯＣ培地を使用した。ＳＯＣ培地の組成を表１０に示す。
（４）形質転換
（４−１）塩化カルシウム法
目的遺伝子のサブクローニングに塩化カルシウム法を用いた。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株のコンピテントセルを氷上で溶かし、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＢＲＥＥ３２ｄ１３ｄＰＢ ＮＳＤＧ）溶液２μＬを静かに添加した。
（ｉｉ）氷上で３０〜６０分冷却した後、４２℃の恒温槽中で３０〜９０秒ヒートショックした。
（ｉｉｉ）ヒートショック後、速やかに氷上に移して２〜３分間冷却した。
（ｉｖ）ＳＯＣ培地９００μＬを加え、３７℃で３０〜６０分間振とう培養した。
（ｖ）カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
（４−１）塩化カルシウム法
目的遺伝子のサブクローニングに塩化カルシウム法を用いた。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株のコンピテントセルを氷上で溶かし、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＢＲＥＥ３２ｄ１３ｄＰＢ ＮＳＤＧ）溶液２μＬを静かに添加した。
（ｉｉ）氷上で３０〜６０分冷却した後、４２℃の恒温槽中で３０〜９０秒ヒートショックした。
（ｉｉｉ）ヒートショック後、速やかに氷上に移して２〜３分間冷却した。
（ｉｖ）ＳＯＣ培地９００μＬを加え、３７℃で３０〜６０分間振とう培養した。
（ｖ）カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
（４−２）接合伝達法
ｄ１に遺伝子を導入する目的で接合伝達を行った。
（ｉ）形質転換によって目的のプラスミドを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株をカナマイシンを含むＬＢ培地１．７ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間培養した。
（ｉｉ）導入する宿主（ｄ１株）もＮＲ培地１．７ｍＬに植菌し、３０℃で１６時間培養した。
（ｉｉｉ）培養後、それぞれの培養液全量をオートクレーブ済みエッペンチューブに移し、１０，０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心した。
（ｉｖ）カナマイシンを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株には、更にＬＢ培地５００μＬを加えて遠心することにより、抗生物質を完全に除去した。
（ｖ）上清を５０μＬほど残るように捨てて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株とＲ． ｅｕｔｒｏｐｈａ ｄ１株を混合し、ＬＢ寒天培地に滴下し、乾燥後、３０℃で５時間培養した。
（ｖｉ）培養後、カナマイシンを含むシモンズクエン酸寒天培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。
（ｖｉｉ）得られた単一コロニーを再度カナマイシンを含むシモンズクエン酸培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。
（ｖｉｉｉ）形成された単一コロニーをカナマイシンを含むＮＲ寒天培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。
（ｉｘ）形成された単一コロニーをカナマイシンを含むＮＲ培地１．７ｍＬに植菌し、３０℃で１６時間培養後、培養液１００μＬとオートクレーブ済みの３０％グリセロール溶液１００μＬを混合し、−８０℃で保存した。
ｄ１に遺伝子を導入する目的で接合伝達を行った。
（ｉ）形質転換によって目的のプラスミドを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株をカナマイシンを含むＬＢ培地１．７ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間培養した。
（ｉｉ）導入する宿主（ｄ１株）もＮＲ培地１．７ｍＬに植菌し、３０℃で１６時間培養した。
（ｉｉｉ）培養後、それぞれの培養液全量をオートクレーブ済みエッペンチューブに移し、１０，０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心した。
（ｉｖ）カナマイシンを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株には、更にＬＢ培地５００μＬを加えて遠心することにより、抗生物質を完全に除去した。
（ｖ）上清を５０μＬほど残るように捨てて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１株とＲ． ｅｕｔｒｏｐｈａ ｄ１株を混合し、ＬＢ寒天培地に滴下し、乾燥後、３０℃で５時間培養した。
（ｖｉ）培養後、カナマイシンを含むシモンズクエン酸寒天培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。
（ｖｉｉ）得られた単一コロニーを再度カナマイシンを含むシモンズクエン酸培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。
（ｖｉｉｉ）形成された単一コロニーをカナマイシンを含むＮＲ寒天培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。
（ｉｘ）形成された単一コロニーをカナマイシンを含むＮＲ培地１．７ｍＬに植菌し、３０℃で１６時間培養後、培養液１００μＬとオートクレーブ済みの３０％グリセロール溶液１００μＬを混合し、−８０℃で保存した。
（５）振とう培養および集菌
（５−１）培養方法
ｄ１／ｐＢＢＲＥＥ３２ｄ１３ｄＰＢ ＮＳＤＧの培養はＮＲ培地およびＭＳ培地を用いた。上記で作成したグリセロールストック溶液をカナマイシンを含むＮＲ寒天培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。形成された単一コロニーをカナマイシンを含むＮＲ液体培地１．７ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｍｉｎ−１で１６時間振とう培養した（前培養）。５００ｍＬ振とうフラスコに、単一炭素源としてトリオレイン（２０ｇ／Ｌ）を含む５０ｍＬのＭＳ液体培地を入れ、前培養液５００μＬを植菌し、３０℃、１３０ｍｉｎ−１で７２時間振とう培養した（本培養）。なお、抗生物質としてカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えた。
（５−１）培養方法
ｄ１／ｐＢＢＲＥＥ３２ｄ１３ｄＰＢ ＮＳＤＧの培養はＮＲ培地およびＭＳ培地を用いた。上記で作成したグリセロールストック溶液をカナマイシンを含むＮＲ寒天培地にストリークし、３０℃で２日間培養した。形成された単一コロニーをカナマイシンを含むＮＲ液体培地１．７ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｍｉｎ−１で１６時間振とう培養した（前培養）。５００ｍＬ振とうフラスコに、単一炭素源としてトリオレイン（２０ｇ／Ｌ）を含む５０ｍＬのＭＳ液体培地を入れ、前培養液５００μＬを植菌し、３０℃、１３０ｍｉｎ−１で７２時間振とう培養した（本培養）。なお、抗生物質としてカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えた。
（５−２）集菌方法
本培養液を２５０ｍＬ遠沈管に移し、振とうフラスコ内を適量のヘキサンで１回、純水で３回すすぎ、この洗液も遠沈管に加えて激しく撹拌した後、４℃、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。菌体ペレットを適量の純水で懸濁、激しく撹拌した後、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。ペレットを適量の純水（５ｍＬ未満）で懸濁し、懸濁液を風袋を秤量済みの５ｍＬ集菌チューブに移し、パラフィルムでチューブの口を塞いで−２０℃で凍結した。チューブの口を塞いだパラフィルムに数か所の風穴を開け、真空乾燥機で水分を完全に除去した（おおよそ３日間）。パラフィルムを除き、チューブを秤量することで乾燥菌体重量を得た。
本培養液を２５０ｍＬ遠沈管に移し、振とうフラスコ内を適量のヘキサンで１回、純水で３回すすぎ、この洗液も遠沈管に加えて激しく撹拌した後、４℃、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。菌体ペレットを適量の純水で懸濁、激しく撹拌した後、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を除いた。ペレットを適量の純水（５ｍＬ未満）で懸濁し、懸濁液を風袋を秤量済みの５ｍＬ集菌チューブに移し、パラフィルムでチューブの口を塞いで−２０℃で凍結した。チューブの口を塞いだパラフィルムに数か所の風穴を開け、真空乾燥機で水分を完全に除去した（おおよそ３日間）。パラフィルムを除き、チューブを秤量することで乾燥菌体重量を得た。
（６）ポリマー分析
（６−１）ＰＨＡの含有率とモノマー組成比の分析
培養した菌体が合成したＰＨＡの含有率とモノマー組成比は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて内部標準法（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｇａｌｌａｗａｙ，Ｗ．Ｅ．，ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．Ｌ．：Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２０７（１９６２）参照）により求めた。この方法では、メタノリシス反応により生じた乾燥菌体内ＰＨＡ分解物であるメチルエステルを測定する。
（６−１）ＰＨＡの含有率とモノマー組成比の分析
培養した菌体が合成したＰＨＡの含有率とモノマー組成比は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて内部標準法（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｇａｌｌａｗａｙ，Ｗ．Ｅ．，ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．Ｌ．：Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２０７（１９６２）参照）により求めた。この方法では、メタノリシス反応により生じた乾燥菌体内ＰＨＡ分解物であるメチルエステルを測定する。
メタノリシス反応によるＰＨＡの分解
（６−２）ＧＣ測定サンプル調製
乾燥菌体をネジ蓋付き試験管に約１０ｍｇ採り、１５％硫酸−メタノール溶液２ｍＬとクロロホルム２ｍＬを加え、途中で数回激しく撹拌しながら１００℃で１４０ｍｉｎ加熱した。室温まで放冷した後、超純水１ｍＬを加えて激しく混合し、一晩放置した。二層分離したサンプル溶液の下層（クロロホルム層）をパスツールピペットで採り、φ０．４５μｍ ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）でろ過した。１．５ｍＬバイアル管にこのろ液と０．１ｖｏｌ％ オクタン酸メチル−クロロホルム溶液を５００μＬずつ加え、８ｍｍポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。
乾燥菌体をネジ蓋付き試験管に約１０ｍｇ採り、１５％硫酸−メタノール溶液２ｍＬとクロロホルム２ｍＬを加え、途中で数回激しく撹拌しながら１００℃で１４０ｍｉｎ加熱した。室温まで放冷した後、超純水１ｍＬを加えて激しく混合し、一晩放置した。二層分離したサンプル溶液の下層（クロロホルム層）をパスツールピペットで採り、φ０．４５μｍ ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）でろ過した。１．５ｍＬバイアル管にこのろ液と０．１ｖｏｌ％ オクタン酸メチル−クロロホルム溶液を５００μＬずつ加え、８ｍｍポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。
（６−３）ＧＣ測定
ＧＣ測定は、以下の条件で行った。
ＧＣ測定は、以下の条件で行った。
・装置
ＧＣ装置：ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所社製）
キャピラリーカラム：
１００％メチルポリシロキサン無極性カラム１０１０−１１１４３
（架橋タイプ、内径０．２５ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．４μｍ）（ジーエルサイエンス社製）
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
オートインジェクタ：ＡＯＣ−２０ｉオートインジェクタ２２１−４４５２７−３０（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＯＣ−２０ｓオートサンプラ２２１−４４８８０−３０（島津製作所社製）
解析装置：クロマトパックＣ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ（島津製作所社製）
ＧＣ装置：ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所社製）
キャピラリーカラム：
１００％メチルポリシロキサン無極性カラム１０１０−１１１４３
（架橋タイプ、内径０．２５ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．４μｍ）（ジーエルサイエンス社製）
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
オートインジェクタ：ＡＯＣ−２０ｉオートインジェクタ２２１−４４５２７−３０（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＯＣ−２０ｓオートサンプラ２２１−４４８８０−３０（島津製作所社製）
解析装置：クロマトパックＣ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ（島津製作所社製）
ガス圧力を、表１１に示す。
設定温度を、表１２に示す。
（６−４）ＧＣ測定データの解析
ＦＩＤにより検出した各保持時間のピークの積分値から、ＰＨＡ菌体内含有率およびモノマー組成比を決定した。ＧＣ測定結果の解析は以下の手順で行った。
ＦＩＤにより検出した各保持時間のピークの積分値から、ＰＨＡ菌体内含有率およびモノマー組成比を決定した。ＧＣ測定結果の解析は以下の手順で行った。
ＧＣ測定の結果、各モノマーに対応するメチルエステルａ、ｂ、ｃが検出されたとき、その積分値をＡ、Ｂ、Ｃとし、対応する補正係数（相対感度の逆数）をＸ、Ｙ、Ｚとすると、ａのモル分率は次式から求められる。
なお、３ＨＢの値で規格化された各補正係数を表１３に示す。
内部標準物質であるオクタン酸メチルのピークの積分値をＳ、サンプルに用いた乾燥菌体の重量をｍ（ｍｇ）とすると、ＰＨＡ菌体内含有率Ｐ（ｗｔ％）は以下の式より算出できる。
ここでＫはＰ（３ＨＢ）を用いて作成した検量線から決定した定数であり、次式よりＫ値を６．２とした。
（７）ＧＰＣ測定
（７−１）ポリマー抽出
乾燥菌体を５０ｍＬネジ口サンプル管に移し、クロロホルム５０ｍＬを加えて、室温で３日間撹拌した。その後、溶液をろ過（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 Ｎｏ．１ ろ紙）し、菌体を除去した。次に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、粗雑なＰＨＡを得た。
（７−１）ポリマー抽出
乾燥菌体を５０ｍＬネジ口サンプル管に移し、クロロホルム５０ｍＬを加えて、室温で３日間撹拌した。その後、溶液をろ過（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 Ｎｏ．１ ろ紙）し、菌体を除去した。次に、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、粗雑なＰＨＡを得た。
（７−２）ポリマー精製
粗雑なＰＨＡを適量のクロロホルムに完全に溶解し、約１０倍量のメタノールに滴下した。静置後、析出物をろ別（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 Ｎｏ．５Ｂ ろ紙）した。その後、真空乾燥機で溶媒を完全に除去し、精製ＰＨＡを得た。
粗雑なＰＨＡを適量のクロロホルムに完全に溶解し、約１０倍量のメタノールに滴下した。静置後、析出物をろ別（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 Ｎｏ．５Ｂ ろ紙）した。その後、真空乾燥機で溶媒を完全に除去し、精製ＰＨＡを得た。
（７−３）ＧＰＣサンプル調製法
ＰＨＡ 約１ｍｇを５ｍＬバイアル管に入れ、クロロホルム１ｍＬを加えて一晩放置し、ＰＨＡを溶解させた。このＰＨＡ溶液をφ０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、ろ液の全量を１．５ｍＬバイアル管に入れ、８ｍｍ ＰＴＦＥ／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。
ＰＨＡ 約１ｍｇを５ｍＬバイアル管に入れ、クロロホルム１ｍＬを加えて一晩放置し、ＰＨＡを溶解させた。このＰＨＡ溶液をφ０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、ろ液の全量を１．５ｍＬバイアル管に入れ、８ｍｍ ＰＴＦＥ／シリコンセプタムを挟んで蓋をした。
（７−４）ＧＰＣ測定条件
・装置
システムコントローラー：ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ（島津製作所社製）
オートインジェクター：ＳＩＬ−１０Ａ ＶＰ（島津製作所社製）
送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＤ ＶＰ（島津製作所社製）
カラムオーブン：ＣＴＯ−１０Ａ（島津製作所社製）
分離カラム：Ｋ−８０６Ｍ、Ｋ−８０２（Ｓｈｏｄｅｘ社製）
検出器：ＲＩＤ−１０Ａ（島津製作所社製）
・装置
システムコントローラー：ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ（島津製作所社製）
オートインジェクター：ＳＩＬ−１０Ａ ＶＰ（島津製作所社製）
送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＤ ＶＰ（島津製作所社製）
カラムオーブン：ＣＴＯ−１０Ａ（島津製作所社製）
分離カラム：Ｋ−８０６Ｍ、Ｋ−８０２（Ｓｈｏｄｅｘ社製）
検出器：ＲＩＤ−１０Ａ（島津製作所社製）
・測定条件
測定条件を表１４に示す。
測定条件を表１４に示す。
（７−５）ＧＰＣ測定データの解析
測定サンプルの分子量および分子量分布の解析には、解析ソフトＧＰＣ ｆｏｒ ＣＬＡＳＳ ＶＰ（島津製作所社製）を用い、標準物質であるスタンダードポリスチレンとの相対値として重量平均分子量（Ｍｗ）を算出した。
測定サンプルの分子量および分子量分布の解析には、解析ソフトＧＰＣ ｆｏｒ ＣＬＡＳＳ ＶＰ（島津製作所社製）を用い、標準物質であるスタンダードポリスチレンとの相対値として重量平均分子量（Ｍｗ）を算出した。
結果を表１５に示す。ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸を添加することで微生物により生産されるＰＨＡの分子量（Ｍｗ）が低下することが明らかとなった。
ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸添加によるＰＨＡ分子量への影響評価結果
（実施例２）改質ＰＫＦＡＤを用いたＰＨＡの生産
実施例１にて作製した改質ＰＫＦＡＤを用い、高密度培養によるＰＨＡの生産を行った。生産にはＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ＋ｐＣＵＰ２−６３１株（国際公開公報ＷＯ２００９／１４５１６４号公報参照）を用いた。
実施例１にて作製した改質ＰＫＦＡＤを用い、高密度培養によるＰＨＡの生産を行った。生産にはＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ＋ｐＣＵＰ２−６３１株（国際公開公報ＷＯ２００９／１４５１６４号公報参照）を用いた。
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％ パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
まず、Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ＋ｐＣＵＰ２−６３１株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２４時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
次に、前培養液を２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製ＭＤＳ−Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源として改質ＰＫＦＡＤを断続的に添加した。培養は６０時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。
また、参考例１と同様の方法にて、得られたＰＨＡの分子量、及びモノマー組成比を測定した。結果を表１６に示す。
（比較例１）未改質ＰＫＦＡＤを用いたＰＨＡの生産
未改質のＰＫＦＡＤを使用した以外は実施例２と同じ方法で、ＰＨＡを製造し、分析した。結果を表１６に示す。
未改質のＰＫＦＡＤを使用した以外は実施例２と同じ方法で、ＰＨＡを製造し、分析した。結果を表１６に示す。
改質ＰＫＦＡＤ、及び未改質ＰＫＦＡＤを用いた高密度培養結果
ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量が少ない改質ＰＫＦＡＤを使用することで、微生物により生産されるＰＨＡの分子量（Ｍｗ）を向上できることが明らかとなった。
（測定例１）ＰＦＡＤ、又はＰＫＦＡＤ中の遊離脂肪酸含有量測定
ＰＦＡＤ、及びＰＫＦＡＤ、並びに、食用パーム油であるＰＫＯ（Ｐａｌｍ ｋｅｒｎｅｌ ｏｉｌ）、及びＰＯＯ（Ｐａｌｍ Ｏｌｅｉｎ Ｏｉｌ）の遊離脂肪酸含有量を、基準油脂分析試験法「２．４．６．１−１９９６ トリアシルグリセリン組成（ガスクロマトグラフ法）」に準じて測定した。結果を表１７に示す。
ＰＦＡＤ、及びＰＫＦＡＤ、並びに、食用パーム油であるＰＫＯ（Ｐａｌｍ ｋｅｒｎｅｌ ｏｉｌ）、及びＰＯＯ（Ｐａｌｍ Ｏｌｅｉｎ Ｏｉｌ）の遊離脂肪酸含有量を、基準油脂分析試験法「２．４．６．１−１９９６ トリアシルグリセリン組成（ガスクロマトグラフ法）」に準じて測定した。結果を表１７に示す。
ＰＫＦＡＤ、ＰＦＡＤ及び食用油脂（ＰＫＯ、ＰＯＯ）の遊離脂肪酸含有量
油脂精製工程にて産生されるＰＦＡＤやＰＫＦＡＤは、遊離脂肪酸含量が高い。本発明の方法によれば、非可食成分である、遊離脂肪酸含量が高い植物由来の炭素源を用いて、高分子量のＰＨＡを効率的に製造することが可能である。
Claims (10)
- ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭ以下であり、遊離脂肪酸含有量が２０重量％以上である植物由来の炭素源を用いて、微生物を培養することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
- さらに、ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭを超え、遊離脂肪酸含有量が２０重量％以上である植物由来の炭素源から、ブタン酸、ペンタン酸、及びヘキサン酸の含有量の合計が５０ｍＭ以下である植物由来の炭素源を調製する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
- 植物由来の炭素源中のブタン酸の含有量が６ｍＭ以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 植物由来の炭素源中のヘキサン酸の含有量が３５ｍＭ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
- 植物由来の炭素源が、活性白土により処理されたものである、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
- 植物由来の炭素源がパーム核油である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
- 微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
- Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、又はその遺伝子組み換え体である、請求項７に記載の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートヘキサノエートである、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
- 植物由来の炭素源を活性白土と接触させることを特徴とする、微生物培養のための炭素源の製造方法。
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