JP2016059292A - ハロモナス菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は簡便な方法にて３−ヒドロキシ酪酸を回収する手段を導き出す事を目的とする。
【解決手段】下記の工程（１）〜（３）を含む、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
（２）培養液のｐＨ７．０以上に調整及び維持し、培養液中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程２、及び
（３）工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
【選択図】なし

Description

本発明は、ハロモナス菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸の製造方法に関する。

近年、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が課題となっている。

３−ヒドロキシ酪酸（以下、本明細書において３−ＨＢと呼ぶことがある。）は、人間では肝臓でアセチルＣｏＡから作られ、血中グルコース濃度が少ない時に脳のエネルギー源として使われること、また、腸内細菌の血中への転移を抑制することから、輸液、目薬等として、また、生分解性プラスチックの原料としての利用が検討されている（特許文献１、２）。

３−ヒドロキシ酪酸の製造方法として、斯かる化合物がポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下、本明細書においてＰＨＢと呼ぶことがある。）のモノマーであることから、例えばＰＨＢを各種菌体で製造した後、別途調整したリパーゼ等でＰＨＢを分解し、そのモノマーである３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（特許文献３）、突然変異体を用い、８．７ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献１）、遺伝子組換え手法を用い１２ｇ／Ｌの収量にて３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献２）等が知られている。

本発明者らは、微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討する中で、ある条件下では、特定の好塩菌が唯一の混入する菌として生育することを認めた。当該好塩菌そのものは、通常はｐＨ５〜１２程度の条件下の、高濃度のナトリウムを含む培地中でも良好に生育するため、好気発酵下であっても他のバクテリア等の混入が極めて起こりにくいことが推定された。そこで、当該好塩菌の各種の炭素源の資化性を検討していたところ、当該好塩菌の菌体内に著量のＰＨＢを蓄積していること明らかにした（特許文献４）。

その後、検討を進める中で、ハロモナス属に属する好塩菌が、好気条件でＰＨＢを蓄積し、微好気条件に移行するとことでＰＨＢのモノマーである３−ヒドロキシ酪酸を培養液中に分泌産生することを見いだした。（特許文献５）
３−ヒドロキシ酪酸は、母乳に著量含まれていることが知られており、低グルコース濃度となった場合に脂肪酸などから誘導されることが知られている。そして、３−ヒドロキシ酪酸の代謝速度は比較的早いことが知られており、３−ヒドロキシ酪酸のメチルエステルは、健康食品等、中でもアスリートに適したサプリメントとして有用であると期待されている。

このように、３−ヒドロキシ酪酸は、そのままでも又は上述のようなエステル体として、他にもこれを構成ユニットとするポリマーとしても非常に有用な化学品原料である。

特開平７−６１９２４号公報 特開２００５−３０６８１５号広報 特開２０１０−１６８５９５号公報 国際公開第２００９／０４１５３１号パンフレット 特開２０１３−０８１４０３

Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０２，Ｉｓｓｕｅ １２，Ｊｕｎｅ ２０１１，Ｐａｇｅｓ ６７６６−６７６８ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｕ．Ｕｇｗｕ，Ｙｕｔａｋａ Ｔｏｋｉｗａ ａｎｄ Ｔｏｓｈｉｏ Ｉｃｈｉｂａ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７）７６：８１１-８１８ Ｑｉａｎ Ｌｉｕ，Ｓｈａｏ−Ｐｉｎｇ Ｏｕｙａｎｇ，Ａｈｌｅｕｍ Ｃｈｕｎｇ，Ｑｉｏｎｇ Ｗｕ ａｎｄ Ｇｕｏ−Ｑｉａｎｇ Ｃｈｅｎ Ｍｏｎｔｅｉｌ−Ｒｉｖｅｒａ Ｆら．２００７ Ｊｕｎ ２２；１１５４（１−２）：３４−４１ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ

培養条件を好気条件から微好気条件に変更することを特徴とする発明が開示される特許文献５では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法が開示され、１５％グルコースを含む培地を使用した際に２０ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸を培養液中に分泌産生させた実施例が示されている。

一方で、より簡便な生産手法を考えた場合、培養条件を、好気条件から微好気条件に変更することは煩雑であり、より容易な培養手法の開発が期待された。

本発明者は、上述のような背景のもとで鋭意研究を進めた結果、ハロモナス属に属する好塩菌体内にＰＨＢを著量蓄積後、その生産が停滞している状況において培養液のｐＨを特定の範囲に調整することにより、菌体内に蓄積されるＰＨＢの量を増加させると共に、３−ヒドロキシ酪酸を培養液中に分泌させ得ることを見いだした。

本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。
〔項１〕下記の工程（１）〜（３）を含む、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
（２）培養液のｐＨ７．０以上に調整及び維持し、培養液中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程２、及び
（３）工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
〔項２〕工程１の後であって、工程２の前に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも一つを添加する工程を含む、上記項１に記載の製造方法。
〔項３〕窒素源が、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、及びアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つである、上記項２に記載の製造方法。
〔項４〕工程２におけるｐＨの調整及び維持を行う時期が、培養液の乾燥菌体重量が１５ｇ／L以上となる時期である、上記項１〜項３の何れか１項に記載の製造方法。
〔項５〕工程２において調整及び維持する培養液のｐＨが、７．５以上である上記項１〜項４の何れか１項に記載の製造方法。
〔項６〕工程２における培養液のｐＨの調整及び維持を、水酸化物、炭酸塩、及び炭酸水素塩からなる群より選択される少なくとも１種を用いて行う、上記項１〜項５の何れか１項に記載の製造方法。
〔項７〕工程３にて得られる培養液１Ｌ当たり、０．２ｇ以上の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれることを特徴とする上記項１〜項６の何れか１項に記載の方法。
〔項８〕前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）である、上記項１〜項７のいずれか１項に記載の方法。

本発明に係る製造方法は、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を、培地中に産生することができる。

本発明に係る製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を培養する工程が含まれるが、斯かる好塩菌の培養は、他の細菌の混入が起こりにくい環境で培養することが可能であり、非滅菌培地及び／又は非滅菌環境下での培養が可能である優れた製造方法である。

本発明に係る製造方法にて用いる好塩菌は、例えば、安価な無機塩に加え、バイオディーゼル生産に副生する廃グリセロール、エタノール発酵等の過程で生産される木材糖化液、生ごみ等の発酵で得られる有機酸等を有機炭素源として単独で、又は他の有機炭素源と組み合わせて用いることが可能である。さらに、酵母細胞を用いたエタノール発酵において得られ、利用が難しいとされる五炭糖のキシロース、アラビノース等を有機炭素源として有効に利用することも可能である。

本発明に係る製造方法では、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培地中にて生産させることが可能である。よって、培養液中から３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む画分を簡便に回収することが可能であり、精製工程を行ったとしても、簡易な精製方法が適用できるため、優れた製造方法である。

この点に関して、本発明に係る製造方法では、ハロモナス属に属する好塩菌体の溶菌を伴わない条件にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩をその培養液中から回収することができるので、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を精製する際に、溶菌に伴う核酸、タンパク質、糖質、脂質等といった夾雑分子を除去するための精製工程が非常に簡便になるといった効果を有する。

特に、本発明に係る方法によると、３−ヒドロキシ酪酸を回収する際の培養液がアルカリ性になっており、３−ヒドロキシ酪酸が塩を形成しにくい環境であるため、３−ヒドロキシ酪酸の回収に有効である。

本発明に係る製造方法によって得られる３−ヒドロキシ酪酸又はその塩は、医療用の輸液等に添加したり、そのまま重合してプラスチックとするだけでなく、化粧品、医薬品、機能性食品、光学活性を持った素材、化成品原料等として有用である。

本発明に係る製造方法は、培養時の通気環境を調製する必要が無く、簡便である。

実施例の製造例１に示す方法によって得られた、ハロモナス菌の乾燥菌体重量（縦軸：乾燥菌体重量（ｇ）／培養液（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。ＳＯＴ改５培地に２５％グルコースを添加し、３７度、２００ｒｐｍの好気条件にて培養し、４８時間目に、炭酸ナトリウムでｐＨ調整を行った場合、及びコントロールとしてｐＨ調整を行わなかった場合を示した。グラフ中の●（丸）は、窒素源として硝酸ナトリウムを２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行わなかった際の結果を示す。グラフ中の▲（三角）は、窒素源として硝酸ナトリウムを２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行った際の結果を示す。グラフ中の■（四角）は、窒素源として尿素を２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行わなかった際の結果を示す。グラフ中の◆（ダイヤモンド）は、窒素源として尿素を２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行った際の結果を示す。 実施例の製造例１に示す方法によって得られた、ＰＨＢの量（縦軸：ＰＨＢ（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。ＳＯＴ改５培地に２５％グルコースを添加し、３７度、２００ｒｐｍの好気条件にて培養し、３７度、２００ｒｐｍの好気条件にて培養し、４８時間目に、炭酸ナトリウムでｐＨ調整を行った場合、及びコントロールとしてｐＨ調整を行わなかった場合を示した。グラフ中の●（丸）は、窒素源として硝酸ナトリウムを２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行わなかった際の結果を示す。グラフ中の▲（三角）は、窒素源として硝酸ナトリウムを２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行った際の結果を示す。グラフ中の■（四角）は、窒素源として尿素を２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行わなかった際の結果を示す。グラフ中の◆（ダイヤモンド）は、窒素源として尿素を２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行った際の結果を示す。 実施例の製造例１に示す方法によって得られた、培養上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ））を示すグラフ。ＳＯＴ改５培地に２５％グルコースを添加し、３７度、２００ｒｐｍの好気条件にて培養し、３７度、２００ｒｐｍの好気条件にて培養し、４８時間目に、炭酸ナトリウムでｐＨ調整を行った場合、及びコントロールとしてｐＨ調整を行わなかった場合を示した。グラフ中の●（丸）は、窒素源として硝酸ナトリウムを２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行わなかった際の結果を示す。グラフ中の▲（三角）は、窒素源として硝酸ナトリウムを２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行った際の結果を示す。グラフ中の■（四角）は、窒素源として尿素を２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行わなかった際の結果を示す。グラフ中の◆（ダイヤモンド）は、窒素源として尿素を２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目に添加し、ｐＨ調整を行った際の結果を示す。

本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法は、下記の工程（１）〜（３）を含む。

（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
（２）培養液のｐＨ７以上に調整及び維持し、培養液中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程２、及び
（３）工程２で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。

本発明に係る製造方法によって製造される３−ヒドロキシ酪酸又はその塩とは、生体内にて通常の光学活性を持った化合物であり、Ｄ体である。

また、３−ヒドロキシ酪酸の塩とは、製造時に使用するハロモナス属に属する好塩菌の培地中に含まれる成分に由来する陽イオン及び／又は菌体内に存在する陽イオンによって形成される塩であり、特に限定はされないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、アンモニウム塩、リチウム塩、銀塩、水銀塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、カドミウム塩、ニッケル塩、スズ塩、鉛塩、マンガン塩、アルミニウム塩等が挙げられる。

工程１について
本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程１は、ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程である。

＜Ａ：好塩菌＞
本発明の製造方法工程１にて用いる好塩菌は、下記の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかによって示されるハロモナス属に属する好塩菌を用いればよい。
（ｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
（ｉｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、ＰＨＢを自らの菌体内にて蓄積した後、ｐＨを調整することで、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培養液に分泌産生することを特徴とする好塩菌。

「無機塩」及び「有機炭素源」については、＜培地＞の欄にて後述する通りにすることができる。

上述のハロモナス属に属する好塩菌は、０．１〜１．０Ｍの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５〜１２程度の培地にて生育する。

上述のハロモナス属に属する好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ４７７０１５として登録されている。

また、上述したようなハロモナス属に属する好塩菌の生育特性等に鑑みて、本発明に係る製造方法において用いる好塩菌として、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ ７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ ７００５９７）等も挙げることができる。

さらに、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、上述のハロモナス属に属する好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等も、本発明に係る製造方法にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として使用してもよい。

なお、上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明に係る製造方法において、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、ＰＨＢの発現量を増大させる遺伝子、ＰＨＢの該菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子；３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培養液にて生産する機能を増大させる遺伝子；３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生量を増大させる遺伝子；ＰＨＢを分解する遺伝子等が挙げられる。組換えＤＮＡの当該菌体への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。

＜Ｂ：培地＞
工程１にて用いる培地は、無機塩と及び有機炭素源を含有する。培地のｐＨは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５〜１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ８．８〜１２の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができ、また分泌された３−ヒドロキシ酪酸がクロトン酸へ変化するのを抑制するので好ましい。

工程１にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。

例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３等を用いればよい。

これらの無機塩は、上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。

窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アンモニウム塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＮａＮＯ_３、ＮａＮＯ_２、ＮＨ_４Ｃｌ等の化合物を用いればよい。

窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。

リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＫ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４等の化合物を用いればよい。

リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌ当たり通常は５０〜４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。

これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１〜２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。

工程１にて用いる培地に配合する有機炭素源は、特に限定はされないが、例えばトリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、エタノール、ｎ−プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。

本発明に係る製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を培養するので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等がほとんどない。従って、上述の培地に対して滅菌処理等を行っても行わなくともよく、且つ、簡便な設備で培養することも可能である。

＜Ｃ：培養方法＞
工程１における上述のハロモナス属に属する好塩菌の培養は、好気培養を採用する。工程１における好気培養は、当該菌体が増殖し、且つ、該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件となる好気培養である限り、特に限定はされない。

具体的には、５ｍｌ程度の培地に当該好塩菌を植菌し、通常３０〜３７℃程度、攪拌速度は１２０〜１８０ｒｐｍ程度で１晩振盪しながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。

本培養は通常２０〜４５℃程度で可能であるが、３０〜３７℃程度で行うことが好ましい。この際の攪拌速度は通常は１５０〜２５０ｒｐｍ程度とすればよい。なお、培養環境は培地が空気に触れる環境とすればよく、培養液表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や培地中に係る気体を吹き込む方法を採用してもよい。

工程１では、このような培養条件でハロモナス属に属する好塩菌を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以上とすればよく、５ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。

工程１での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を効率よく製造するには、本発明に係る方法によって用いる好塩菌が他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮して長期の連続培養も可能である。そして、培養環境も特に限定はされず、非滅菌環境下であっても滅菌環境下であってもよい。

工程２について
本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程２は、培養液のｐＨ７．０以上に調整及び維持し、培養液中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程である。

培養を継続した場合、有機酸の精製により、培地のｐＨは下がる傾向がある。この様な培養液のｐＨは適宜公知のｐＨ測定用装置又はこれが付随したジャーファーメンター等によって確認することができる。

用語「調整及び維持」とは、上述のようなｐＨの確認を行いながら、ｐＨ調整剤を添加してｐＨ７．０以上の状態を保つことを意味する。

工程４にて調整及び維持するｐＨは好ましくは７．５以上、より好ましくは８．０以上、さらに好ましくは８．５以上である。

ハロモナス属に属する好塩菌は、通常は中程度の高塩濃度且つアルカリ条件下で培養することが可能であるため、夾雑菌の混入・繁殖（コンタミネーション）が少ない。しかしながら、一部乳酸菌には、中程度の高塩濃度且つｐＨ８．４以下の環境下において増殖可能な菌も存在し、このような菌が本発明の培養系にコンタミネーションすると、ハロモナス属に属する好塩菌が分泌した３ーヒドロキシ酪酸又はその塩を乳酸発酵の基質として消費してしまい、更には培養液のｐＨの一段の低下を生じさせる恐れがある。

このため、本発明において培地を滅菌せず及び／又は非滅菌環境下でハロモナス属に属する好塩菌を培養して、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を製造するためには、工程２における培地のｐＨの調整及び維持をｐＨ８．５程度以上とすることが好ましい。

ｐＨ調整剤としては、特に限定はされないが、例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩等が挙げられる。より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素マグネシウム等が挙げられ、中でも弱アルカリ性を示すものが好ましく、炭酸水素ナトリウムが最も好ましい。

工程３において、「培養液中に３−ヒドロキシ酪酸を生産させる」とは、工程１〜２にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から、その培養液中に３−ヒドロキシ酪酸を分泌させることを意味する。

そして、「培養液中に３−ヒドロキシ酪酸の塩を生産する」とは、工程１及び２にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から、その培養液中に３−ヒドロキシ酪酸の塩を分泌させることのみならず、工程１及び２にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から培養液中に分泌された３−ヒドロキシ酪酸が、培養液中に存在する陽イオン成分と反応して、３−ヒドロキシ酪酸の塩を形成することも意味する。

陽イオン成分とは、培地中に含まれているものであれば、特に限定はされないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、モリブデンイオン、アンモニウムイオン、マンガンイオン等が挙げられる。

ｐＨの調製時期は、菌体内でのＰＨＢの蓄積量がほぼ一定となる時期であれば特に限定されないが、例えば、工程１によって得られるハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり１５重量部程度以上となる時期等が挙げられる。

また、工程１によって得られるハロモナス属に属する好塩菌体の乾燥菌体重量が培養液１Ｌ当たり３０重量部程度以上となる時期であってもよい。

具体的なハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量は、下記の実施例に示す方法を採用して測定する。

工程３について
本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程３は、上記工程２で得られた培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程である。ここで、回収とは培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が存在している時に上述の工程２の培養を停止し、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む培養液と、上記好塩菌体を分離すればよい。

具体的な分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記工程２によって得られるハロモナス属に属する好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離手段を用いて培養液と前記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。

培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれたまま培養をし続けて、特に培養条件が好気的になればなるほど、ハロモナス属に属する好塩菌体から
培養液中に分泌された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用される傾向となり、培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が減少し、最終的には培養液からこれらが消失してしまう。

培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、継時的に培養液を採取し、これをキャピラリー電気泳動等の分析方法を供して、培養を停止する時間を決定することもできる。

なお、回収される３−ヒドロキシ酪酸の塩は、培養液中に含まれる無機塩に基づくナトリウム、カルシウム等のアルカリ金属；アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。従って、３−ヒドロキシ酪酸を製造するには、回収した培養液を塩析等の常法に供すればよい。

また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。これら以外の他の方法として、回収した培養液のｐＨを適宜変更して、所望の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。また、回収した培養液に低級アルコール類を添加し、エステル化反応を経て、３−ヒドロキシ酪酸エステルとして蒸留等で精製することも可能である。

本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法には、上記工程１の後であって及び工程２の前に、培養液中に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程を含んでいてもよい。

すなわち、本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法には、以下に示す工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む方法も包含される。
（Ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程Ａ、
（Ｂ）窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程Ｂ、
（Ｃ）培養液のｐＨ７以上に調整及び維持し、培養液中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程Ｃ、及び
（Ｄ）工程Ｃで得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程Ｄ。

工程Ａは上記工程１と、工程Ｃは上記工程２と、そして工程Ｄは上記工程３と同様とすることができる。

工程Ｂは、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程である。

すなわち、上記工程Ｂでは、窒素源のみを添加してもよいし、更に金属塩及び／又はホウ酸塩を添加してもよい。窒素源並びに金属塩及び／又はホウ酸塩の添加時期は、同一であっても異なっていてもよく、特に限定はされないが、異なる場合は窒素源の添加の後に金属塩及び／又はホウ酸塩を添加することが好ましい。

なお、金属塩及びホウ酸塩を添加する際の添加時期は、同一であっても、異なっていてもよく、特に限定はされない。

窒素源は、上記工程１（工程Ａ）において詳述した通りとすればよい。

金属塩は、特に限定はされないが、例えば亜鉛塩、モリブデン塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩等が挙げられる。これらの金属塩は適宜組み合わせて添加すればよく、特に限定はされないが、少なくともモリブデン塩を含む組み合わせとすることが好ましい。

具体的にはモリブデン塩、亜鉛塩、マンガン塩、銅塩、及びコバルト塩を含む金属塩；モリブデン塩、銅塩を含む金属塩；モリブデン塩、亜鉛塩を含む金属塩；モリブデン塩、マンガン塩を含む金属塩；モリブデン塩、コバルト塩を含む金属塩等の組み合わせが挙げられる。

ホウ酸塩は、特に限定はされないが例えばホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）、メタホウ酸（ＨＢＯ_２）_ｎ、過ホウ酸（ＨＢＯ_３）、次ホウ酸（Ｈ_４Ｂ_２Ｏ_４）、ボロン酸（Ｈ_３ＢＯ_２）、ボリン酸（Ｈ_３ＢＯ）等が挙げられる。

工程３における、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期は、特に限定はされないが、例えば培養液のＯＤ６００の値が５０以上となる時期にすればよい。ＯＤ６００の測定方法は、市販の分光光度計を用いて測定する。

窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期は特に限定はされないが、工程Ａによって得られるハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり５重量部以上となる時期等が挙げられる。

また、工程Ａによって得られるハロモナス属に属する好塩菌体の乾燥菌体重量が培養液１Ｌ当たり１５重量部以上となる時期であってもよい。

工程Ｂにおける窒素源の添加量は、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して、硝酸ナトリウムとして０．１〜０．５重量部程度、尿素として０．０７〜０．３５重量部程度とすればよい。また、工程Ｂにおける金属塩の添加量は、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して０．０２〜０．２５０重量部程度とすればよい。そして、工程Ｂにおけるホウ酸塩の添加量も、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して０．１４３〜０．２８６重量部程度とすればよい。なお、金属塩及びホウ酸塩の添加量の合計は、１００重量部の培地に対して通常は０．０２〜０．２８６重量部程度とすればよい。

窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される、少なくとも１つを添加する回数は、特に限定はされないが、通常は１〜５回程度とすればよい。複数回添加する場合、上述の培養条件下であれば、３〜２４時間の間隔を空ければよい。

なお、上述した窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加した後、引き続いて行う工程Ｃまでの所定の時間は、上記工程１（工程Ａ）に示す培養条件と同様の培養条件にて培養を行えばよい。

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。

本実施例では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を製造する方法について具体的に詳述する。

表１に示すＳＯＴ改５（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ改５）を基本にした培地を用いた。この培地は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（国立環境研究所のＨＰ）であり、ＮａＨＣＯ_３及びＮａ_２ＣＯ_３の量を調整し、窒素源のＮａＮＯ_３を５倍に、リン源のＫ_２ＨＰＯ_４を４倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のｐＨは９．４±０．１であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。

培養の際には、上述の培地に対して各種有機炭素源を適宜追加して用いた。具体的な有機炭素源として、それぞれ培地中での終濃度が２０％もしくは２５％となるグルコースを使用した。

＜３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の測定＞
本実施例における培養液にて生産される３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の測定は、非特許文献３に記載されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）分析の手法を応用した以下の方法にて行った。

培養液を遠心分離して上清のみ採取し、５０μＬを乾燥させた。この上清乾燥物に、３ｖｏｌ％のＨ_２ＳＯ_４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で１時間加熱し、３−ヒドロキシ酪酸またはその塩をすべて３−ヒドロキシ酪酸メチルに変換した。

その後、室温まで冷却し、次いでクロロホルム０．５０ｍｌ及び蒸留水０．２５ｍｌを加えて激しく攪拌した後、１分間遠心分離工程に供して１μｌのクロロホルム層サンプルとして分取した。そして、ガスクロマトグラフ装置を用いて、サンプル中の３−ヒドロキシ酪酸の量を測定した。

一方で、３−ヒドロキシ酪酸の標品を上清乾燥物と同様の処理等を行い、これを基準として培地１Ｌ当たりの３−ヒドロキシ酪酸蓄積率（３−ヒドロキシ酪酸（ｇ）／上清液（Ｌ））を求めた。また、「Ｆ−キット Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸」（株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）のキットでは、Ｄ体のみが検出される。このキットでの測定値と、ガスクロマトグラフ装置での測定値が一致したことから、分泌された３−ヒドロキシ酪酸はほぼＤ体であることが確認された。

＜ＰＨＢ蓄積率測定＞
本実施例における菌体内に蓄積されたＰＨＢの蓄積量の測定は、非特許文献１に記載の手法を適宜採用した以下に示す方法で行った。

上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体１〜３ｍｇに、３ｖｏｌ％のＨ_２ＳＯ_４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で３時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、０．５０ｍｌのクロロホルム及び０．２５ｍｌの蒸留水を加えて激しく攪拌した。

その後、１分間遠心分離工程に供して１μｌのクロロホルム層サンプルとして分取した。そして、ガスクロマトグラフ装置を用いて、サンプル中のＰＨＢの量を測定した。

一方で、ＰＨＢの標品を乾燥菌体と同様の処理等を行い、これを基準として乾燥菌体当たりのＰＨＢ蓄積率（ＰＨＢ（ｇ）／乾燥菌体重量（ｇ））を求めた。

＜ハロモナス属に属する好塩菌のプレ培養＞
ハロモナス属に属する好塩菌（ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、プレート培養より、１６．５ｍｍ径の試験管に５ｍｌの上記ＳＯＴ５改培地に炭素源として上述のグルコースではなく、１ｗ／ｖ％グルコースを加えて、３７℃で１晩振盪培養した。

＜ハロモナス属に属する好塩菌の培養、サンプルの回収等＞
製造例１
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．２ｍｌを、１００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地２０ｍｌに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、２４時間後から、およそ１２時間おきに培養液を０．５ｍｌずつ回収して、上清中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の量を測定した。

有機炭素源は２０重量％のグルコースとなるように培地に添加した。

培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養した。培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、回分培養した。

さらに、窒素源として、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを添加し、２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目それぞれに、２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウム加えたもの、または、培養当初に８．７５ｇ／Ｌの尿素を添加し、２４時間目、３６時間目、４８時間目、６０時間目それぞれに、１．７５ｇ／Ｌの尿素を加えたもの、さらに、それぞれ、培養４８時間目に、炭酸ナトリウムでｐＨ８．５に調整したもの、調整しなかったものについて比較した。結果を図１〜３に示す。

図１、２に示す結果から、ｐＨ調整を行ったものは、ｐＨ調整を行わなかったものに比べて、窒素源が硝酸ナトリウム、尿素いずれの場合も、乾燥菌体重量、ＰＨＢの蓄積量の増加が見られた。また、図３において、ｐＨ調整を行わなかったものは好気条件において、３−ＨＢの分泌が起こらなかったのに対し、ｐＨ調整を行ったものは、窒素源が硝酸ナトリウム、尿素いずれの場合も、ｐＨ調整後から、３−ＨＢの分泌が見られた。

以上の結果から、菌体の増殖が行われたのちに、ｐＨ調整を行っただけで、菌体中のＰＨＢの蓄積が増加すると共に、３−ＨＢの分泌が行われることが明らかになった。

Claims (8)

1. 下記の工程（１）〜（３）を含む、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
   （１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
   （２）培養液のｐＨ７．０以上に調整及び維持し、培養液中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程２、及び
   （３）工程２で得られる培養液中から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
2. 工程１の後であって、工程２の前に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも一つを添加する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
3. 窒素源が、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、及びアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項２に記載の製造方法。
4. 工程２におけるｐＨの調整及び維持を行う時期が、培養液の乾燥菌体重量が１５ｇ／L以上となる時期である、請求項１〜３の何れか１項に記載の製造方法。
5. 工程２において調整及び維持する培養液のｐＨが、７．５以上である請求項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。
6. 工程２における培養液のｐＨの調整及び維持を、水酸化物、炭酸塩、及び炭酸水素塩からなる群より選択される少なくとも１種を用いて行う、請求項１〜５の何れか１項に記載の製造方法。
7. 工程３にて得られる培養液１Ｌ当たり、０．２ｇ以上の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. 前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９５）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

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