JP5229904B2 - 好塩菌による乳酸及び/又は酢酸の産生方法 - Google Patents
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Description
下で良好に生育するため他のバクテリア等のコンタミが極めて起こりにくいことが推定された。そこで各種の炭素源の資化性を調べるために菌体を培養し、ポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)の生産量を調べたところ著量のPHAsの蓄積を行
うことを認めた(特許文献1)。
生産では、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ触媒を用いて、植物、動物油脂から脂肪酸メチルエステル(BDFの主体)を作製する方法が主流である。そのため、この
手法によるアルカリを多く含んだ廃グリセロールの処理が問題となっている。特許文献1には、これらの廃グリセロールからメタノール除去を行えば、当該好塩菌が廃グリセロールを炭素源として、PHAsを生産することができることも記載されている。
1)。非特許文献1では、培養に用いられているMH培地には緩衝成分がほとんど含まれておらず、僅かな酸の産成で容易にpH変化が起こりうる。pHにより変化する試薬の呈色により酸の産生を見ているが、当該の酸の同定はなされていない。
バクテリアのコンタミが起こりにくい環境での培養が可能であるという知見を得た。また、乳酸及び/又は酢酸の産生は一連の菌体増殖の中で行われるため、一段階の培養での乳酸及び/又は酢酸の産生が可能である。
項1.ハロモナス属に属する好塩菌を用いた乳酸及び/又は酢酸の産生方法であって、好塩菌は無機塩と単一の有機炭素源からなる初期pH8.8〜11の培地で増殖並びに乳酸及び/
又は酢酸を培地中に産生することが可能であり、好塩菌を無機塩と単一又は複数の有機炭素源を含む初期pHが8.8〜11の培地で培養し、培地中の乳酸及び/又は酢酸が存在してい
る間に培養を停止する、乳酸及び/又は酢酸の産生方法。
項2.pHの低下によって培地中の酢酸の存在の確認を行う、項1に記載の方法。
項3.前記培養を行う培地中の有機炭素源がグルコースである、項1又は2に記載の方法。
項4.前記培養を行う培地中の有機炭素源が廃グリセロールである、項1又は2に記載の方法。
項5.前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株(FERM BP-10995)である、項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
のようにペプトンや酵母エキス等の高価な有機炭素・窒素源を用いず低コストでの培養が可能であって、乳酸及び/又は酢酸の産生を一段階の培養で、他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境で行うことができる。
明に用いる好塩菌が炭素源として利用し、乳酸及び/又は酢酸を産生することができる。更に、光合成できる微細藻類スピルリナなどとの混合培養の実施も可能である。
好塩菌を無機塩と単一又は複数の有機炭素源を含む初期pHが8.8〜11の培地で培養し、培
地中の乳酸及び/又は酢酸が存在している間に培養を停止することを特徴とする。
本発明に用いる好塩菌は、ハロモナス属に属する好塩菌であって、無機塩と単一の有機炭素源からなる初期pH8.8〜11の培地で増殖並びに乳酸及び/又は酢酸を培地中に産生す
ることが可能であることを特徴とする。
好ましくは8.8〜11の培地で生育が可能なものである。
以上の酢酸を産生できることが好ましく、0.17w/v%以上の乳酸及び/又は2.0w/v%以上の
酢酸を産生できることがより好ましい。
ロモナス・エスピー KM-1株はまた、16S rRNA遺伝子が、DDBJ Accession Number AB477015として登録されている。
総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に受託番号FERM P-21316として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はFERM BP-10995である。
。そして、この菌株の培養とバイオプラスチックPHAsの生産、乳酸及び酢酸生産の関連を観察した結果、十分量の炭素源が存在して培養している場合には、乾燥菌体重量に対し20重量%以上のPHBの蓄積を行うとともに、著量の乳酸及び酢酸を培地中に蓄積することが
判明した。これらの工程は一連の菌体増殖の中で行われるため、特段の変更操作を必要としない(実施例参照)。
培養可能なハロモナス・メルリアナ(Halomonas meridiana) NBRC15608株等が挙げられ、
本株もKM-1株と同様に、著量の酸を生産し、pHの低下が見られた。
れを宿主細胞に導入して形質転換することにより行なわれる。例えば宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に該遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びSD(シヤイン・アンド・ダルガーノ)塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン(例えばATG)を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい
。かくして得られる所望の組換えDNAの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方
法としては、一般的な各種方法を採用できる。
本発明の乳酸及び/又は酢酸の産生方法に用いる培地は、無機塩と単一又は複数の有機炭素源を含む初期pHが8.8〜11であることを特徴とする。
該無機塩の濃度は、総量で通常0.2M〜2.0 M、好ましくは0.2〜1.0 M、より好ましくは0.2〜0.5 M程度である。
アラビノース)、二糖(スクロース)、糖アルコール(マンニトール、ソルビトール)、酢酸
、酢酸ナトリウム、エタノール、グリセロール、可溶性デンプン、n-プロパノール、プロピオン酸等が挙げられ、好ましくは、グルコース、及び廃グリセロールである。
ばグリセロールの場合、好ましくは培地中に0.1〜20 w/v%、より好ましくは2〜10 w/v%含まれ、廃グリセロールの場合、好ましくは培地中に1〜20 w/v%、より好ましくは3〜10 w/v%含まれ、グリセロールの場合、好ましくは培地中に1〜20 w/v%、より好ましくは3〜10 w/v%含まれる。
が排出されるが、これらの廃グリセロールからメタノール除去等を行ったものは、有機炭素源として上記培地に添加して使用することができる。廃グリセロールは、例えばグリセリンを350〜400 mg/g程度、カリウムを41〜62 mg/g程度含んでおり、廃グリセロール1 g
を蒸留水に100 mlに溶解したpHは10.3〜10.4程度である。培地への廃グリセロールの添加量は1〜20重量%、好ましくは3〜10重量%である。
本発明での培養は、好塩菌を前記培地を用いて、培地中の乳酸及び/又は酢酸が存在している間に停止することを特徴とする。
例を以下に挙げる。
度120〜180 rpmで1晩振盪前培養される。
し本培養する。本培養は20〜45℃で可能であるが、好ましくは30〜37℃で行う。
要がある。これは、乳酸や酢酸は好塩菌により産生されて培地中に分泌されるが、好塩菌により再度取り込まれて栄養源として利用されるため、培養時間が長くなると培地中から無くなってしまうためである。
本発明により培地中に生産される乳酸及び/又は酢酸は、培地のアルカリ性を維持するために加える炭酸カルシウムと反応し、カルシウム塩として回収できる。酸のまま回収したい場合には、蒸留等の常法に従い回収することができる。
<使用培地組成>
国立環境研究所のSOT培地に炭素源を加えて使用した。
(培地名)SOT改(Spirulina platensis Medium改)
(培地組成)
NaHCO3 1.68 g K2HPO4 50 mg
NaNO3 250 mg K2SO4 100 mg
NaCl 100 mg MgSO4・7H2O 20 mg
CaCl2・2H2O 4 mg FeSO4・7H2O 1 mg
Na2 EDTA 8 mg A5+Co 溶液 0.1 ml
例 (酢酸ナトリウム 1.0 g 炭素源として)
蒸留水に溶解し、100 mlとする。
A5+Co 溶液
H3BO3 286 mg MnSO4・7H2O 250 mg
ZnSO4・7H2O 22.2 mg CuSO4・5H2O 7.9 mg
Na2MoO4・2H2O 2.1 mg Co(NO3)6H2O 4.398 mg
蒸留水 100 ml
滅菌の際には、上記培地組成を2種類に分け
SOT-A: (NaHCO3 1.68 g K2HPO450 mg/50 ml)2倍濃度水溶液
SOT-B: (上記以外/50 ml) 2倍濃度水溶液
(プレート培養の場合 SOT-Bに終濃度1.5 w/v%のアガーを加える。)
を別々にオートクレーブ滅菌し、50度以下に冷却した後混合する。培地調製後のpHは、液体培養、プレート培養ともに、pH8.9±0.1となる。
ロールサンプルをいただき、培養に用いた。このサンプルのpHを前述する方法で測定すると、pH10.38であった。
上記の培地(それぞれの炭素源を1 w/v%を含む)を5 ml加えた試験管に、プレート培養した菌体を植菌し、37℃ で1晩振盪培養した。
プレ培養した菌体0.1 mlを、100 ml容量の三角フラスコに入れた液体培地30 mlに混合
して植菌し、シリコセンをした。これを、30℃で振盪培養し、12時間後より、経時的に培養液を1 ml回収して、遠心後の培養上清を回収し、キャピラリー電気泳動(CAPI-3300、大塚電子株式会社製)にて分析した。有機酸を含む陰イオンの一斉分析用に開発されたアル
カリ性泳動溶液を用い、泳動溶液のバックグラウンド吸収を利用する間接吸光法により検出を行った。以下の文献の記載に従い、培養液および有機酸標準溶液の測定結果を比較し、検出されたピークを同定・定量した(T. Soga and G.A. Ross, J. Chromatogr. A, 1999, 837, 231-239)。結果を図1〜3に示す。
シロース2.5%の場合38時間で0.12 w/v%、廃グリセロール5%の場合45時間で0.08 w/v%の乳酸の最大生産量となった。
ー KM-1株による乳酸と酢酸の産生が確認された。そのため、低コストでの培養が可能で
あって、乳酸及び/又は酢酸の産生を他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境で行うことができる。乳酸及び酢酸の産生が一連の菌体増殖の中で行われるため、一段階の培養での乳酸及び酢酸の産生が可能であることも分かる。
Claims (4)
- ハロモナス属に属する好塩菌を用いた乳酸及び/又は酢酸の産生方法であって、好塩菌はハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株(FERM BP-10995)であり、好塩菌を無機塩と単一又は複数の有機炭素源を含む初期pHが8.8〜11の培地で培養し、培地中の乳酸及び
/又は酢酸が存在している間に培養を停止する、乳酸及び/又は酢酸の産生方法。 - pHの低下によって培地中の酢酸の存在の確認を行う、請求項1に記載の方法。
- 前記培養を行う培地中の有機炭素源がグルコースである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記培養を行う培地中の有機炭素源が廃グリセロールである、請求項1又は2に記載の方法。
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