JP5164182B2 - 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）産生方法及び好塩菌 - Google Patents
好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）産生方法及び好塩菌 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5164182B2 JP5164182B2 JP2009534385A JP2009534385A JP5164182B2 JP 5164182 B2 JP5164182 B2 JP 5164182B2 JP 2009534385 A JP2009534385 A JP 2009534385A JP 2009534385 A JP2009534385 A JP 2009534385A JP 5164182 B2 JP5164182 B2 JP 5164182B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phas
- halomonas
- medium
- strain
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 title claims description 89
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 title claims description 89
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 51
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 106
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 48
- 241001653918 Halomonas sp. Species 0.000 claims description 37
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 28
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 claims description 26
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 241000206596 Halomonas Species 0.000 claims description 20
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 229920000218 poly(hydroxyvalerate) Polymers 0.000 claims description 5
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 45
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 36
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 26
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 8
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N pentaneperoxoic acid Chemical compound CCCCC(=O)OO UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 6
- 239000000306 component Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 4
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000739391 Halomonas boliviensis LC1 Species 0.000 description 2
- 241000144833 Halomonas salina Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 229920001397 Poly-beta-hydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 description 2
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001330505 Halomonas alimentaria Species 0.000 description 1
- 241001278824 Halomonas campisalis Species 0.000 description 1
- 241001049244 Halomonas daqingensis Species 0.000 description 1
- 241000508292 Halomonas desiderata Species 0.000 description 1
- 241001643756 Halomonas nitritophilus Species 0.000 description 1
- 241000252379 Halomonas sp. KM-1 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical group ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229920003232 aliphatic polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008162 cooking oil Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- -1 fatty acid ester Chemical class 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001319 headspace solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000013190 lipid storage Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000070 poly-3-hydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、好塩菌による生分解性プラスチックであるポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)（PHAs）の産生方法およびハロモナス属に属する好塩菌に関する。
生分解性プラスチックは、微生物などの作用により例えば土壌中に埋めた状態で分解されるため、環境破壊を防止する観点から注目されている。生分解性プラスチックは、通常の難分解性プラスチックよりも価格が高く、性能の点で劣っていたが、これらの欠点についても解消されて実用化の段階に入っており、使用量の増大に合わせて生分解性プラスチックの量産技術が求められている。
生分解性プラスチックの一種であるポリヒドロキシアルカノエートは、ラルストニア属水素細菌、ラン藻、メタン資化細菌等広範囲の細菌により、ある種の栄養源（窒素やリンなど）が欠乏した条件で産生される。
一方、好塩菌は、グルコースなどを主な炭素源とし、ペプトンや酵母エキスを少量含むpH7.5〜8.56の培地で菌体内に著量のPHBを蓄積することが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
Quillaguaman J.; Munoz M.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: "Optimizing conditions for poly(beta-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis LC1 in batch culture with sucrose as carbon source." Appl Microbiol Biotechnol 2007 ; 74 ( 5 ) : 981-986 Quillaguaman J.; Hashim S.; Bento F.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: "Poly(beta-hydroxybutyrate) production by a moderate halophile, Halomonas boliviensis LC1 using starch hydrolysate as substrate." J Appl Microbiol 2005 ; 99 ( 1 ) : 151-157
Quillaguaman J.; Munoz M.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: "Optimizing conditions for poly(beta-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis LC1 in batch culture with sucrose as carbon source." Appl Microbiol Biotechnol 2007 ; 74 ( 5 ) : 981-986 Quillaguaman J.; Hashim S.; Bento F.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: "Poly(beta-hydroxybutyrate) production by a moderate halophile, Halomonas boliviensis LC1 using starch hydrolysate as substrate." J Appl Microbiol 2005 ; 99 ( 1 ) : 151-157
本発明は、他の細菌が混入しても安定してPHAsを低コストで生産できる、PHAsの産生方法を提供することを目的とする。本発明はまた、ペプトンや酵母エキス等の複数の有機炭素・窒素源を含む培地を用いることが生育に必須ではなく、高塩濃度、高アルカリ条件下で生育でき、PHAsを産生できる好塩菌を提供することを目的とする。
本発明者らは、商業的な屋外培養でコンタミがほとんどないことが知られている微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討していたところ、ある条件下で好塩菌が唯一のコンタミ菌として生育することを認めた。
この好塩菌は、pH8.8以上のアルカリ性、高濃度のナトリウムを含む培地で良好に生育するため他のバクテリア等のコンタミが極めて起こりにくいことが推定された。そこで各種の炭素源の資化性を調べるために菌体を培養し、PHAsの生産量を調べたところ著量のPHAsの蓄積を行うことが認められた。
各種の炭素源とは、六単糖(グルコース、フラクトース)、五単糖(キシロース、アラビノース)、二糖(スクロース)、糖アルコール(マンニトール、ソルビトール)、酢酸、酢酸ナトリウム、エタノール、グリセロール、可溶性デンプン、n-プロパノール、プロピオン酸等であった。
既知の文献において、好塩菌の培養に用いられる培地には、ペプトンや酵母エキスが必ず含まれており、主要な炭素源に加えて、これらの有機炭素・窒素源を少量用いることがPHAsの蓄積を向上させることが示されている(非特許文献１，２)。
しかるに、本好塩菌は、ペプトンや酵母エキスは用いることなく、無機塩と単純な有機炭素源を加えた低コストな培地で培養可能であることを本発明者は確認した。従って、本発明の方法および好塩菌は実際の商業培養において有利であると言える。
本発明者らは、ある種の好塩菌において、単一の有機炭素源を基質とする場合において、増殖を中心とする工程と、PHAs蓄積を中心とする工程を、自動的、連続的に変換して行い、高価な複数種の有機炭素・窒素源を含むペプトンや酵母エキス等を与えなくても著量のPHAsが蓄積されることを見出した。本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のPHAs産生方法及び好塩菌を提供するものである。
項１．ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)（PHAs）産生方法であって、好塩菌は無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができ、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法。
項２．前記無機塩の濃度が0.2〜1.0 Mである、項１に記載の方法。
項３．前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)（PHB）を含む、項１又は２に記載の方法。
項４．前記有機炭素源がグリセロールを含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートを含む、項１又は２に記載の方法。
項５．前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーを含む、項１又は２に記載の方法。
項６．前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株（FERM BP-10995）である、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌。
項８．ハロモナス・エスピー KM-1株である、項７に記載の好塩菌。
項１．ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)（PHAs）産生方法であって、好塩菌は無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができ、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法。
項２．前記無機塩の濃度が0.2〜1.0 Mである、項１に記載の方法。
項３．前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)（PHB）を含む、項１又は２に記載の方法。
項４．前記有機炭素源がグリセロールを含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートを含む、項１又は２に記載の方法。
項５．前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーを含む、項１又は２に記載の方法。
項６．前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株（FERM BP-10995）である、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌。
項８．ハロモナス・エスピー KM-1株である、項７に記載の好塩菌。
本発明の好塩菌によるPHAs産生方法によれば、PHAs生産に際し従来のようにペプトンや酵母エキス等の高価な有機炭素・窒素源を用いずともPHAsの蓄積を一段階の培養で、他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境で行うことができる。本発明において、好塩菌は、ペプトンや酵母エキス等の複数の有機炭素・窒素源を含む培地を用いることが生育に必須ではないため、例えば、グリセリンなどを含む塩濃度の高いBDF廃液の処理に用いることや、光合成できる微細藻類スピルリナなどとの混合培養の実施も可能である。
また、糖などを基質として用いるとヒドロキシブチレートのホモポリマーを形成するが、n-プロパノール又はプロピオン酸を有機炭素源として用いて培養すると、ヒドロキシブチレートだけでなくヒドロキシバレレート13％程度まで構成要素として含むコポリマーの作成も可能である。
地球に優しい燃料として利用がすすんでいるバイオディーゼルフュエル(BDF)の生産では、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ触媒を用いて、植物、動物油脂から脂肪酸メチルエステル(BDFの主体)を作製する方法が主流である。そのため、この手法によるアルカリを多く含んだ廃グリセロールの処理が問題となっている。しかしながら、これらの廃グリセロールからメタノール除去等をおこなえば、この好塩菌が炭素源として利用し、PHAsを生産することができる。
さらに、高濃度の塩を含むアルカリ性廃液(漬け物廃液等)から不溶性有機物をろ過等によって除き、廃水処理を行うとともにPHAsを生産する場合にも、本好塩菌は有効に作用するものと推定される。
好塩菌
本発明は、無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌を提供する。
本発明は、無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌を提供する。
当該無機塩と当該有機炭素源は、後述するものと同じである。
当該ハロモナス属に属する好塩菌は、前記培地中で乾燥菌体重量に対して、好ましくは25重量%以上、より好ましくは30重量%以上のPHAsを産生することができる。
ハロモナス属とは、0.2M以上1.0M程度までの塩濃度を適とする好塩性有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。
当該ハロモナス属に属する好塩菌は、0.2M以上1.0M程度までの塩濃度を適とする好塩性を示す細菌である。当該ハロモナス属に属する好塩菌としては、ペプトンや酵母エキス等の複数の有機炭素・窒素源を培養に必要としないものであり、pHが8.8以上、好ましくは8.8〜11で生育可能なものであって、前記培地中で乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができるものであれば特に限定されないが、好ましくはハロモナス・エスピー(Halomonassp.) KM-1株である。当該ハロモナス・エスピー KM-1株は、無機塩と単一の有機炭素源からなり、pHが8.8以上、好ましくは8.8〜11の培地で培養でき、当該培地中で乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することを特徴とする。当該ハロモナス・エスピー KM-1株はまた、16S rRNA遺伝子が配列表の配列番号１に示す塩基配列を有する。
以下に、ハロモナス・エスピー KM-1株の菌学的性質を示す。
SOT改培地(後述)を用い、37℃にて、24時間程度培養したコロニーの形状は、直径 1.0〜1.5 mm、ごく薄いオレンジ〜薄い肌色の色調であり、これを長期に冷蔵保存すると白っぽくなる。形は、円形、隆起状態は半レンズ状、周辺は波状、表面の形状はスムーズ、不透明であり、粘稠性がある。
生育当初は薄いオレンジから薄い肌色だが、数日すると白っぽくなる。きれいな単一のコロニーを形成するのは難しく、画線培養の場合連続したコロニー群となりやすい。
培地の殺菌条件は、オートクレーブ121 ℃ 15 min、又はろ過滅菌(0.2μm)、通常の培養には、20〜37℃で好気培養し、培養期間 12〜24時間である。生育に光は要求しない。保護剤にスキムミルク10%およびグルタミン酸ナトリウム1%を用い、5℃で保存する凍結乾燥法での保管が可能である。凍結乾燥法からの復元には、炭素源として酢酸ナトリウム1%を含むSOT改培地にて行う。また、30%グリセロール溶液を用いて、-80℃付近での凍結法による保管も可能である。
当該ハロモナス・エスピーKM-1株は、16SリボゾームRNA配列による分析で、ハロモナス属ハロモナス・ニトリトフィルス(Halomonas nitritophilus)と特に相同性が高く、また、ハロモナス・ダキンゲンシス(Halomonas daqingensis)、ハロモナス・サリナ(Halomonas salina)、ハロモナス・アリメンタリア(Halomonas alimentaria)、ハロモナス・カンピサリス(Halomonas campisalis)、ハロモナス・デシデラタ(Halomonas desiderata)等との相同性も示された。
当該ハロモナス・エスピー KM-1株は、平成19年７月10日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第6）に受託番号FERM P-21316として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はFERM BP-10995である。
本発明者は、当該ハロモナス・エスピー KM-1株をスピルリナ菌株の培地から分離した。そして、この菌株の培養とPHAs生産の関連を観察した結果、誘導培養期はごく僅かなPHAs生産しか行わないが、対数増殖期後期になり、菌体密度が高く(OD600＝2.0以上)なると、菌体の増殖に数時間遅れて乾燥菌体当たり20重量％以上の著量のPHAsを菌体中に蓄積することが判明した。これらの工程は一連の菌体増殖の中で行われるため、特段の変更操作を必要としない(実施例 図１，２参照)。ハロモナス・エスピー KM-1株は、乾燥菌体当たり20重量％以上、条件により40〜95重量％のPHAsを含むことができる。
ハロモナス・エスピー KM-1株以外の当該好塩菌の具体例としては、例えば16SリボゾームRNA配列による分析から、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリアなどが挙げられる。
尚、上述した細菌と同様の性質を有するハロモナス属に属する好塩菌であれば、ハロモナス・ニトリトフィルスや、ハロモナス・エスピー KM-1等に限らず、本発明の好塩菌によるPHAs産生方法を適用でき、本発明の好塩菌に含まれる。
更に、当該ハロモナス属に属する好塩菌に遺伝子を導入することもできる。
該遺伝子の導入は、導入する遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えDNAを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換することにより行なわれる。例えば宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に該遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びSD（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばATG）を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。かくして得られる所望の組換えDNAの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。
PHAs産生方法
(a)培地
本発明における、好塩菌の培養は、無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源、好ましくは、無機塩と単一の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で行う。
(a)培地
本発明における、好塩菌の培養は、無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源、好ましくは、無機塩と単一の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で行う。
当該無機塩としては、リン酸塩、硫酸塩、及びナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。ナトリウムを含む培地成分としては、NaCl、NaNO3、NaHCO3、Na2CO3等が挙げられる。当該無機塩は複数であってもよく、当該無機塩の濃度は、総量で好ましくは0.2M〜2.5M、より好ましくは0.2〜1.0M、特に0.2〜0.5 M程度である。
当該有機炭素源としては、六単糖(グルコース、フラクトース)、五単糖(キシロース、アラビノース)、二糖(スクロース)、糖アルコール(マンニトール、ソルビトール)、酢酸、酢酸ナトリウム、エタノール、グリセロール、可溶性デンプン、n-プロパノール、プロピオン酸等が挙げられ、好ましくは、エタノール、n-プロパノール、プロピオン酸、グルコース、キシロース、グリセロール、スクロースである。当該有機炭素源は単一もしくは複数であり、適切な濃度は炭素源により異なるが、例えばグリセロールの場合、培地中に0.1〜20w/v%、好ましくは2〜10w/v%含まれる。
当該培地は、無機塩と有機炭素源以外の成分を一部含んでいてもよく、そのような成分としては、例えば廃グリセロールの場合、副次的な有機炭素源として脂肪酸、脂肪酸エステル、触媒由来のカリウム、ナトリウムなどの金属などが挙げられる。
当該培地のpHは、5以上、好ましくはアルカリ条件、菌種により好ましくは8.8以上、特に8.8〜11であればよい。
アルカリ条件かつ塩濃度の高い条件の培地で、好塩菌を培養するため、他のバクテリアのコンタミネーションの恐れがほとんどなく、また単一の安価な炭素源を用いて培養が行えるため、低コストでの培養が可能となる。
バイオディーゼルフュエル(BDF)の生産に伴い、アルカリを多く含んだ廃グリセロールが排出されるが、これらの廃グリセロールからメタノール除去等を行ったものは、有機炭素源として上記培地に添加して使用することができる。廃グリセロールは、例えばグリセリンを350〜400mg/g程度、カリウムを41〜62mg/g程度含んでおり、廃グリセロール1 gを蒸留水に100mlに溶解したpHは10.3〜10.4程度である。培地への廃グリセロールの添加量は1〜20重量%、好ましくは3〜10重量%である。
(b)培養方法
本発明の好塩菌を培養する方法としては、PHAsが生産される方法であれば特に制限されないが、培養の例を以下に挙げる。
本発明の好塩菌を培養する方法としては、PHAsが生産される方法であれば特に制限されないが、培養の例を以下に挙げる。
ハロモナス・エスピー KM-1株を含むハロモナス属に属する好塩菌は、5 ml程度の培地に植菌し、30〜37℃程度、攪拌速度120〜180rpmで１晩振盪前培養する。
前培養した菌体を、三角フラスコ、発酵槽等に入った培地中に100〜1000倍程度に希釈し本培養する。本培養は20〜45℃で可能であるが、好ましくは30〜37℃で行う。
必要な培養時間は、培地の条件により異なるが、培地の条件により最適な培養時間を適宜設定すれば、乾燥菌体重量あたり20重量%以上のPHAsを生産できる。
(c)PHAs
本発明により生産されるPHAsは、ヒドロキシアルカノエート単位からなるポリマーであり、ヒドロキシアルカノエートは、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート等がある。また、PHAsは、すべて同じヒドロキシブチレートから構成されるホモポリマーであることが多い。n-プロパノール、プロピオン酸又はその塩を炭素源として培養することで、ヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートからなるPHAsコポリマーを産生できる。この場合、ヒドロキシバレレートの含有量は0.5〜13%、好ましくは5〜13%である。
本発明により生産されるPHAsは、ヒドロキシアルカノエート単位からなるポリマーであり、ヒドロキシアルカノエートは、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート等がある。また、PHAsは、すべて同じヒドロキシブチレートから構成されるホモポリマーであることが多い。n-プロパノール、プロピオン酸又はその塩を炭素源として培養することで、ヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートからなるPHAsコポリマーを産生できる。この場合、ヒドロキシバレレートの含有量は0.5〜13%、好ましくは5〜13%である。
菌体中に蓄積されたPHAsは、例えば菌体を破砕後、トリクロロエチレンで抽出するなどの常法に従い回収することができる。
本発明で産生されるPHAsの含有量は乾燥菌体に対し20重量%〜95重量%であり、好ましくは50重量%〜95重量%である。PHBの含有量は乾燥菌体に対し20重量%〜95重量%であり、好ましくは50重量%〜80重量%である。
ハロモナス・エスピー KM-1株で生産されるPHAsの数平均分子量(MN)は40万、重量平均分子量(MW)は56万ぐらいであるので、一般的な用途で十分に使用が可能である。また、他のハロモナス属に属する好塩菌でも類似するMN、MWのPHAsが得られ得る。
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
本実施例では、微生物により産生される脂肪族ポリエステル系生分解性プラスチックであるポリヒドロキアルカノエート（PHAs）を産生する方法について詳述する。
＜使用培地組成＞
国立環境研究所のSOT培地に炭素源を加えて使用した。
（培地名）SOT改（Spirulina platensisMedium改）
（培地組成）
NaHCO31.68 g K2HPO450 mg
NaNO3 250 mg K2SO4 100 mg
NaCl 100 mg MgSO4・7H2O 20 mg
CaCl2・2H2O 4 mg FeSO4・7H2O 1 mg
Na2 EDTA 8 mg A5＋Co 溶液 0.1 ml
例 （酢酸ナトリウム 1.0g 炭素源として）
蒸留水に溶解し、100mlとする。
A5＋Co 溶液改
H3BO3 286 mg MnSO4 ・7H2O 250 mg
ZnSO4・7H2O 22.2 mg CuSO4 ・5H2O 7.9 mg
Na2MoO4・2H2O 2.1 mg Co(NO3)6H2O 4.398mg
蒸留水 100 ml
滅菌の際には、上記培地組成を2種類に分け
SOT-A: （NaHCO3 1.68 g K2HPO450 mg/50 ml）2倍濃度水溶液
SOT-B： (上記以外/50 ml) 2倍濃度水溶液
（プレート培養の場合 SOT-Bに終濃度1.5 w/v%のアガーを加える。）
を別々にオートクレーブ滅菌し、50度以下に冷却した後混合する。培地調整後のpHは、液体培養、プレート培養ともに、8.9±0.1となる。
国立環境研究所のSOT培地に炭素源を加えて使用した。
（培地名）SOT改（Spirulina platensisMedium改）
（培地組成）
NaHCO31.68 g K2HPO450 mg
NaNO3 250 mg K2SO4 100 mg
NaCl 100 mg MgSO4・7H2O 20 mg
CaCl2・2H2O 4 mg FeSO4・7H2O 1 mg
Na2 EDTA 8 mg A5＋Co 溶液 0.1 ml
例 （酢酸ナトリウム 1.0g 炭素源として）
蒸留水に溶解し、100mlとする。
A5＋Co 溶液改
H3BO3 286 mg MnSO4 ・7H2O 250 mg
ZnSO4・7H2O 22.2 mg CuSO4 ・5H2O 7.9 mg
Na2MoO4・2H2O 2.1 mg Co(NO3)6H2O 4.398mg
蒸留水 100 ml
滅菌の際には、上記培地組成を2種類に分け
SOT-A: （NaHCO3 1.68 g K2HPO450 mg/50 ml）2倍濃度水溶液
SOT-B： (上記以外/50 ml) 2倍濃度水溶液
（プレート培養の場合 SOT-Bに終濃度1.5 w/v%のアガーを加える。）
を別々にオートクレーブ滅菌し、50度以下に冷却した後混合する。培地調整後のpHは、液体培養、プレート培養ともに、8.9±0.1となる。
＜PHAs産生菌の選定＞
各種の単一の炭素源とナイルレッド0.5 μg/mlを含むプレートに植菌し、スクリーニングした。30℃にて、2日培養した。発生したコロニーを365 nmの紫外光下で蛍光発光させることで、PHAsを生産するハロモナス・エスピー KM-1株を選抜した（次の文献の定性的なPHB生産分析手法による。）。なお、この方法では定性的に数％以上PHAsを含む菌株を選抜できる。
Patricia Spiekermann; Bernd H. A. Rehm; Rainer Kalscheuer; Dirk Baumeister; A. Steinbuchel: “A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds” Archives of Microbiology 1999; 171(2), 73-80
各種の単一の炭素源とナイルレッド0.5 μg/mlを含むプレートに植菌し、スクリーニングした。30℃にて、2日培養した。発生したコロニーを365 nmの紫外光下で蛍光発光させることで、PHAsを生産するハロモナス・エスピー KM-1株を選抜した（次の文献の定性的なPHB生産分析手法による。）。なお、この方法では定性的に数％以上PHAsを含む菌株を選抜できる。
Patricia Spiekermann; Bernd H. A. Rehm; Rainer Kalscheuer; Dirk Baumeister; A. Steinbuchel: “A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds” Archives of Microbiology 1999; 171(2), 73-80
＜PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の16SリボゾームRNA配列分析結果＞
選抜したPHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の16SリボゾームRNAを、PCR法により増幅し精製し、これをテンプレートとして、その配列を解析した。配列は配列表の配列番号１に記載しており、1535 bpである。
選抜したPHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の16SリボゾームRNAを、PCR法により増幅し精製し、これをテンプレートとして、その配列を解析した。配列は配列表の配列番号１に記載しており、1535 bpである。
＜PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株のプレ培養＞
プレート培養より、16.5 mm径の試験管に5 ml上記の培地(それぞれの炭素源を1 w/v%を含む)を加え、37℃ で１晩振盪培養した。
プレート培養より、16.5 mm径の試験管に5 ml上記の培地(それぞれの炭素源を1 w/v%を含む)を加え、37℃ で１晩振盪培養した。
＜PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の培養、サンプルの回収など＞
プレ培養した菌体0.1 mlを、100 ml容の三角フラスコに入れた液体培地30 mlに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、30℃で振盪培養し、12時間後より、およそ12時間おきに培養液を1 ml回収して、OD600、乾燥菌体重量、及びPHAs含有量を測定した。培養液は、再度シリコセンをし、30℃で振盪培養を継続し、培養した。
プレ培養した菌体0.1 mlを、100 ml容の三角フラスコに入れた液体培地30 mlに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、30℃で振盪培養し、12時間後より、およそ12時間おきに培養液を1 ml回収して、OD600、乾燥菌体重量、及びPHAs含有量を測定した。培養液は、再度シリコセンをし、30℃で振盪培養を継続し、培養した。
図１、２、３、４に、菌体濁度OD600、乾燥菌体重量あたりのPHAsの割合、乾燥菌体重量あたりのPHBの割合、n-プロパノール又はプロピオン酸を基質としたときの乾燥菌体重量あたりのヒドロキシブチレート及びヒドロキシバレレートの割合を、それぞれ培養時間に対して相対化してプロットした。
図２の乾燥菌体重量あたりのPHAsの割合の値(%)を以下の表に示す。
図２の乾燥菌体重量あたりのPHAsの割合の値(%)を以下の表に示す。
図1より、スクロース、グルコース及び酢酸ナトリウムは、50時間程度、エタノール及びグリセロールは、60から70時間程度、n-プロパノール、プロピオン酸及び可溶性デンプンは、100時間以降にもっともOD600、菌体密度の高い時期がある。
図２より、菌体密度の上昇に伴い、これに10時間程度遅れてPHAs量が増大する。乾燥菌体あたりのPHAs量は、最大に達したあとで減少に転じる。
図３は、PHBのみの乾燥菌体あたりの量を示したもので、n-プロパノール及びプロピオン酸以外は図２のPHAsのグラフと同じである。
図４は、n-プロパノール又はプロピオン酸を基質とした場合のヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートの蓄積量を示したもので蓄積初期は若干ヒドロキシバレレートの割合が多い。この結果、生育時期により異なった性質のコポリマーを作製できることが示された。
＜PHAs蓄積率測定＞
菌体内に蓄積されたPHAsの蓄積量を測定するため、次の文献の手法を用い以下の実験を行った。
Fanny Monteil-Riveraa; Aimesther Betancourta; Huu Van Trab; Abdessalem Yezzaa; Jalal Hawaria: “Use of headspace solid-phase microextraction for the quantification of poly(3-hydroxybutyrate) in microbial cells” Journal of Chromatography A 2007;1154(1-2):34-41
菌体内に蓄積されたPHAsの蓄積量を測定するため、次の文献の手法を用い以下の実験を行った。
Fanny Monteil-Riveraa; Aimesther Betancourta; Huu Van Trab; Abdessalem Yezzaa; Jalal Hawaria: “Use of headspace solid-phase microextraction for the quantification of poly(3-hydroxybutyrate) in microbial cells” Journal of Chromatography A 2007;1154(1-2):34-41
上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体1〜3 mgに、3vol% H2SO4を含むメタノール0.2 mlを加え105℃で2時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム0.2 ml、蒸留水0.1 mlを加え、激しく攪拌した。1分間遠心分離したのち、クロロホルム層を2 μl分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、PHAsを分析した。ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレートを含む標品を乾燥菌体と同様に処理、分析し、これを基準として乾燥菌体あたりのPHAs蓄積率(PHAs(g)/乾燥菌体重量(g)) を求めた。
＜PHAsの平均分子量＞
前記ハロモナス・エスピー KM-1株の菌体内に蓄積されたPHAsの平均分子量を測定するため、以下の実験を行った。
前記ハロモナス・エスピー KM-1株の菌体内に蓄積されたPHAsの平均分子量を測定するため、以下の実験を行った。
グリセリン1w/v%含む培養液を用いて培養した培養液を遠心分離し、上清を除き、蒸留水にて懸濁、再度遠心分離し、上清を除き、菌体のみとし、乾燥させた。この乾燥菌体5 mgに、クロロホルム0.5 mLを加え、70℃で2時間加熱し、PHAsを溶解した。遠心分離後、上澄みを濾過後、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（以下、GPCと称する）を用いて、平均分子量を測定した。
菌体内に蓄積されたPHAsの分子量は、乾燥菌体重量あたりPHB含量50.0%を含むサンプルについて、MN 40万、MW 56万を示し、菌体内に蓄積されたPHBの平均分子量は、4〜5.6×105程度であることが判明した。
従って、菌体の増殖開始から所望量のPHAs蓄積に至るまで連続して行っても、高分子のPHAsを得ることができると認められた。
実施例２
＜ハロモナス・エスピー KM-1株の異なるpH環境下での培養＞
好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株をグリセロール3 w/v%の炭素源で、異なるpH環境下で培養したときに蓄積されたPHBの割合（PHAs/乾燥菌体）を測定した。緩衝成分であるSOT-A: （NaHCO3 1.68 g(0.2M)、K2HPO4 50 mg/50 ml）2倍濃度水溶液に対し、SOT-A’: （Na2CO3 2.12 g、K2HPO4 50 mg/50 ml）2倍濃度水溶液を加え、pH10、およびpH10.5の溶液を、pHメータで調整して作成し、これを同量のSOT-B 2倍濃度液と混合してそれぞれの培地とした。図５にそれぞれのPHBの割合を培養時間に対して相対化してプロットした。
＜ハロモナス・エスピー KM-1株の異なるpH環境下での培養＞
好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株をグリセロール3 w/v%の炭素源で、異なるpH環境下で培養したときに蓄積されたPHBの割合（PHAs/乾燥菌体）を測定した。緩衝成分であるSOT-A: （NaHCO3 1.68 g(0.2M)、K2HPO4 50 mg/50 ml）2倍濃度水溶液に対し、SOT-A’: （Na2CO3 2.12 g、K2HPO4 50 mg/50 ml）2倍濃度水溶液を加え、pH10、およびpH10.5の溶液を、pHメータで調整して作成し、これを同量のSOT-B 2倍濃度液と混合してそれぞれの培地とした。図５にそれぞれのPHBの割合を培養時間に対して相対化してプロットした。
ハロモナス・エスピーKM-1株は、通常の培養条件のpH8.9のみならず、pH10及び10.5においても、pH8.9以上の菌体内でのPHAs蓄積速度を示し、また3 w/v%のグリセロールを資化できることが示された。
実施例３
有機炭素源として有望なバイオディーゼルに副製する廃グリセロールの代表的な組成は以下の通りである。
有機炭素源として有望なバイオディーゼルに副製する廃グリセロールの代表的な組成は以下の通りである。
一般的なバイオディーゼル製造装置では、アルカリ触媒はメタノールへの溶解度が高いKOHが用いられる。
実際の廃グリセロ-ルとして、京都市廃食油燃料化施設より、2008年5月1日に廃グリセロールサンプルをいただき、培養に用いた。
上記と同様に、このサンプルのpHを測定すると、pH10.38であった。
そこで、前記使用培地組成から、緩衝成分であるNaHCO3 16.8 g/lを除いた培地を作成し、これにそれぞれ、廃グリセロールを加えてハロモナス・エスピー KM-1株を培養した。コントロールとして、NaHCO3 を含む培地に精製グリセロール5重量%を含むものも加えた。培養方法等は上記方法と同じある。
結果を、図６に示した。廃グリセロール1-20重量％まで含む培地で生育することが分かり、廃グリセロール5重量％の場合には、精製グリセロールより良い生育を示した。
実施例４
培地組成として、緩衝成分であるNaHCO3 とNa2CO3は終濃度0.2Mとして以下の配合で調製し、他の成分はSOT改と同じとした培地を作成し、1重量%の廃グリセロールを加えた場合のハロモナス・エスピー KM-1株の生育を見た。培養方法等は上記方法と同じである。
培地組成として、緩衝成分であるNaHCO3 とNa2CO3は終濃度0.2Mとして以下の配合で調製し、他の成分はSOT改と同じとした培地を作成し、1重量%の廃グリセロールを加えた場合のハロモナス・エスピー KM-1株の生育を見た。培養方法等は上記方法と同じである。
実施例５
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、廃グリセロールの濃度を、3重量%、5重量%、又は10重量%、本培養の温度を30℃と37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、廃グリセロールの濃度を、3重量%、5重量%、又は10重量%、本培養の温度を30℃と37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。
結果を、図８、９に示した。生育は37℃の方が、30℃よりいいが、PHBの蓄積量についてはさほど変わらず。いずれも廃グリセロール3%の時に、培養時間33時間で、約2.5 mg/mlのPHBの蓄積を認めた。
実施例６
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、グルコースとキシロース濃度を、合わせた濃度が2 w/v%、本培養の温度を37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、グルコースとキシロース濃度を、合わせた濃度が2 w/v%、本培養の温度を37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。
結果を、図１０、１１に示した。生育はグルコースとキシロースを混合した方が良く、また、PHBの蓄積量については、グルコースと、グルコースとキシロースを混合したものはさほど変わらなかった。培養液に対して最大約2.8 mg/mlのPHBの蓄積を認めた
本発明の好塩菌によるPHAsの産生方法は、工業的なPHAsの産生に利用できる。
Claims (6)
- ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)（PHAs）産生方法であって、好塩菌はハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株（FERM BP-10995）であり、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアル
カリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法。 - 前記無機塩の濃度が0.2〜1.0Mである、請求項１に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)
（PHB）を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記有機炭素源がグリセロールを含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
- ハロモナス・エスピー KM-1株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009534385A JP5164182B2 (ja) | 2007-09-26 | 2008-09-25 | 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）産生方法及び好塩菌 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007248651 | 2007-09-26 | ||
| JP2007248651 | 2007-09-26 | ||
| PCT/JP2008/067340 WO2009041531A1 (ja) | 2007-09-26 | 2008-09-25 | 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（PHAs）産生方法及び好塩菌 |
| JP2009534385A JP5164182B2 (ja) | 2007-09-26 | 2008-09-25 | 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）産生方法及び好塩菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2009041531A1 JPWO2009041531A1 (ja) | 2011-01-27 |
| JP5164182B2 true JP5164182B2 (ja) | 2013-03-13 |
Family
ID=40511413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009534385A Active JP5164182B2 (ja) | 2007-09-26 | 2008-09-25 | 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）産生方法及び好塩菌 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8372611B2 (ja) |
| EP (1) | EP2202316B1 (ja) |
| JP (1) | JP5164182B2 (ja) |
| WO (1) | WO2009041531A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5229904B2 (ja) * | 2009-05-27 | 2013-07-03 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 好塩菌による乳酸及び／又は酢酸の産生方法 |
| KR101054039B1 (ko) | 2009-05-28 | 2011-08-04 | 아주대학교산학협력단 | Ｈａｌｏｍｏｎａｓ 속으로부터 9Ｚ 헥사데센노이드산의 생산방법 |
| JP5299969B2 (ja) * | 2009-09-03 | 2013-09-25 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 好塩菌による木材糖化液を用いたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）等の産生方法 |
| EP2576213A4 (en) * | 2010-05-24 | 2016-07-13 | Xyleco Inc | BIOMASS TREATMENT |
| US10807893B2 (en) | 2011-08-09 | 2020-10-20 | Hsinying Liu | Polyhydroxyalkanoate production during wastewater treatment |
| US9150445B2 (en) | 2011-08-09 | 2015-10-06 | Hsin-Ying Liu | Polyhydroxyalkanoate production during wastewater treatment |
| JP5892507B2 (ja) | 2011-10-07 | 2016-03-23 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | ３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生方法。 |
| JP6057046B2 (ja) * | 2012-01-06 | 2017-01-11 | 日環科学株式会社 | 土壌・水質汚染の改善、温暖化ガス発生抑制、並びに植物の機能性を向上させる微生物資材の製造方法 |
| EP3070172A4 (en) * | 2013-11-12 | 2017-07-05 | National Institute Of Advanced Industrial Science | Method for manufacturing 3-hydroxybutyric acid using halomonas sp. |
| EP3137593B1 (fr) | 2014-05-02 | 2020-12-16 | Institut De Recherche Pour Le Développement I.R.D. | Nouvelle souche hyperhalophile et son utilisation pour la degradation des substrats carbones |
| WO2016081902A1 (en) | 2014-11-20 | 2016-05-26 | Full Cycle Bioplastics Inc. | Producing polyhydroxyalkanoate copolymers from organic waste products |
| JP6780152B2 (ja) * | 2018-09-27 | 2020-11-04 | 住友林業株式会社 | 好塩菌が産生するｐｈａ共重合体の分子量制御技術 |
| CN109456922B (zh) * | 2018-11-30 | 2021-09-10 | 江苏大学 | 一株提高鱼酱发酵品质的中度嗜盐菌菌株花津滩芽孢杆菌 |
| CN114686391B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-07-04 | 中国石油化工股份有限公司 | 一株高耐盐菌及其应用 |
| CN115044624B (zh) * | 2022-06-22 | 2023-05-09 | 珠海麦得发生物科技股份有限公司 | 一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法 |
| CN115651874B (zh) * | 2022-11-21 | 2023-04-28 | 清华大学 | 一种培养嗜盐微生物的培养基和培养方法 |
| CN117551585A (zh) * | 2023-11-29 | 2024-02-13 | 华南理工大学 | 一株盐单胞菌、重组盐单胞菌及其构建方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07303490A (ja) * | 1994-05-13 | 1995-11-21 | Repsol Quimica Sa | ポリヒドロキシアルカノエートの抽出方法 |
-
2008
- 2008-09-25 JP JP2009534385A patent/JP5164182B2/ja active Active
- 2008-09-25 EP EP08832989.1A patent/EP2202316B1/en active Active
- 2008-09-25 WO PCT/JP2008/067340 patent/WO2009041531A1/ja active Application Filing
- 2008-09-25 US US12/674,102 patent/US8372611B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07303490A (ja) * | 1994-05-13 | 1995-11-21 | Repsol Quimica Sa | ポリヒドロキシアルカノエートの抽出方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6008055212; Ｒｏｍａｎｏ Ｉ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌａ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａ ｎｏｖｅｌ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｓａｌｔ ｐｏｏ' Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．５２, 2006, ｐ．３３９-３４８ * |
| JPN6008055214; Ｑｕｉｌｌａｇｕａｍａｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｐｏｌｙ（beta-ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｈａｌｏｐｈｉｌｅ， Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ ＬＣ１．' Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３８, 2006, ｐ．１４８-１５４ * |
| JPN6008055216; Ｑｕｉｌｌａｇｕａｍａｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ： ｈａｌｏｐｈｉｌｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｓ ａｎ ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｓｏｕｒｃｅ．' Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ Ｌｉｆｅ ｉｎ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｈａｂｉｔａｔｓ ａｎｄ Ａｓｔｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．９, 2005, ｐ．３５７-３６７ * |
| JPN6008055218; Ｌｉｌｌｏ Ｊ． ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ-Ｖａｌｅｒａ Ｆ．: 'Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｐｏｌｙ（beta-ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ．' Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．５６, 1990, ｐ．２５１７-２５２１ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2202316B1 (en) | 2013-09-11 |
| US8372611B2 (en) | 2013-02-12 |
| WO2009041531A1 (ja) | 2009-04-02 |
| US20110104767A1 (en) | 2011-05-05 |
| EP2202316A4 (en) | 2012-07-11 |
| EP2202316A1 (en) | 2010-06-30 |
| JPWO2009041531A1 (ja) | 2011-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5164182B2 (ja) | 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）産生方法及び好塩菌 | |
| Song et al. | Polyhydroxyalkanoate (PHA) production using waste vegetable oil by Pseudomonas sp. strain DR2 | |
| JP5892507B2 (ja) | ３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生方法。 | |
| Możejko et al. | Saponified waste palm oil as an attractive renewable resource for mcl-polyhydroxyalkanoate synthesis | |
| CN102325883B (zh) | 微生物的培养方法及利用微生物制造物质的方法 | |
| US9725745B2 (en) | Process for biodiesel production from a yeast strain | |
| CN102575272B (zh) | 使用有产油能力的微生物生产脂肪酸烷基酯的方法 | |
| CN111593006B (zh) | 一株自凝絮嗜盐菌及其应用 | |
| CN101300354A (zh) | 具有改良的聚羟基链烷酸产生能力的去调节的细菌 | |
| Yasin et al. | Study of the fermentation conditions of the Bacillus Cereus Strain ARY73 to produce polyhydroxyalkanoate (PHA) from glucose | |
| JP2024023240A (ja) | アルギン酸を炭素源とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 | |
| JP2011083204A (ja) | 好塩菌による高効率なポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）等の産生方法 | |
| JP2017012117A (ja) | ３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の好気的生産方法 | |
| JP5229904B2 (ja) | 好塩菌による乳酸及び／又は酢酸の産生方法 | |
| JPWO2014042076A1 (ja) | 改質油脂組成物を用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 | |
| KR20220095143A (ko) | 폴리하이드록시부티레이트 생산능을 갖는 변이주 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트 생산방법 | |
| CN101899468A (zh) | 一种改变大肠杆菌脂肪酸组成的方法 | |
| Ahn et al. | Niabella terrae sp. nov. isolated from greenhouse soil | |
| EP0526850A2 (en) | Copolymer and method for production thereof | |
| JP5555975B2 (ja) | ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 | |
| JP7498460B2 (ja) | 海藻を原料とする生分解性プラスチックの製造方法 | |
| El-Nahrawy et al. | Production of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) by Azotobacter sp. isolated from different sources | |
| JP2012170385A (ja) | α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の産生方法。 | |
| JP4931009B2 (ja) | ポリヒドロキシブチレート（ｐｈｂ）の産生方法 | |
| CN104694438A (zh) | 一种产表面活性剂细菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121030 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121116 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121211 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121213 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151228 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5164182 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |