JP5164182B2 - 好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)産生方法及び好塩菌 - Google Patents
好塩菌によるポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)産生方法及び好塩菌 Download PDFInfo
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Quillaguaman J.; Munoz M.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: "Optimizing conditions for poly(beta-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis LC1 in batch culture with sucrose as carbon source." Appl Microbiol Biotechnol 2007 ; 74 ( 5 ) : 981-986 Quillaguaman J.; Hashim S.; Bento F.; Mattiasson B.; Hatti-Kaul R.: "Poly(beta-hydroxybutyrate) production by a moderate halophile, Halomonas boliviensis LC1 using starch hydrolysate as substrate." J Appl Microbiol 2005 ; 99 ( 1 ) : 151-157
項1.ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)産生方法であって、好塩菌は無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができ、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法。
項2.前記無機塩の濃度が0.2〜1.0 Mである、項1に記載の方法。
項3.前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)(PHB)を含む、項1又は2に記載の方法。
項4.前記有機炭素源がグリセロールを含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートを含む、項1又は2に記載の方法。
項5.前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも1種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーを含む、項1又は2に記載の方法。
項6.前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株(FERM BP-10995)である、項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
項7.無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌。
項8.ハロモナス・エスピー KM-1株である、項7に記載の好塩菌。
本発明は、無機塩と単一の有機炭素源からなるpH8.8〜11の培地で増殖並びに乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生することができる、ハロモナス属に属する好塩菌を提供する。
(a)培地
本発明における、好塩菌の培養は、無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源、好ましくは、無機塩と単一の有機炭素源を含むアルカリ条件の培地で行う。
本発明の好塩菌を培養する方法としては、PHAsが生産される方法であれば特に制限されないが、培養の例を以下に挙げる。
本発明により生産されるPHAsは、ヒドロキシアルカノエート単位からなるポリマーであり、ヒドロキシアルカノエートは、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート等がある。また、PHAsは、すべて同じヒドロキシブチレートから構成されるホモポリマーであることが多い。n-プロパノール、プロピオン酸又はその塩を炭素源として培養することで、ヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートからなるPHAsコポリマーを産生できる。この場合、ヒドロキシバレレートの含有量は0.5〜13%、好ましくは5〜13%である。
国立環境研究所のSOT培地に炭素源を加えて使用した。
(培地名)SOT改(Spirulina platensisMedium改)
(培地組成)
NaHCO31.68 g K2HPO450 mg
NaNO3 250 mg K2SO4 100 mg
NaCl 100 mg MgSO4・7H2O 20 mg
CaCl2・2H2O 4 mg FeSO4・7H2O 1 mg
Na2 EDTA 8 mg A5+Co 溶液 0.1 ml
例 (酢酸ナトリウム 1.0g 炭素源として)
蒸留水に溶解し、100mlとする。
A5+Co 溶液改
H3BO3 286 mg MnSO4 ・7H2O 250 mg
ZnSO4・7H2O 22.2 mg CuSO4 ・5H2O 7.9 mg
Na2MoO4・2H2O 2.1 mg Co(NO3)6H2O 4.398mg
蒸留水 100 ml
滅菌の際には、上記培地組成を2種類に分け
SOT-A: (NaHCO3 1.68 g K2HPO450 mg/50 ml)2倍濃度水溶液
SOT-B: (上記以外/50 ml) 2倍濃度水溶液
(プレート培養の場合 SOT-Bに終濃度1.5 w/v%のアガーを加える。)
を別々にオートクレーブ滅菌し、50度以下に冷却した後混合する。培地調整後のpHは、液体培養、プレート培養ともに、8.9±0.1となる。
各種の単一の炭素源とナイルレッド0.5 μg/mlを含むプレートに植菌し、スクリーニングした。30℃にて、2日培養した。発生したコロニーを365 nmの紫外光下で蛍光発光させることで、PHAsを生産するハロモナス・エスピー KM-1株を選抜した(次の文献の定性的なPHB生産分析手法による。)。なお、この方法では定性的に数%以上PHAsを含む菌株を選抜できる。
Patricia Spiekermann; Bernd H. A. Rehm; Rainer Kalscheuer; Dirk Baumeister; A. Steinbuchel: “A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds” Archives of Microbiology 1999; 171(2), 73-80
選抜したPHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の16SリボゾームRNAを、PCR法により増幅し精製し、これをテンプレートとして、その配列を解析した。配列は配列表の配列番号1に記載しており、1535 bpである。
プレート培養より、16.5 mm径の試験管に5 ml上記の培地(それぞれの炭素源を1 w/v%を含む)を加え、37℃ で1晩振盪培養した。
プレ培養した菌体0.1 mlを、100 ml容の三角フラスコに入れた液体培地30 mlに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、30℃で振盪培養し、12時間後より、およそ12時間おきに培養液を1 ml回収して、OD600、乾燥菌体重量、及びPHAs含有量を測定した。培養液は、再度シリコセンをし、30℃で振盪培養を継続し、培養した。
図2の乾燥菌体重量あたりのPHAsの割合の値(%)を以下の表に示す。
菌体内に蓄積されたPHAsの蓄積量を測定するため、次の文献の手法を用い以下の実験を行った。
Fanny Monteil-Riveraa; Aimesther Betancourta; Huu Van Trab; Abdessalem Yezzaa; Jalal Hawaria: “Use of headspace solid-phase microextraction for the quantification of poly(3-hydroxybutyrate) in microbial cells” Journal of Chromatography A 2007;1154(1-2):34-41
前記ハロモナス・エスピー KM-1株の菌体内に蓄積されたPHAsの平均分子量を測定するため、以下の実験を行った。
<ハロモナス・エスピー KM-1株の異なるpH環境下での培養>
好塩菌ハロモナス・エスピー KM-1株をグリセロール3 w/v%の炭素源で、異なるpH環境下で培養したときに蓄積されたPHBの割合(PHAs/乾燥菌体)を測定した。緩衝成分であるSOT-A: (NaHCO3 1.68 g(0.2M)、K2HPO4 50 mg/50 ml)2倍濃度水溶液に対し、SOT-A’: (Na2CO3 2.12 g、K2HPO4 50 mg/50 ml)2倍濃度水溶液を加え、pH10、およびpH10.5の溶液を、pHメータで調整して作成し、これを同量のSOT-B 2倍濃度液と混合してそれぞれの培地とした。図5にそれぞれのPHBの割合を培養時間に対して相対化してプロットした。
有機炭素源として有望なバイオディーゼルに副製する廃グリセロールの代表的な組成は以下の通りである。
培地組成として、緩衝成分であるNaHCO3 とNa2CO3は終濃度0.2Mとして以下の配合で調製し、他の成分はSOT改と同じとした培地を作成し、1重量%の廃グリセロールを加えた場合のハロモナス・エスピー KM-1株の生育を見た。培養方法等は上記方法と同じである。
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、廃グリセロールの濃度を、3重量%、5重量%、又は10重量%、本培養の温度を30℃と37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。
培地組成として、上記SOT改2 (pH9.40)を用い、グルコースとキシロース濃度を、合わせた濃度が2 w/v%、本培養の温度を37℃でハロモナス・エスピー KM-1株を培養し、生育およびPHBの蓄積量を見た。
Claims (6)
- ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)産生方法であって、好塩菌はハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株(FERM BP-10995)であり、好塩菌を無機塩と単一もしくは複数の有機炭素源を含むアル
カリ条件の培地で培養し、乾燥菌体重量に対して20重量%以上のPHAsを産生するPHAs産生方法。 - 前記無機塩の濃度が0.2〜1.0Mである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)
(PHB)を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記有機炭素源がグリセロールを含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレートを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも1種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーを含む、請求項1に記載の方法。
- ハロモナス・エスピー KM-1株。
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