JP5299969B2 - 好塩菌による木材糖化液を用いたポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)等の産生方法 - Google Patents
好塩菌による木材糖化液を用いたポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)等の産生方法 Download PDFInfo
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リウムを含む培地で良好に生育する好塩菌を分離、同定し、各種の炭素源を用いて菌体を培養し、PHAsの生産量を調べたところ著量のPHAsの蓄積を行うことが認めた。
ノース)、二糖(スクロース)、糖アルコール(マンニトール、ソルビトール)、酢酸、酢酸
ナトリウム、エタノール、グリセロール、可溶性デンプン、n-プロパノール、プロピオン酸等であったことを上記の特許文献1、2にて開示している。
ス代謝抑制が認められないデータが特許文献1、2の中に示されている。
が、ヘミセルロースからは酢酸が、リグニンからはPhenol類が形成され、それぞれ多くの微生物に対して生育阻害や発酵阻害することが知られている。(例えば、非特許文献4、5参照)
一方、特殊なコリネバクテリウムでは、上記のFuran類やPhenol類と共存してもエタノ
ール発酵を阻害しないことが知られていた。(例えば、非特許文献6参照)しかしながら、成長の促進効果は知られていなかった。
問題となっており、木材糖化液の有効活用はされていなかった。
ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)製造方法であって、好塩菌を無機塩、木材糖化液、および単一もしくは
複数の有機炭素源を含むpH8.8〜11の培地で培養することを特徴とするPHAs製造方法。
前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)(PHB)である、項1に記載の方法。
前記有機炭素源がn-プロパノール、プロピオン酸及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも1種を含み、前記ポリヒドロキシアルカノエートがヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレート(polyhydroxyvalerate)(PHV)のコポリマーである、項1に記載の方法。
前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株(FERM BP-10995)である、項1〜3のいずれかに記載の方法。
む)を利用して、PHAs等の生産を行うことが可能である。
本発明の方法は、無機塩と木材糖化液を単独もしくは他の炭素源に追加した初期pH8.8
〜11の培地を用いて、ハロモナス属に属する好塩菌を培養することで実施することができる。該ハロモナス属に属する好塩菌は、前記培地中で乾燥菌体重量に対して、好ましくは50重量%以上のPHAsを産生することができる。
ができるものであれば特に限定されない。最も好ましいハロモナス属の好塩菌はハロモナス・エスピー(Halomonassp.) KM-1株である。当該ハロモナス・エスピー KM-1株は、無機塩と単一の有機炭素源からなり、pHが8.8以上、好ましくは8.8〜11の培地で培養でき、当該培地中で乾燥菌体重量に対して50重量%以上のPHAsを産生することを特徴とする。
総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に受託番号FERM P-21316として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はFERM BP-10995である。
アなどが挙げられる。
よるPHAs産生方法を適用できる。
(a)培地
本発明における、好塩菌の培養は、無機塩と木材糖化液を単独もしくは複数の他の炭素源に追加した初期pH8.8〜11の培地で行うことができる。
あってもよく、これらの無機塩は、菌体における窒素源やリン源となるものが含まれる。当該無機塩の濃度は、総量で0.2〜2.5M、好ましくは0.2〜1.0M、より好ましくは0.2〜0.5
M程度である。
トール)、酢酸、酢酸ナトリウム、エタノール、グリセロール、可溶性デンプン、n-プロ
パノール、プロピオン酸等が挙げられ、好ましくは、酢酸ナトリウム、エタノール、n-プロパノール、プロピオン酸、グルコース、キシロース、グリセロール、スクロースである。より好ましくは、グルコースである。
ーカリ、ポプラ、ナラ、ブナなどがあり、好ましくはユーカリ、ナラである。具体的な針葉樹の例としては、スギ、ヒノキ、カラマツ、ダグラスファー(米松)などがあり、好ましくはカラマツ、ダグラスファーである。
本発明にて木材糖化液の原料として用いる至適木材の主要構成成分はセルロースであるが、結晶構造を持つ強固な構造の物質であり、同じグルコースのポリマーであるデンプンなどと比較して分解が難しい。
渣中または廃液中にエタノールなどのアルコール成分が含まれていても、本発明を実施するにあたって問題となることはない。
らの酢酸、リグニンからはPhenol類が夾雑物として含まれていてもよい。当該培地のpHは、5以上、菌種により好ましくは8.8以上、特に8.8〜11であればよい。
本発明の好塩菌を培養する方法としては、PHAsが生産される方法であれば特に制限されないが、培養の例を以下に挙げる。
に植菌し、30〜37℃程度、攪拌速度120〜180rpmで1晩振盪前培養される。
し本培養する。本培養は20〜45℃で可能であるが、好ましくは30〜37℃で行う。
本発明で産生されるPHAsの含有量は乾燥菌体に対し50重量%以上である。
より好ましくは50〜75%である。最も好ましくは60〜75%である。
この培地は、下記の表1に示す組成に従い、作成した。本実施例においては、SOT3改培地に、1.0gの酢酸ナトリウム・3水和物を加えた。下記の培地調整後のpHは、9.4±0.1とな
る。
米松(ダクラスファー、針葉樹)、ユーカリ(広葉樹)の木材チップをボールミルによる微粉砕処理(2時間)を行い、処理物に乾燥重量1g当たり20 FPU のアクレモニウムセルラー
ゼ(明治製菓)を加え、pH 5.0 の50 mM 酢酸バッファー中で、45℃で48時間反応させて、
酵素糖化を行った。
糖化産物の組成は以下の表2の通りである。
菌体内に蓄積されたPHAsの蓄積量を測定するため、非特許文献7に記載の手法を用い以下の実験を行った。
間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム0.2 ml、蒸留水0.1 mlを加え、激しく攪拌した。1分間遠心分離したのち、クロロホルム層を2 μl分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、PHAsを分析した。ヒドロキシブチレートの標品を乾燥菌体と同様に処理、分析し、これを基準として乾燥菌体あたりのPHAs蓄積率(PHAs(g)/乾燥菌体重量(g))を求めた。
<PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株のプレ培養>
プレート培養より、16.5 mm径の試験管に5mlの上記SOT3改培地(グルコース等の炭素源
を1 w/v%を含む)を加え、37℃で1晩振盪培養した。
<PHAs産生菌ハロモナス・エスピー KM-1株の培養、サンプルの回収など>
プレ培養した菌体0.1 mlを、100 ml容の三角フラスコに入れた上記SOT3改培地20 mlに
混合して植菌し、シリコセンをした。これを、30℃で振盪培養し、12時間後より、およそ12時間おきに培養液を1 ml回収して、OD600、乾燥菌体重量、及びPHB含有量を測定した。培養液は、再度シリコセンをし、30℃で振盪培養を継続し、培養した。
育した。
<木材糖化液を含む培地を用いたPHAsの生産>
SOT3改培地に、炭素源として一般的なグルコースと木材糖化物を加えて培養を行った。調整したサンプルは以下の表3の通りである。
積の割合も向上、促進されていることをしめしている。
さほど差はないが、特に米松糖化物を加えたについては、グルコース単独に比べ45時間での比較において20%以上PHB蓄積総量が多く、木材糖化液がPHBの蓄積を促進していること
を示している。
図4では、図1の条件で、グルコース8%、及び10%を生育させた場合を示している。いずれの場合のグルコース5%に比べ、8%、及び10%のものが、少し生育が悪いことが示されてい
る。
ずれの場合のグルコース5%に比べ、8%、及び10%のものが、少しPHB蓄積の割合が低くなっていることが示されている。
ずれの場合のグルコース5%に比べ、8%、及び10%のものが、少しPHB蓄積総量が低くなっていることが示されている。
一連の菌体増殖の中で行われるため、一段階の培養でのPHBの産生が可能であることも分
かる。
Claims (3)
- ハロモナス属に属する好塩菌を用いたポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)製造方法であって、好塩菌を無機塩、木材糖化液、および単一もしくは複
数の有機炭素源を含むpH8.8〜11の培地で培養する工程を含み、前記好塩菌がハロモナス
・エスピー(Halomonas sp.)KM-1株(FERM BP-10995)であり、前記ポリヒドロキシアルカノエートがポリヒドロキシブチレート(polyhydroxybutyrate)(PHB)であることを特徴とするPHAs製造方法。 - 木材糖化液が木材の酵素分解法により得られたものである、請求項1に記載の製造方法。
- 単一もしくは複数の有機炭素源がグルコース、キシロース、アラビノースからなる群から選ばれる、請求項1又は2に記載の製造方法。
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