KR20220095143A - 폴리하이드록시부티레이트 생산능을 갖는 변이주 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리하이드록시부티레이트 생산능을 갖는 변이주 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 균주는 종래 PHB를 생산하는 시아노박테리아 대비 성장성 및 PHB 생산성이 현저히 우수한바, PHB 생산 및 PHB를 이용한 다양한 제품 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 신규 균주는 별도의 유기 탄소원 없이 CO2만으로부터 PHB를 생산할 수 있어 산업 배가스를 이용한 PHB 생산 공정을 구축하기 위한 광합성 균주로도 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규 균주는 종래 PHB를 생산하는 시아노박테리아 대비 성장성 및 PHB 생산성이 현저히 우수한바, PHB 생산 및 PHB를 이용한 다양한 제품 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 신규 균주는 별도의 유기 탄소원 없이 CO2만으로부터 PHB를 생산할 수 있어 산업 배가스를 이용한 PHB 생산 공정을 구축하기 위한 광합성 균주로도 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 폴리하이드록시부티레이트 생산능을 갖는 변이주 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트 생산방법에 관한 것이다.
플라스틱을 포함한 석유화학 제품 산업은 전 세계적으로 CO2 배출량의 16%를 차지하며 이는 기후변화에 큰 영향을 미치고 있다. 석유기반 플라스틱의 낮은 분해성으로 인한 폐기물 매립, 해양생태계 위협, 미세플라스틱의 독성 등의 문제가 이슈화되면서 기존 플라스틱을 대체할 수 있는 지속가능하고 친환경적인 바이오플라스틱에 대한 연구가 활발해지고 있다. 바이오플라스틱의 다양한 재료 중 폴리하이드록시부티레이트 (Polyhydroxybutyrate; PHB)는 우수한 인장 강도와 같은 기계적 물성으로 인해 널리 사용되는 석유화학 유래의 고분자 폴리프로필렌 (PP)을 대체할 수 있는 생분해성 고분자로 각광받고 있다. 높은 결정도 및 내습성 모두 PP와 비슷하며 우수한 열가소성 가공성을 가지고 있어 실용성이 크다. 또한 PHB의 생체 적합성으로 인해 다른 석유 기반 플라스틱에 비해 잠재적인 적용 가능성이 크게 확대될 수 있다. 현재 PHB의 산업적 생산은 옥수수나 정제 설탕을 사용하는 미생물 발효에 주로 의존하여 생산 비용이 높고 식품 자원을 사용한다는 윤리적 문제를 안고 있다. 특히 경제적 관점에서 석유기반 플라스틱에 비해 PHB의 높은 생산 비용은 바이오플라스틱의 산업화에 있어 걸림돌이 되고 있다.
이를 극복하기 위한 대안으로서 광합성 생물을 이용하는 광독립배양(photoautotrophic)을 이용한 PHB 생산이 주목을 받고 있다(Chaogang et al., 2010, J. Phycol. 46 (2), 396-402). 이 전략은 CO2를 유일한 탄소원으로 사용하기 때문에 원료의 비용을 줄일 수 있을 뿐만이 아니라 CO2 저감에 기여할 수 있다. 또한, CO2를 산업용 배가스(industrial flue gas)와 같은 지속가능한 자원에서 얻게 된다면 추가적인 비용절감이 기대될 수 있다. 이를 실현하기 위한 다양한 광합성 생물 중 시아노박테리아는 형질전환된 식물보다 우수한 성장성, 광합성 효율 및 CO2 전환율을 가지고 있어 대부분의 광합성 PHB 생산 연구는 시아노박테리아에서 진행되어왔다.
그러나 지금까지 알려진 야생형 시아노박테리아는 광독립배양 조건하에 PHB 함량이 10% 미만으로, 생산성이 낮아 산업적 적용은 제한적이었으며 이를 극복하고자 PHB 생산성을 높이는 연구가 진행되어왔다. 예를 들어 대표적인 PHB 생산 균주인 Synechocystis sp . PCC 6803에서 대사공학을 통한 많은 연구가 있었으나 PHB 함량의 증가는 한계적이었다(Drosg et al., 2015, Chem. Biochem. Eng. Quarter. 29 (2), 145-156). 바이오매스 생산성이 최종 바이오산물 생산성에 영향을 끼치는 주요 매개 변수라는 점을 고려했을 때, 낮은 PHB 생산성의 주된 이유는 Synechocystis sp. PCC 6803과 같이 자연적으로 PHB를 합성하는 시아노박테리아 균주 자체의 낮은 바이오매스 생산성 때문이다.
관련하여 최근에는 종래 다른 시아노박테리아 균주를 압도하는 빠른 성장률을 가진 균주로 Synechococcus elongatus UTEX 2973(이하 Synechococcus 2973)이 보고된바 있으며, 상기 Synechococcus 2973은 광합성 속도와 CO2 흡수 속도가 2배 이상 빠른 것으로 보고되었다(Abernathy et al., 2017, Biotechnol. Biofuels 10 (1), 1-13).
전술한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 PHB 생산성이 우수한 균주를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, Synechococcus elongatus UTEX 2973 균주에 Cupriavidus necator H16에서 파생된 phaCAB 유전자를 도입한 신규 균주가 종래 균주 대비 PHB 생산성이 현저하게 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폴리하이드록시부티레이트 고생산능을 갖는 신규 시네코코커스 일롱게투스 (Synechococcus elongatus) 변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이주를 이용하여 폴리하이드록시부티레이트를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
β-ketothiolase를 코딩하는 유전자 phaA, acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자 phaB 및 PHB(polyhydroxybutytrate) synthase를 코딩하는 유전자 phaC를 포함하는 시네코코커스 일롱게투스 (Synechococcus elongatus) 균주를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 β-ketothiolase를 코딩하는 유전자 phaA는 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자 phaB는 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 PHB synthase를 코딩하는 유전자 phaC는 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 균주는 수탁번호 KCTC14421BP로 기탁된 Synechococcus 2973-phaCAB일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 폴리하이드록시부티레이트(polyhydroxybutytrate, PHB) 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 배양은 탄소원으로 이산화탄소 또는 배가스(flue gas)가 공급되는 광독립배양(photoautotrophic) 조건에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 이산화탄소의 농도는 4 ~ 6%(v/v)일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 배양은 10 ~ 600 μE m-2s-1의 광도에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 배양은 36 ~ 40℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 신규 균주는 종래 PHB를 생산하는 시아노박테리아 대비 성장성 및 PHB 생산성이 현저히 우수한바, PHB 생산 및 PHB를 이용한 다양한 제품 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 신규 균주는 별도의 유기 탄소원 없이 CO2만으로부터 PHB를 생산할 수 있어 산업용 배가스를 이용한 PHB 생산 공정을 구축하기 위한 광합성 균주로도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1의 A는 Synechococcus 2973 균주에 PHB 생산능력을 부여하기 위해 사용된 플라스미드 모식도로, Synechococcus 2973 염색체의 중성 부위 1(neutral site 1, NSI)로의 phaCAB의 도입을 나타낸다. PCR 검증에 사용되는 프라이머는 화살표로 표시된다. 도 1의 B는 complete segregation된 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB의 확인을 위한 PCR 분석 결과로서, 구체적으로는 상동 재조합(homologous recombination)을 통해 염섹체의 Neutral Site I 부분에 PHB 경로가 삽입되었는지 확인하기 위한 야생형 Synechococcus 2973과 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB의 PCR 분석 결과를 나타낸다. 야생형에 대한 각 PCR 산물의 타겟 사이즈는 NSI(1.0kb) 및 phaCAB(밴드 없음)이고, 변이주에 대한 각 PCR 산물의 타겟 사이즈는 NSI(7.7kb) 및 phaCAB(4.0kb)이다. Elpis-biotech (Korea)의 1kb DNA ladder을 마커로 사용하였다.
도 2는 야생형 Synechococcus 2973과 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB의 탄소 저장소의 비율을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 시간은 IPTG 유도 이후 시간을 나타낸다.
도 3은 완전 배지에서 Synechococcus 2973-phaCAB 및 Synechocystis 6803과 질소 결핍 배지에서 Synechocystis 6803의 바이오매스 축적(Biomass accumulation)(A) 및 PHB 축적(PHB accumulation)(B)을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 시간은 IPTG 첨가 또는 질소 결핍 배지로 변경한 후의 일수(day)를 나타낸다.
도 4는 Synechococcus 2973-phaCAB 및 Synechocystis 6803에서 PHB 합성에 관여하는 유전자의 상대적 전사 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 4의 A는 IPTG 유도 이후 Synechococcus 2973-phaCAB에서 phaA, phaB 및 phaC 유전자의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 발현 수준은 레퍼런스 유전자 16S rRNA에 대해 정규화하고 배수 변화를 IPTG 유도 전의 발현 수준과 비교하였다. 도 4의 B는 질소 결핍 배지로 옮긴 이후 Synechocystis 6803에서 phaA, phaB, phaC 및 phaE 유전자의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 발현 수준은 레퍼런스 유전자 rnpB에 대해 정규화하고 배수 변화를 질소 결핍 전의 발현 수준과 비교하였다.
도 5는 대규모 광생물 반응기에서의 배양을 통한 PHB 생산을 나타내는 것으로, 도 5의 A는 5% CO2 (v/v)를 사용한 실내 배양 및 유일한 탄소원으로 산업용 배가스를 사용한 실외 배양 중 Synechococcus 2973-phaCAB의 바이오매스 축적 및 PHB 축적을 나타낸다. 도 5의 B는 실내 배양에 사용되는 광생물 반응기의 이미지를 나타내고, 도 5의 C는 광생물 반응기, 실외배양을 위한 산업용 배가스 source 및 조성을 나타낸 개략도이다.
도 6은 Synechococcus 2973-phaCAB에서 PHB 합성 확인을 위한 GC-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 PHB 합성의 시각적 확인을 위한, 야생형 Synechococcus 2973(A)과 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB(B)의 TEM 이미지를 나타낸 것이다. 빨간색 화살표는 세포 내 PHB 그래뉼(granule)의 예를 나타낸 것이다.
도 8은 다양한 유도 조건(1 mM IPTG, 1mM IPTG 및 질소 결핍(N deprivation), 질소 결핍(N deprivation)에서 Synechococcus 2973-phaCAB의 PHB 축적을 나타낸 것이다. 질소 결핍 시의 성장 억제를 방지하기 위해, 세포는 후기 지수기(late exponential phase)(배양 후 4일)에 질소 결핍 배지에 노출되었다. PHB 생산에 대한 IPTG 및 질소 결핍의 영향을 비교하기 위해 IPTG의 첨가도 동시에 수행하였다.
도 2는 야생형 Synechococcus 2973과 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB의 탄소 저장소의 비율을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 시간은 IPTG 유도 이후 시간을 나타낸다.
도 3은 완전 배지에서 Synechococcus 2973-phaCAB 및 Synechocystis 6803과 질소 결핍 배지에서 Synechocystis 6803의 바이오매스 축적(Biomass accumulation)(A) 및 PHB 축적(PHB accumulation)(B)을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 시간은 IPTG 첨가 또는 질소 결핍 배지로 변경한 후의 일수(day)를 나타낸다.
도 4는 Synechococcus 2973-phaCAB 및 Synechocystis 6803에서 PHB 합성에 관여하는 유전자의 상대적 전사 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 4의 A는 IPTG 유도 이후 Synechococcus 2973-phaCAB에서 phaA, phaB 및 phaC 유전자의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 발현 수준은 레퍼런스 유전자 16S rRNA에 대해 정규화하고 배수 변화를 IPTG 유도 전의 발현 수준과 비교하였다. 도 4의 B는 질소 결핍 배지로 옮긴 이후 Synechocystis 6803에서 phaA, phaB, phaC 및 phaE 유전자의 상대적 발현 수준을 나타낸다. 발현 수준은 레퍼런스 유전자 rnpB에 대해 정규화하고 배수 변화를 질소 결핍 전의 발현 수준과 비교하였다.
도 5는 대규모 광생물 반응기에서의 배양을 통한 PHB 생산을 나타내는 것으로, 도 5의 A는 5% CO2 (v/v)를 사용한 실내 배양 및 유일한 탄소원으로 산업용 배가스를 사용한 실외 배양 중 Synechococcus 2973-phaCAB의 바이오매스 축적 및 PHB 축적을 나타낸다. 도 5의 B는 실내 배양에 사용되는 광생물 반응기의 이미지를 나타내고, 도 5의 C는 광생물 반응기, 실외배양을 위한 산업용 배가스 source 및 조성을 나타낸 개략도이다.
도 6은 Synechococcus 2973-phaCAB에서 PHB 합성 확인을 위한 GC-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 PHB 합성의 시각적 확인을 위한, 야생형 Synechococcus 2973(A)과 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB(B)의 TEM 이미지를 나타낸 것이다. 빨간색 화살표는 세포 내 PHB 그래뉼(granule)의 예를 나타낸 것이다.
도 8은 다양한 유도 조건(1 mM IPTG, 1mM IPTG 및 질소 결핍(N deprivation), 질소 결핍(N deprivation)에서 Synechococcus 2973-phaCAB의 PHB 축적을 나타낸 것이다. 질소 결핍 시의 성장 억제를 방지하기 위해, 세포는 후기 지수기(late exponential phase)(배양 후 4일)에 질소 결핍 배지에 노출되었다. PHB 생산에 대한 IPTG 및 질소 결핍의 영향을 비교하기 위해 IPTG의 첨가도 동시에 수행하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
시아노박테리아는 광합성을 통해 에너지를 생산하고 이산화탄소를 고정하여 대사물질을 만들 수 있는 미생물이다. 진핵세포인 미세조류에 비해 원핵세포인 시아노박테리아는 유전자 조작이 용이하여 대사경로를 바꾸거나 대사물질을 인위적으로 조절하는데 유리하다. 최근에는 이러한 유전자조작 기술을 기초로 하는 합성생물학/대사공학적 기법을 시네코코커스 일롱게투스에 도입하여 기존에는 없는 대사경로를 이용하여 다양한 바이오연료 대체물 또는 화학제품을 생산하고 있다.
본 발명자들은 시아노박테리아의 한 종류인 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongates) 균주에 Cupriavidus necator H16에서 파생된 phaCAB 유전자를 도입하여 제조한 신규 균주 및 상기 균주의 우수한 PHB 생산성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 β-ketothiolase를 코딩하는 유전자 phaA, acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자 phaB 및 PHB(polyhydroxybutytrate) synthase를 코딩하는 유전자 phaC를 포함하는 시네코코커스 일롱게투스 (Synechococcus elongatus) 균주를 제공한다.
이때, 상기 β-ketothiolase를 코딩하는 유전자 phaA는 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자 phaB는 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 PHB synthase를 코딩하는 유전자 phaC는 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 균주는 수탁번호 KCTC14421BP로 기탁된 Synechococcus 2973-phaCAB일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주 또는 이의 배양산물을 유효성분으로 포함하는 PHB 생산용 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 PHB의 생산성이 우수한바, 상기 균주 또는 이의 배양물을 PHB를 높은 수율로 생산할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주의 배양산물은 PHB를 높은 수율로 생산하는데 사용될 수 있는한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 상기 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 균주의 배양물을 원심분리하여 수득한 배양상등액, 메탄올자화균 변이주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득한 파쇄물, 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득한 분획물 등이 될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 폴리하이드록시부티레이트(polyhydroxybutytrate, PHB) 생산방법을 제공한다.
이때, 상기 배양은 탄소원으로 이산화탄소 또는 배가스(flue gas)가 공급되는 광독립배양(photoautotrophic) 조건에서 수행하는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 상기 이산화탄소는 상기 균주를 광배양하기 위해 공급되는 것으로서, 그 농도는 4 ~ 6%(v/v)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 배양은 10 ~ 600 μE m-2s-1의 광도에서 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 배양은 36 ~ 40℃의 온도에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 38 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 배양은 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl-β-D-thiogalactoside; IPTG)가 첨가된 조건에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 균주는 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 최대 420 mg/L (함량 16.7%)의 PHB를 생산하였으며 종래 대표적인 PHB 생산 균주 Synechocystis sp . PCC 6803보다 PHB 생산성이 2.4배 (Induction 기간 기준)에서 3.8배 (배양기간 기준) 이상 향상되는 것으로 확인되었는바, PHB 생산 및 PHB를 이용한 다양한 제품 개발에 유용하게 활용될 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 따른 균주는 별도의 유기 탄소원 없이 CO2만으로부터 PHB를 생산할 수 있어 산업용 배가스를 이용한 PHB 생산 공정을 구축하기 위한 광합성 균주로도 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실험 방법
재료 및 방법
화학물질 및 시약
모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하였다. Taq 중합효소는 Takara(Japan), 제한 효소는 Fisher Scientifics(Pittsburg, USA), Gibson 어셈블리 믹스는 New England Biolabs(Ipswich, USA), DNA ladder는 Elpis-biotech(Korea)에서 구입하였다.
균주 제작
플라스미드 및 균주 구성
Escherichia coli (E. coli) strain Top10을 분자 클로닝을 위한 숙주로 사용하였고, E. coli strain HB101은 플라스미드를 시아노박테리아로 형질전환하는 데 사용하였다. 본 발명에서는 외인성 유전자의 부위 특이적 염색체 재조합을 위해 설계된 SyneBrick 벡터(pSe1Bb1s-GFP)를 플라스미드 백본으로 사용하였다(Chwa et al., 2016, Plant Biotechnol. J. 14 (8), 1768-1776.). 플라스미드는 접합 전달(conjugal transfer)을 위해 복제 기점에 bom 사이트(oriT 영역)를 포함해야 하기 때문에, pUC 복제 기점은 제한 효소 클로닝을 통해 pBR322 복제 기점으로 대체되었다. gfp 서열이 제거되었고, Cupriavidus necator H16의 phaCAB 오페론이 Gibson Assembly에 의해 플라스미드에 삽입되어 pSe1Bb1s-bom-phaCAB가 생성되었다. 본 발명에 사용된 모든 플라스미드 및 균주는 하기 표 1에 나타내었다.
Synechococcus
2973의 접합(Conjugation)
Synechococcus 2973은 natural competence가 없기 때문에, 먼저 종래 문헌(Elhai, and Wolk et al., 1988, Methods in Enzymology, Vol. 167, Elsevier, pp. 747-754.)에 기재된 방법을 참고하여 triparental mating을 이용한 접합을 수행하였다. 접합 및 헬퍼 E. coli 균주는 전기천공을 통해 각각 pRL443 및 pRL623(Elhai et al., 1997, J. Bacteriol. 179 (6), 1998-2005.)을 E. coli HB101로 형질전환함으로써 먼저 제조하였다. 그런 다음 표적 플라스미드 pSe1Bb1s-bom-phaCAB를 competent helper HB101로 형질전환시켰다. Triparental mating의 경우, pRL443을 포함하는 접합 HB101(conjugal HB101) 및 pRL623와 pSe1Bb1s-bom-phaCAB를 모두 포함하는 helper HB101를 적절한 항생제(ampicillin 50 μg mL-1, chloramphenicol 25 μg mL- 1)와 함께 밤새 배양하였다. 100μL의 각 균주를 새로운 Lysogeny Broth(LB) 배지로 두 번 세척하여 모든 항생제를 제거하고, 동일한 부피의 LB 배지에 재현탁하였다. 다음으로, 두 균주를 함께 혼합하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 200 μL의 Synechococcus 2973(OD730 
0.4-0.6)을 E. coli 현탁액과 혼합하고 실온에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로 혼합물을 0.45 μm 니트로셀룰로오스 필터(Millipore)로 덮인 BG11 + 5%(v/v) LB 한천 플레이트에 펴고 24시간 동안 38 ℃의 온도 및 100 μE m-2s-1의 광도에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 필터를 적절한 항생제(75 μgmL-1 of spectinomycin)를 함유하는 콜로니 선별용 BG11 한천 플레이트로 옮겼다. 콜로니는 38 ℃의 온도 및 100 μE m-2s-1의 광도에서 3-7일 인큐베이션한 후에 나타났다. 돌연변이체(mutant)의 complete segregation을 위해 개별 콜로니를 새로운 콜로니 선별용 BG11 플레이트에 3-4회 다시 스트리킹하고 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 확인하였다(표 2). 상기 segregation된 돌연변이체는 Synechococcus 2973-phaCAB로 명명하고, 부다페스트 조약에 따른 미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생명자원센터에 2020년 12월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC14421BP를 부여받았다.
| Primer name | Primer sequence (5'-3') |
| phaCAB -F | GACATCATAACGGTTCTGGC |
| phaCAB-R | TCTTTCGACTGAGCCTTTCG |
| NSI-F | TAGTCGCCGCAGTAGTGATG |
| NSI-R | CTCCAGCAAGCTAGCGATTT |
랩 스케일(lab-scale) 실험을 위한 배양 조건
Synechococcus 2973과 Synechocystis 6803은 10 mM HEPES-NaOH(pH 8.0)를 함유하는 BG-11 배지에서 성장하였다. 50 μg mL-1의 스펙티노마이신을 돌연변이체 성장을 위한 배지에 첨가하였다. PHB 생산을 위해 두 균주를 헤드스페이스에 5% (v/v) CO2가 공급된 250mL 진탕 플라스크(shaking flask)(130rpm)에서 연속 형광 빛 조건(200 μE m-2s- 1)하에 배양하였다. 온도는 Synechococcus 2973과 Synechocystis 6803 각각 38 ℃와 30 ℃의 최적 온도로 유지되었다. Synechococcus 2973의 경우, OD730 
0.4-0.6에서 1 mM isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 PHB 합성을 유도하였다. Synechocystis 6803의 질소 결핍을 위해, 완전한 BG-11 배지에서 성장하는 세포를 후기 지수기(late exponential phase)에 질소 결핍 BG-11 배지로 옮겼다. 질소 결핍 BG-11은 NaNO3를 제거하고 (NH4)5[Fe(C6H4O7)2] 및 Co (NO3)26H2O를 각각 동몰의(equimola) FeC6H5O7 및 CoCl26H2O로 대체하여 제조하였다. 세포는 모든 랩 스케일 실험에서 0.05의 초기 OD730에서 접종되었다.
대규모 배양(large-scale cultivation)을 위한
광생물
반응기를 이용한 배양 조건
실내 배양(Indoor cultivation)
시아노박테리아 균주의 실내 배양을 위해 폐쇄형 버블 컬럼 10L 광생물반응기를 사용하였다. 광생물 반응기는 세포 축적을 방지하기 위해 바닥이 V자형인 폴리프로필렌 필름(14 cm width × 140 cm height)으로 제작하였다. 배지 조성의 경우, HEPES 버퍼를 광생물 반응기의 30mM 수산화칼륨 용액에 12시간 동안 5% CO2 가스를 살포하여 최종 pH가 약 7.8-8.0로 조정한 중탄산염 버퍼 시스템으로 교체하였다. 실외 배양 시스템을 시뮬레이션하기 위해, 세포를 16:8 명암 주기로 400 μE m-2s-1의 광도에서 배양하였다. 광생물 반응기에 5% CO2 (v/v)를 0.1 vvm으로 공급하였고, 평균온도는 34℃로 유지하였다. 세포는 0.3의 초기 OD730에서 접종되었다. 돌연변이 유도를 위해, 1 mM의 IPTG가 배양 24시간 후에 첨가되었다.
산업용
배가스를
이용한 실외 배양(Outdoor cultivation using industrial flue gas)
배가스(3-6% of CO2, 11.99 ± 0.73% of O2, 21.72 ± 3.72 ppm of NOx, 1.43 ± 4.03 ppm of CO, water vapor and dust)는 한국지역난방공사의 열병합발전소(Panggyo, Gyeonggi-do Province, South Korea)에서 공급받았다. 파이프라인은 탈황 장치(desulfurization unit)에서 배양 장소가 위치한 온실로 연결되었고 가스는 0.1 vvm에서 광생물 반응기에 공급되었다. 전술한 광생물 반응기는 너비와 높이를 동일한 비율로 3 L로 확장되었다. 자연광은 실외 배양 동안 유일한 광원으로 제공되었으며 주간에는 10-600 μE m-2s-1의 광도 변화가 있었다. 온실 내부 온도는 배양 기간 동안 20~35℃였다. 세포를 0.5의 OD730에서 접종하고 24시간 배양 후 1 mM IPTG를 첨가하였다.
건조 중량(dry weight)의 정량화
시아노박테리아의 세포 건조 중량을 측정하기 위해 먼저, 여과지(Whatman, pore size 0.45 μm) 를 탈이온수(DI water)로 세척하고 물을 완전히 제거하기 위해 60℃에서 밤새 건조시켰다. 5 mL의 세포 현탁액을 미리 가중된(pre-weighted) 건조 필터에 넣고 탈이온수로 헹구어 과잉 염을 제거하였다. 세포가 로딩된 필터를 밤새 건조하고 무게를 측정하여 건조 세포 중량을 측정하였다. 여과지의 무게 변화는 주어진 세포 부피당 건조 세포 무게에 해당한다.
PHB의
정량화
PHB의 농도를 측정하기 위해 먼저, 클로로포름과 15% (v/v) H2SO4가 함유된 메탄올을 동결 건조된 세포에 첨가하고 100℃에서 140분 동안 인큐베이션하였다. 반응 후 상분리를 위해 DI water를 첨가하고, DB-WAX 모세관 컬럼이 장착된 기체 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS)(Agilent, 6890/5975)를 사용하여 메틸 에스테르를 포함하는 유기(bottom) 상을 DB-WAX 모세관 컬럼(30 m × 250 μm × 0.5 μm)이 장착된 기체 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS)(Agilent, 6890/5975)를 사용하여 PHB 분석하였다. GC 구성 매개변수(GC configuration parameters)는 다음과 같이 프로그래밍되었다: split ratio 1:20, injection temperature 250 ℃, flow rate 0.7 mL min-1, column oven temperature 80 ℃ for 2 min, temperature ramp of 10 ℃ min-1 및 245 ℃ for 1 min. 질량 분석기는 전자 충격(EI) 모드, 70 eV, 이온 소스 온도 215 ℃ 및 스캔 질량 범위 20-200으로 프로그래밍되었다. 메틸 벤조에이트(Methyl benzoate)를 내부 표준으로 사용하고 폴리[(R)-3-하이드록시부티르산](poly[(R)-3-hydroxybutyric acid])(Sigma-aldrich, USA)을 검량선(calibration curve)으로 사용하였다.
글리코겐의 정량화
세포 현탁액을 원심분리에 의해 수집하고 펠렛을 300 μL의 30% KOH로 재현탁하고 100℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 최종 농도가 70-75% (v/v)가 되도록 얼음처럼 차가운 에탄올을 첨가하여 글리코겐을 침전시키고 얼음 위에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 원심분리에 의해 글리코겐을 수집하고, 이어서 펠렛을 70% 및 98% (v/v) 에탄올로 세척하고, 나머지 에탄올이 증발할 때까지 건조시켰다. 각 펠렛을 300μL 아세트산나트륨 용액(100 mM, pH 4.75)에 재현탁하고 아밀로글루코시다아제 (4 U assay- 1)를 첨가하여 글리코겐을 글루코오스로 효소 가수분해하였다. 반응은 60℃에서 2시간 동안 진행하였다. 원심분리 후 상등액은 제조사의 프로토콜에 따라 글루코오스 분석 키트(Sigma-aldrich, USA)를 사용하여 글리코겐 함량을 결정하는데 사용하였다.
투과전자현미경(
TEM
)을 이용한
PHB
그래뉼(granule)의
관찰
원심분리로 배지를 제거한 후, 세포를 0.1 M 인산완충액(pH 7.4) 중 2% Glutaraldehyde-2% Paraformaldehyde에 12시간 동안 고정하고, 0.1 M 인산완충액으로 세척한 다음 0.1 M 인산완충액에서 1% OsO4로 2시간 동안 후고정(postfixation)하였다. 고정된 샘플은 에탄올 시리즈(50, 60, 70, 80, 90, 95 및 100%)를 이용하여 각각 10분씩 탈수하고 프로필렌 옥사이드로 10분 동안 침윤시켰다. 그런 다음 샘플들을 Poly/Bed 812 키트 (Polysciences)로 임베딩하고, 전자 현미경 오븐(TD-700, DOSAKA, Japan)에서 65℃, 12시간 동안 중합하고, 200 nm semi-thin 섹션으로 절단하고 톨루이딘 블루로 염색하였다. 처리된 샘플들을 구리 그리드에 놓고, 30분 동안 3% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 및 7분 동안 3% 시트르산 납(lead citrate)으로 이중 염색하고 80kV에서 Megaview III CCD 카메라(Soft imaging system-Germany)가 장착된 투과 전자 현미경(JEM-1011, JEOL, Tokyo, Japan)으로 이미지화하였다.
RNA 추출 및 real-time
qPCR
세포 현탁액을 원심분리하고 세포 펠렛을 액체 질소에서 즉시 동결시켰다. 동결된 세포를 lysis buffer를 이용하여 균질화하고 제조사의 지시에 따라 PureHelix™Total RNA Purification Kit(Nanohelix, South Korea)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA를 정제하여 gDNA 오염을 제거하고 제조업체의 지침에 따라 QuantiTect®Reverse Transcription 키트(Qiagen, USA)로 역전사하였다. 생성된 cDNA는 후속 real-time qPCR 분석을 위한 템플릿으로 사용되었다. 정량적 real-time PCR은 Rotor-Gene Q pure detection system (Qiagen, USA)에서 QuantiFast SYBR Green PCR 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 수행하였다. Synechococcus 2973 및 Synechocystis 6803에 대한 레퍼런스 유전자는 각각 16S rRNA 및 rnpB였다. 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다. 대조군에 대한 유전자 발현의 배수 변화(fold change)는 다음 식에 의해 계산되었다: Relative expression level (fold change) = 2-△△CT.
| Synechococcus 2973 - phaCAB | |
| Genes | Primer sequence (5'-3') |
| phaA | For: ACGTTGTCATCGTATCCGCC |
| Rev: ATGACTTCGCTCACCTGCTC | |
| phaB | For: CGACAAGGTCAAGTCCGAGG |
| Rev: GCTTGGTGACGTTGAACAGC | |
| phaC | For: CAGCTGTTGCAGTACAAGCC |
| Rev: GTATGTCCCTGCTCCACCAC | |
| 16S rRNA | For: GAATCTGCCTACAGGACGGG |
| Rev: AGCTACTGATCGTCGCCTTG | |
| Synechocystis 6803 | |
| Genes | Primer sequence (5'-3') |
| phaA | For: GCAATTGATTCCCCGGCAAG |
| Rev: AGCCCGGATGGTTAAAGCTG | |
| phaB | For: CTTTGGCGATCCGGGAAGAT |
| Rev: TACTGGCTACGGGGGAAAGT | |
| phaC | For: ACATCCAGGTGGGCTTTACC |
| Rev: AAATCCACCATGTAGGGGCG | |
| phaE | For: ATTATTGCGGGCCTTTGACG |
| Rev: CCCGGGCCAGTAAATCTTCC | |
| rnpB | For: GGTACTGGCTCGGTAAACCC |
| Rev: GGCACCCTTGGGGAGTTATC | |
결과 및 고찰
신규 변이주
Synechococcus
2973-
phaCAB
의
구축 및 검증
PHB를 생산하는 Synechococcus 2973 균주를 개발하기 위해 Cupriavidus necator H16으로부터의 PHB 합성 경로를 접합을 통해 Synechococcus 2973에 도입하였다. Synechococcus 2973은 게놈의 99.8% 유사성에도 불구하고 Synechococcus 7942보다 3배 빠르게 성장한다는 점을 감안할 때(Ungerer et al., 2018, mBio 9 (1). https://doi.org/ 10.1128/mBio.02327-17), Synechococcus 2973에서 PHB 경로의 발현은 PHB 생산성을 크게 향상시킬 것으로 예상되었다. 본 발명에서 phaCAB 오페론은 neutral site I (NSI)-targeting plasmid 플라스미드로 클로닝되었고 IPTG 유도성 strong promoter Ptrc에서 발현되었다. complete segregation된 형질전환체(이하 Synechococcus 2973-phaCAB)는 표 1에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 확인하였다(도 1B). Synechococcus 2973은 자연적으로 PHB를 축적하지 않기 때문에 GC-MS 분석을 통해 외인성 경로에 의한 PHB 합성을 검증하였다. Synechococcus 2973-phaCAB의 메탄올화된 샘플은 메탄올화된 상업용 PHB 표준과 유사한 체류 시간(9.827분)으로 현저한 피크를 나타내었으며, 이는 야생형(Synechococcus 2973)에서는 나타나지 않았다(도 6). PHB의 육안 확인은 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 추가로 수행하였다. 그 결과, 야생형과 달리, 광독립영양 배양 8일 후 돌연변이체(Synechococcus 2973-phaCAB)의 세포내에서 PHB 그래뉼이 관찰됨을 확인하였다(도 7).
신규 변이주
Synechococcus
2973-
phaCAB
의
특성화
먼저, 본 발명에 따른 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB과 야생형의 성장을 비교하여 돌연변이체(Synechococcus 2973-phaCAB)의 생존력을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 그 결과, 38 ℃, 200 μE m-2s-1 및 5% CO2 조건 하에서, 야생형 및 돌연변이체의 평균 바이오매스 생산성은 각각 0.535 g L-1d-1 and 0.472 g L-1d-1이었고, 평균 성장률은 각각 0.843 d-1 및 0.813 d-1이었다(data not shown). 이러한 결과를 통해, 돌연변이체의 바이오매스 축적이 약간 감소하지만, 세포내 생성물의 합성으로 인한 성장 억제는 발생하지 않는다는 것을 확인하였다. 다음으로, 본 발명에 따른 변이주가 상기 TEM 결과에서와 같이 많은 양의 PHB를 축적하는 방법을 파악하기 위해, 변이주의 탄소 이용을 글리코겐 함량을 기준으로 특성화하였다. 이를 위해, PHB 유전자의 IPTG 유도 이후 60시간 동안 변이주의 글리코겐 및 PHB 함량을 관찰하고 해당 기간에 성장한 야생형과 비교하였다(도 2). 그 결과, 야생형 및 변이주 모두 PHB 유도 초기 글리코겐 함량은 유사하였다. 그러나, 시간이 경과함에 따라, 야생형의 글리코겐은 건조 세포 중량의 35%까지 꾸준히 증가하는 반면, 변이주의 글리코겐은 60시간에 건조 세포 중량의 26%로 상대적으로 글리코겐 함량이 적었다. 야생형과 변이주 모두 12시간에 글리코겐의 함량이 감소하였는데, 이는 빠른 바이오매스 축적에 비해 느린 글리코겐 축적 속도의 결과로 보여진다. PHB는 60시간에 건조 세포 중량의 7%까지 축적되었으며 변이주의 PHB 및 글리코겐 함량의 합은 야생형의 글리코겐 함량과 비슷하였다. 이러한 결과는 변이주에서 탄소 저장을 위해 탄소 플럭스가 글리코겐과 PHB 사이에서 공유됨을 암시하는 것이다. 또한, 글리코겐 및 PHB 함량의 정량화를 통해, trc 프로모터에 의한 phaCAB의 발현이 추가 대사 경로 또는 최적화의 구현 없이도 원래 탄소 흡수원에서 PHB로 플럭스를 효율적으로 리디렉션할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
신규 변이주
Synechococcus
2973-
phaCAB
의
PHB의
광독립영양
생산
먼저, 본 발명에 따른 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB의 volumetric PHB accumulation을 자연적으로 PHB를 생산하는 시아노박테리아인 Synechocystis 6803과 비교하였다. 또한 배가스 환경에서의 잠재적 적용 가능성을 확인하기 위해, 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB와 Synechocystis 6803의 성장, PHB 축적 및 생산성은 5% CO2를 유일 탄소원으로 사용하여 평가하였다. 또한, Synechococcus 6803의 경우 (1) 자가 영양 결핍(self-limitation of macronutrients)에 의존하는 완전한 BG11 배지에서 성장한 세포 및 (2) 질소 결핍 배지에서 성장한 세포를 모두 관찰하였다. 영양 결핍 환경에서는 초기 세포 성장이 크게 억제될 수 있기 때문에, 후자의 경우에는 세포가 충분히 성장한 후 질소 결핍 배지로 세포를 옮기는 2단계 배양을 적용하였다. 또한, 질소 결핍은 Synechococcus 2973-phaCAB에서 PHB 유도에 미미한 영향을 미치는 것으로 나타났는바(도 8), Synechococcus 2973-phaCAB는 IPTG가 첨가된 완전한 BG11 배지에서만 평가하였다. 두 균주의 성장 성능을 비교한 결과, 본 발명에 따른 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB는 예상대로 우수한 성장을 보였다(도 3A). Synechococcus 2973-phaCAB의 평균 바이오매스 생산성은 0.469 g L-1d-1이었고, 이는 Synechocystis 6803(완전 배양 및 질소 결핍 배양에 대해 각각 0.310 g L-1d-1 및 0.323g g L-1d- 1)보다 1.5배 더 높은 것으로 나타났다. 최대 비성장률(maximum specific growth rate) 또한 Synechococcus 2973-phaCAB는 2.67 d-1로 Synechocystis 6803(완전 배양 및 질소 결핍 배양의 경우 각각 1.65 d-1 및 1.77 d-1)보다 훨씬 높은 것으로 확인되었다. Synechococcus 2973-phaCAB의 더 빠른 성장이 확인되면서, 유도 시점 이후의 PHB 축적을 Synechocystis 6803과 비교하였고 그 결과를 도 3B에 나타내었다. 구체적으로, 먼저 Synechococcus 2973-phaCAB에서 phaCAB 오페론을 유도하기 위해 배양 1일 후에 1 mM의 IPTG를 첨가하였다. 또한, Synechocystis 6803에서 PHB 합성을 유도하기 위해 배양 6일 후 배지를 질소 결핍 BG11로 변경하였다. 질소의 자가 결핍에 의존하는 완전한 BG11 배지에서 자란 Synechocystis 6803도 Synechocystis 6803에 대한 대조군으로 비교되었다. 유도 9일(즉, 배양 10일) 후 Synechococcus 2973-phaCAB의 volumetric PHB titer는 420 mgL-1이었고, 이는 건조 세포 중량의 16.7%를 나타낸다. 한편, 유도 9일(즉, 배양 15일) 후 질소 결핍 조건 하에서 Synechocystis 6803의 volumetric PHB titer는 167 mgL-1이었다. 질소 결핍이 없는 Synechocystis 6803은 92 mgL-1만 축적되었는바, 질소 결핍 유도는 Synechocystis 6803에서 효과적인 것으로 확인되었다. 유도 후 평균 PHB 생산성을 비교했을 때, Synechococcus 2973-phaCAB는 46.7 mg L-1d- 1 의 PHB를 축적할 수 있었으며, 이는 Synechocystis 6803(10.2 mg L-1d-1) 및 질소 결핍 Synechocystis 6803(18.6 mg L-1d-1) 보다 각각 4.6배 및 2.4배 더 높았는데, Synechocystis 6803에 대한 유도는 세포 성장 억제를 방지하기 위해 배양 6일 후에 시작되었기 때문에, 전체 배양 기간을 고려할 때, Synechococcus 2973-phaCAB와 질소 결핍 Synechocystis 6803 사이의 실제 PHB 생산성 차이는 훨씬 더 크다는 점을 알 수 있다. 더욱이, Synechocystis 6803은 그 이후로 PHB 축적에서 약 3일의 긴 지연기(lag phase)를 나타내었지만, Synechococcus 2973-phaCAB는 유도 직후 상당한 양의 PHB를 쉽게 축적할 수 있었다. Synechococcus 2973-phaCAB는 실제로 유도 첫날에 75 mg L-1 d-1의 가장 높은 비 PHB 생산성(specific PHB productivity)을 보여주었다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB는 초기 지수 단계(early exponential phase)에서 시작하여 다량의 PHB를 생성하는 능력이 있기 때문에 PHB 생산성 측면에서 큰 이점을 가지고 있음을 확인하였다.
Synechococcus
2973-
phaCAB
및
Synechocystis
6803에서
PHB
유전자의 상대적 발현 수준 비교
다음으로, 표 3의 프라이머를 사용하여, qRT-PCR을 통해 PHB 합성에 관여하는 mRNA 발현량을 평가하였다. Synechococcus 2973-phaCAB에서 phaCAB 유전자의 전사 발현은 IPTG 유도 이후 60시간 동안 확인하였고(도 4A), Synechocystis 6803의 phaABCE 유전자의 전사 발현은 질소 결핍 배지로 이동 후 동일한 기간 동안 확인하였다(도 4B). Synechococcus 2973-phaCAB에서, trc 프로모터의 제어하에 있는 3개의 유전자 모두는 IPTG 첨가에 의해 고도로 상향조절되었다. 유도 12시간 후 발현 수준의 급격한 증가는 유도 후 첫날에 달성된 가장 높은 비 PHB 생산성(75 mg L-1d-1)에 의해 반영되었다. 시간 경과에 따른 감소된 발현 수준은 배지에서 IPTG의 소비에 기인할 수 있지만 발현 수준은 여전히 매우 높은 수준으로 유지되었다. 대조적으로, Synechocystis 6803의 PHB 유전자는 질소 결핍의 의해 효과적으로 상향 조절되지 않았고, 이는 상대적으로 낮은 PHB 축적 능력을 반영할 수 있다. 더 중요한 것은 Synechococcus 2973-phaCAB에서의 급격한 발현 증가와는 대조적으로 Synechocystis 6803에서 PHB 유전자의 발현 수준은 시간이 지남에 따라 천천히 그리고 꾸준히 증가하는 경향을 보였다는 것이다. 질소 결핍에 따른 이러한 PHB 유전자의 점진적인 반응은 글리코겐 합성에서 세포의 1차 반응에 의해 유발되어 질소 결핍 초기에 PHB 축적이 느려지는 결과를 초래한 것으로 판단된다. 이와는 달리 본 발명에 따른 변이주 Synechococcus 2973-phaCAB는 PHB 유전자의 유도를 영양소 제한에 의존하지 않기 때문에, 다른 경쟁 대사 산물과 관련된 유전자의 상향 조절 없이 많은 양의 PHB를 효과적으로 축적할 수 있다.
대규모 배양 조건에서의
PHB
생산
Synechochoccus 2973-phaCAB는 랩스케일에서 현저하게 높은 PHB 생산성을 나타내었는바, 대규모 광생물 반응기에서의 실내 및 실외 배양시의 확장성과 성능을 추가로 평가하기 위한 실험을 진행하였다. 도 5A에 나타난 바와 같이, 배양 10일 동안 달성된 가장 높은 volumetric PHB titer는 건조 세포 중량의 21.1%에 해당하는 278 mg L-1이었다. 관찰된 배양 기간 동안 volumetric PHB 생산성 및 바이오매스 생산성은 각각 27.8 mg L-1d-1 및 0.122 g L-1d-1이었다. 랩스케일 실험 대비 전체 바이오매스 농도의 감소는 광생물 반응기의 그림자 효과(shading effect)에 기인한 것으로 판단된다. 놀랍게도 PHB 함량(건조 세포 중량의 16.7%)은 배양 10일 후 랩스케일 실험보다 상당히 높았으며, 이는 바이오매스 축적 감소에도 불구하고 높은 PHB 축적이 유지됨을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 PHB 축적 측면에서 Synechochoccus 2973-phaCAB의 성능이 실내 광생물 반응기에서 합리적으로 유지될 수 있음을 보여준다. Synechochoccus 2973-phaCAB의 PHB 생산 성능은 LNG 발전소의 배가스를 사용하는 실외 배양에서 추가로 평가하였다. 국내 열병합발전(CHP) 발전소에서 발생하는 배가스를 유일 탄소원으로 직접 활용하였으며, 실외 배양 장소와 배가스의 구성에 대한 개략도는 하기 도 5C에 나타내었다. 평가 결과, 배양 10일에 걸쳐 127 mg L-1의 volumetric PHB titer를 달성할 수 있었으며, 이는 12.7 mg L-1d-1의 체적 PHB 생산성 및 건조 세포 중량의 10.5% PHB 함량을 나타낸다(도 5A). 이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 변이주 Synechochoccus 2973-phaCAB는 산업용 배가스를 이용한 대규모 PHB 생산 공정에 유용하게 적용될 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation
<120> A mutant strain having polyhydroxybutytrate production ability
and method for producing polyhydroxybutytrate using the strain
<130> JKP-1602R1
<150> KR 10-2020-0185509
<151> 2020-12-29
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gene coding beta-ketothiolase (phaA)
<400> 1
atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg 60
ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120
gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180
tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240
gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300
gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360
gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420
gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480
gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540
ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600
ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga cgagttcgtg 660
cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga caaggccggc 720
acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt ggtggtgatg 780
tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa gagctatgcc 840
aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc caagcgcgcc 900
ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa cgaggccttt 960
gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa ggtcaatgtg 1020
aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg tatcctggtg 1080
acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc gctgtgcatc 1140
ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aa 1182
<210> 2
<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gene coding acetoacetyl-CoA reductase (phaB)
<400> 2
atgactcagc gcattgcgta tgtgaccggc ggcatgggtg gtatcggaac cgccatttgc 60
cagcggctgg ccaaggatgg ctttcgtgtg gtggccggtt gcggccccaa ctcgccgcgc 120
cgcgaaaagt ggctggagca gcagaaggcc ctgggcttcg atttcattgc ctcggaaggc 180
aatgtggctg actgggactc gaccaagacc gcattcgaca aggtcaagtc cgaggtcggc 240
gaggttgatg tgctgatcaa caacgccggt atcacccgcg acgtggtgtt ccgcaagatg 300
acccgcgccg actgggatgc ggtgatcgac accaacctga cctcgctgtt caacgtcacc 360
aagcaggtga tcgacggcat ggccgaccgt ggctggggcc gcatcgtcaa catctcgtcg 420
gtgaacgggc agaagggcca gttcggccag accaactact ccaccgccaa ggccggcctg 480
catggcttca ccatggcact ggcgcaggaa gtggcgacca agggcgtgac cgtcaacacg 540
gtctctccgg gctatatcgc caccgacatg gtcaaggcga tccgccagga cgtgctcgac 600
aagatcgtcg cgacgatccc ggtcaagcgc ctgggcctgc cggaagagat cgcctcgatc 660
tgcgcctggt tgtcgtcgga ggagtccggt ttctcgaccg gcgccgactt ctcgctcaac 720
ggcggcctgc atatgggctg a 741
<210> 3
<211> 1770
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gene coding PHB synthase (phaC)
<400> 3
atggcgaccg gcaaaggcgc ggcagcttcc acgcaggaag gcaagtccca accattcaag 60
gtcacgccgg ggccattcga tccagccaca tggctggaat ggtcccgcca gtggcagggc 120
actgaaggca acggccacgc ggccgcgtcc ggcattccgg gcctggatgc gctggcaggc 180
gtcaagatcg cgccggcgca gctgggtgat atccagcagc gctacatgaa ggacttctca 240
gcgctgtggc aggccatggc cgagggcaag gccgaggcca ccggtccgct gcacgaccgg 300
cgcttcgccg gcgacgcatg gcgcaccaac ctcccatatc gcttcgctgc cgcgttctac 360
ctgctcaatg cgcgcgcctt gaccgagctg gccgatgccg tcgaggccga tgccaagacc 420
cgccagcgca tccgcttcgc gatctcgcaa tgggtcgatg cgatgtcgcc cgccaacttc 480
cttgccacca atcccgaggc gcagcgcctg ctgatcgagt cgggcggcga atcgctgcgt 540
gccggcgtgc gcaacatgat ggaagacctg acacgcggca agatctcgca gaccgacgag 600
agcgcgtttg aggtcggccg caatgtcgcg gtgaccgaag gcgccgtggt cttcgagaac 660
gagtacttcc agctgttgca gtacaagccg ctgaccgaca aggtgcacgc gcgcccgctg 720
ctgatggtgc cgccgtgcat caacaagtac tacatcctgg acctgcagcc ggagagctcg 780
ctggtgcgcc atgtggtgga gcagggacat acggtgtttc tggtgtcgtg gcgcaatccg 840
gacgccagca tggccggcag cacctgggac gactacatcg agcacgcggc catccgcgcc 900
atcgaagtcg cgcgcgacat cagcggccag gacaagatca acgtgctcgg cttctgcgtg 960
ggcggcacca ttgtctcgac cgcgctggcg gtgctggccg cgcgcggcga gcacccggcc 1020
gccagcgtca cgctgctgac cacgctgctg gactttgccg acacgggcat cctcgacgtc 1080
tttgtcgacg agggccatgt gcagttgcgc gaggccacgc tgggcggcgg cgccggcgcg 1140
ccgtgcgcgc tgctgcgcgg ccttgagctg gccaatacct tctcgttctt gcgcccgaac 1200
gacctggtgt ggaactacgt ggtcgacaac tacctgaagg gcaacacgcc ggtgccgttc 1260
gacctgctgt tctggaacgg cgacgccacc aacctgccgg ggccgtggta ctgctggtac 1320
ctgcgccaca cctacctgca gaacgagctc aaggtaccgg gcaagctgac cgtgtgcggc 1380
gtgccggtgg acctggccag catcgacgtg ccgacctata tctacggctc gcgcgaagac 1440
catatcgtgc cgtggaccgc ggcctatgcc tcgaccgcgc tgctggcgaa caagctgcgc 1500
ttcgtgctgg gtgcgtcggg ccatatcgcc ggtgtgatca acccgccggc caagaacaag 1560
cgcagccact ggactaacga tgcgctgccg gagtcgccgc agcaatggct ggccggcgcc 1620
atcgagcatc acggcagctg gtggccggac tggaccgcat ggctggccgg gcaggccggc 1680
gcgaaacgcg ccgcgcccgc caactatggc aatgcgcgct atcgcgcaat cgaacccgcg 1740
cctgggcgat acgtcaaagc caaggcatga 1770
Claims (10)
- β-ketothiolase를 코딩하는 유전자 phaA, acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자 phaB 및 PHB(polyhydroxybutytrate) synthase를 코딩하는 유전자 phaC를 포함하는 시네코코커스 일롱게투스 (Synechococcus elongatus) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 β-ketothiolase를 코딩하는 유전자 phaA는 서열번호 1의 서열을 포함하는, 시네코코커스 일롱게투스 균주. - 제1항에 있어서,
상기 acetoacetyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자 phaB는 서열번호 2의 서열을 포함하는, 시네코코커스 일롱게투스 균주. - 제1항에 있어서,
상기 PHB synthase를 코딩하는 유전자 phaC는 서열번호 3의 서열을 포함하는, 시네코코커스 일롱게투스 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는 수탁번호 KCTC14421BP로 기탁된 Synechococcus 2973-phaCAB인, 시네코코커스 일롱게투스 균주. - 제1항 내지 제5항에 따른 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 폴리하이드록시부티레이트(polyhydroxybutytrate, PHB) 생산방법.
- 제6항에 있어서,
상기 배양은 탄소원으로 이산화탄소 또는 배가스(flue gas)가 공급되는 광독립배양(photoautotrophic) 조건에서 수행되는 것인, 폴리하이드록시부티레이트 생산방법. - 제7항에 있어서,
상기 이산화탄소의 농도는 4 ~ 6%(v/v)인, 폴리하이드록시부티레이트 생산방법. - 제7항에 있어서,
상기 배양은 10 ~ 600 μE m-2s-1의 광도에서 수행되는 것인, 폴리하이드록시부티레이트 생산방법. - 제7항에 있어서,
상기 배양은 36 ~ 40℃의 온도에서 수행되는 것인, 폴리하이드록시부티레이트 생산방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21217952.7A EP4036227A1 (en) | 2020-12-29 | 2021-12-28 | A mutant strain having polyhydroxybutytrate production ability and process for producing polyhydroxybutytrate using the strain |
| US17/564,601 US11702681B2 (en) | 2020-12-29 | 2021-12-29 | Mutant strain having polyhydroxybutyrate production ability and method for producing polyhydroxybutyrate using the strain |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200185509 | 2020-12-29 | ||
| KR20200185509 | 2020-12-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220095143A true KR20220095143A (ko) | 2022-07-06 |
Family
ID=82400219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210188836A KR20220095143A (ko) | 2020-12-29 | 2021-12-27 | 폴리하이드록시부티레이트 생산능을 갖는 변이주 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트 생산방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20220095143A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117887641A (zh) * | 2024-03-13 | 2024-04-16 | 南京农业大学 | 一株兼具苯胺降解及聚羟基丁酸酯合成能力的菌株及其应用 |
-
2021
- 2021-12-27 KR KR1020210188836A patent/KR20220095143A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117887641A (zh) * | 2024-03-13 | 2024-04-16 | 南京农业大学 | 一株兼具苯胺降解及聚羟基丁酸酯合成能力的菌株及其应用 |
| CN117887641B (zh) * | 2024-03-13 | 2024-05-14 | 南京农业大学 | 一株兼具苯胺降解及聚羟基丁酸酯合成能力的菌株及其应用 |
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