CN116970659A - 一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，所述的方法包括使用戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐培养盐单胞菌。该盐单胞菌可以以五碳或七碳为底物高产包含3‑羟基戊酸单体的聚羟基脂肪酸酯，进一步通过调整戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐与葡萄糖的比例控制聚羟基脂肪酸酯中3‑羟基戊酸单体的摩尔比，在实际应用上，可以根据需求，可定制化的获得不同3HV摩尔比的PHA，多样化的材料也能满足更多的应用需求。因此，本申请的方法在提高包含3HV单体的PHA的产品竞争力和大规模生产效益等方面具有重要的实践意义。

Description

一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程、发酵工程和合成生物学技术领域，具体涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌及其制备方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）是一类可由多种细菌合成的环境友好型生物聚酯，是极具潜力的石油基替代产品之一。同时，PHA在医用植入材料、可降解包装材料、食品级涂层材料和动物饲料等领域也有着广泛的应用前景。传统的发酵工艺存在灭菌过程需要大量消耗能源，大量消耗淡水，容易染菌等不足，严重制约了现代工业生物技术的快速发展。为解决上述不足，基于极端嗜盐微生物底盘菌开发的下一代工业生物技术（Next Generation Industrial Biotechnology，NGIB）体系无需灭菌可直接进行开放式、连续发酵，工程化流程较为简单，能显著提高发酵过程的稳定性。盐单胞菌Halomonas bluephagenesis是清华大学陈国强课题组在新疆艾丁湖分离出的一株嗜盐菌，具有广泛的环境适应性和耐盐、耐碱等特性，是NGIB工艺的重要底盘菌株之一。野生型Halomonas bluephagenesis在无灭菌条件下以葡萄糖为唯一碳源能积累超过细胞干重80%的P3HB（聚3-羟基丁酸酯）。
PHA聚合物按照单体的组成可分为均聚PHA和共聚PHA。均聚PHA由一种单体组成，材料学性能较单一。共聚PHA由两种及以上的单体组成，可通过改变其单体摩尔比来调控材料学性能从而满足不同的应用需求。聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯即Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，简称P(3HB-co-3HV)或P3HB3HV，是一种由短链单体（C4）和中链单体（C5）聚合而成的共聚PHA，可通过调节3HV单体的比例来调控其材料学性能，具有广阔的应用前景和巨大的市场需求。
目前，CN101845414B公开了使用恶臭假单胞菌生产PHA，但是对于带有3HV单体的PHA只涉及均聚物，并不涉及包含3HV与其他单体的均聚。
专利CN114134096B公开了重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis能以葡萄糖作为唯一碳源来生产P3HB3HV，或以葡萄糖和丙酸作为混合碳源来生产P3HB3HV并进一步通过调节丙酸的添加量来调控3HV单体的摩尔比。但是获得的P3HB3HV材料中的3HV单体摩尔比低，3HV单体可调节范围比较窄，材料学性能相对有限。
因此，面对生物基可降解材料日益增加的市场需求和多元化的应用场景，基于盐单胞菌底盘菌株和NGIB工艺开发3HV单体比例可调、可持续和高效益生产P3HB3HV的方法，对进一步降低生产成本，拓宽P3HB3HV的材料学性能，具有十分重要的促进作用。
发明内容
基于目前现有技术中生产包含3HV单体的PHA，都需要在出发菌株中导入合成3HV相关的基因进行改造后，进行生产，对于3HV摩尔量的调控范围也受限等的问题。本申请提供了野生型盐单胞菌以及经过改造的盐单胞菌都适用的包含3HV单体的PHA的生产方法。该方法3HV的可调范围大，通过基因改造也可以上调3HV的摩尔量。具体的，利用特定碳源以及不同碳源之间的比例对盐单胞菌的培养进行调节，再结合基因编辑对盐单胞菌进行改造，可以获得3HV摩尔比在0-98%的范围内调整的PHA，以此调控包含3HV单体的PHA的材料性能。另外，也证实了通过弱化盐单胞菌内源β氧化循环途径的关键基因（例如fadB）可以显著上调PHA中3HV单体的摩尔比。具体方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法或调节盐单胞菌生产聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体摩尔比的方法，所述的方法包括以底物培养盐单胞菌，所述的底物包括戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上。
所述的底物还包括常规碳源，例如葡萄糖、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯、蔗糖、果糖、有机酸或有机酸盐中的一种或两种以上。所述的有机酸或有机酸盐例如乙酸、丙酸、丙酸盐、丁酸、丁酸盐、己酸、己酸盐或中长链脂肪酸（例如十二酸、棕榈油或油酸）中的一种或两种以上。
所述的盐可以为钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、铝盐、锌盐或铁盐等。例如所述的戊酸盐可以为戊酸钾、戊酸钙、戊酸钠、戊酸镁、戊酸铝、戊酸锌或戊酸铁等。例如所述的庚酸盐可以为庚酸钾、庚酸钙、庚酸钠、庚酸镁、庚酸铝、庚酸锌或庚酸铁等。
所述的底物包含在培养基中。
所述的培养基可以为固体培养基、液体培养基或半固体培养基。
当所述的培养基为液体培养基时，所述的底物浓度为0.0001-100g/L中的任一数值，优选1-50g/L中的任一数值，例如0.0001、0.1、1、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、20、30、40、50g/L等。
所述的戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上在培养基中的浓度为0.0001-10g/L中的任一数值，优选1-7g/L中的任一数值，例如0.0001、0.1、1、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10g/L等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的底物包括：
组分A：戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上；
组分B：葡萄糖；
其中，组分A与组分B的质量比（0.0001-7）：（0-30），例如（0.0001、1、2、3、4、5、6、7）：（0、5、10、15、20、25、30），优选7：（0-30），例如7：（0、5、10、15、20、25、30）。
所述的培养基中还包括氮源、无机盐以及微量元素、生长因子和其他有利于菌体生长和代谢的物质。
所述的氮源可以为无机氮源和/或有机氮源。所述的无机氮源例如硝酸盐、铵盐、亚硝酸盐或氨水等中的一种或两种以上。所述的有机氮源例如花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、酵母提取物、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸皮或废菌丝体等中的一种或两种以上。
所述的无机盐用于维持所述盐单胞菌所需的渗透压。例如钾盐和/或钠盐等。所述钾盐包括但不限于氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾、葡萄糖酸钾、硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾或磷酸二氢钾中的一种或两种以上。所述的钠盐包括但不限于氯化钠、硫酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖酸钠、硝酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸二氢中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，通过调整底物类型或含量或不同底物之间的比例可以调节菌体的生长、聚羟基脂肪酸酯的产量以及聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸的摩尔比。例如调整组分A与组分B的比例来调节PHA中3HV单体的摩尔比。
所述的聚羟基脂肪酸酯为由单体组成的均聚物或共聚物，所述的单体包括3-羟基戊酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯（PHA）包括但不限于PHV、P3HB3HV、P3HB4HB3HV或P3HB3HV3HHx中的一种或两种以上。
所述的聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体的摩尔比为0-98%中的任一数值，优选5-98%或60-98%中的任一数值。例如0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%等。
所述的盐单胞菌表达烯酰辅酶A水合酶（PhaJ）。优选的，所述的PhaJ可以为内源的或外源的。
优选的，所述的烯酰辅酶A水合酶来源于Aeromonas caviae（优选Aeromonascaviae FA440）和/或Aeromonas hydriphila（优选Aeromonas hydriphila 4AK4）。
其中，来源于Aeromonas caviae FA440的PhaJ的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或其变体。
进一步的，所述的盐单胞菌过表达烯酰辅酶A水合酶，所述的过表达包括提高烯酰辅酶A水合酶/基因（phaJ）的启动子强度和/或向盐单胞菌中导入烯酰辅酶A水合酶基因。例如在内源本底表达的基础上进一步导入phaJ实现过表达。又例如用比内源表达更强或活性更强的phaJ替换内源phaJ，即使内源phaJ失活后进行导入。
所述的导入的烯酰辅酶A水合酶编码基因在质粒上表达或在染色体上表达。
所述的导入采用表达载体导入，所述的表达载体包含PhaJ编码基因。
所述的PhaJ编码基因由诱导型启动子和/或组成型启动子调控，也可以由将组成型启动子改造为具有诱导特性的启动子进行调控。
所述的诱导型启动子包括但不限于P lux启动子、P lac启动子、phaP启动子或fadBA启动子中的一种或两种以上。
所述的P lux启动子为AHL（高丝氨酸内酯）型诱导型启动子。优选的，所述的AHL诱导浓度为0-2mM，优选为0.0001-0.01mM中任一数值，例如0、0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2mM。优选的，P lux启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5或其变体。
所述的P lac启动子（SEQ ID NO：6）为IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）型诱导型启动子。优选的，所述的IPTG诱导浓度为0-5g/L，优选为0.02-2g/L中任一数值，例如0、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5g/L。
P lac启动子（SEQ ID NO：6）：CCGCTTCTAGAGCTCGGTACCAAATTCCAGAAAAGAGGCCGCGAAAGCGGCCTTTTTTCGTTTTGGTCCtactagATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGcccatgagttaattatatttgtggcattatagggaGAattgtgagcgctcacaatt
所述的组成型启动子包括但不限于野生型P porin（SEQ ID NO：7）或其突变体。优选的，所述的P porin突变体包括但不限于突变型P porin58（SEQ ID NO：8）、突变型P porin42（SEQ IDNO：9）、突变型P porin68（SEQ ID NO：10）、突变型P porin140、突变型P porin278（SEQ ID NO：11）、突变型P porin194（SEQ ID NO：12）、突变型P porin211、突变型P porin221（SEQ ID NO：13）、突变型P porin203（SEQ ID NO：14）。
野生型P porin（SEQ ID NO：7）：ttgcgtTCACTGGAATCCCANNNtagagtTTGACCTGCGAGCA；
P porin42（SEQ ID NO：9）：ttgcgttcactggaatcccaCTAtagagtttgacctgcgagca；
P porin278（SEQ ID NO：11）：ttgcgttcactggaatcccagtatTAAAtttgacctgcgagca；
P porin194（SEQ ID NO：12）：ttgcgttcactggaatcccagtatCTAAtttgacctgcgagca；
P porin221（SEQ ID NO：13）：ttgcgttcactggaatcccagtatGCTAtttgacctgcgagca；
P porin203（SEQ ID NO：14）：ttgcgttcactggaatcccagtatCCCTtttgacctgcgagca。
所述的phaP启动子具有PHA颗粒调控蛋白（PhaR）的结合位点，以产生的PHA为诱导剂进行调控表达。当然也可以将现有技术中的组成型启动子改造为包含PhaR结合位点且具有启动子活性，以产生的PHA为诱导剂进行调控表达（可参考专利申请2021116569347中的技术）。
所述的fadBA启动子具有响应油酸的蛋白质的结合位点，以油酸为诱导剂进行调控表达。当然也可以将现有技术中的组成型启动子改造为包含可以响应油酸的蛋白质的结合位点且具有启动子活性，以油酸为诱导剂进行调控表达（可参考专利申请2022103805971中的技术）。
导入的烯酰辅酶A水合酶来源于Aeromonas caviae（优选Aeromonas caviae FA440）和/或Aeromonas hydriphila（优选Aeromonas hydriphila 4AK4）中的一种或两种以上。
所述的盐单胞菌还表达或过表达PHA水合酶（PhaC）。优选的，所述的PhaC可以为内源的或外源的。
优选的，所述的PhaC来源于Halomonas bluephagenesis（优选Halomonas bluephagenesis TD01）、Aeromonas caviae（优选Aeromonas caviae FA440）或Aeromonas hydriphila（优选Aeromonas hydriphila 4AK4）中的一种或两种以上。
其中，来源于Aeromonas caviae FA440的PhaC的氨基酸序列包含SEQ ID NO：18。
所述的过表达包括提高内源PhaC编码基因的启动子强度和/或向盐单胞菌中导入PhaC编码基因和/或将内源PhaC替换为酶活性更好的PhaC，例如替换为Aeromonas caviae（优选Aeromonas caviae FA440）来源的PhaC。
所述的导入的PhaC编码基因在质粒上表达或在染色体上表达。
所述的PhaC编码基因由诱导型启动子和/或组成型启动子调控，也可以由将组成型启动子改造为具有诱导特性的启动子进行调控。
所述的方法包括弱化盐单胞菌内源β氧化循环途径的关键基因，例如fadA、fadB、fadD、fadE或fadL等。优选的，所述的方法包括盐单胞菌内源β氧化循环途径的关键基因失活。
所述的失活包括：敲除或敲低β氧化循环途径的关键基因的全部或部分，和/或，突变β氧化循环途径的关键基因，使得该基因无法正常表达蛋白或表达的蛋白活性减弱或无活性。
优选的，所述的盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。
所述的脂肪酸氧化复合物亚基α为FadB（包含SEQ ID NO：3）。
所述的方法包括敲除或敲低脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因（fadB）。优选的敲除fadB的全部或部分碱基，或者通过突变使得该基因无法正常表达蛋白，或者，表达的蛋白活性减弱或无活性。
所述的方法包括使用靶向fadB的sgRNA进行敲除或敲低，所述的sgRNA包含SEQ IDNO：15或2。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱，所述的盐单胞菌不表达内源PHA水合酶，以及，所述的盐单胞菌表达来源于Halomonas bluephagenesis、Aeromonas caviae或Aeromonas hydriphila的PHA水合酶，和表达来源于Aeromonas caviae或Aeromonas hydriphila的烯酰辅酶A水合酶。
优选的，所述的盐单胞菌表达4-羟基丁酰辅酶A转移酶。
优选的，所述的盐单胞菌不表达月桂酰酰基转移酶和/或脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶，或表达的月桂酰酰基转移酶和/或脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶不具有功能。
优选的，所述的盐单胞菌不表达PHA颗粒结构蛋白1，或表达的PHA颗粒结构蛋白1不具有功能。
所述的盐单胞菌的基因组中包含phaCAB。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌为将4HB-CoA转移酶编码基因整合进基因组，敲除或敲低phaP1基因，敲除或敲低lpxL基因，敲除或敲低lpxM基因，将表达phaCAB的PMmp1启动子替换为Pporin启动子，再过表达与必需基因ompW相关联的额外的phaCAB。
所述的盐单胞菌为盐单胞菌属，例如包括Halomonas bluephagenesis或其衍生菌、Halomonas campaniensis或其衍生菌或Halomonas aydingkolgenesis或其衍生菌。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌为Halomonas bluephagenesisWZY278，该菌具有外膜缺陷，利于下游提取等特点，但是并不适用于生产3HV，本申请通过调节底物，将该菌用于生产3HV，且3HV的摩尔量可调。
所述培养的条件可以根据具体盐单胞菌适当调整。
所述的培养包括种子培养、摇瓶培养或发酵罐培养。
所述培养的温度为30-40℃。
所述培养过程无需灭菌。
本发明的第二方面，提供了一种上述的方法获得的聚羟基脂肪酸酯。
本发明的第三方面，提供了一种上述方法制备的聚羟基脂肪酸酯在制备生物可降解材料中的应用。例如医用植入材料、可降解包装材料、食品级涂层材料和动物饲料等。
本发明的第四方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌，所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。
所述的脂肪酸氧化复合物亚基α为FadB。
所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能通过敲除或敲低脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因实现。
优选的，使用靶向脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因的sgRNA进行敲除或敲低，所述的sgRNA包含SEQ ID NO：15或2。
所述的重组盐单胞菌表达或过表达烯酰辅酶A水合酶。所述的烯酰辅酶A水合酶来源于Aeromonas caviae（优选Aeromonas caviae FA440）和/或Aeromonas hydriphila（优选Aeromonas hydriphila 4AK4）。
所述的盐单胞菌还表达或过表达PHA水合酶（PhaC）。优选的，所述的PhaC可以为内源的或外源的。
优选的，所述的PhaC来源于Halomonas bluephagenesis（优选Halomonasbluephagenesis TD01）、Aeromonas caviae（优选Aeromonas caviae FA440）或Aeromonas hydriphila（优选Aeromonas hydriphila 4AK4）中的一种或两种以上。
所述的聚羟基脂肪酸酯为由单体组成的均聚物或共聚物。所述的单体包括3-羟基戊酸。
所述的重组盐单胞菌包括Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis或Halomonas aydingkolgenesis。
所述的重组盐单胞菌以包含戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上为底物，生产包含3-羟基戊酸单体的聚羟基脂肪酸酯。
本发明的第五方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌，所述的重组盐单胞菌过表达烯酰辅酶A水合酶。
优选的，所述的烯酰辅酶A水合酶来源于Aeromonas caviae（优选Aeromonas caviae FA440）和/或Aeromonas hydriphila（优选Aeromonas hydriphila 4AK4）。
优选的，所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。
本发明的第六方面，提供了一种重组盐单胞菌，所述的重组盐单胞菌不表达月桂酰酰基转移酶和/或脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶，或表达的月桂酰酰基转移酶和/或脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶不具有功能。
优选的，所述的盐单胞菌不表达PHA颗粒结构蛋白1，或表达的PHA颗粒结构蛋白1不具有功能。
优选的，所述的盐单胞菌表达4-羟基丁酰辅酶A转移酶。
所述的盐单胞菌的基因组中包含phaCAB。
所述的盐单胞菌的基因组中包含phaCAB。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌为将4HB-CoA转移酶编码基因整合进基因组，敲除或敲低phaP1基因，敲除或敲低lpxL基因，敲除或敲低lpxM基因，将表达phaCAB的PMmp1启动子替换为Pporin启动子，再过表达与必需基因ompW相关联的额外的phaCAB。
本发明的第七方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的重组盐单胞菌的制备方法，所述的重组盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱。
所述的重组盐单胞菌表达烯酰辅酶A水合酶。
所述的聚羟基脂肪酸酯为由单体组成的均聚物或共聚物，所述的单体包括3-羟基戊酸。
所述的制备方法包括使用靶向脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因的sgRNA进行敲除或敲低，所述的sgRNA包含SEQ ID NO：15或2。
所述的制备方法包括：
1）敲除盐单胞菌的fadB基因，优选的，使用CRISPR/Cas9基因组编辑方法来敲除fadB基因；优选的，所述的CRISPR/Cas9基因组编辑方法包括使用sgRNA，优选所述的sgRNA的核苷酸序列包含如SEQ ID NO：15或2所示核苷酸序列。
2）将1）获得的fadB基因失活质粒结合转化至盐单胞菌中。
所述的制备方法包括提高烯酰辅酶A水合酶编码基因的启动子强度和/或向重组盐单胞菌中导入异源的烯酰辅酶A水合酶编码基因。
导入的烯酰辅酶A水合酶编码基因在质粒上表达或在染色体上表达。
所述的烯酰辅酶A水合酶编码基因由诱导型启动子和/或组成型启动子调控。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括将下列任一种或两种以上的质粒导入盐单胞菌中：
a）phaJ FA440基因表达质粒；
b）fadB基因失活质粒。优选sgRNA、上下游同源臂，和/或，Cas9蛋白的编码基因，进一步优选的，所述的sgRNA靶向fadB基因，所述的上下游同源臂来源于fadB基因。
本发明的第八方面，提供了一种上述制备方法获得的重组盐单胞菌。
本发明的第九方面，提供了一种载体，所述的载体为phaJ FA440基因表达质粒、fadB基因失活质粒或phaC-phaJ功能模块整合质粒中的一种或两种以上。
所述的phaJ FA440基因表达质粒包含phaJ FA440基因，优选还包括调控元件。
phaC-phaJ功能模块整合质粒包含phaC基因和phaJ基因，以及上下游同源臂。优选的，所述的phaC-phaJ功能模块整合质粒的序列包含SEQ ID NO：4或其变体。
优选的，所述的载体上还包含启动子，例如诱导型启动子和/或组成型启动子，也可以为将组成型启动子改造为具有诱导特性的启动子。
优选的，所述的载体还包括中还包含核糖体结合位点和终止子。进一步优选的，所述的核糖体结合位点，和/或，终止子可以是现有技术中任一核糖体结合位点，和/或，终止子序列。
本发明的第十方面，提供了包含上述载体的细胞。
本发明的第十一方面，提供了上述的载体、细胞、盐单胞菌或重组盐单胞菌在生产PHA（特别是P3HB3HV）中的应用。
本发明的第十二方面，提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，所述的方法包括培养上述的重组盐单胞菌，和/或，上述的制备方法获得的重组盐单胞菌。
本发明的第十三方面，提供了一种发酵方法，所述的发酵方法包括发酵培养上述的重组盐单胞菌，和/或，上述的制备方法获得的重组盐单胞菌。
优选的，所述的发酵培养使用的培养基为现有技术已知的培养基或者为了适应微生物的生存和产生产物适当的调整培养基的成分。也可以采用上述所述的包含戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐一种或两种以上为底物。
本发明的第十四方面，提供了一种发酵方法，所述的发酵方法包括以戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐一种或两种以上为底物培养盐单胞菌生产包含3HV单体的PHA。
优选的，所述的发酵方法无需灭菌。
优选的，所述的发酵产物优选为P3HB3HV。
所述发酵的条件可以根据具体重组盐单胞菌适当调整。
所述发酵的设备可以为摇瓶、小试发酵罐、中试发酵罐或者工业大量生产的大型发酵罐。
本发明的第十五方面，提供了一种调节盐单胞菌生产聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体摩尔比的方法，所述的方法包括培养上述的重组盐单胞菌，和/或，上述的制备方法获得的重组盐单胞菌。
所述的培养过程中碳源包括戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐一种或两种以上。优选的，所述的碳源还包括葡萄糖。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源包括：
组分A：戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上；
组分B：葡萄糖；
其中，组分A与组分B的质量比（0.0001-7）：（0-30）。
本发明的第十六方面，提供了一种用盐单胞菌催化底物生产3-羟基戊酸或包含3-羟基戊酸单体的PHA的方法，所述的方法培养盐单胞菌，所述的底物包括戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上。
本发明的第十七方面，提供了一种培养盐单胞菌生产包含3HV单体的PHA的培养基，所述的培养基中包含碳源，所述的碳源包含戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上。优选还包含葡萄糖。
所述的盐单胞菌可以为野生型或改造型，所述的改造型优选为上述的重组盐单胞菌。
本发明所述的“β氧化循环途径”是指将脂肪酸分解为较短的脂肪酸和乙酰辅酶A以及乙酰辅酶A与脂肪酸合成长的脂肪酸的过程。包括脂肪酸的激活，即将脂肪酸与辅酶A结合形成酰辅酶A；脂肪酸的转运，即将酰辅酶A转运到线粒体内；脂肪酸的氧化，即将酰辅酶A分解为较短的脂肪酸和乙酰辅酶A；脂肪酸的合成，即将乙酰辅酶A与其他脂肪酸合成更长的脂肪酸。所述的“β氧化循环途径的关键基因”包括所有在β氧化循环途径中涉及的酶的编码基因以及调控这些酶的活性或表达的基因，所述的酶例如激活所需的酶、转运所需的酶、氧化所需的酶、合成所需的酶。
本发明所述的“过表达”为将基因上调表达，高于原本天然的表达量或使得原本不表达变为表达。其中，所述的“上调表达”可以为通过强化调控元件，上调基因的表达，也可以通过进一步导入一定拷贝数的编码序列等等。
本发明所述的“变体”可以为经过取代、缺失、突变、插入等方式获得的同源性在一定范围的序列，且该序列依然保留原始的活性或高于原始的活性或具备了其他的优势等等，所述的同源性范围优选为60-100%中的任一数值，例如60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99.1%、99.5%、99.9%、100%等。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含所有描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤；当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本申请英文简写与中文全称对照见表1。
表1：英文简写与中文全称对照
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本申请提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下内容，以实施例的方式详细描述本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中使用的Halomonas bluephagenesis TD01为专利申请公开号CN102120973A中记载的(Halomonas sp.) TD01；公众可以从清华大学获得该菌。
实施例中使用的Halomonas bluephagenesisWZY 278为将4HB-CoA转移酶编码基因整合进重组Halomonas bluephagenesis TD01基因组，ΔphaP1，ΔlpxL，ΔlpxM，将表达phaCAB的PMmp1启动子替换为Pporin启动子，再过表达与必需基因ompW相关联的额外的phaCAB，具体详见文章Ji, M., et al. PHB production from food waste hydrolysatesbyHalomonas bluephagenesisHarboring PHB operon linked with an essential gene.Metabolic Engineering, 2023, 77, 12-20.中记载的(Halomonas sp.) WZY278；公众可以从清华大学获得该菌。
实施例中关于盐单胞菌的位点例如G3、G4等参照或者延用文章：聚（3-羟基丁酸-co-4羟基丁酸酯）的低成本工业化生产（清华大学理学博士学位论文，叶健文、陈国强），或者文章：Stimulus response-based fine-tuning of polyhydroxyalkanoate pathway in Halomonas（Ye JW et al，Metabolic Engineering，2020）的命名规则。具体的，G3（guideRNA）：AATAGTGGCGCGGCTAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG（SEQ ID NO：16），G4（guide RNA）：TTCACCTAGCTAGATGAGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG（SEQID NO：17）。
大肠杆菌生长在LB培养基中，培养基成分配置含有：10g/L的氯化钠，10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母提取物，0.1-50g/L碳源组合。
盐单胞菌如无特殊说明，均在60LB的培养基上培养。60LB成分除氯化钠的浓度调整至60g/L外其它成分同LB一样。
大肠杆菌和盐单胞菌的生长温度均为37℃。
本申请中所使用的盐单胞菌基因编辑技术中的CRISPR/Cas9技术，包括内源DNA敲除和异源DNA整合技术，参见文献Qin et.al. CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp. Metabolic Engineering. 47 (2018) 219-229。
摇瓶发酵P3HB3HV培养基：
60LB发酵培养基：60g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，0.1-50g/L碳源组合。
60MM培养基：60g/L氯化钠，1.0g/L酵母提取物，0.6g/L尿素，1.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L硫酸镁，3.81g/L磷酸氢二钠，10.0ml/L的组分III，1.0ml/L组分IV。碳源按实际需要添加。
组分III：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L二水氯化钙，浓盐酸（12mol/L）41.7ml，加水定容至1000mL。
组分IV：100mg/L七水硫酸锌，30mg/L四水氯化锰，300mg/L硼酸，200mg/L六水氯化钴，10mg/L无水硫酸铜，20mg/L六水氯化镍，30mg/L二水钼酸钠。
以上培养基均可以采用标准配制方法制得。
细胞干重测定方法：
称量50mL空离心管的质量；用离心管收集一定体积经摇瓶或发酵罐培养后的菌液，10000×g离心10min后，弃上清收集菌体；用适量去离子水重悬菌体后以10000×g离心10min，弃上清后再次收集菌体；将得到的菌体沉淀置于-80℃低温冰箱冷冻3h以上后，放入真空冷冻干燥机内至恒重；称量离心管和管内干燥菌体的总重；利用差量法计算细胞干重。
P3HB3HV检测方法：
取30-40mg干燥的菌体或15mg左右标样置于酯化管中，加入2mL酯化液（色谱纯甲醇溶液中添加3%（v/v）浓硫酸和0.5g/L苯甲酸）和2mL氯仿，加盖密封；100℃恒温反应4h后冷却至室温；每管均加入1mL去离子水，振荡混匀后静置至液体完全分层；吸取适量的下层氯仿样品用于GC分析；GC分析程序为：柱温由室温升至80℃后停留90s，0.5℃/s的速率升温至140℃后停留0s，0.7℃/s的速率升温至240℃后停留分析120s，降至室温结束分析；采用内标归一法，根据峰面积值对PHA进行定量分析，并计算出PHA占细胞干重的质量比，以及3HB和3HV占PHA的摩尔比。
P3HB3HV的含量（wt%）=(3HB的质量+3HV的质量)÷冷冻干燥产物的质量×100%；
3HV的含量(mol%)=3HV的摩尔数÷(3HB的摩尔数+3HV的摩尔数)×100%；
3HB的含量(mol%)=3HB的摩尔数÷(3HB的摩尔数+3HV的摩尔数)×100%。
本申请所述的实施方式是对生产P3HB3HV的盐单胞菌构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
实施例1：野生型盐单胞菌利用碳源生产P3HB3HV
盐单胞菌在60MM培养基中以不同类型的碳源为底物，在摇瓶中发酵生产P3HB3HV。
具体实施过程如下：
将盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01接种到20mL的60LB培养基中，培养10-12h后按1%的体积比转接到新的20mL的60LB培养基中，继续培养8-12h，作为摇瓶发酵种子液。
将2.5mL的发酵种子液接种到含有47.5mL 60MM培养基的500mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。碳源浓度为7g/L，摇床温度为37℃，转速为200rpm。培养48h后，检测细胞干重、PHA含量以及3HV含量，每组实验设三个平行，结果取均值，结果见表2。
表2：Halomonas bluephagenesis TD01利用不同的碳源生产P3HB3HV
结果显示，盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01能以戊酸或戊酸钠，庚酸或庚酸钠为碳源合成P3HB3HV，且3HV单体的摩尔比高于60%。
实施例2：盐单胞菌WZY278利用碳源生产P3HB3HV
盐单胞菌WZY278在60MM培养基中以不同比例的碳源为底物，在摇瓶中发酵生产P3HB3HV。
具体实施过程如下：
将盐单胞菌Halomonas bluephagenesis WZY278接种到20mL的60LB培养基中，培养10-12h后按1%的体积比转接到新的20mL的60LB培养基中，继续培养8-12h，作为摇瓶发酵种子液。
将2.5mL的发酵种子液接种到含有47.5mL 60MM培养基的500mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。碳源为葡萄糖和/或戊酸钠组成的混合碳源，摇床温度为37℃，转速为200rpm。培养48h后，检测细胞干重、PHA含量以及3HV含量，每组实验设三个平行，结果取均值，结果见表3。
表3：Halomonas bluephagenesis WZY278利用不同比例的碳源生产PHA
结果显示，盐单胞菌Halomonas bluephagenesis WZY278能以混合碳源合成P3HB3HV，且可利用混合碳源比例调节3HV单体的摩尔比。
实施例3：重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis G34利用碳源生产P3HB3HV
在实施例1中，野生型Halomonas bluephagenesis TD01能以戊酸或戊酸钠，庚酸或庚酸钠为底物合成P3HB3HV。本实施例进一步通过基因改造制备盐单胞菌Halomonas bluephagenesis G34菌株并验证利用底物生产P3HB3HV的能力。
盐单胞菌Halomonas bluephagenesis G34为在Halomonas bluephagenesis TD01菌株的基础上，敲除内源的phaC基因和fadB基因并将优化的phaC基因和phaJ基因功能表达模块整合至基因组上后优选获得的重组菌株。
构建菌株具体步骤如下：
1）敲除phaC基因获得PHA合成酶功能缺陷型嗜盐菌Halomonas bluephagenesis，命名为TDC。
PHA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示：MLSGWKMPSQGVSQEELEAWKVQLSDVGEQYKGLLEDLLSRMVPSEAADSVQSDMRESFEAAAQSLMSNPNLLWQTQSRLLQDQWLLWQQGVRAMSGEQVTPLVTPAKGDRRFKDEAWTQEPYYLAIMQQYLLFSQMVEELIESLDDLDPTQKRNLAFYARQLVSAMSPTNFVSTNPEVMRCTLETRGQNLVDGLTRLREDLANSAEGINVRMTDRSAFGVGDNIAVTPGAVVYENELIQLIQYTPTTEKTFKTPLLIVPPWINKYYILDLREDNSLVKWMVDQGHTVFLISWRNPGPEQRDITWADYMQMGPISAMEAIEQACGEKSVNLLSYCVGGTLTASTVAYLTSTRRGRKVKSVTYMATLQDFRDPGDIGVFLNERVVEGIENTLEMKGYLDGRSMAYTFNLLRENDLFWSFYINNYLKGEIPAAFDLLYWNTDGTNLPAGTHAWYLRHMYLENRLVEPGGIELDEVKIDLRKISAPCYFVSTKEDHIAKWNSTYYGALLPKGPVTFVLGGSGHIAGIVNPPHKNKYGYWTNDALPETHDAWQEGSTFNEGSWWPHWQAWVTENGYADPDPEKMVSARQPGEGELNVIESAPGRYVKMTIPEVLGELPAS（SEQ ID NO：19）
2）使用CRISPR/Cas9基因组编辑方法来敲除fadB。具体地，含有sgRNA（attcgccccacgctctcttagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc，SEQ ID NO：2）及重组模板的质粒构建方法为：将上下游各1000bp同源臂，sgRNA表达模块等DNA片段通过Gibson Assembly方法插入至原始表达质粒pSEVA241（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因）上。质粒排列顺序依次为：sgRNA表达模块-上游同源臂-下游同源臂。
将表达sgRNA及重组模板的pSEVA241质粒和表达Cas9的pQ08质粒通过大肠杆菌E.coliS17-1接合转化至相应的盐单胞菌中。
FadB的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：MIYQGNAITVERRDTQGGNDIAKLTFDLKDESVNKLSSAVVAELGEAVKALQAESGLQGLMISSGKDAFIVGADITEFHSLFDKGEEYLVEMNLKVHDIFNAIEDLPFPTVTAINGLALGGGCEVLLTTDFRVMSEKAKIGLPETKLGILPGWGGCVRLPRLIGADNAIEWIAGGTENRANAALKVGAVDAVVTHELLEEAALDILDRANAGELDYQARREEKKSPLNLNAIEQMMAFETAKGFVAGKAGPHYPAPVESIKVIQKGAGETRARAQAIEAKAFAKLALSSVAFNLVGLFLNDQVVKKKGSKYEKQSQPVKQTAVLGAGIMGGGIAYQSASKGTPIVMKDINEEAIELGLKEARKLFSKQVERKKLTTEQMAEKLTNIRPTLSYGDFGNVDLVVEAVVENPKVKDAVLTEVEGMVSESTILTSNTSTISINRLAKNLKRPENFCGMHFFNPVHRMPLVEVIRGEKTSDAAVAATVAYARAMGKTPIVVNDCPGFLVNRVLFPYFGGFSFLVEQGADFQRVDKVMEKFGWPMGPAYLLDVVGLDTAVHANEVMAEGFPDRMARDGKTAIQVMYDNKRLGQKNDKGFYAYEEDKKGKPKKVTDEQAYALVKDVVKEQKEFSDEDIIARMMVPLCLETVRCLEDGIVETPAEADMALIYGIGFPPFRGGALRYIDAMGVAEFVKLAENLAEELGPLYAPTEKLRQMAQNNEQFYSGTQA
通过菌落PCR设计引物筛选基因敲除的fadB突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。进一步的，通过在液体培养基中连续、多次传代基因组编辑成功后的菌株，并分别在壮观霉素抗性、氯霉素抗性和无抗性的平板上划线培养，鉴定出CRISPR/Cas9质粒丢失的菌株，便于下一轮基因组编辑。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实相应盐单胞菌基因组中fadB基因已敲除。
3）phaC-phaJ功能模块整合质粒的构建
phaC-phaJ功能模块包括启动子、RBS、来源于Aeromonas caviaeFA440的phaC（氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示）、终止子，以及启动子、RBS、来源于Aeromonas caviaeFA440的phaJ、终止子，即Pporin58-RBS1-phaC FA440-T1-Pporin68-RBS2-phaJ FA440-T2（SEQ ID NO：4）。
ttgcgttcactggaatcccaatatagagtttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggagaaatactagatgagccaaccatcttatggcccgctgttcgaggccctggcccactacaatgacaagctgctggccatggccaaggcccagacagagcgcaccgcccaggcgctgctgcagaccaatctggacgatctgggccaggtgctggagcagggcagccagcaaccctggcagctgatccaggcccagatgaactggtggcaggatcagctcaagctgatgcagcacaccctgctcaaaagcgcaggccagccgagcgagccggtgatcaccccggagcgcagcgatcgccgcttcaaggccgaggcctggagcgaacaacccatctatgactacctcaagcagtcctacctgctcaccgccaggcacctgctggcctcggtggatgccctggagggcgtcccccagaagagccgggagcggctgcgtttcttcacccgccagtacgtcaacgccatggcccccagcaacttcctggccaccaaccccgagctgctcaagctgaccctggagtccgacggccagaacctggtgcgcggactggccctcttggccgaggatctggagcgcagcgccgatcagctcaacatccgcctgaccgacgaatccgccttcgagctcgggcgggatctggccctgaccccgggccgggtggtgcagcgcaccgagctctatgagctcattcagtacagcccgactaccgagacggtgggcaagacacctgtgctgatagtgccgcccttcatcaacaagtactacatcatggacatgcggccccagaactccctggtcgcctggctggtcgcccagggccagacggtattcatgatctcctggcgcaacccgggcgtggcccaggcccaaatcgatctcgacgactacgtggtggatggcgtcatcgccgccctggacggcgtggaggcggccaccggcgagcgggaggtgcacggcatcggctactgcatcggcggcaccgccctgtcgctcgccatgggctggctggcggcgcggcgccagaagcagcgggtgcgcaccgccaccctgttcactaccctgctggacttctcccagcccggggagcttggcatcttcatccacgagcccatcatagcggcgctcgaggcgcaaaatgaggccaagggcatcatggacgggcgccagctggcggtctccttcagcctgctgcgggagaacagcctctactggaactactacatcgacagctacctcaagggtcagagcccggtggccttcgatctgctgcactggaacagcgacagcaccaatgtggcgggcaagacccacaacagcctgctgcgccgtctctacctggagaaccagctggtgaagggggagctcaagatccgcaacacccgcatcgatctcggcaaggtgaagacccctgtgctgctggtgtcggcggtggacgatcacatcgccctctggcagggcacctggcagggcatgaagctgtttggcggggagcagcgcttcctcctggcggagtccggccacatcgccggcatcatcaacccgccggccgccaacaagtacggcttctggcacaacggggccgaggccgagagcccggagagctggctggcaggggcgacgcaccagggcggctcctggtggcccgagatgatgggctttatccagaaccgtgacgaagggtcagagcccgtccccgcgcgggtcccggaggaagggctggcccccgcccccggccactatgtcaaggtgcggctcaaccccgtgtttgcctgcccaacagaggaggacgccgcatgatgataagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagagccgcttctagagctcggtaccaaattccagaaaagaggccgcgaaagcggccttttttcgttttggtcctactagatgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccagactagagtttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggagaaatactagatgagcgcacaatccctggaagtaggccagaaggcccgtctcagcaagcggttcggggcggcggaggtagccgccttcgccgcgctctcggaggacttcaaccccctgcacctggacccggccttcgccgccaccacggcgttcgagcggcccatagtccacggcatgctgctcgccagcctcttctccgggctgctgggccagcagttgccgggcaaggggagcatctatctgggtcaaagcctcagcttcaagctgccggtctttgtcggggacgaggtgacggccgaggtggaggtgaccgcccttcgcgaggacaagcccatcgccaccctgaccacccgcatcttcacccaaggcggcgccctcgccgtgacgggggaagccgtggtcaagctgccttaactgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggattactagaggtcatgcttgccatctgttttcttgcaagat（SEQ ID NO：4）
使用CRISPR/Cas9基因组编辑方法来整合目标DNA序列。具体地，含有sgRNA及重组模板的质粒构建方法为：将上下游各1000bp同源臂，sgRNA表达模块，phaC-phaJ功能模块等DNA片段通过Gibson Assembly方法插入至原始表达质粒pSEVA241(含卡那霉素和壮观霉素抗性基因)上。质粒排列顺序依次为：sgRNA表达模块-上游同源臂-“phaC-phaJ功能模块”-下游同源臂。
phaC FA440的氨基酸序列（SEQ ID NO：18）：MSQPSYGPLFEALAHYNDKLLAMAKAQTERTAQALLQTNLDDLGQVLEQGSQQPWQLIQAQMNWWQDQLKLMQHTLLKSAGQPSEPVITPERSDRRFKAEAWSEQPIYDYLKQSYLLTARHLLASVDALEGVPQKSRERLRFFTRQYVNAMAPSNFLATNPELLKLTLESDGQNLVRGLALLAEDLERSADQLNIRLTDESAFELGRDLALTPGRVVQRTELYELIQYSPTTETVGKTPVLIVPPFINKYYIMDMRPQNSLVAWLVAQGQTVFMISWRNPGVAQAQIDLDDYVVDGVIAALDGVEAATGEREVHGIGYCIGGTALSLAMGWLAARRQKQRVRTATLFTTLLDFSQPGELGIFIHEPIIAALEAQNEAKGIMDGRQLAVSFSLLRENSLYWNYYIDSYLKGQSPVAFDLLHWNSDSTNVAGKTHNSLLRRLYLENQLVKGELKIRNTRIDLGKVKTPVLLVSAVDDHIALWQGTWQGMKLFGGEQRFLLAESGHIAGIINPPAANKYGFWHNGAEAESPESWLAGATHQGGSWWPEMMGFIQNRDEGSEPVPARVPEEGLAPAPGHYVKVRLNPVFACPTEEDAA
phaJ FA440的氨基酸序列（SEQ ID NO：1）：
MSAQSLEVGQKARLSKRFGAAEVAAFAALSEDFNPLHLDPAFAATTAFERPIVHGMLLASLFSGLLGQQLPGKGSIYLGQSLSFKLPVFVGDEVTAEVEVTALREDKPIATLTTRIFTQGGALAVTGEAVVKLP（SEQ ID NO：1）
Pporin58序列（SEQ ID NO：8）：TtgcgttcactggaatcccaATAtagagtttgacctgcgagca
Pporin68序列（SEQ ID NO：10）：ttgcgttcactggaatcccaGACtagagtttgacctgcgagca
4）将嗜盐菌TDC基因组中G3，G4位点敲入phaC-phaJ功能模块得到的重组嗜盐菌命名为Halomonas bluephagenesis G34。
将表达sgRNA及重组模板的pSEVA241质粒和表达Cas9的pQ08质粒通过大肠杆菌E.coli S17-1接合转化至嗜盐菌TDC中。
通过菌落PCR设计引物筛选phaC-phaJ功能模块敲入突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。进一步的，通过在液体培养基中连续、多次传代基因组编辑成功后的菌株，并分别在壮观霉素抗性、氯霉素抗性和无抗性的平板上划线培养，鉴定出CRISPR/Cas9质粒丢失的菌株，便于下一轮基因组编辑。
最终，经过菌落PCR和DNA测序确认，证实重组嗜盐菌基因组中特定的位点已敲入phaC-phaJ功能模块。
底物验证具体实施过程如下：
将盐单胞菌Halomonas bluephagenesis G34接种到20mL的60LB培养基中，培养10-12h后按1%的体积比转接到新的20mL的60LB培养基中，继续培养8-12h，作为摇瓶发酵种子液。
将2.5mL的发酵种子液接种到含有47.5mL 60MM培养基的500mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。添加7g/L的庚酸钠或戊酸钠作为碳源，摇床温度为37℃，转速为200rpm。培养48h后，检测细胞干重、P3HB3HV含量以及3HV含量，每组实验设三个平行，结果取均值，结果见表4。
表4：重组盐单胞菌利用不同的碳源为底物生产P3HB3HV
结果显示，盐单胞菌Halomonas bluephagenesis G34能以庚酸钠或戊酸钠为碳源合成P3HB3HV，且3HV的摩尔比超过了90mol%。
实施例4：过表达phaJ基因对重组盐单胞菌利用不同碳源生产P3HB3HV的影响
在本实施例中，探究了过表达phaJ FA440基因（氨基酸序列包含SEQ ID NO：1）对重组盐单胞菌利用碳源生产P3HB3HV的影响。
具体实施过程如下：
（1）诱导型phaJ FA440基因表达质粒的构建
以盐单胞菌Halomonas bluephagenesis G34的基因组为模板，设计特定引物分别PCR扩增phaJ FA440基因元件。直接合成AHL诱导型启动子元件（含AHL启动子（Plux：Acctgtaggatcgtacaggtttacgcaagaaaatggtttgttactttcgaataaa，SEQ ID NO：5）和调控模块），核糖体结合位点RBS，终止子Terminator。利用GibsonAssembly技术将表达模块“Plux-RBS-phaJ FA440-Terminator”组合至低拷贝质粒pSEVA321的多酶切位点中。经过菌落PCR和基因测序确认后，将成功构建的质粒命名为：p321-Plux-phaJ FA440。
（2）过表达phaJ FA440重组盐单胞菌的构建
将构建好的质粒p321-Plux-phaJ FA440首先转化至E.coliS17-1中，然后通过接合转化的方法将质粒p321-Plux-phaJ FA440分别转化至不同种类的盐单胞菌中，得到不同的重组盐单胞菌菌株。
具体的，将质粒p321-Plux-phaJ FA440转化至野生型盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01中得到的重组盐单胞菌命名为：TD-phaJ FA440。
具体的，将质粒p321-Plux-phaJ FA440转化至重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis G34中得到的重组盐单胞菌命名为：G34-phaJ FA440。
（3）摇瓶发酵实验
将上述重组盐单胞菌菌株分别接种到20mL的60LB(含25μg/mL的氯霉抗生素)培养基中，培养10-12h后按1%的体积比转接到新的20mL的60LB(含25μg/mL的氯霉抗生素)培养基中，继续培养8-12h，作为摇瓶发酵种子液。
将2.5mL的发酵种子菌液接种到含有47.5mL 60MM发酵培养基的500mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。氯霉抗生素浓度为25μg/mL。AHL浓度为0，10×10-4mM，100×10-4mM。戊酸钠浓度为7g/L。摇床温度为37℃，转速为200rpm。培养48h后，检测细胞干重和PHA含量，每组实验设三个平行，结果取均值，结果见表5。
表5：过表达phaJ FA440基因对重组盐单胞菌生产P3HB3HV的影响
结果显示，通过过表达phaJ FA440基因能进一步提高P3HB3HV共聚物中3HV单体的摩尔比。这也说明，可以通过调控phaJ FA440基因的表达量来调控P3HB3HV共聚物中3HV单体的摩尔比。
实施例5：失活内源fadB基因对重组盐单胞菌利用碳源生产P3HB3HV的影响
在实施例2中，重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesisG34能以五碳或七碳为底物合成P3HB3HV，且3HV单体的摩尔比高于90mol%。这一结果提示：通过弱化盐单胞菌内源的fadB可以进一步提高P3HB3HV共聚物中3HV单体的摩尔比。在本实施例中，探究敲除野生型盐单胞菌Halomonas bluephagenesisTD01内源的fadB基因对菌株合成P3HB3HV的影响。
具体实施过程如下：
（1）敲除盐单胞菌的fadB基因
使用CRISPR/Cas9基因组编辑方法来敲除目标基因。具体地，含有sgRNA（attcgccccacgctctcttaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG，SEQ ID NO：15）及重组模板的质粒构建方法为：将上下游各1000bp同源臂，sgRNA表达模块等DNA片段通过Gibson Assembly方法插入至原始表达质粒pSEVA241（含卡那霉素和壮观霉素抗性基因）上。质粒排列顺序依次为：sgRNA表达模块-上游同源臂-下游同源臂。
将表达sgRNA及重组模板的pSEVA241质粒和表达Cas9的pQ08质粒通过大肠杆菌E.coliS17-1接合转化至相应的盐单胞菌中。
通过菌落PCR设计引物筛选基因敲除的fadB突变株，并且通过基因测序确认。菌落PCR为常规操作。进一步的，通过在液体培养基中连续、多次传代基因组编辑成功后的菌株，并分别在壮观霉素抗性、氯霉素抗性和无抗性的平板上划线培养，鉴定出CRISPR/Cas9质粒丢失的菌株，便于下一轮基因组编辑。
最终，经过菌落PCR和基因测序确认，证实相应盐单胞菌基因组中fadB基因已敲除。
具体的，将嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01基因组中fadB基因敲除得到的重组盐单胞菌命名为，Halomonas bluephagenesis TD01（ΔfadB）。
（2）摇瓶验证重组盐单胞菌生产P3HB3HV的能力
将重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01（ΔfadB）接种到20mL的60LB培养基中，培养10-12h后按1%的体积比转接到新的20mL的60LB培养基中，继续培养8-12h，作为发酵种子液。
将2.5mL的发酵种子菌液接种到含有47.5mL 60MM培养基的500mL锥形瓶中，进行摇瓶实验。戊酸钠浓度为7g/L，摇床温度为37℃，转速为200rpm。培养48h后，检测细胞干重和P3HB3HV含量。野生型盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01作为对照组。每组实验设三个平行，结果取均值，结果见表6。
表6：失活fadB基因对重组盐单胞菌生产P3HB3HV的影响
结果表明，弱化盐单胞菌内源fadB基因的表达的确可以进一步提高P3HB3HV共聚物中3HV单体的摩尔比。在野生型盐单胞菌中敲除fadB基因即可将P3HB3HV共聚物中3HV单体的摩尔比提升至90mol%。
实施例6：重组盐单胞菌利用混合碳源生产P3HB3HV
以实施例5中构建好的重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01（ΔfadB）为发酵菌株，在摇瓶中以葡萄糖和戊酸钠为混合碳源来生产P3HB3HV。
具体实施过程如下：
将重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01（ΔfadB）接种到20mL的60LB培养基中，培养10-12h后按1%的体积比转接到新的20mL的60LB培养基中，继续培养8-12h，作为摇瓶发酵种子液。
将2.5mL的摇瓶发酵种子菌液接种到含有47.5mL 60MM发酵培养基的500mL锥形瓶中，进行培养。添加的戊酸钠和葡萄糖的终浓度如表7所示。摇床温度为37℃，转速为200rpm。培养48h后，检测细胞干重和PHA含量，每组实验设三个平行，结果取均值。
表7：重组盐单胞菌利用混合碳源生产P3HB3HV
结果显示，通过调控混合碳源中葡萄糖和戊酸钠的比例可以控制P3HB3HV共聚物中3HV的摩尔比。将戊酸钠占混合碳源的比例控制在0—100%，重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01（ΔfadB）生产的P3HB3HV共聚物中3HV单体的摩尔比对应可控制在0—93 mol%。
实施例7：重组盐单胞菌在发酵罐中以混合碳源生产P3HB3HV
以实施例5中构建好的重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01（ΔfadB）为发酵菌株，在7L发酵罐中以葡萄糖和戊酸钠为混合碳源生产P3HB3HV。
具体实施过程如下：
将重组盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01（ΔfadB）接种到20ml的60LB培养基中，培养12-16h后按1%的体积比转接到新的60LB培养基中，继续培养8-12h，制备好300mL种子溶液作为7L生物反应器（NBS Bioflo3000）的接种种子液。
配置2.7L底料培养基。底料中各成分浓度为：葡萄糖（60g），氯化钠（180g），酵母提取物（30g）、尿素（9g）、柠檬酸二钠（7.8g），无水硫酸镁（0.6g）、磷酸二氢钾（15.6g）、组分III（30mL）和组分IV(3mL)。
配置补料I培养基含有葡萄糖（200g）、酵母提取物（8g）和尿素（32g）。
配置补料II培养基含有葡萄糖（200g）、酵母提取物（4g）和尿素（28g）。
在发酵过程中通过搅拌和通气来调节氧溶量；培养基的pH值设定为8.5，由NaOH自动调节；温度设定为37℃，由仪器自动控制。
发酵8h后开始依次流加补料I和补料II，通过血糖仪即时检测发酵罐中残留葡萄糖的含量，将其浓度控制在5-10g/L之间。
同时，发酵8h后开始流加戊酸钠，戊酸钠浓度由HPLC在线检测，控制罐内戊酸钠浓度不超过3g/L。
经过48h的发酵后，P3HB3HV中3HV的摩尔比约为18mol%。该实验结果证明在发酵罐规模可以利用混合碳源来生产P3HB3HV，结合实施例6的结果，在发酵罐中也可以通过戊酸钠和葡萄糖的比例来控制P3HB3HV中3HV的摩尔比。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯为由单体组成的均聚物或共聚物，所述的单体包括3-羟基戊酸，所述的方法包括以底物培养盐单胞菌，所述的底物包括戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括弱化盐单胞菌内源β氧化循环途径的关键基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱；所述的脂肪酸氧化复合物亚基α为FadB。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括敲除或敲低脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用靶向脂肪酸氧化复合物亚基α编码基因的sgRNA进行敲除或敲低，所述的sgRNA包含SEQ ID NO：15或2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐单胞菌过表达烯酰辅酶A水合酶，所述的过表达包括提高烯酰辅酶A水合酶编码基因的启动子强度和/或向盐单胞菌中导入烯酰辅酶A水合酶编码基因。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐单胞菌不表达脂肪酸氧化复合物亚基α或表达的脂肪酸氧化复合物亚基α不具有功能或功能减弱，所述的盐单胞菌不表达内源PHA水合酶，以及，所述的盐单胞菌表达来源于Halomonas bluephagenesis、Aeromonas caviae或Aeromonas hydriphila的PHA水合酶，和表达来源于Aeromonas caviae和/或Aeromonas hydriphila的烯酰辅酶A水合酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐单胞菌为将4HB-CoA转移酶编码基因整合进基因组，敲除或敲低phaP1基因，敲除或敲低lpxL基因，敲除或敲低lpxM基因，将表达phaCAB的PMmp1启动子替换为Pporin启动子，再过表达与必需基因ompW相关联的额外的phaCAB。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯包括PHV、P3HB3HV、P3HB4HB3HV或P3HB3HV3HHx中的一种或两种以上。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述的盐单胞菌包括Halomonas bluephagenesis或其衍生菌、Halomonas campaniensis或其衍生菌或Halomonas aydingkolgenesis或其衍生菌。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的底物还包括葡萄糖。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的底物包括：
组分A：戊酸、戊酸盐、庚酸或庚酸盐中的一种或两种以上；
组分B：葡萄糖；
其中，组分A与组分B的质量比（0.0001-7）：（0-30）。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体的摩尔比为0-98%。
14.一种权利要求1-13任一所述的方法获得的聚羟基脂肪酸酯。
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