CN111363713A - 一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2‑羟基丙酰‑CoA合成途径中相关基因以增加LA‑CoA的合成，改造途径还包括削弱大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI和yciA中的一种或两种，以减少LA‑CoA流向乳酸合成途径。本发明将大肠杆菌体内的LA‑CoA有效的流向目标产物的合成模块，减少目标产物合成前体LA‑CoA的浪费，通过对代谢途径的分析和调控，利用基因工程手段对大肠杆菌进行改造，获得的重组菌株产生的聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量明显增加。

Description

一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠 杆菌的构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及利用葡萄糖或木糖生产聚羟基丁酸乳酸酯的基因工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用。
背景技术
目前，常用的塑料大多是由石油和天然气等化石燃料合成的，导致了全球变暖及固体废弃物积累等环境问题，这些问题催促我们开发利用可持续的原料生产生物基聚合物。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxy alkanoates,PHA)是由微生物产生的一种聚酯，目前因其生物可降解性、光学性能和生物相容性等优良性质引起了研究者的广泛关注。
聚乳酸是一种很有前景的生物质衍生聚合物，因为它可以替代石油基塑料，具有几种理想的性质，如生物降解性，生物相容性和可堆肥性，聚乳酸本身无毒，但是传统生化方法生产中的金属催化剂残留会影响其在医学等方面的应用。可惜目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，无法实现在生物体内一步生产。 Seiichi Taguchi等利用底物相似性原则，通过对PHA合成酶进行突变成功地创造了微生物生物合成乳酸基聚酯的体系——聚3羟基丁酸乳酸酯P(3HB-co-L A)。
P(3HB-co-LA)是PHA家族的一种，该聚合物融合了单独的聚乳酸透明且坚硬以及聚3-羟基丁酸不透明且易碎的特点，根据乳酸含量从而表现出不同的弹性和透明度。
P(3HB-co-LA)由经过突变的具有乳酸聚合活性的PHA合成酶催化3-羟基丁酰辅酶A(3HB-CoA)和2-羟基丙酰-CoA(乳酰辅酶A，LA-CoA)合成。为了进一步提高乳酸组分含量，研究者尝试经过厌氧发酵使前体物质乳酸积累量增加，结果聚合物中乳酸的摩尔比大幅度增加到47mol％，但由于厌氧状态对于细胞生长有一定的阻碍作用，使得聚合物干重有所下降，仅占菌体的2 wt％。Nduko等尝试对碳源优化，以木糖作为碳源时，在改造后的大肠杆菌细胞合成的聚合物中，乳酸组分达到34mol％，相比于在葡萄糖中的26mol％有了较大幅度提升，当对PHA合成酶进一步优化后，乳酸组分再次提高到60 mol％。
日本科学家Seiichi Taguchi发现，在大肠杆菌中引入突变的PHA合成酶、丙酸辅酶A转移酶、β酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶合成的P(3HB-co-LA) 中，乳酸组分含量都在70％以下，而同一套体系在谷氨酸棒杆菌中表达，产生的P(3HB-co-LA)中，乳酸组分含量在96.8-99.3％，进一步研究发现，谷氨酸棒杆菌体内的LA-CoA处于较高水平，几乎和乙酰CoA同等浓度，但大肠杆菌体外的LA-CoA几乎检测不到。说明存在对LA-CoA有活性的降解酶，导致了 LA-CoA的降解，缺失这种降解酶将对提高P(3HB-co-LA)中的乳酸组分含量具有重要意义。但目前在大肠杆菌中，关于降解LA-CoA的酶没有被报道。硫酯酶能水解化合物中羰基和硫原子之间的硫酯键的一大类酶，可以通过裂解酰基 CoA中间体中硫酯键形成游离的羧酸和CoA，由Tillander等科学家首次在大肠杆菌中检测到。
中国专利CN110295188A公开了一种提高大肠杆菌合成的聚(3-羟基丁酸 -co-乳酸)中乳酸组分含量的方法，以E.coli MG1655为宿主，以启动子trc 控制phaA、phaB、phaCm基因的重组表达，以阿拉伯糖启动子控制pctcp基因的重组表达构建获得重组大肠杆菌E.coli MG-01，在此基础上敲除黄素异戊烯基转移酶基因ubiX，和/或敲除D-乳酸脱氢酶基因dld，和/或替换表达丙酰辅酶A转移酶pctcp的启动子为组成型的ldhA启动子，并没有从降解LA-CoA的酶的途径进行改造。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法。
本发明的第二个目的在于提供利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌菌株。
本发明的第三个目的在于提供利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌在以葡萄糖或木糖为碳源发酵生产高乳酸组分的聚羟基丁酸乳酸酯中的应用。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2-羟基丙酰-CoA(LA-CoA)合成途径中相关基因以增加LA-CoA的合成，所述相关基因包括phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且削弱大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI和yciA中的一种或两种，以减少LA-CoA流向乳酸合成途径。
所述2-羟基丙酰-CoA(LA-CoA)合成途径中相关基因涉及4个酶，分别为β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、丙酸辅酶A转移酶突变体和PHA合成酶突变体。在罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)中，编码β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因分别是phaA和phaB；在荧光假单胞菌2P24 (Pseudomonas fluorescens strain 2P24)中，编码PHA合成酶的基因是phaC，经过突变后基因是phaCm；在丙酸梭菌(Clostridium propionicum)中，编码丙酸辅酶A转移酶的基因是pct，经过突变后是pctcp。
作为一个优选方案，同时过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp。具体地， phaA、phaB来源于Ralstonia eutropha，phaCm来源于Pseudomonas fluorescens strain 2P24，pctcp来源于Clostridium propionicum。
作为一个优选方案，改造途径还包括缺失dld。
作为一个优选方案，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失ydiI。
作为一个优选方案，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失yciA。
作为一个优选方案，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失yciA和缺失ydiI。
作为一个优选方案，改造途径为同时过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp，并且缺失dld，缺失yciA和缺失ydiI。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌菌株。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的基因工程大肠杆菌菌株在以葡萄糖或木糖为碳源发酵生产高乳酸组分的聚羟基丁酸乳酸酯中的应用。以葡萄糖或木糖为主要碳源，在大肠杆菌常用的发酵培养基M9中发酵生产高乳酸组分的P(3HB-co-LA)。
phaCm基因为Pseudomonas fluorescens strain 2P24来源的PHA合成酶突变体，其氨基酸序列在中国专利CN110295188A公开。在本发明的一种实施方式中，通过pTrc99a质粒表达phaA、phaB、phaCm。编码丙酸辅酶A转移酶的基因是pct，经过突变后是pctcp。
本发明中涉及的P(3HB-co-LA)生成的关键酶：phaA，β-酮硫解酶；phaB，乙酰乙酰辅酶A还原酶；pctcp，丙酸辅酶A转移酶突变体；phaCm，PHA合成酶突变体；dld，D-乳酸脱氢酶；ydiI，1,4-二羟基-2萘甲酰基CoA水解酶； yciA，酰基CoA硫酯水解酶。
代谢工程改造的大肠杆菌使用葡萄糖或木糖为原料发酵生产 P(3HB-co-LA)，主要包括对由丙酮酸合成P(3HB-co-LA)途径中的不同来源的关键酶的编码基因进行克隆，构建一条完整的P(3HB-co-LA)生产途径，并结合宿主菌的改造，包括对乳酸合成途径的改造，以增加乳酸的积累的利用；并通过削弱大肠杆菌内源性硫酯酶作用于LA-CoA，以减少LA-CoA流向乳酸合成途径，增加P(3HB-co-LA)产物前体的积累。本发明通过对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得好氧及不额外增加碳源和能量的条件下，提高P(3HB-co-LA)中的乳酸组分的基因工程大肠杆菌菌株。并利用改造后的代谢工程菌株以葡萄糖或木糖为碳源生产P(3HB-co-LA)。
本发明的方法是利用分子生物学技术构建外源表达的P(3HB-co-LA)生产途径，并且该途径的基因来源于多个宿主菌，包括来源于罗尔斯通氏菌的phaA 和phaB，来源于荧光假单胞菌2P24中的phaC，经过突变后基因是phaCm，这三个基因克隆到pTrc99a质粒上，形成质粒pTrc99aABC；来源于丙酸梭菌的pct，经过突变后是pctcp，随后将pctcp连接在Trc启动子上，形成Trc-pctcp，最后将Trc-pctcp克隆到pBAD33上，形成质粒pBAD-PTrc-pctcp。另外利用Red 重组技术敲除dld、ydiI、yciA，构建单缺失菌或组合缺失菌。
本发明的一个优选实施例中，以野生型大肠杆菌MG1655(市售)为出发菌，构建一条异源的P(3HB-co-LA)生产途径。乳酸作为P(3HB-co-LA)生产的重要前体物质，其在胞内的积累量影响P(3HB-co-LA)中乳酸组分的含量，因此，通过缺失D-乳酸脱氢酶dld基因，阻止发酵后期D-乳酸转化为丙酮酸，从而防止胞内乳酸浓度的降低。另外，大肠杆菌内源性硫酯酶是降低LA-CoA 浓度的一个重要原因，该酶可以裂解硫酯键释放出游离的乳酸和CoA，使 P(3HB-co-LA)中的乳酸含量降低，因此通过敲除硫酯酶ydiI和yciA可以增加 LA-CoA的积累量，提高聚合物中的乳酸组分含量。
本发明的优点在于，本发明通过对大肠杆菌内源性硫酯酶的挖掘和筛选，确定了使P(3HB-co-LA)中乳酸组分下降的硫酯酶，并将其缺失，从而获得了产生高乳酸组分的P(3HB-co-LA)的基因工程大肠杆菌。将大肠杆菌体内的 LA-CoA有效的流向目标产物的合成模块，减少目标产物合成前体LA-CoA的浪费，通过对代谢途径的分析和调控，利用基因工程手段对大肠杆菌进行改造，获得的重组菌株产生的聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量明显增加。
附图说明
图1为大肠杆菌利用葡萄糖或木糖生产P(3HB-co-LA)代谢图。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
实施例1.敲除基因dld防止乳酸转化为丙酮酸
由于在发酵后期，乳酸可能在D-乳酸脱氢酶(dld)的作用下合成丙酮酸，使得P(3HB-co-LA)中乳酸组分降低。因此，采用Red重组的方法敲除基因dld，将获得的菌株命名为WXJ01。基因敲除的具体操作如下：
对于基因dld的敲除，首先设计引物(引物序列如下表所示)，通过PCR 克隆约1700bp的带有卡那霉素抗性的DNA片段。宿主菌中钙转化导入质粒 pKD46，以氨苄青霉素筛选重组子。导入pKD46的重组菌30℃培养至OD600约为0.3时，加入L-阿拉伯糖诱导1小时，然后使用10％的甘油制备电转感受态。将以上获得的卡那霉素片段转入制备好的电转感受态中。电转化采用细菌模式1(1.8KV，5ms)进行，使用卡那霉素筛选发生同源重组的转化子。设计敲除验证引物，采用菌落PCR方法验证敲除是否成功。
对敲除成功的重组菌，37℃培养5-6小时后，转入42℃培养过夜，分离单菌落，然后验证抗性。只有卡那霉素抗性无氨苄青霉素抗性的为pKD46已消除的菌落。然后在该菌中转入质粒pCP20，30℃培养一段时间后，转入42℃培养过夜，分离单菌落，然后验证抗性。挑取只在无抗性平板上生长，而卡那霉素抗性平板和氨苄青霉素抗性平板上均不生长的菌落进行鉴定。使用以上的验证引物进行菌落PCR，抗性消除成功的转化子与野生菌PCR得到的目的片段大小相似，而与抗性未消除菌株PCR片段大小存在明显的差异，能够判定抗性基因是否消除重组成功。
实施例2.敲除基因ydiI削弱LA-CoA的降解途径
大肠杆菌体内的硫酯酶对LA-CoA具有降解作用，使LA-CoA走向脂肪酸的合成途径，导致LA-CoA合成聚合物的流量减少，最终不利于高乳酸组分的 P(3HB-co-LA)的合成。因此，本发明将大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI敲除，削弱 LA-CoA的降解途径，使LA-CoA作为P(3HB-co-LA)的直接前体更多地走向聚合物合成途径。在菌株WXJ01基础上，采用Red重组的方法敲除基因ydiI，将获得的菌株命名为WXJ02。基因敲除的具体操作与基因dld的操作方法相同。
实施例3.敲除基因yciA削弱LA-CoA的降解途径
大肠杆菌体内的硫酯酶yciA与ydiI具有类似的性质，都可以将LA-CoA 降解形成相应的脂肪酸，因此本发明在菌株WXJ01的基础上敲除了基因yciA，获得的菌株命名为WXJ021，削弱LA-CoA的降解，使其更多的走向 P(3HB-co-LA)的合成途径。基因敲除的具体操作与基因dld的操作方法相同。
实施例4.敲除基因ydiI和yciA削弱LA-CoA的降解途径
由于基因ydiI和基因yciA对于LA-CoA都有一定的降解作用，为了进一步削弱LA-CoA的降解，增加P(3HB-co-LA)中的乳酸组分，本发明在菌株 WXJ021的基础上进一步敲除了基因ydiI，获得的菌株命名为WXJ03。基因敲除的具体操作与基因dld的操作方法相同。
表1 基因敲除引物(SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.12)
Figure BDA0002423910440000061
Figure BDA0002423910440000071
实施例5.高乳酸组分P(3HB-co-LA)生产菌株葡萄糖发酵
以MG1655或其缺失菌为出发菌，通过钙转转入构建P(3HB-co-LA)生产途径的质粒，分别得到MG1655(pTrc99aABC,pBAD-PTrc-pctcp)、 WXJ01(pTrc99aABC,pBAD-PTrc-pctcp)、WXJ02(pTrc99aABC, pBAD-PTrc-pctcp)、WXJ021(pTrc99aABC,pBAD-PTrc-pctcp)、WXJ03(pTrc99aABC,pBAD-PTrc-pctcp)菌株。上述菌株构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)。
摇瓶发酵操作：保存在甘油管中的种子接种于装有3mL LB的试管中培养过夜，然后转接到装有50mL M9，其中含有2g/L的酵母提取物和5g/L的葡萄糖培养基的锥形瓶中，接种量1％，培养条件均为37，℃220rpm。二级种子培养12h后，转入摇瓶发酵培养基(M9培养基)。M9培养基中添加20g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物。接种量为1％，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM。培养条件为30，℃220rpm。
M9培养基组成为(每升)：Na2HPO4·12H2O 15.12g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.011g，NH4Cl 1g，1％维生素B1 0.2mL。
P(3HB-co-LA)的萃取和分析方法：
(1)冻干样品的制备
取发酵结束后菌液20mL，8000rpm离心10min后去上清。用40mL的去离子水洗涤菌体两次后用1.5mL的去离子水重悬。用液氮速冻后，真空冷冻干燥两天。
(2)酯化液的配置
取170mL甲醇，加入1g/L苯甲酸后缓慢加入30mL 98wt％的浓硫酸(边加边用玻璃棒搅拌)。
(3)聚合物的萃取：15mg左右冻干的样品，置于酯化管中，加入1.5mL 分析纯氯仿和1.5mL酯化液。将3-羟基丁酸钠标准品配成100g/L的水溶液，分别取45、75、105、135、165、195μL置于酯化管中，用与样品同样的方法处理，对应终浓度3、5、7、9、11、13g/L。将D-乳酸钠标准品配成25g/L 的水溶液，分别取30、60、90、120、150μL置于酯化管中用与样品同样的方法处理，对应终浓度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/L。样品和标准品均需在金属浴中100℃恒温酯化4h。酯化结束后，冰浴降温。加入750mL去离子水，旋涡震荡2min。低速离心使得水相和有机相分离，取氯仿层(下层)进行GC分析。
(4)GC分析
通过GC-2014气相色谱仪(岛津，日本)测定细胞中聚合物的单体组成。 色谱柱为rx-5毛细管柱，长30m，内径0.25mm。检测器为火焰离子化检测器。 使用高纯氮气为载气，氢气为燃气，空气为助燃气。使用AOC-20S型自动化 进样器，乙醇作为清洗剂。GC分析程序为：开始时于54℃停留4min，再以 5℃/min的速度升温至80℃，随后以10℃/min的速度升温至125℃，再以 30℃/min升温至180℃，最后以20℃/min升温至220℃并维持220min。生物 量的测定采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。
摇瓶发酵结果如下表：
表2 葡萄糖P(3HB-co-LA)产量及LA组分含量
Figure BDA00024239104400000810
实施例6.高乳酸组分P(3HB-co-LA)生产菌株木糖发酵
文献研究表明，木糖代谢有利于胞内乳酸的积累，且以木糖为碳源发酵生产乳酸基聚合物可以增加共聚物中乳酸组分含量，因此，本发明将同样的重组菌株体系在以木糖为碳源下进行发酵，以进一步增加P(3HB-co-LA)中的乳酸组分。发酵过程及样品的检测分析与葡萄糖发酵方法相同。
摇瓶发酵结果如下表：
表3 木糖发酵P(3HB-co-LA)产量及LA组分含量
Figure BDA0002423910440000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用
<130> /
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcttcca tgacaacaac tgataataaa gcctttttga atgaacttgc tcgtccgtct 60
tgagcgattg tgtag 75
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggttgaact gcggatcttg gaatccgggg atcggtaaaa ccagtaaacg gaaaaactgg 60
caggaagtgg agtaa 75
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaggcgcta ttctagtttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacggcacag aacgattaag 20
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggcacgg gggtacgcca tcctgtgcag gctttactgg agattattaa cgtcttgagc 60
gattgtgtag 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcagataat gaccaaaagc aatatgcgtc acacttttct ggtgacaacg gatgtaacgc 60
actgagaagc 70
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtaccgaa gttaccgcct tgccg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaatcatagt agcatcgcgc ctgtgatttt ccttttaagt cggttttacc cgtcttgagc 60
gattgtgtag 70
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaattcagta agcagaaagt caaaagcctc cgaccggagg cttttgacta gatgtaacgc 60
actgagaagc 70
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atggtcgaag ctgaatctgg cctgg 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcgcattaa gccgtaatca gccgc 25

Claims (9)

1.一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2-羟基丙酰-CoA合成途径中相关基因以增加LA-CoA的合成，所述相关基因包括phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且削弱大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI和yciA中的一种或两种，以减少LA-CoA流向乳酸合成途径。
2.根据权利要求1所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，同时过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp。
3.根据权利要求1所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，还包括缺失dld。
4.根据权利要求3所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失ydiI。
5.根据权利要求3所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失yciA。
6.根据权利要求3所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp中的一种或多种，并且缺失dld，缺失yciA和缺失ydiI。
7.根据权利要求3所述的一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，改造途径为同时过表达phaA、phaB、phaCm和pctcp，并且缺失dld，缺失yciA和缺失ydiI。
8.利用权利要求1—7任一所述构建方法得到的基因工程大肠杆菌菌株。
9.权利要求8所述基因工程大肠杆菌菌株在以葡萄糖或木糖为碳源发酵生产高乳酸组分的聚羟基丁酸乳酸酯中的应用。
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