CN110438056A - 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 - Google Patents

一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110438056A
CN110438056A CN201910738599.1A CN201910738599A CN110438056A CN 110438056 A CN110438056 A CN 110438056A CN 201910738599 A CN201910738599 A CN 201910738599A CN 110438056 A CN110438056 A CN 110438056A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
ncbi
genetic engineering
accession number
engineering bacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910738599.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110438056B (zh
Inventor
陈修来
郭亮
刘立明
刁文文
刘佳
罗秋玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910738599.1A priority Critical patent/CN110438056B/zh
Publication of CN110438056A publication Critical patent/CN110438056A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110438056B publication Critical patent/CN110438056B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01157—3-Hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (1.1.1.157)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01055—3-Hydroxybutyryl-CoA dehydratase (4.2.1.55)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用，属于发酵工程技术领域。本发明以Escherichia coli ATCC 8739为出发菌株，利用代谢工程手段，通过构建丁酸的合成路径以及切断冗余代谢支路构建了生产丁酸的大肠杆菌基因工程菌。在发酵72h后丁酸的产量达到15g/L。该发酵过程为好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高，目前未见直接利用甘油发酵生产丁酸的报道。该方法采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。

Description

一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
技术领域
本发明涉及一株产丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用，属于发酵工程技术领域。
背景技术
丁酸(Butyric acid)是一种短链脂肪酸，是合成其他香料物质和精细化工产品的重要原料。丁酸及其衍生物被广泛应用于化工、食品、医药、动物饲料和化妆品等行业。丁酸衍生物，如丁酸酯，用于饮料、食品和化妆品中作为芳香和增味剂。由丁酸和醋酸纤维素制备的聚合物可用于制造塑料和纺织纤维。丁酸盐的衍生物作为高活性化合物，显示出具有抗癌作用。此外，丁酸的商业价值因其作为生物燃料(如正丁醇)的前体而备受推崇。
目前，丁酸的生产方法主要有化学法和发酵法。化学法是采用源于石油化工的正丁醛氧化法。与化学法相比，生物发酵法具有原料广泛、环境友好和可持续等优点，发酵法主要以淀粉或糖为原料，用丁酸梭状芽孢杆菌发酵得丁酸。
丁酸梭状芽孢杆菌是严格厌氧的革兰氏阳性菌，长期以来一直被研究用于生产丁酸。然而，丁酸梭状芽孢杆菌发酵过程复杂，发酵条件难以控制，操作步骤繁琐，需要仔细优化影响丁酸产量的关键因素。此外，可用于丁酸梭状芽孢杆菌的遗传操作工具和其生理信息少也阻碍了其发展。而大肠杆菌由于其生长过程已于控制，遗传操作工具成熟，遗传背景清晰。但目前应用大肠杆菌生产丁酸，是以葡萄糖和乙酸为底物，发酵48h，产量为10g/L左右(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(19):4342-4348)。
甘油(glycerol)学名丙三醇，是一种三元醇。随着化石燃料日趋紧张，国际油价持续上涨，人们环保意识随之增强且越来越注重研究开发可再生的替代能源，生物柴油是一个有希望替代的可再生燃料，其生产的原料主要包括动植物的油脂和餐饮方面的垃圾油，在水解制备生物柴油的同时，将会生成一定量的甘油。近年来，生物柴油的发展速度加快，副产物甘油的产量也在迅速上升，这将使得甘油的价格大幅下降。此外，工业化制皂的过程中，闭合的皂胶经盐析后，下层溶液中也含有副产物甘油。如此大量的甘油生成将会给生物柴油行业带来严重负担，增加生产成本。相比于高额的处理成本，如果能够高效充分利用这些甘油转化成需要的高附加值化合物将带来巨大的效益，降低生物柴油制造的成本，减少资源的浪费、污染物排放以及环境污染等。若能采用微生物发酵直接利用甘油生产丁酸，则可以解决上述问题和不足。
丙酮酸是合成丁酸的前体物质，获得能够积累丙酮酸的菌株是发酵法生产丁酸的必要前提。
综上所述，提供一种以甘油为底物发酵生产正丁酸的低污染、低成本的方法，对于正丁酸的工业生产具有重要的应用价值。然而，目前该方法还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为不表达乙酸激酶基因(ackA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)和乳酸脱氢酶基因(ldhA)，并游离过表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(atoB)、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因(hbd)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因(crt)、反式烯酰辅酶A还原酶基因(ter)和酰基辅酶A硫酯酶II基因(tesB)。所述不表达包括敲除或沉默。
在本发明的一种实施方式中，所述出发菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 8739。所述Escherichia coli ATCC 8739是在ATCC上购买的野生型大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB含有NCBI上accession number:P76461所示基因编码的氨基酸；所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶hbd含有NCBI上accession number:KHD37023.1所示基因编码的氨基酸；所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶crt含有NCBI上accession number:NP_349318.1所示基因编码的氨基酸；所述反式烯酰辅酶A还原酶ter含有NCBI上accession number:4EUF_A所示基因编码的氨基酸序列；所述酰基辅酶A硫酯酶II tesB含有NCBI上accession number:WP_085701399所示基因编码的氨基酸。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酸激酶基因ackA含有NCBI上accessionnumber:ACA77022.1所示基因的核苷酸序列；所述乙醇脱氢酶基因adhE含有NCBI上accession number:ACA78022.1所示基因的核苷酸序列；所述乳酸脱氢酶基因ldhA含有NCBI上accession number:ACA77911.1所示基因的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达atoB和tesB是将这两个基因连接到pEac载体进行游离表达；所述过表达crt，hbd和ter，是将这三个基因连接到pCloDF13载体上进行游离表达。
在本发明的一种实施方式中，利用FLp/FRT系统敲除乙酸激酶基因(accessionnumber:ACA77022.1)，乙醇脱氢酶基因(accession number:ACA78022.1)和乳酸脱氢酶基因(accession number:ACA77911.1)。
本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌在发酵生产丁酸方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将大肠杆菌工程菌活化后，于温度35-39℃、转速700-900rpm，通气量1-1.5vvm，7-9mM的KOH溶液调节pH至6.5-7.5进行发酵，发酵时间为60-90h。
进一步地，所述应用是将大肠杆菌工程菌活化后，于温度37℃、转速800rpm,通气量1vvm，8mM的KOH调节pH至7.0进行发酵，发酵时间为72h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵使用的发酵培养基含有：甘油40-60g/L，酵母膏20-25g/L，蛋白胨10-15g/L，KH2PO4 2.0-2.5g/L，K2HPO4 12-13g/L。
进一步地，所述发酵使用的发酵培养基含有：甘油50g/L，酵母膏24g/L，蛋白胨12g/L，KH2PO4 2.13g/L，K2HPO4 12.54g/L。
本发明的第三个目的是提供一种构建上述基因工程菌的方法，包括如下步骤：
(一)乙酸激酶基因(ackA)的敲除
(1)以pKD4质粒为模板，根据ATCC 8739中ackA基因3`和5`端45bp序列设计携带有ackA同源臂的引物，扩增出含有ackA同源臂的卡那霉素抗性基因敲除框；
(2)将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的出发菌株感受态细胞中，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得ackA基因敲除菌；
(二)乙醇脱氢酶基因(adhE)的敲除
(1)以pKD4质粒为模板，根据ATCC 8739中adhE基因3`和5`端45bp序列设计携带有adhE同源臂的引物，扩增出含有ackA同源臂的卡那霉素抗性基因敲除框；
(2)将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ackA基因敲除感受态细胞中，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得adhE、ackA基因敲除菌；
(三)乳酸脱氢酶基因的敲除
(1)以pKD4质粒为模板，根据ATCC8739中ldhA基因3`和5`端45bp序列设计携带有ldhA同源臂的引物，扩增出含有ldhA同源臂的卡那霉素抗性基因敲除框；
(2)将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的adhE、ackA基因敲除感受态细胞中，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得ldhA、adhE、ackA基因敲除菌；
(四)atoB和tesB基因的过表达
(1)采用PCR的技术以大肠杆菌ATCC 8739的基因组为模板，分别扩增出atoB、tesB基因片段，并采用一步同源重组的方式连接到质粒pEtac上得到重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB；
(五)ter、hbd和crt基因的过表达
(1)采用PCR的技术以丙酮丁醇梭菌ATCC 824的基因组为模板，分别扩增出ter、hbd、crt基因片段，并采用一步同源重组的方式连接到质粒pCloDF13上得到重组质粒pCloDF13/ter-hbd-crt；
(六)将上述得到的两个重组质粒，转化至上述ldhA、adhE、ackA基因敲除菌，涂布卡那霉素和奇霉素双抗性平板进行筛选，并通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌。
本发明的第四个目的是提供上述基因工程菌在化工、食品、医药、动物饲料或化妆品领域中的应用。
本发明的有益效果：
i)本发明可以将工业废弃物甘油转化为高价值产品丁酸，在发酵72h后丁酸的产量达到15g/L；
ii)本发明采用好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高；
iii)本发明采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用；
iv)本发明为高产丁酸菌株的构建提供了一种新的思路。
附图说明
图1为大肠杆菌工程菌中构建的丁酸合成途径，其中，atoB：乙酰乙酰辅酶A硫解酶；hbd：3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶；crt：3-羟基丁酰辅酶A脱水酶；ter：反式烯酰辅酶A还原酶；tesB：酰基辅酶A硫酯酶II。
图2为同源重组阳性重组子的电泳鉴定图(敲除ackA)，其中，M为2000bp marker，+为野生型大肠杆菌乙酸激酶基因，-为空白对照，17为乙酸激酶基因敲除后菌落PCR验证。
图3为同源重组阳性重组子的电泳鉴定图(敲除adhE)，其中，M为2000bp marker，+为野生型大肠杆菌乙醇脱氢酶基因，-为空白对照，5为乙醇脱氢酶基因敲除后菌落PCR验证。
图4为同源重组阳性重组子的电泳鉴定图(敲除ldhA)：M为2000bp marker，+为野生型大肠杆菌乳酸脱氢酶基因，-为空白对照，17为乳酸脱氢酶基因敲除后菌落PCR验证。
图5为重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB构建流程。
图6为重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB的图谱。
图7为重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB构建流程。
图8为重组质粒pCloDF13/Ptac-ter-hbd-crt的图谱。
图9为基因工程菌BUT-1重组蛋白的SDS鉴定图，其中，Marker为蛋白marker，BUT-1为基因工程菌，Control为E.coli ATCC 8739。
具体实施方式
丁酸检测方法(高效液相色谱条件)：
色谱柱：(5μm 4.6×250mm)
流动相：5mM H2SO4
柱温：45℃
检测波长：210
进样量：20μL
流速：0.6mL/min
实施例1E.coli ATCC8739乙酸激酶基因ackA的敲除
根据NCBI数据库中大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739中ackA(乙酸激酶基因)基因5`和3`端45bp序列设计上、下游同源臂扩增引物ackA-1、ackA-2，并以pKD4为模板扩增出含有同源臂的敲除框，命名为ackAK。
将ackAK电转化至含pKD46质粒的E.coli ATCC8739感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5mS)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素(30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物ackA-U和ackA-D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1708bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物ackA-U和ack-D进行验证，ackA被成功敲除的菌株扩增片段约295bp，构建过程如图1所示，图2为PCR验证。
验证正确的菌株，命名为E.coli ATCC8739A
引物序列见表1。
表1用于PCR扩增敲除片段及过表达基因的引物序列
实施例2E.coli ATCC8739A乙醇脱氢酶基因adhE的敲除
根据NCBI数据库中大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739中adhE(乙醇脱氢酶基因)基因5`和3`端45bp序列设计上、下游同源臂扩增引物adhE-1、adhE-2，并以pKD4为模板扩增出含有同源臂的敲除框，命名为adhEK。
将adhEK电转化至含pKD46质粒的E.coli ATCC8739A感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5ms)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素(30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物adhE-U和adhE-D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约2236bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物adhE-U和adhE-D进行验证，adhE被成功敲除的菌株扩增片段约823bp，构建过程如图3所示，图4为PCR验证。
验证正确的菌株，命名为E.coli ATCC8739AA。
引物序列见表1。
实施例3E.coli ATCC8739AA乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除
根据NCBI数据库中大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739中ldhA(乳酸脱氢酶基因)基因5`和3`端45bp序列设计上、下游同源臂扩增引物ldhA-1、ldhA-2，并以pKD4为模板扩增出含有同源臂的敲除框，命名为ldhAK。
将adhEK电转化至含pKD46质粒的E.coli ATCC 8739AA感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5ms)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素(30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物ldhA-U和ldhA-D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约2329bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物ldhA-U和ldhA-D进行验证，ldhA被成功敲除的菌株扩增片段约916bp，构建过程如图3所示，图4为PCR验证。
验证正确的菌株，命名为E.coli ATCC8739AAL。
引物序列见表1。
实施例4atoB和tesB基因的过表达
根据NCBI数据库中E.coli ATCC8739的基因组为模板，利用引物atoB-A和atoB-S将来自于E.coli ATCC8739的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(NCBI accession number:P76461)进行PCR扩增，利用引物tesB-A和tesB-S扩增酰基辅酶A硫酯酶II基因(NCBIaccession number:WP_085701399)。
引物序列见表1。
将扩增得到的片段，采用一步同源重组的方式连接到，用EcoR I和Xho I双酶切的pEtac质粒上。
将上述的连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有卡那抗性的LB平板，挑取转化子，提取质粒，测序验证，得到质粒PEtac/Ptac-atoB-tesB。
实施例5ter，hbd和crt基因的过表达
根据NCBI数据库中Clostridium acetobutylicum ATCC824的基因组为模板，利用引物ter-A和ter-S将来自于Clostridium acetobutylicum ATCC824的反式烯酰辅酶A还原酶基因(NCBIaccession number:4EUF_A)进行PCR扩增，利用引物hbd-A和hbd-S扩增3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因(NCBI accession number:KHD37023.1)，利用引物crt-A和crt-S扩增3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因(NCBI accession number:NP_349318.1)。
引物序列见表1。
将扩增得到的片段，采用一步同源重组的方式连接到，用Hind III和Xho I双酶切的pCloDF13质粒上。
将上述的连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有齐霉素抗性的LB平板，挑取转化子，提取质粒，测序验证，得到质粒pCloDF13/Ptac-ter-hbd-crt。
实施例6
将上述得到的质粒PEtac/Ptac-atoB-tesB和pCloDF13/Ptac-ter-hbd-crt转化至E.coliATCC8739AAL的感受态细胞，涂布卡那霉素和奇霉素双抗性平板进行筛选，并通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌，命名为BUT-1。
实施例7利用大肠杆菌基因工程菌BUT-1生产丁酸
将保存于甘油管中的工程菌株接种于LB培养基斜面，取一环至种子培养基(20ml/100ml三角瓶)，37℃，200rpm培养12h后，以10％接种量(V/V)接种发酵培养基(50mL/250mL三角烧瓶)，温度为37℃，转速800rpm，通气量1vvm，8mM的KOH调节至7.0，发酵时间为72h。采用高效液相色谱(HPLC)测得：本发明的基因工程菌(BUT-1)丁酸的产量为15g/L(见表2)，而出发菌株(WT)积累少量丁酸。丁酸相对甘油的得率为0.3g/g。
表2产物产量(单位:g/L)
丁酸
WT 0.5
BUT-1 15
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcagtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcaggcagtc aggcggctcg cgtcttgcgc gataaccagt tcttccatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggacacgg tttatcctct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgctacgctc tatggctccc 20
<210> 5
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagccatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgctgtctg ataactggtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcataagcgg atggtcactg 20
<210> 9
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgaactcgc cgttttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 10
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctcatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gataacggag atcgggaatg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctttggctgt cagttcacca 20
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttcacacagg aaacagaatt catgaaaaat tgtgtcatcg tcag 44
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggtacctttc tcctctttaa tctgcagtta attcaaccgt tcaatcacca tcgc 54
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctgcagatta aagaggagaa aggtaccatg atagtaaaag caaagtttgt 50
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggtggtggtg gtggtgctcg agttaaggtt ctaattttct taataattc 49
<210> 17
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cacacagtcg acaagcttat taaagaggag aaaatcgata tgatagtaaa agcaaagttt 60
g 61
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggaatcttcc tcctgctaga attcttaagg ttctaatttt cttaataat 49
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaattctagc aggaggaaga ttccatgaaa aaggtatgtg ttatag 46
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggtacctttc tcctctttaa taagctttta ttttgaataa tcgtagaaac c 51
<210> 21
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aagcttatta aagaggagaa aggtaccatg gaactaaaca atgtcatcc 49
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtggtggtgg tgctcgagct atctattttt gaagccttc 39

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为不表达乙酸激酶基因ackA、乙醇脱氢酶基因adhE和乳酸脱氢酶基因ldhA，并游离过表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因hbd、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因crt、反式烯酰辅酶A还原酶基因ter和酰基辅酶A硫酯酶II基因tesB。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株包括EscherichiacoliATCC8739。
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB含有NCBI上accession number:P76461所示基因编码的氨基酸；所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶hbd含有NCBI上accession number:KHD37023.1所示基因编码的氨基酸；所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶crt含有NCBI上accession number:NP_349318.1所示基因编码的氨基酸；所述反式烯酰辅酶A还原酶ter含有NCBI上accession number:4EUF_A所示基因编码的氨基酸序列；所述酰基辅酶A硫酯酶II tesB含有NCBI上accession number:WP_085701399所示基因编码的氨基酸。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酸激酶基因ackA含有NCBI上accession number:ACA77022.1所示基因的核苷酸序列；所述乙醇脱氢酶基因adhE含有NCBI上accession number:ACA78022.1所示基因的核苷酸序列；所述乳酸脱氢酶基因ldhA含有NCBI上accession number:ACA77911.1所示基因的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述过表达atoB和tesB是将这两个基因连接到pEac载体进行游离表达；所述过表达crt，hbd和ter，是将这三个基因连接到pCloDF13载体上进行游离表达。
6.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，利用FLp/FRT系统敲除了+乙酸激酶基因、乙醇脱氢酶基因、和乳酸脱氢酶基因。
7.一种产丁酸的方法，其特征在于，应用权利要求1-6任一所述的基因工程菌进行发酵。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求1-6任一所述的基因工程菌活化后，于温度35-39℃、转速700-900rpm，通气量1-1.5vvm，调节pH至6.5-7.5进行发酵，发酵时间为60-90h。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基含有：甘油40-60g/L，酵母膏20-25g/L，蛋白胨10-15g/L，KH2PO4 2.0-2.5g/L，K2HPO4 12-13g/L。
10.权利要求1-6任一所述的基因工程菌在化工、食品、医药、动物饲料或化妆品领域中的应用。
CN201910738599.1A 2019-08-12 2019-08-12 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 Active CN110438056B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910738599.1A CN110438056B (zh) 2019-08-12 2019-08-12 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910738599.1A CN110438056B (zh) 2019-08-12 2019-08-12 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110438056A true CN110438056A (zh) 2019-11-12
CN110438056B CN110438056B (zh) 2021-05-28

Family

ID=68434554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910738599.1A Active CN110438056B (zh) 2019-08-12 2019-08-12 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110438056B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088209A (zh) * 2020-01-15 2020-05-01 南京工业大学 一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用
CN111363713A (zh) * 2020-03-24 2020-07-03 华东理工大学 一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用
CN113122563A (zh) * 2021-04-22 2021-07-16 洛阳华荣生物技术有限公司 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法
CN114107153A (zh) * 2021-11-26 2022-03-01 江南大学 一种生产己二酸的重组菌、构建方法和应用
CN114774338A (zh) * 2022-03-29 2022-07-22 北京航空航天大学 一种产丁酸的益生菌及其构建方法和应用
CN115975897A (zh) * 2022-11-21 2023-04-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产丁酸的重组大肠杆菌及其构建方法
CN116064546A (zh) * 2022-11-21 2023-05-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种调控丁酸生产的启动子及其应用
CN117051080A (zh) * 2023-10-12 2023-11-14 山东省食品药品检验研究院 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120064622A1 (en) * 2011-10-31 2012-03-15 Ginkgo Bioworks Methods and Systems for Chemoautotrophic Production of Organic Compounds
CN103562398A (zh) * 2011-03-22 2014-02-05 Opx生物工艺学公司 化学产品的微生物生产以及相关的组合物、方法和系统
CN104789487A (zh) * 2014-01-17 2015-07-22 逢甲大学 分别可生产丁酸和正丁醇的菌株、及生成正丁醇的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103562398A (zh) * 2011-03-22 2014-02-05 Opx生物工艺学公司 化学产品的微生物生产以及相关的组合物、方法和系统
US20120064622A1 (en) * 2011-10-31 2012-03-15 Ginkgo Bioworks Methods and Systems for Chemoautotrophic Production of Organic Compounds
CN104789487A (zh) * 2014-01-17 2015-07-22 逢甲大学 分别可生产丁酸和正丁醇的菌株、及生成正丁醇的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAE HYUNG LIM等: "Refactoring redox cofactor regeneration for high-yield biocatalysis of glucose to butyric acid in Escherichia coli", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 *
JANG-MI BAEK等: "Butyrate Production in Engineered Escherichia coli With Synthetic Scaffolds", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
陈修来等: "微生物代谢路径的优化与调控", 《生物加工过程》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088209A (zh) * 2020-01-15 2020-05-01 南京工业大学 一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用
CN111363713A (zh) * 2020-03-24 2020-07-03 华东理工大学 一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用
CN113122563A (zh) * 2021-04-22 2021-07-16 洛阳华荣生物技术有限公司 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法
CN113122563B (zh) * 2021-04-22 2023-12-08 洛阳华荣生物技术有限公司 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法
CN114107153A (zh) * 2021-11-26 2022-03-01 江南大学 一种生产己二酸的重组菌、构建方法和应用
CN114774338A (zh) * 2022-03-29 2022-07-22 北京航空航天大学 一种产丁酸的益生菌及其构建方法和应用
CN114774338B (zh) * 2022-03-29 2023-08-08 北京航空航天大学 一种产丁酸的益生菌及其构建方法和应用
WO2023185760A1 (zh) * 2022-03-29 2023-10-05 北京航空航天大学 一种产丁酸的益生菌及其构建方法和应用
CN115975897A (zh) * 2022-11-21 2023-04-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 生产丁酸的重组大肠杆菌及其构建方法
CN116064546A (zh) * 2022-11-21 2023-05-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种调控丁酸生产的启动子及其应用
CN117051080A (zh) * 2023-10-12 2023-11-14 山东省食品药品检验研究院 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用
CN117051080B (zh) * 2023-10-12 2024-01-23 山东省食品药品检验研究院 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110438056B (zh) 2021-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110438056A (zh) 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
Abdelaal et al. CRISPR/Cas9-mediated engineering of Escherichia coli for n-butanol production from xylose in defined medium
CN105051179B (zh) 重组微生物和其用途
Yang et al. Fermentation of biodiesel-derived glycerol by Bacillus amyloliquefaciens: effects of co-substrates on 2, 3-butanediol production
Gu et al. Ammonium acetate enhances solvent production by Clostridium acetobutylicum EA 2018 using cassava as a fermentation medium
CN101952430B (zh) 增强的产乙醇和丁醇微生物以及使用该微生物制备乙醇和丁醇的方法
Berezina et al. Microbial producers of butanol
CN105861341B (zh) 一株汉逊德巴利酵母菌株及其发酵制备3-羟基丙酸的方法
Dong et al. Biobutanol
CN101631864A (zh) 使用酵母菌通过丁酰-CoA作为中间体制备丁醇的方法
Raganati et al. Butanol production from leftover beverages and sport drinks
CN102618478B (zh) 一株产d-乳酸动态调控重组菌及用其制备d-乳酸的方法
CN107400652A (zh) 一种动态调控3‑羟基丙酸合成的工程菌构建方法
Wang et al. Bioethanol production from the dry powder of Jerusalem artichoke tubers by recombinant Saccharomyces cerevisiae in simultaneous saccharification and fermentation
CN104789487B (zh) 分别可生产丁酸和正丁醇的菌株、及生成正丁醇的方法
CN103146740B (zh) 一株生产1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法
CN102618479B (zh) 一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用
CN106148255B (zh) 产有机酸途径缺失的工程菌及其在联产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇和乙醇中的应用
CN103725718A (zh) 一种生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法
CN111334459A (zh) 一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用
CN103194419B (zh) 微生物及其用途
CN102703493A (zh) 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法
CN104204206B (zh) 一种用于生产丁醇的方法
CN104789516A (zh) 一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌及构建方法及应用
CN104498523B (zh) 一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant