CN117051080A - 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用 - Google Patents
一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117051080A CN117051080A CN202311319234.8A CN202311319234A CN117051080A CN 117051080 A CN117051080 A CN 117051080A CN 202311319234 A CN202311319234 A CN 202311319234A CN 117051080 A CN117051080 A CN 117051080A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- metabolic pathway
- butyric acid
- coa
- microecological
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 124
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 title claims abstract description 68
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 53
- 239000012190 activator Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 41
- KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N crotonoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)/C=C/C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KFWWCMJSYSSPSK-PAXLJYGASA-N 0.000 claims description 27
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 21
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 13
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 10
- 102000012737 Electron-Transferring Flavoproteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010079426 Electron-Transferring Flavoproteins Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 claims description 7
- QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 0.000 claims description 7
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- MBMLMWLHJBBADN-UHFFFAOYSA-N Ferrous sulfide Chemical compound [Fe]=S MBMLMWLHJBBADN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010081409 Iron-Sulfur Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000005298 Iron-Sulfur Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N butyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 108010055682 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 108700024126 Butyrate kinases Proteins 0.000 claims description 6
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 claims description 6
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 claims description 6
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 claims description 6
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 108010031852 Pyruvate Synthase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N butanoyl dihydrogen phosphate Chemical compound CCCC(=O)OP(O)(O)=O JSHMCUNOMIZJDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010068197 Butyryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- QMXHMSQJMXMMKL-XGXNYEOVSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(3r)-3-hydroxy-4-[[3-[2-(3-hydroxybutylsulfanyl)ethylamino]-3-oxopropyl]amino]-2,2-dimethyl-4-oxobutyl] hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSCCC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QMXHMSQJMXMMKL-XGXNYEOVSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 4
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 claims description 3
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- CFWWTDCUSWIZTB-BLPRJPCASA-N [C@@H]1([C@H](O)[C@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](COP(=O)(O)OP(=O)(O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12.OC(C(=O)O)CC Chemical compound [C@@H]1([C@H](O)[C@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](COP(=O)(O)OP(=O)(O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12.OC(C(=O)O)CC CFWWTDCUSWIZTB-BLPRJPCASA-N 0.000 claims description 2
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 3
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 7
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 7
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 6
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 6
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 6
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- -1 kegg: r 01128) Proteins 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 102100024639 Short-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 4
- 102000005345 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Human genes 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 3
- 108700020831 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 1
- QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N (S)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N 0.000 description 1
- QHHKKMYHDBRONY-XQUJUNONSA-N 3-hydroxybutyryl-coenzyme a Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-XQUJUNONSA-N 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- 101100235003 Acetobacterium woodii (strain ATCC 29683 / DSM 1030 / JCM 2381 / KCTC 1655 / WB1) lctC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 208000036649 Dysbacteriosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 1
- 101150110799 ETFA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- QMXHMSQJMXMMKL-JRQZLUQRSA-N [[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(3R)-3-hydroxy-4-[[3-[2-[(3S)-3-hydroxybutyl]sulfanylethylamino]-3-oxopropyl]amino]-2,2-dimethyl-4-oxobutyl] hydrogen phosphate Chemical compound O[C@H](CCSCCNC(CCNC([C@@H](C(COP(OP(OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC1=2)O)OP(=O)(O)O)(=O)O)(=O)O)(C)C)O)=O)=O)C QMXHMSQJMXMMKL-JRQZLUQRSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 201000009840 acute diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 150000004652 butanoic acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000019902 chronic diarrheal disease Diseases 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004922 colonic epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000031891 intestinal absorption Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 101150003612 pfo gene Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用，属于微生态活菌制品领域。提取完整的微生态活菌制品基因组，并对基因序列拼接及序列校正，获得环状基因组，进行基因注释和酶功能注释，经过基因注释的基因组和酶功能注释与代谢通路数据库比对，对丁酸代谢通路进行分析，获得完整的丁酸代谢通路，确认微生态活菌制品的代谢通路覆盖度，确认相关基因和化合物，即为微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂。本发明通过生物信息学对一种生物标志物代谢通路进行代谢通路的完整性分析，确定关键标志物和基因，采用补加方式补全完善通路，使现有微生态活菌产品发挥更多的益生作用，起到更好的临床治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于微生态活菌制品技术领域，具体涉及一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用。
背景技术
微生态活菌制品系由人体内正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌经培养，收集菌体、干燥成菌粉后，加入适宜辅料混合制成。微生态活菌制品纳入药品管理，我国最早的微生态活菌制品研发于上世纪50年代，目前中国药典收载了15种可用于生产微生态活菌制品的菌株。微生态活菌制品安全性好，疗效确切，在临床上广泛使用。微生态活菌的作用机理复杂，其中，有益的代谢产物发挥了重要作用，具有改善肠道环境、抑制有害菌、促进有益菌生长等作用。微生态活菌菌株有多重代谢通路可以产生有益代谢产物，但是，由于筛选方式方法的局限性，现有用于商业生产的菌株大多基于最优代谢法则原则，有些通路的部分代谢所需化合物缺失，代谢通路未完全畅通。因此，部分限制了菌株益生作用的发挥。
丁酸又名酪酸，是一种短链脂肪酸，它是人肠道上皮细胞的主要营养物质，在小肠中，丁酸是结肠细胞正常生长发育的重要物质，是快速分化细胞的能量源。丁酸用于补充能量可被直接吸收，不需借助胆汁盐的作用。在体内外的研究中已经表明，丁酸对结肠上皮细胞的生长发育具有最显著的作用。研究表明，丁酸可促使小肠吸收面积最大化。此外，体外培养人的大肠黏膜细胞，在没有循环神经因素作用下丁酸钠可直接刺激上皮细胞增殖。另外，以丁酸为代表的短链脂肪酸可刺激结肠吸收钠，从而满足机体贮存水分的需要，维持机体稳态。丁酸还能通过影响肠道pH值进而影响消化酶的活性。丁酸可调节胃肠道酸度、肠道菌群平衡，刺激结肠有益微生物的生长，抑制不耐酸的弯曲杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌，肠道菌群平衡得到改善。人体内超过95%的丁酸在结肠内产生和吸收，一定水平的丁酸能够使结肠细胞保持稳定，从而可防止或抑制癌变，调节肠道菌群失调和治疗肠易激综合征、抗生素相关性肠炎、急慢性腹泻等疾病。丁酸属于脂肪酸，当通过外界食物摄取时，在其到达大肠发挥作用之前就基本被吸收，因此无法在下消化道中发挥益生作用；而丁酸也是大肠中产丁酸细菌的主要代谢物，因此，大肠中产丁酸微生物对机体健康意义重大。
目前尚未有针对为生态活菌制品中的菌株代谢特点，加入代谢通路激活剂，打通特定代谢通路，产生更多益生代谢产物，增强微生态活菌制品益生功能的产品。代谢通路调节剂填补了市场空白，会对微生态活菌制品市场的发展产生积极的推动作用。
发明内容
针对现有技术中微生态活菌制品代谢通路未完全打开、限制了菌株益生作用的发挥的问题，本发明提供了一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用，通过生物信息学对一种生物标志物代谢通路进行代谢通路的完整性分析，确定关键标志物和基因，采用补加方式补全完善通路，使现有微生态活菌产品发挥更多的益生效果，起到更好的临床作用效果。
本发明通过以下技术方案实现：
一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，包括以下步骤：
（1）基因组提取：对微生态活菌制品的菌株进行培养、纯化，提取完整基因组；
（2）基因序列拼接及序列校正：将基因组测序得到的碱基序列通过无参序列拼接，组成完整的基因组，然后采用序列矫正对测序产生的低质量环化共有序列进行纠错，使所得序列能够完整正确反映目标菌株的实际遗传序列信息，拼接结果为环状基因组，无碎片；
（3）基因注释和酶功能注释；
（4）代谢通路分析：经过基因注释的基因组和酶功能注释与代谢通路数据库比对，对丁酸代谢通路进行分析，获得完整的丁酸代谢通路；丁酸代谢通路的相关基因为丙酮酸合成酶基因（EC 1.2.7.1）、乙酰辅酶A乙酰转移酶基因（EC 2.3.1.9）、羟丁酸辅酶A脱氢酶基因（EC 1.1.1.35）、3-羟基丁基-CoA脱水酶基因（EC 4.2.1.150）、丁酰基辅酶A脱氢酶基因（EC 1.3.8.1）、磷酸转丁酸酶基因（EC 2.3.1.19）以及丁酸激酶基因（EC 2.7.2.7）；
（5）根据步骤（4）的比对结果确认微生态活菌制品的代谢通路覆盖度，确认相关基因和化合物，即为微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂。
进一步地，步骤（1）采用磁珠法提取完整基因组。
进一步地，步骤（2）中以二代及三代测序结果互为参考，采用从头测序方法，原始数据通过FastQC进行质量评估，通过Trimmomatic对测序数据进行质量剪切，使用SPAdes拼接二代测序数据，采用GapFiller对拼接得到的contig补GAP，利用PrInSeS-G修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。
进一步地，步骤（3）中采用Uniref作为基因注释及酶功能注释的数据库。
进一步地，步骤（4）中的代谢通路数据库为京都基因和基因组百科全书和MetaCyc。
进一步地，步骤（4）中获得的丁酸代谢通路的相关化合物包括丙酮酸盐、氧化铁氧还蛋白[铁硫]簇、CoA、乙酰CoA、还原铁氧还蛋白[铁硫]、乙酰乙酰CoA、3-羟基丁酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、巴豆酰CoA、丁酰基CoA、氧化的电子转移黄素蛋白+H+、还原的电子转移黄素蛋白、丁酰基磷酸。
本发明中，所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法在筛选微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂中的应用。
进一步地，所述的微生态活菌制品蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，或其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品。
进一步地，蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，或其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品的丁酸代谢通路激活剂为3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和/或其产物巴豆酰辅酶A。
本发明取得的有益效果为：
本发明通过生物信息学对一种生物标志物代谢通路进行代谢通路的完整性分析，确定关键标志物和基因，采用补加方式补全完善通路，使产品功效得到提升，针对其中一种未打通的有益代谢通路，通过增加调节剂，使通路打开，从而强化了其益生效果。
附图说明
图1为丁酸代谢全局图及3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶在其中的位置；
图2为双歧杆菌四联活菌中不同菌株的丁酸途径基因丰度图；
图3为丁酸对照品溶液色谱图；
图4为巴豆酰辅酶A对照品溶液色谱图；
图5为空白培养基对照色谱图；
图6为粪肠球菌未添加激活剂培养物色谱图；
图7为嗜酸乳杆菌未添加激活剂培养物色谱图；
图8为婴儿双歧杆菌未添加激活剂培养物色谱图；
图9为蜡样芽胞杆菌未添加激活剂培养物色谱图；
图10为添加巴豆酰辅酶A的空白培养基对照色谱图；
图11为粪肠球菌添加巴豆酰辅酶A培养物色谱图；
图12为嗜酸乳杆菌添加巴豆酰辅酶A培养物色谱图；
图13为双歧杆菌添加巴豆酰辅酶A培养物色谱图；
图14为蜡样芽胞杆菌添加巴豆酰辅酶A培养物色谱图。
具体实施方式
为了对本发明进行更进一步的详细描述，给出以下具体实施范例，但仅用于阐明本发明，使步骤更加清晰，而不是为了限制本发明的应用范围。
实施例1 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，具体为：
（1）基因组提取：对微生态活菌制品的菌株进行培养、纯化，采用磁珠法提取完整基因组；
（2）基因序列拼接及序列校正：将基因组测序得到的碱基序列通过无参序列拼接，组成完整的基因组，然后采用序列矫正对测序产生的低质量环化共有序列进行纠错，使所得序列能够完整正确反映目标菌株的实际遗传序列信息，拼接结果为环状基因组，无碎片；
测序的原始数据通过FastQC进行质量评估，通过Trimmomatic对测序数据进行质量剪切，得到相对准确的有效数据，使用SPAdes拼接二代测序数据，采用GapFiller对拼接得到的contig补GAP，利用PrInSeS-G修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。基因组测序得到散在的reads通过无参序列拼接，即从头测序（Denovo Genome Sequencing，Denovo），组装成完整的基因组，三代及二代测序结果互为参考可有效避免“一致性序列”不足，之后采用序列矫正（Polish）对测序产生的低质量环化共有序列（Circular ConsensusSequencing，CCS）等进行纠错，所得序列能够完整正确反映目标菌株的实际遗传序列信息，拼接结果为环状基因组，无碎片。基于参考序列拼接方法获得的序列称为“一致性序列”，顾名思义，就是与参考序列保持一致。但这种方法得到的序列并不是真实存在的基因组序列，主要有以下原因：1）已发表出来的参考序列并不是100%准确的，如果参考序列中累积的错误，使用该方法，错误会被逐渐累积；2）该方法受参考序列影响很大，选择不同的参考序列会得到不同的一致性序列；3）如果参考序列与测序物种之间存在较大的结构变异，则无法突出这些结构变异。因此，本专利未使用参考基因组测序拼接，而使用从头测序（denovo）。
（3）基因注释和酶功能注释；基因注释及酶功能注释采用Uniref（https://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/uniref/，2023-05-03）作为数据库，本专利采用Uniref而未采用GO（Gene Ontology）、NR（NCBI non-redundant protein sequences）以及COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins）等注释数据库的原因是UniRef是目前最全面的非冗余蛋白质序列数据库。
（4）代谢通路分析：经过基因注释的基因组和酶功能注释与代谢通路数据库比对，对丁酸代谢通路进行分析，获得完整的丁酸代谢通路；代谢通路数据库为京都基因和基因组百科全书（KEGG）和MetaCyc，使用的数据库版本为MetaCyc Pathway Database（2022年05月）。在通路的完整度上，KEGG更加注重将所有物种的通路汇总到一张图上，而MetaCyc更加注重不同物种通路的差异化。相较于MetaCyc，KEGG通路覆盖更全面，而MetaCyc相对会更特异，两者MetaCyc可以互为补充。
通过代谢通路分析，丁酸代谢全局图如图1所示：
通过对丁酸代谢通路进行分析，丁酸代谢通路涉及的相关基因为由丙酮酸合成酶（pfoA）基因（EC 1.2.7.1，KEGG：R01196）、乙酰辅酶A乙酰转移酶（thl）基因（EC 2.3.1.9，KEGG：R00238）、羟丁酸辅酶A脱氢酶（hbd）基因（EC 1.1.1.35，KEGG：R01975）、3-羟基丁基-CoA脱氢酶（crt）基因（EC 4.2.1.150，KEGG：R03026）、丁酰基辅酶A脱氢酶（NAD+，铁氧还蛋白）（etfA）基因（EC 1.3.8.1，KEGG：R01178）、磷酸转丁酸酶（ptb）基因（EC 2.3.1.19，KEGG：R01174）以及丁酸激酶（buk1）基因（EC 2.7.2.7，KEGG：R01688）7种核心基因用以实现微生物体内合成丁酸；
丁酸代谢通路涉及的化合物包括丙酮酸盐、氧化铁氧还蛋白[铁硫]簇、CoA、乙酰CoA、还原铁氧还蛋白[铁硫]、乙酰乙酰CoA、3-羟基丁酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、巴豆酰CoA、丁酰基CoA、氧化的电子转移黄素蛋白+H+、还原的电子转移黄素蛋白、丁酰基磷酸等。
丁酸代谢通路涉及涉及的酶促化学反应包括：1）丙酮酸盐+2氧化铁氧还蛋白[铁硫]簇+辅酶A↔乙酰CoA+CO2+2还原铁氧还蛋白[铁硫]簇+H+；2）乙酰CoA↔乙酰乙酰CoA+CoA；3）3-羟基丁酰基-CoA+NAD+↔乙酰乙酰CoA+NADH+H+；4）3-羟基丁酰基-CoA↔巴豆酰基CoA+H2O；5）丁酰基CoA+氧化的电子转移黄素蛋白+H+↔巴豆酰CoA+还原的电子转移黄素蛋白；6）丁酰基CoA+磷酸盐↔丁酰基磷酸+CoA；7）丁酸盐+ATP↔丁酰基磷酸+ADP。
丁酸代谢通路始于乙酰辅酶A C-乙酰转移酶，它催化两个乙酰辅酶A分子缩合形成乙酰乙酰辅酶A；乙酰基辅酶A通过NAD依赖性的（S）-3-羟基丁基辅酶A脱氢酶转化为（S）-3-羟基丁酰基辅酶A；3-羟基丁基-CoA脱水酶和丁酰基-CoA脱氢酶（NAD+，铁氧还蛋白）继续形成巴豆酰基CoA和丁酰基CoA；丁酰基辅酶A向丁酸的最后两步转化是细胞产生ATP的重要能量来源。这种两步转化是由磷酸反式丁酸酶和丁酸激酶催化的。在正常发酵条件下，反应仅在丁酸形成的方向上进行。
（5）根据步骤（4）的比对结果确认微生态活菌制品的代谢通路覆盖度，确认相关基因和化合物，即为微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂。
实施例2 双歧杆菌四联活菌制剂丁酸代谢通路激活剂的筛选：
（1）无菌称取3.0g成品（双歧杆菌四联活菌片，思连康），加入27ml 0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，振荡混匀，必要时可以加入无菌玻璃珠。充分混匀后即为10-1稀释液，取10-1稀释液1ml至9ml 0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，即为10-2稀释液，用相同方法10倍系列稀释至10-3和10-4稀释液，取10-3稀释液100μl，滴入BA琼脂平皿上，平行制备3份；取10-4稀释液100μl，分别滴入改良TPY琼脂培养基、改良MRS琼脂培养基、EC琼脂培养基平皿上，每种培养基平行制备3份，以无菌涂布棒涂匀。观察分析。进行多次菌株纯化。采用磁珠法提取完整基因组；
（2）根据实施例1步骤（4）丁酸代谢通路分析结果，对双歧杆菌四联活菌制剂中的四个菌株进行所述代谢通路分析，双歧杆菌四联活菌制剂四种菌株丁酸代谢通路线管基因丰度图如图2所示（白色基因位置表示基因缺失，灰度越深，基因丰度越高），结果显示各菌株代谢通路均存在差异，双歧杆菌四联活菌制剂四种菌株丁酸代谢通路覆盖率如下表1所示：
表1
通过对四个菌株的分析可知，蜡样芽孢杆菌的通路相关基因覆盖度达0.857，仅缺失编码EC 4.2.1.150的基因，该基因为3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶（3-hydroxybutyryl-CoAdehydratase），其底物为3-羟异丁酰辅酶A（(S)-3-hydroxybutanoyl-CoA），产物为巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）基因，3-羟基丁酰辅酶A在丁酸代谢全局图中的位置如图1圆形标出的位置所示。可通过添加3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和/或其产物巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）促进丁酸合成。
实施例3 丁酸代谢通路激活剂3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和其产物巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）促进丁酸合成的效果验证：
（1）HPLC法测定丁酸的方法：色谱条件：十八烷基硅胶键合相（镶嵌极性基团）为填充剂（色谱柱为Waters® XBridge Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）），流动相为乙腈加入0.15%的磷酸溶液，流动相中乙腈与磷酸溶液的体积比为25:75，所述乙腈为色谱纯，流速为1.0ml/min，检测器为紫外检测器，波长为206nm，柱温为30℃，进样量为10 μL，所有进样溶液均摇匀后过0 .45μm微孔滤膜处理后进样。
（2）标准对照品溶液的制备步骤为：精密称定丁酸钠对照品约10mg，置于10ml容量瓶中，用0.1%的磷酸溶液定容，摇匀后过0.45μm微孔滤膜，制成浓度为1 mg/ml的溶液；精密称定巴豆酰辅酶A对照品约100mg，置于10ml容量瓶中，用0.1%的磷酸溶液定容，摇匀后过0.45μm微孔滤膜，制成浓度为10 mg/ml的溶液；上述两种溶液作为对照品溶液，将两种对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，其中丁酸对照品溶液的色谱图如图3所示，巴豆酰辅酶A对照品溶液的色谱图如图4所示。
（3）对照培养物溶液的制备：选取胰酪大豆胨液体培养基等适宜的培养基，分装成100ml每瓶湿热灭菌，配置完成后，在4瓶培养基中分别接入4株不同菌株（蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌），36℃，180rpm培养18小时，其中婴儿双歧杆菌厌氧培养，培养结束后8000rpm离心10分钟，取上清作为对照培养物溶液，另外取未加入微生物的空白培养基作为培养基对照。
将对照培养物溶液和空白培养基分别注入高效液相色谱仪进行检测，其中空白培养基的色谱图如图5所示，粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌未添加激活剂（巴豆酰辅酶A）的对照培养物溶液的色谱图分别如图6、图7、图8和图9所示。
（4）供试品溶液的制备：选取胰酪大豆胨液体培养基等适宜的培养基，分装成100ml每瓶湿热灭菌，灭菌后加入0.45μm微孔滤膜处理的上述巴豆酰辅酶A对照品溶液2ml，使培养基中巴豆酰辅酶A终浓度约为200μg/ml，配置完成后，在4瓶培养基中分别接入4株不同菌株（蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌），36℃，180rpm培养18小时，其中婴儿双歧杆菌厌氧培养，培养结束后8000rpm离心10分钟，取上清作为供试品溶液，另外取未加入微生物的含巴豆酰辅酶A的空白改良培养基作为培养物对照溶液。以上所有溶液均摇匀后过0 .45μm微孔滤膜处理后进样。
将供试品溶液和培养物对照溶液分别注入高效液相色谱仪进行检测，其中培养物对照溶液的色谱图如图10所示，粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌和蜡样芽胞杆菌添加激活剂（巴豆酰辅酶A）的供试品溶液的色谱图分别如图11、图12、图13和图14所示。
经过实验验证（图3-14），体外培养蜡样芽孢杆菌至指数期过程中补加3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和巴豆酰辅酶A，可以检测到丁酸分泌水平的提高，表明羟基丁酰辅酶A脱氢酶和巴豆酰辅酶A可作为蜡样芽孢杆菌菌剂或双歧杆菌四联活菌制剂丁酸通路激活剂。
Claims (9)
1.一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）基因组提取：对微生态活菌制品的菌株进行培养、纯化，提取完整基因组；
（2）基因序列拼接及序列校正：将基因组测序得到的碱基序列通过无参序列拼接，组成完整的基因组，然后采用序列矫正对测序产生的低质量环化共有序列进行纠错，使所得序列能够完整正确反映目标菌株的实际遗传序列信息，拼接结果为环状基因组，无碎片；
（3）基因注释和酶功能注释；
（4）代谢通路分析：经过基因注释的基因组和酶功能注释与代谢通路数据库比对，对丁酸代谢通路进行分析，获得完整的丁酸代谢通路；丁酸代谢通路的相关基因为丙酮酸合成酶基因、乙酰辅酶A乙酰转移酶基因、羟丁酸辅酶A脱氢酶基因、3-羟基丁基-CoA脱水酶基因、丁酰基辅酶A脱氢酶基因、磷酸转丁酸酶基因以及丁酸激酶基因；
（5）根据步骤（4）的比对结果确认微生态活菌制品的代谢通路覆盖度，确认相关基因和化合物，即为微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂。
2.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（1）采用磁珠法提取完整基因组。
3.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中以二代及三代测序结果互为参考，采用从头测序方法，原始数据通过FastQC进行质量评估，通过Trimmomatic对测序数据进行质量剪切，使用SPAdes拼接二代测序数据，采用GapFiller对拼接得到的contig补GAP，利用PrInSeS-G修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。
4.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中采用Uniref作为基因注释及酶功能注释的数据库。
5.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中的代谢通路数据库为京都基因和基因组百科全书和MetaCyc。
6.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中获得的丁酸代谢通路的相关化合物包括丙酮酸盐、氧化铁氧还蛋白[铁硫]簇、CoA、乙酰CoA、还原铁氧还蛋白[铁硫]、乙酰乙酰CoA、3-羟基丁酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、巴豆酰CoA、丁酰基CoA、氧化的电子转移黄素蛋白+H+、还原的电子转移黄素蛋白、丁酰基磷酸。
7.一种权利要求1~6任一项所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法在筛选微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的微生态活菌制品为蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，或其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，以及其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品，丁酸代谢通路激活剂为3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和/或其产物巴豆酰辅酶A。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311319234.8A CN117051080B (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311319234.8A CN117051080B (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117051080A true CN117051080A (zh) | 2023-11-14 |
| CN117051080B CN117051080B (zh) | 2024-01-23 |
Family
ID=88669605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311319234.8A Active CN117051080B (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117051080B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006107127A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Method for improving a strain based on in-silico analysis |
| CN103361431A (zh) * | 2013-07-18 | 2013-10-23 | 江南大学 | 一种基于全基因组序列分析不产真菌毒素的真菌菌株安全性评价方法 |
| CN108753616A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 贵州茅台酒股份有限公司 | 一种基于全基因组信息学分析定向筛选角鲨烯菌株的办法 |
| CN110438056A (zh) * | 2019-08-12 | 2019-11-12 | 江南大学 | 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 |
| CN112126615A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-25 | 天津大学 | 一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 |
| CN112877272A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-01 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法 |
| CN113116938A (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-16 | 杭州远大生物制药有限公司 | 四联活菌制剂及其应用 |
| CN114395575A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-04-26 | 华南理工大学 | 一种生产丁酸丁酯的酪丁酸梭菌重组菌株及其构建方法和应用 |
| CN114525214A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-24 | 天津大学 | 一种工程益生菌的构建方法及其应用 |
-
2023
- 2023-10-12 CN CN202311319234.8A patent/CN117051080B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006107127A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Method for improving a strain based on in-silico analysis |
| CN103361431A (zh) * | 2013-07-18 | 2013-10-23 | 江南大学 | 一种基于全基因组序列分析不产真菌毒素的真菌菌株安全性评价方法 |
| CN108753616A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 贵州茅台酒股份有限公司 | 一种基于全基因组信息学分析定向筛选角鲨烯菌株的办法 |
| CN110438056A (zh) * | 2019-08-12 | 2019-11-12 | 江南大学 | 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 |
| CN113116938A (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-16 | 杭州远大生物制药有限公司 | 四联活菌制剂及其应用 |
| CN112126615A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-25 | 天津大学 | 一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 |
| CN112877272A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-01 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法 |
| CN114395575A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-04-26 | 华南理工大学 | 一种生产丁酸丁酯的酪丁酸梭菌重组菌株及其构建方法和应用 |
| CN114525214A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-24 | 天津大学 | 一种工程益生菌的构建方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WIDODO WIDODO等: "Genomic Comparison of Lactobacillus casei AP and Lactobacillus plantarum DR131 with Emphasis on the Butyric Acid Biosynthetic Pathways", MICROORGANISMS, pages 393 - 394 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117051080B (zh) | 2024-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qian et al. | Cooperation within the microbial consortia of fermented grains and pit mud drives organic acid synthesis in strong-flavor Baijiu production | |
| Guo et al. | Depletion of microbiome-derived molecules in the host using Clostridium genetics | |
| Khan et al. | Synergy and oxygen adaptation for development of next-generation probiotics | |
| Zhao et al. | Metabolic engineering of Escherichia coli for producing adipic acid through the reverse adipate-degradation pathway | |
| Zhao et al. | Metabolic engineering of Escherichia coli for secretory production of free haem | |
| Zhao et al. | Discovery of potential genes contributing to the biosynthesis of short-chain fatty acids and lactate in gut microbiota from systematic investigation in E. coli | |
| Liu et al. | Clostridium sporogenes uses reductive Stickland metabolism in the gut to generate ATP and produce circulating metabolites | |
| Martínez-del Campo et al. | Characterization and detection of a widely distributed gene cluster that predicts anaerobic choline utilization by human gut bacteria | |
| Wang et al. | Non-lethal inhibition of gut microbial trimethylamine production for the treatment of atherosclerosis | |
| Alteri et al. | Preferential use of central metabolism in vivo reveals a nutritional basis for polymicrobial infection | |
| Hao et al. | Complete sequencing and pan-genomic analysis of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus reveal its genetic basis for industrial yogurt production | |
| Yao et al. | Pantothenic acid, vitamin C, and biotin play important roles in the growth of Lactobacillus helveticus | |
| Yi et al. | Dietary concentrate-to-forage ratio affects rumen bacterial community composition and metabolome of yaks | |
| Feng et al. | Characterization of the central metabolic pathways in Thermoanaerobacter sp. strain X514 via isotopomer-assisted metabolite analysis | |
| Jijakli et al. | Metabolic modeling of Streptococcus mutans reveals complex nutrient requirements of an oral pathogen | |
| Schneider et al. | Oxalyl-coenzyme A reduction to glyoxylate is the preferred route of oxalate assimilation in Methylobacterium extorquens AM1 | |
| Li et al. | High alcohol-producing Klebsiella pneumoniae causes fatty liver disease through 2, 3-butanediol fermentation pathway in vivo | |
| Sanchez-Carrillo et al. | A body weight loss-and health-promoting gut microbiota is established after bariatric surgery in individuals with severe obesity | |
| Chen et al. | Genome‐scale modeling for Bacillus coagulans to understand the metabolic characteristics | |
| Matsumoto et al. | A single-nucleotide insertion in a drug transporter gene induces a thermotolerance phenotype in Gluconobacter frateurii by increasing the NADPH/NADP+ ratio via metabolic change | |
| Armingol et al. | Understanding the impact of the cofactor swapping of isocitrate dehydrogenase over the growth phenotype of Escherichia coli on acetate by using constraint-based modeling | |
| CN117051080B (zh) | 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用 | |
| Fan et al. | Ambient pH regulates lactate catabolism pathway of the ruminal Megasphaera elsdenii BE2‐2083 and Selenomonas ruminantium HD4 | |
| Whitham et al. | Characterization of Clostridium ljungdahlii OTA1: a non-autotrophic hyper ethanol-producing strain | |
| Agne et al. | Enoyl-coenzyme A respiration via formate cycling in syntrophic bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |