CN112877272A - 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及农业生物技术领域，具体涉及一种N‑乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法。本发明通过截断糖酵解途径和磷酸戊糖途径对N‑乙酰氨基葡萄糖合成前体6‑磷酸果糖的分流，提高了突变型大肠杆菌底盘细胞中的产物前体供应，再利用游离的高拷贝质粒在底盘细胞内表达了N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径的关键酶，利用混合碳源培养基发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖，N‑乙酰氨基葡萄糖的产量达到2.8 g/L。

Description

一种N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法

技术领域

本申请涉及农业生物技术领域，具体涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法。

背景技术

氨基葡萄糖是由葡萄糖分子的羟基被氨基所取代后的化合物。通常以N-乙酰基衍生物或N-硫酸酯和N-乙酰-3-O-乳酸醚形式存在于细胞壁结合多糖和动物结缔组织中。工业生产的氨基葡萄糖已被广泛应用于饲料、医药、食品、日化等诸多行业。其中，N-乙酰氨基葡萄糖能够修复人体受损软骨细胞组织，增加关节间的润滑，在医药领域尤其是治疗和预防关节炎方面发挥着重要作用。

目前，我国的N-乙酰氨基葡萄糖多以壳聚糖作为原料，通过水解反应进行生产。这不仅使原料来源受到很大限制，而且会造成体质敏感的人群发生过敏反应等。随着合成生物学的发展，生物合成N-乙酰氨基葡萄糖的方法已经被建立起来。但目前的发酵大多仅利用葡萄糖作为唯一碳源，存在产量低、转化效率低、副产物（乙酸、谷氨酸等）含量较高的缺陷。这不仅造成了因生产成本高而难以产生良好经济效益的工业生产困境，而且副产物的大量产生会使能源严重浪费并进一步造成环境污染。因此，建立一种能够在提升葡萄糖原料的转化率的同时能够将代谢副产物回收进行利用，从而避免能源浪费和环境污染，进而提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量的生产策略无疑极具吸引力。

发明内容

为解决现有N-乙酰氨基葡萄糖制备技术中存在的转化效率低、能源浪费等问题，本发明的目的是提供一种产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌。

本发明的再一目的是提供一种高效发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

根据本发明的产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌，所述工程菌为外源表达N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因和混合碳源共利用酶基因的敲除了糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键基因的突变型大肠杆菌，

其中，被敲除的糖酵解途径关键基因为ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1的编码基因pfkA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2的编码基因pfkB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和磷酸戊糖途径关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，

所述N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因为Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4，果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5， Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6，

所述混合碳源共利用酶基因为Pichia pastoris来源的甘油激酶编码基因glpK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7。

根据本发明的构建产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌的方法，包括以下步骤：

敲除糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键基因，构建突变型大肠杆菌底盘细胞；

导入表达N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因和混合碳源共利用酶基因，

其中，被敲除的糖酵解途径关键基因为ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1的编码基因pfkA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2的编码基因pfkB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和磷酸戊糖途径关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，

所述N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因为Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4，果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5， Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6，

所述混合碳源共利用酶基因为Pichia pastoris来源的甘油激酶编码基因glpK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7。

根据本发明的构建产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌的方法，其中，将所述Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶编码基因glms的突变基因和果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB、所述Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因、以及所述Pichia pastoris来源的甘油激酶编码基因glpK连接到pEasy-T3载体上，分别利用各自的启动子进行胞内表达。

根据本发明的构建产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌的方法，其中，所述启动子均为P _PGI ，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明另一个目的是提供一种发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：摇瓶发酵上述的产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌株，得到N-乙酰氨基葡萄糖。

根据本发明的发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其中，利用混合碳源培养基进行摇瓶发酵。

根据本发明的发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其中，发酵培养基的配方为：磷酸氢二钠 6.78 g、磷酸二氢钾 3 g、氯化钠 1.5 g、氯化铵1 g、葡萄糖10 g、氯化钙 0.011g、七水合硫酸镁 0.493 g、5 g甘油、酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g，以水作为溶剂定容至1L。

根据本发明的发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其中，所述发酵培养基中添加氨苄抗生素终浓度为50 µg/mL。

根据本发明的发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其中，所述摇瓶发酵条件为温度37℃，转速200 rpm，发酵108小时。

本申请的技术方案的优点：

1. 本发明通过截断糖酵解途径和磷酸戊糖途径对N-乙酰氨基葡萄糖合成前体6-磷酸果糖的分流，提高了突变型大肠杆菌底盘细胞中的产物前体供应，再利用游离的高拷贝质粒在底盘细胞内表达了N-乙酰氨基葡萄糖合成途径的关键酶，利用混合碳源培养基发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到2.8 g/L。

2. 根据本申请的技术方案，被敲除的糖酵解途径关键基因为ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1的编码基因 pfkA ，ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2的编码基因 pfkB ，以及磷酸戊糖途径关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因 zwf 。虽然敲除三个基因的目的是截断糖酵解途径和磷酸戊糖途径对N-乙酰氨基葡萄糖合成前体6-磷酸果糖的分流，提高了突变型大肠杆菌底盘细胞中的产物前体供应，但糖酵解和磷酸戊糖途径的阻断以及6-磷酸果糖的积累会严重影响菌株对葡萄糖的吸收和代谢，造成菌株在以葡萄糖为碳源的基础培养基中生长缓慢，进而会影响N-乙酰氨基葡萄糖的生产。

3. 根据本申请的技术方案，为了解决上述问题，在上述突变型大肠杆菌底盘细胞中表达特异性的述N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因、混合碳源共利用酶基因的基因组合，选用的N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因为Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因，果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB，以及 Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因，Pichia pastoris来源的甘油激酶编码基因glpK，其中，Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因为将Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶进行E14K、D386V、S449P、E524G突变获得突变体的编码基因，Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因为Caenorhabditiselegans葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶进行Q155V、C158G突变获得的突变体的编码基因。所述Escherichia coli来源的glms的突变基因编码L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶催化果糖6-磷酸生成D-氨基葡萄糖6-磷酸，Caenorhabditis elegans来源的gna-1的突变基因编码葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶催化乙酰辅酶A和D-氨基葡萄糖6-磷酸生成N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸，Escherichia coli来源基因yqaB编码果糖-1-磷酸酶YqaB催化N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸生成N-乙酰氨基葡萄糖。过表达Pichia pastoris来源的glpK使菌株能够同时代谢甘油和葡萄糖。在敲除糖酵解途径磷酸果糖激酶基因pfkA、pfkB和敲除磷酸戊糖途径zwf的底盘工程菌株中表达上述N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因、混合碳源共利用酶基因实现了N-乙酰氨基葡萄糖的合成和葡萄糖、甘油共利用。

通过表达glpK使菌株具有了甘油和葡萄糖共代谢的能力，解决了菌株在阻断糖酵解和磷酸戊糖途径后生长受到抑制的影响。同时，引入的N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因对转化6-磷酸果糖生成N-乙酰氨基葡萄糖具有高催化活性，进一步降低了6-磷酸果糖在细胞内的积累，从而有利于葡萄糖的转运和代谢。

4. 大肠杆菌发酵的主要副产物是乙酸，而乙酸的积累会严重抑制菌株的生长，且会降低产物的产率（产物量/发酵底物量）。根据本申请的技术方案，并未对乙酸代谢途径进行改造，但是，试验数据表明，本申请的阻断糖酵解和磷酸戊糖途径的工程菌株的乙酸产量显著降低，并在发酵后期被重吸收，因此在发酵结束时基本没有乙酸的积累。一方面，本申请的工程菌株的乙酸产量降低，可减少乙酸对菌体生长的影响，并提高产物产率。另一方面，乙酸在大肠杆菌中通过乙酰辅酶A合成酶（ACS）催化被重吸收后可生成乙酰辅酶A，可为葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶提供用于合成N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸的乙酰基，提高了产物合成的能力。

附图说明

图1显示大肠杆菌野生株和本申请构建的工程菌株产N-乙酰氨基葡萄糖的结果；

图2显示大肠杆菌野生株和本申请构建的工程菌株利用甘油的结果；

图3显示大肠杆菌野生株和本申请构建的工程菌株利用葡萄糖的结果；

图4显示大肠杆菌野生株和本申请构建的工程菌株利用自身产生的乙酸的结果；

图5 显示大肠杆菌野生株和本申请构建的工程菌株acs基因的相对表达量；

图6显示大肠杆菌野生株和本申请构建的工程菌株在对比实施例1混合发酵培养基中产N-乙酰氨基葡萄糖的结果；

图7 显示大肠杆菌野生株和本申请构建的工程菌株在对比实施例2混合发酵培养基中产N-乙酰氨基葡萄糖的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1构建大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf底盘细胞

突变型大肠杆菌底盘细胞为敲除糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键基因的大肠杆菌宿主，被敲除的糖酵解途径关键基因为ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1的编码基因pfkA、ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2的编码基因pfkB和磷酸戊糖途径关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf。

一、构建大肠杆菌MG1655-∆pfkB菌株

将pRed_cas9_recA_poxb300质粒和pfkB基因靶向敲除载体p∆pfkB-T3导入大肠杆菌MG1655宿主中。利用阿拉伯糖诱导Cas9蛋白表达，在gRNA引导下剪切大肠杆菌MG1655基因组序列，获得pfkB基因敲除的大肠杆菌MG1655-∆pfkB菌株。具体方法如下：

1. 构建带有启动子P23119、pfkB基因的20 bp sgRNA和gRNA scaffold序列的片段的敲除质粒p∆pfkB-gRNA-T3

根据组成型启动子P23119和pfkB基因序列（GenBank:QPA15527.1）设计合成引物。以pRed_cas9_recA_poxb300（购买自Molecularcloud）质粒为模板，利用上述设计的引物扩增带有完整启动子P23119、pfkB基因的20 bp sgRNA和gRNA scaffold序列的片段，片段大小约131 bp。将获得的片段使用TA连接方式连接至pEasy-T3质粒上，电击转化至大肠杆菌NEB express宿主中，涂布LB固体平板（卡那霉素50 µg/mL，氨苄青霉素50 µg/mL），筛选阳性克隆子，目标片段640 bp。命名为p∆pfkB-gRNA-T3。

2. 构建带有pfkB基因上下游同源臂的敲除质粒p∆pfkB-T3

在pfkB基因的CDS区上下游各选取约500 bp作为同源臂序列，以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用引物扩增目标片段，并通过overlap PCR将各片段连接。利用限制性核酸内切酶SbfI、NdeI对质粒p∆pfkB-gRNA-T3进行双酶切，电泳回收4574 bp片段。与所述pfkB同源臂序列以一定比例加入同源重组反应体系中，50℃反应15分钟，取5μL连接产物转化大肠杆菌NEB express宿主，使用氨苄青霉素抗性平板筛选。挑取阳性克隆并进行液体培养。提取质粒并进行PCR验证，目的片段为1000 bp。将成功构建的质粒命名为p∆pfkB-T3。

3. 构建大肠杆菌MG1655-∆pfkB突变菌株

将pRed_cas9_recA_poxb300和p∆pfkB-T3质粒通过电击转化导入MG1655大肠杆菌宿主细胞中，利用LB（卡那霉素50µg/mL，氨苄青霉素50µg/mL）固体平板筛选阳性克隆子。将阳性克隆子转接于相同抗性的LB液体培养基中复壮。将菌体稀释至10^-4涂布于相同抗性且含有2 g/L阿拉伯糖的LB固体诱导培养平板上，30℃诱导培养16小时。进行菌落PCR检测，筛选目的基因被成功敲除的克隆，目的片段大小为1600 bp。将成功构建的菌株接种于LB液体培养基（卡那霉素50 µg/mL）中，于42℃下200 rpm培养16 h，并连续培养5代。将菌体进行梯度稀释至10^-6，涂布LB固体平板（卡那霉素50 µg/mL）上筛选出无p∆pfkB-T3质粒的菌株，命名为大肠杆菌MG1655-∆pfkB。

二、构建大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB菌株

将pfkA基因靶向敲除载体p∆pfkA-T3导入大肠杆菌MG1655-∆pfkB宿主中，利用阿拉伯糖诱导Cas9蛋白表达，在gRNA引导下剪切大肠杆菌MG1655-∆pfkB宿主菌株基因组序列，最终获得pfkA基因敲除的大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB菌株。具体方法如下：

1. 构建带有启动子P23119、pfkA基因的20 bp sgRNA和gRNA scaffold序列的片段的敲除质粒p∆pfkA-gRNA-T3

根据组成型启动子P23119和pfkA基因序列（GenBank:QPA15527.1）设计合成引物，以pRed_cas9_recA_poxb300（购买自Molecularcloud）质粒为模板，利用合成引物扩增带有完整启动子P23119、pfkA基因的20 bp sgRNA和gRNA scaffold序列的片段，片段大小约131bp。将获得的片段使用TA连接方式连接至pEasy-T3质粒上，电击转化至大肠杆菌NEBexpress宿主中，涂布LB固体平板（卡那霉素50 µg/mL，氨苄青霉素50 µg/mL），筛选阳性克隆子，PCR检测片段大小为640bp为阳性。命名为p∆pfkA-gRNA-T3。

2. 构建带有pfkA基因上下游同源臂的敲除质粒p∆pfkA-T3

在pfkA基因的CDS区上下游各选取约500 bp作为同源臂序列，以大肠杆菌MG1655基因组为模板，扩增目标片段，并通过overlap PCR将各片段连接。利用限制性核酸内切酶SbfI、NdeI对质粒p∆pfkA-gRNA-T3进行双酶切，电泳回收4574 bp片段。与所述pfkA同源臂序列以一定比例加入同源重组反应体系中，50℃反应15分钟，取5μL连接产物转化大肠杆菌NEB express宿主，使用LB抗性平板（氨苄青霉素50 µg/mL）筛选。挑取阳性克隆并进行液体培养。提取质粒并利用引物pfkA-N-F和M13-R进行PCR验证，目的片段为1000 bp。将成功构建的质粒命名为p∆pfkA-T3。

2. 构建大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB菌株

将pRed_cas9_recA_poxb300和p∆pfkA-T3质粒电转导入大肠杆菌MG1655-∆pfkB菌株中。利用LB固体平板（卡那霉素50 µg/mL，氨苄青霉素50 µg/mL）于30℃进行培养。将阳性克隆子转接于相同抗性的液体LB培养基中，复壮14小时，将菌体稀释至10^-4涂布于具有相同抗性且含有2 g/L阿拉伯糖的LB固体平板上，30℃诱导培养16小时。进行菌落PCR检测，筛选成功敲除了pfkA基因的克隆子，目的片段大小为1300 bp。

将成功构建的菌株接种于LB液体培养基（卡那霉素50 µg/mL）中，于42℃下200rpm培养16 h，并连续培养5代。将菌体进行梯度稀释至10^-6，涂布LB固体平板（卡那霉素50 µg/mL）上筛选出无p∆pfkA-T3质粒的菌株，命名为大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB。

三、构建大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf底盘细胞

将zwf基因靶向敲除载体p∆zwf -T3导入大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB宿主中，利用阿拉伯糖诱导Cas9蛋白表达，在gRNA引导下剪切大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB宿主菌株基因组序列，最终获得zwf基因敲除的大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf菌株。具体方法如下：

1. 构建带有启动子P23119、zwf基因的20 bp sgRNA和gRNA scaffold序列的片段的敲除质粒p∆zwf-gRNA-T3

根据组成型启动子P23119和zwf基因序列（GenBank:QPA15527.1）设计合成引物zwf-gRNA-F和gRNA-R。以pRed_cas9_recA_poxb300（购买自Molecularcloud）质粒为模板，扩增带有完整启动子P23119、zwf基因的20 bp sgRNA和gRNA scaffold序列的片段，片段大小约131 bp。将获得的片段使用TA连接方式连接至pEasy-T3质粒上，电击转化至大肠杆菌NEB express宿主中，涂布LB固体平板（氨苄青霉素50 µg/mL）。挑取阳性克隆并进行液体培养。提取质粒并进行PCR验证，目的片段为640 bp。将成功构建的质粒命名为p∆zwf-gRNA-T3。

2.构建带有zwf基因上下游同源臂的敲除质粒p∆zwf-T3

在zwf基因的CDS区上下游各选取约500 bp作为同源臂序列，以大肠杆菌MG1655基因组为模板，扩增目标片段，并通过overlap PCR将各片段连接。利用限制性核酸内切酶SbfI、NdeI对质粒p∆zwf-gRNA-T3进行双酶切，电泳回收4574 bp片段。与所述zwf同源臂序列以一定比例加入同源重组反应体系中，50℃反应15分钟，取5μL连接产物转化大肠杆菌NEB express宿主，使用LB抗性平板（氨苄青霉素50 µg/mL）筛选。挑取阳性克隆并进行液体培养。提取质粒并进行PCR验证，目的片段为1000 bp。将成功构建的质粒命名为p∆zwf-T3。

2. 构建大肠杆菌MG1655- ∆pfkA∆pfkB∆zwf菌株

将pRed_cas9_recA_poxb300和p∆zwf-T3质粒电转导入大肠杆菌MG1655-∆pfkA ∆pfkB菌株中。利用LB固体平板（卡那霉素50 µg/mL，氨苄青霉素50 µg/mL）于30℃进行培养。将阳性克隆子转接于相同抗性的液体LB培养基中，复壮14小时，将菌体稀释至10^-4涂布于具有相同抗性且含有2 g/L阿拉伯糖的LB固体平板上，30℃诱导培养16小时。进行菌落PCR检测，筛选成功敲除了zwf基因的克隆子，目的片段大小为1300 bp。将成功构建的菌株接种于无抗性LB液体培养基中，于42℃下200 rpm培养16 h，并连续培养5代。将菌体进行梯度稀释至10^-6，涂布LB固体平板上筛选出无质粒的菌株，命名为大肠杆菌MG1655- ∆pfkA∆pfkB∆zwf。上述大肠杆菌突变体具体见表1所。

表1

菌株	性状
		大肠杆菌MG1655	野生菌株
大肠杆菌MG1655-∆<i>pfkB</i>	<i>pfkB</i>基因敲除菌株
		大肠杆菌MG1655-∆<i>pfkA</i>∆<i>pfkB</i>	<i>pfkA</i>和<i>pfkB</i>基因敲除菌株
大肠杆菌MG1655-<i> ∆pfkA∆pfkB∆zwf</i>	<i>pfkA、pfkB</i>和<i>zwf</i>基因敲除菌株

实施例2 构建产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株

一、构建含N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因的表达质粒pGGY-1

将Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶编码基因glms的突变基因和Caenorhabditiselegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因、果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB分别置于P _PGI 启动子调控下进行表达。将各基因的表达盒组装到表达质粒上，质粒命名为pGGY-1；具体构建方法如下：

扩增获得约1800bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：4的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因；以Escherichia coli MG1655基因组为模板进行PCR，获得360bp 的P _PGI 启动子序列，将两个片段通过overlap PCR方法连接在一起，通过TA连接组装至pEasy-T3，通过热击转化导入大肠杆菌T10宿主中，涂布于LB培养基（氨苄青霉素50µg/mL）固体平板上，37℃下培养16 h，筛选阳性克隆子，阳性菌株的目标条带2300bp。将成功构建的质粒命名为pGlms-T3。

将质粒pGlms-T3使用XhoI、HindIII在37℃，酶切3小时，凝胶电泳回收5500bp片段。扩增获得约500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因；扩增获得约560bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：5的果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB；以Escherichia coli MG1655基因组为模板扩增出两个P _PGI 启动子序列，基因序列片段大小为240bp；将上述片段overlap连接与pGlms-T3酶切片段（5500bp）连接，电转导入大肠杆菌NEB express中。在LB（氨苄青霉素50µg/mL）固体培养基，37℃培养16小时，进行菌落PCR检测，筛选阳性克隆子，目标片段为7500 bp。将构建成功的含有N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因的表达盒的质粒命名为pGGY-1。

二、构建甘油激酶基因高表达质粒pGGY-T3

Pichiapastoris来源的甘油激酶编码基因glpK序列（GenBank：NC_012966）依据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化后进行全基因合成。从Escherichia coli基因组pgi基因CDS区上游截取约200 bp启动子序列，终止子选用Escherichia coli 16s终止子序列。根据上述序列合成引物进行PCR扩增，获得目的片段。具体如下：

分别以Escherichia coli MG1655基因组为模板利用引物P _PGI -F4、P _PGI -R4进行PCR，获得380bp 的P _PGI 启动子序列，利用引物16st-F、16st-R进行PCR，获得230bp的16s终止子序列。扩增获得甘油激酶编码基因glpK基因（1800 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：7）。将三个片段通过overlap PCR方法连接在一起，组装至质粒pGGY-1，通过热击转化导入大肠杆菌T10宿主中，涂布于LB培养基（氨苄青霉素50µg/mL）固体平板上，37℃下培养16 h，利用引物M13-F和M13-R筛选阳性克隆子，阳性菌株的目标条带6300bp。将成功构建的质粒命名为pGGY-T3。

三、构建可以同时利用多种碳源进行生长和合成N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株

将pGGY-T3质粒电转导入大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf底盘细胞中并涂布LB培养基（氨苄青霉素50µg/mL）固体平板，于37℃下培养16 h。利用引物M-13-F、M-13R进行菌落PCR检测，筛选阳性克隆子，目标片段为6500bp。将成功构建的产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌株命名为大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY。

实施例3 利用产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖

将产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株接种于50 mL的LB液体培养基（氨苄青霉素50µg/mL）中，于37℃ 200 rpm复壮16小时。

制备混合碳源发酵培养基：准确称取磷酸氢二钠 6.78 g、磷酸二氢钾 3 g、氯化钠 1.5 g、氯化铵1 g、葡萄糖10 g、氯化钙 0.011 g、七水合硫酸镁 0.493 g、5 g甘油、酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g，以水作为溶剂定容至1 L，115℃高压湿热灭菌灭菌30分钟，得到混合碳源发酵培养基。

将大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株按1%的接种量转接至200mL混合发酵培养基（氨苄青霉素50 µg/mL）中，于37℃ 200 rpm下进行摇瓶发酵。每隔3 h取样测定培养基内葡萄糖浓度、甘油浓度、乙酸浓度以及N-乙酰氨基葡萄糖的浓度。

菌液OD₆₀₀测定：利用可见光分光光度计，测定波长600 nm下菌液的吸收值。

葡萄糖浓度、甘油浓度、乙酸浓度以及N-乙酰氨基葡萄糖的浓度测定：使用高效液相色谱仪对样品中N-乙酰氨基葡萄糖、甘油、葡萄糖、乙酸同时检测。高效液相色谱仪为岛津20A；色谱柱为AminexHPX-87H Column （300 mm×7.8 mm）；流动相：5 mM H₂SO₄；洗脱程序为：等度洗脱25分钟；流速0.5mL/min，柱温35℃； 进样量10 μL；利用示差检测器RID-20A进行检测，检测波长214 nm。N-乙酰氨基葡萄糖含量检测结果如图1所示，MG1655-∆pfkA∆ pfkB∆zwf-pGGY工程菌株108小时最高产量为2.8 g/L；甘油含量检测结果如图2所示，MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株108小时消耗甘油2.7 g/L；葡萄糖含量检测结果如图3所示，MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株108小时消耗葡萄糖3 g/L；乙酸含量检测结果如图4所示，MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株12小时产生乙酸0.8g/L，发酵108小时发酵液中剩余乙酸0.1 g/L。实现葡萄糖、甘油共利用进行菌体生长和N-乙酰氨基葡萄糖的合成；工程菌株相比野生菌株的乙酸产量少，且在发酵后期被菌体重吸收，为N-乙酰氨基葡萄糖的生产提供了更多的乙酰辅酶A前体物。

实施例4 产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY工程菌株乙酰辅酶A合成酶基因acs的相对表达量

将产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌株MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY、MG1655-∆pfkA∆pfkB-pGGY以及大肠杆菌MG1655-pGGY接种于50 mL的LB液体培养基（氨苄青霉素50µg/mL）中，于37℃ 200 rpm复壮16小时。

制备混合碳源发酵培养基：准确称取磷酸氢二钠 6.78 g、磷酸二氢钾 3 g、氯化钠 1.5 g、氯化铵1 g、葡萄糖10 g、氯化钙 0.011 g、七水合硫酸镁 0.493 g、5 g甘油、酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g，以水作为溶剂定容至1 L，115℃高压湿热灭菌灭菌30分钟，得到混合碳源发酵培养基。

将产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY、MG1655-∆pfkA∆pfkB-pGGY以及大肠杆菌MG1655-pGGY（未敲除pfkA、pfkB、zwf基因，仅导入SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的基因）按1%的接种量转接至200 mL混合发酵培养基（氨苄青霉素50 µg/mL）中，于37℃ 200 rpm下进行摇瓶发酵。发酵36小时，提取总RNA并进行反转录获得cDNA，并以获得的cDNA为模板进行荧光定量PCR。在荧光定量PCR仪RT-qPCR-20A Applied Biosystems By Life Technologies QuantStudio 6 Flex系统进行定量，按照标准方法计算2^-∆∆ct值，结果如图5。在相同条件下，产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌MG1655-∆pfkA∆pfkB∆zwf-pGGY的乙酰辅酶A合成酶基因acs的相对表达量是菌株MG1655-pGGY的2.75倍，工程菌株MG1655-∆pfkA∆pfkB-pGGY工程菌株乙酰辅酶A合成酶基因acs的相对表达量是菌株MG1655-pGGY的1.75倍。乙酰辅酶A合成酶ACS能够以乙酸为底物催化合成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A参与经Caenorhabditis elegans来源的gna-1的突变基因编码葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶催化的乙酰辅酶A和D-氨基葡萄糖6-磷酸生成N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸的反应过程，用于合成N-乙酰氨基葡萄糖的合成。

对比实施例1

除不含组分“酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g”，并且添加100 mg/L丙酮酸替换外，其与组分与实施例3的混合碳源发酵培养基配方相同。发酵84小时后，N-乙酰氨基葡萄糖产量达到最高值，为0.12 g/L。结果如图6所示。丙酮酸为糖酵解途径下游的代谢中间产物，其添加是为了补充糖酵解和磷酸戊糖途径阻断后菌体生长所需中间代谢产物的不足，然而相比于酵母提取物和蛋白胨，丙酮酸的添加对菌体的生长提升不大，菌体最终未能到达与野生株相同的生物量，N-乙酰氨基葡萄糖产量仅为实施例3的4%。

对比实施例2

除不含组分“酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g”，并且添加“2 g/L柠檬酸”外，其与组分与实施例3的混合碳源发酵培养基配方相同。发酵60小时后，N-乙酰氨基葡萄糖产量达到最高值，为0.033 g/L。结果如图7所示。柠檬酸为三羧酸循环途径中的代谢中间产物，其添加是为了补充糖酵解和磷酸戊糖途径阻断后菌体生长所需中间代谢产物的不足，然而，相比于酵母提取物和蛋白胨，柠檬酸的添加未提高产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的生长速率和生物总量，N-乙酰氨基葡萄糖的产量为实施例3的1%。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgattaaga aaatcggtgt gttgacaagc ggcggtgatg cgccaggcat gaacgccgca 60

attcgcgggg ttgttcgttc tgcgctgaca gaaggtctgg aagtaatggg tatttatgac 120

ggctatctgg gtctgtatga agaccgtatg gtacagctag accgttacag cgtgtctgac 180

atgatcaacc gtggcggtac gttcctcggt tctgcgcgtt tcccggaatt ccgcgacgag 240

aacatccgcg ccgtggctat cgaaaacctg aaaaaacgtg gtatcgacgc gctggtggtt 300

atcggcggtg acggttccta catgggtgca atgcgtctga ccgaaatggg cttcccgtgc 360

atcggtctgc cgggcactat cgacaacgac atcaaaggca ctgactacac tatcggtttc 420

ttcactgcgc tgagcaccgt tgtagaagcg atcgaccgtc tgcgtgacac ctcttcttct 480

caccagcgta tttccgtggt ggaagtgatg ggccgttatt gtggagatct gacgttggct 540

gcggccattg ccggtggctg tgaattcgtt gtggttccgg aagttgaatt cagccgtgaa 600

gacctggtaa acgaaatcaa agcgggtatc gcgaaaggta aaaaacacgc gatcgtggcg 660

attaccgaac atatgtgtga tgttgacgaa ctggcgcatt tcatcgagaa agaaaccggt 720

cgtgaaaccc gcgcaactgt gctgggccac atccagcgcg gtggttctcc ggtgccttac 780

gaccgtattc tggcttcccg tatgggcgct tacgctatcg atctgctgct ggcaggttac 840

ggcggtcgtt gtgtaggtat ccagaacgaa cagctggttc accacgacat catcgacgct 900

atcgaaaaca tgaagcgtcc gttcaaaggt gactggctgg actgcgcgaa aaaactgtat 960

taa 963

<210> 2

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtacgta tctatacgtt gacacttgcg ccctctctcg atagcgcaac aattaccccg 60

caaatttatc ccgaaggaaa actgcgctgt accgcaccgg tgttcgaacc cgggggcggc 120

ggcatcaacg tcgcccgcgc cattgcccat cttggaggca gtgccacagc gatcttcccg 180

gcgggtggcg cgaccggcga acacctggtt tcactgttgg cggatgaaaa tgtccccgtc 240

gctactgtag aagccaaaga ctggacccgg cagaatttac acgtacatgt ggaagcaagc 300

ggtgagcagt atcgttttgt tatgccaggc gcggcattaa atgaagatga gtttcgccag 360

cttgaagagc aagttctgga aattgaatcc ggggccatcc tggtcataag cggaagcctg 420

ccgccaggtg tgaagctgga aaaattaacc caactgattt ccgctgcgca aaaacaaggg 480

atccgctgca tcgtcgacag ttctggcgaa gcgttaagtg cagcactggc aattggtaac 540

atcgagttgg ttaagcctaa ccaaaaagaa ctcagtgcgc tggtgaatcg cgaactcacc 600

cagccggacg atgtccgcaa agccgcgcag gaaatcgtta atagcggcaa ggccaaacgg 660

gttgtcgttt ccctgggtcc acaaggagcg ctgggtgttg atagtgaaaa ctgtattcag 720

gtggtgccac caccggtgaa aagccagagt accgttggcg ctggtgacag catggtcggc 780

gcgatgacac tgaaactggc agaaaatgcc tctcttgaag agatggttcg ttttggcgta 840

gctgcgggga gtgcagccac actcaatcag ggaacacgtc tgtgctccca tgacgatacg 900

caaaaaattt acgcttacct ttcccgctaa 930

<210> 3

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60

cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120

ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180

gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240

accctgagtg cacgtctgga tttttgtaat ctcgatgtca atgacactgc tgcattcagc 300

cgtctcggcg cgatgctgga tcaaaaaaat cgtatcacca ttaactactt tgccatgccg 360

cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420

gcacgcgtag tcatggagaa accgctgggg acgtcgctgg cgacctcgca ggaaatcaat 480

gatcaggttg gcgaatactt cgaggagtgc caggtttacc gtatcgacca ctatcttggt 540

aaagaaacgg tgctgaacct gttggcgctg cgttttgcta actccctgtt tgtgaataac 600

tgggacaatc gcaccattga tcatgttgag attaccgtgg cagaagaagt ggggatcgaa 660

gggcgctggg gctattttga taaagccggt cagatgcgcg acatgatcca gaaccacctg 720

ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780

cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840

gaaaaaaccg tacgcgggca atatactgcg ggcttcgccc agggcaaaaa agtgccggga 900

tatctggaag aagagggcgc gaacaagagc agcaatacag aaactttcgt ggcgatccgc 960

gtcgacattg ataactggcg ctgggccggt gtgccattct acctgcgtac tggtaaacgt 1020

ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080

aaagaatcgt ggcaggatct gccgcagaat aaactgacta tccgtctgca acctgatgaa 1140

ggcgtggata tccaggtact gaataaagtt cctggccttg accacaaaca taacctgcaa 1200

atcaccaagc tggatctgag ctattcagaa acctttaatc agacgcatct ggcggatgcc 1260

tatgaacgtt tgctgctgga aaccatgcgt ggtattcagg cactgtttgt acgtcgcgac 1320

gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380

gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440

acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476

<210> 4

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag caaaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420

actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480

atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540

attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600

acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660

aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720

tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780

ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840

gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900

tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960

attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020

aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080

cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccgt tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ctgccgagcc gtattgagca gatgctgcct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500

ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560

gcaccgaaca acggtttgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 5

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtacgagc gttatgcagg tttaattttt gatatggatg gcacaatcct ggatacggag 60

cctacgcacc gtaaagcgtg gcgcgaagta ttagggcact acggtcttca gtacgatatt 120

caggcgatga ttgcgcttaa tggatcgccc acctggcgta ttgctcaggc aattattgag 180

ctgaatcagg ccgatctcga cccgcatgcg ttagcgcgtg aaaaaacaga agcagtaaga 240

agtatgctgc tggatagcgt cgaaccgctt cctcttgttg atgtggtgaa aagttggcat 300

ggtcgtcgcc caatggctgt aggaacgggg agtgaaagcg ccatcgctga ggcattgctg 360

gcgcacctgg gattacgcca ttattttgac gccgtcgtcg ctgccgatca cgtcaaacac 420

cataaacccg cgccagacac atttttgttg tgcgcgcagc gtatgggcgt gcaaccgacg 480

cagtgtgtgg tctttgaaga tgccgatttc ggtattcagg cggcccgtgc agcaggcatg 540

gacgccgtgg atgttcgctt gctgtga 567

<210> 6

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgagccata tttttgatgc gagcgtgctg gcgccgcata ttccgagcaa tctgccggat 60

aactttaaag tgcgcccgct ggcgaaagat gattttagca aaggctatgt ggatctgctg 120

agccagctga ccagcgtggg taatctggat caggaagcgt ttgaaaaacg ctttgaagcg 180

atgcgcacca gcgtgccgaa ttatcatatt gtggtgattg aagacagcaa cagccagaaa 240

gtggtggcga gcgcgtcatt agtggtggaa atgaaattta ttcacggcgc gggcagccgc 300

ggccgcgttg aagatgttgt tgttgatacc gaaatgcgcc gccagaaact gggcgcggtt 360

ttattaaaaa ccctggtgag cctgggcaaa agcctgggcg tttataaaat tagcctggaa 420

tgcgtgccgg aactgctgcc gttttatagc cagtttggct ttgtggatga tggcaacttt 480

atgacccagc gcttttaa 498

<210> 7

<211> 1866

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttaagcagtg tccttaagcc agccctttgc ctttgcaatg gcattttccc acaatctcca 60

ttcctttctt ctgacctcgt cgctcaatgt ggccttgaag tccaaagaag tgttccctgc 120

agccaagtac atcttgttac cctcaagaat ggcctcggta cattccttca aggaacccca 180

aattctatct tccttaggga caccaaaacc ggcagcaatg gcagctccca gtgcagtaca 240

ttcagggttg atggaacgtc taacagtgac acatggaccc aaaatatcag cttggatctg 300

catcatctcg tctgatttgg acatacctcc gtccacggca agaactgaca gagggttgtg 360

gccagtggcc ttggatgatt cctccaaaaa gtcagcagaa gctcctgcat cgctgatcat 420

ggccttcaaa atggctctag tttggaaaca gacaccttcc aaagcagctc tagcaatatg 480

agaagctgag gtgtattggg tcagaccgaa aatggttcct ctggagttgg aatcccagta 540

aggggcaaac aatcctgaaa atgctggaac aaataccaca cctccagagt tgtcaacttg 600

agaagccaat ggtccgacgt cctgagcctt ggaaatcaaa cgaaggttat ctcttaacca 660

ttgcacgaca gatccagcga cagcaatcga tccctccaaa gcatactgtg gcttagaaga 720

gtgtttgcca tcttcggact catccaaacc tgggaaccaa tatcccacag tggtcaaagc 780

accgtgctca gaaatcaaag tctgatcacc agtgttgtac agcaagaaag caccggtacc 840

atatgtacat ttggcatcac cctttctgac agccaactgt ccaaccaaag aggcagattg 900

gtcacccaga catccagcca aaggagcacc ttcaatagtt tccagaagag caagggcgtc 960

atcagtaagg taagactcaa catatccaat agactccaag tgtgggacct tgaagtgtcc 1020

gtagacttct gcggaagatc tgatttctgg aaggatgact ttggaagtat cgacgtccca 1080

gaatttcaaa agtctgtcgt catatttgtt ggtttcaatg ttcatgaagt tggttctgga 1140

ggcattggta acatcagtga cgtgggattt ttcgttagtc aagtggtaaa tcaaccaaga 1200

gtcaatagta ccaaacatta gatccccatc agcattgtca taggcctgtt tgacctcagg 1260

aacatgcttc agtaaccatc tgaacttggt tgcagaaaag taggtggaga ttggacaacc 1320

acacaaggtt cgcatttcct ctctctcctt ctcagagtac ttggcggtgt actcgtcaac 1380

aatatcgttg tttctggtat cgttccacac aataccgttg taaagaggct ttcctgtctt 1440

cttggaccaa acaaccgtgg tctctctcat gttggcaaca ccgatagata tgagcttgta 1500

tttatttttt tcatctcggt ccaagttctt gttctccatg gtgactaaac aagcagcaag 1560

acactgaacg gcgttggcca agatgtgact tggacgacat tcaacccagc ctggctgagg 1620

aaattgcaaa gttggaccag ccttattgtc aacggactca acttccaagt cgtcagaaac 1680

tgtcagggaa ataccttcgg aagagatgat ctgagaacgc tttcttttga tatcatcctg 1740

agcagaggta gagtactcga tctggtgctt ggccacttcc tgaccgtggt agtcaaaaag 1800

aatagctctg gtggaggtag taccaatatc gatggtagca actagtggtg tatagtcttt 1860

tcccat 1866

<210> 8

<211> 386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttctggtgac aacccagggg attcagcccc tgtagccgat gatgaacgtg gccagccgtt 60

caatcacctc ggcgatgcac cccctcaggt gttatcacag gactggctcc tccaacaccg 120

ttacttgggc aacgcgcctc ttctggcctg cgctagcgca ggtagtacat ttataaataa 180

agggtgagcg gggcggttgt caacgatggg gtcatgcgga tttttcatcc actcctggcg 240

gtcagtagtt cagctaataa atgcttcact gcgctaaggg tttacactca acattacgct 300

aacggcacta aaaccatcac atttttctgt gactggcgct acaatcttcc aaagtcacaa 360

ttctcaaaat cagaagagta ttgcta 386

Claims (6)

1.一种产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为外源表达N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因和混合碳源共利用酶基因的敲除了糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键基因的突变型大肠杆菌，

其中，被敲除的糖酵解途径关键基因为ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1的编码基因pfkA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2的编码基因pfkB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和磷酸戊糖途径关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，

所述N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因为Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4，果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5， Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6，

所述混合碳源共利用酶基因为Pichia pastoris来源的甘油激酶编码基因glpK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7。

2.一种构建产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

敲除糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键基因，构建突变型大肠杆菌底盘细胞；

导入表达N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因和混合碳源共利用酶基因，

其中，被敲除的糖酵解途径关键基因为ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶1的编码基因pfkA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ATP依赖性6-磷酸果糖激酶同工酶2的编码基因pfkB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，和磷酸戊糖途径关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，

所述N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因为Escherichia coli来源的谷氨酰胺果糖-6磷酸转氨酶基因glms的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4，果糖-1-磷酸酶YqaB编码基因yqaB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5， Caenorhabditis elegans来源的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶编码基因gna-1的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6，

所述混合碳源共利用酶基因为Pichia pastoris来源的甘油激酶编码基因glpK，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7。

3.一种发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法包括摇瓶发酵权利要求1所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌得到N-乙酰氨基葡萄糖的步骤。

4.根据权利要求3所述的发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，利用混合碳源培养基进行摇瓶发酵，其中，所述混合碳源培养基的配方为：磷酸氢二钠 6.78 g、磷酸二氢钾 3 g、氯化钠 1.5 g、氯化铵1 g、葡萄糖10 g、氯化钙 0.011 g、七水合硫酸镁 0.493g、5 g甘油、酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g，以水作为溶剂定容至1 L。

5.根据权利要求3所述的发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述混合碳源培养基含终浓度为50 µg/mL的氨苄抗生素。

6.根据权利要求3所述的发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵条件为温度37℃，转速200 rpm，发酵108小时。

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