CN112760305A - 一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用 - Google Patents

一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用，所述栖热腔菌磷酸酶突变体由来源于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型磷酸酶经突变所得，所述突变为以下一种：N212G或N212D。本发明栖热腔菌磷酸酶突变体对氨基葡萄糖‑6‑磷酸具有较高的催化活力(最高达1.64U/mg)，相对于其他磷酸单糖(葡萄糖‑6‑磷酸，葡萄糖‑1‑磷酸，果糖‑6‑磷酸)的酶活力提升不显著或者下降，从而其对氨基葡萄糖‑6‑磷酸的底物专一性较其亲本磷酸酶有了较大的提升。

Description

一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用。
背景技术
氨基葡萄糖又名葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)，通常以N-乙酰基衍生物(如甲壳素)等形式广泛存在于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中，是糖蛋白及蛋白聚糖的重要组成成分。作为一种重要的功能性单糖，氨基葡萄糖在食品、医疗保健、化妆品等多个领域具有广泛用途。随着骨关节炎病人数量的不断增加，硫酸氨基葡萄糖作为首个高效减缓骨关节炎病况的特异性药物，尤其在刺激软骨细胞的生长，抑制关节软骨的分解，促进软骨组织修复等方面具有重要的治疗效果。此外，氨基葡萄糖硫酸盐还能够抑制白血病细胞增殖，并有消炎护肝，抗氧化抗衰老等功效。在欧美国家，氨基葡萄糖被作为食品及保健品的配料。随着全球老龄化加剧，氨基葡萄糖需求不断增加，据调查数据显示，2018年氨基葡萄糖国内销售市场规模约40亿元，可见其发展前景好，市场潜力大。
目前氨基葡萄糖的合成路线主要包括甲壳素水解法及微生物发酵法两种方式。甲壳素水解法包括甲壳素酸水解和甲壳素酶水解法，虽简单快速，但环境污染严重，原料供应受到地域限制，且会引起过敏体质患者的过敏反应。甲壳素酶解法利用壳聚糖酶对虾蟹壳进行降解，现在面临的最大问题是生产效率低下，表现为壳聚糖酶价格较高、转化时间较长及生产成本较高。而且，来源于虾蟹壳的氨基葡萄糖在临床应用过程中会引起过敏体质患者的过敏反应。微生物发酵法具有污染小、生产强度高、成本较低、条件温和、无过敏反应的优点，但反应产物N-乙酰基葡萄糖氨需要进一步通过去乙酰化反应，导致分离纯化产品过程复杂、原子经济性能不高等局限。
近期游醇等公开了一种利用体外多酶反应体系合成氨基葡萄糖的新合成方法(CN201810772487.3)，该方法利用淀粉或淀粉衍生物等廉价碳源为底物，设计了能够利用无机胺盐实现氨基葡萄糖的合成路径，通过构建多酶反应体系催化生产氨基葡萄糖，该方法具有原料廉价、来源丰富、生产成本低、环境友好、对人体安全等优点。但在该合成路线中，由于同时存在多个磷酸单糖，若磷酸酶对氨基葡萄糖-6-磷酸水解活力不高，底物选择性差，则在此多酶反应系统中，会造成反应中间体(如葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸)磷酸键水解，从而导致副产物如葡萄糖、果糖等的累积，影响目的产物氨基葡萄糖的得率。因此，获得一种对氨基葡萄糖-6-磷酸的磷酸水解活力且专一性较高的磷酸酶是提高目的产物得率的关键。天然酶库中，嗜热菌来源的磷酸酶热稳定较高，适合长时期多批次的连续反应操作，更具有工业应用潜力。但目前嗜热型磷酸酶底物谱广，对氨基葡萄糖-6-磷酸水解活性普遍较低，无法实现氨基葡萄糖的定向合成。故在此背景下，本发明通过分子改造技术获得对底物氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸键水解特异性和酶活提高的嗜热菌来源的磷酸酶突变体，可应用于氨基葡萄糖的催化合成。本发明对减少副产物，提高氨基葡萄糖的产率具有重要意义。
发明内容
本发明目的是在于对栖热腔菌属(unclassified Thermosipho(in：Bacteria))磷酸酶(ThGlmP)进行分子改造，获得对磷酸键水解反应底物氨基葡萄糖-6-磷酸的酶活力及专一性较高的突变体，利用该磷酸酶突变体可应用于氨基葡萄糖的催化合成。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过分子改造对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的栖热腔菌属(unclassified Thermosipho(in：Bacteria))来源的磷酸酶ThGlmP的第7位、第9位、第42位、第103位、第172位、第210位、第211位、第212位经过单位点突变或多位点突变，实现该酶对氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸键水解反应的高效性及专一性的有效调控。优选的，所述磷酸酶活力突变体由序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第42位精氨酸突变为天冬氨酸，(2)第211位天冬氨酸突变为缬氨酸，(3)第212位天冬酰胺突变为天冬氨酸或者甘氨酸。
本发明又提供了所述栖热腔菌磷酸酶突变体在催化合成氨基葡萄糖中的应用。
本发明又提供了编码所述栖热腔菌磷酸酶突变体的基因。突变为N212D时，氨基酸序列为SEQ ID NO.3，优选的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。突变为N212G时，氨基酸序列为SEQID NO.5，优选的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
本发明又提供了所述基因在催化合成氨基葡萄糖中的应用。
本发明又提供了一种基因工程菌，包括宿主菌和导入宿主菌内进行外源表达的外源基因，所述外源基因是编码所述栖热腔菌磷酸酶突变体的基因。
本发明还提供了一种催化合成氨基葡萄糖的方法，底物氨基葡萄糖-6-磷酸使用所述栖热腔菌磷酸酶突变体催化去磷酸生成产物氨基葡萄糖。
本发明有益效果主要体现在：本发明通过定点饱和突变技术，获得高酶活，底物专一性较好，耐高温的磷酸酶突变体的基因文库，并从中筛选获得酶活力、底物专一性均好的磷酸酶突变体；该磷酸酶的突变体对氨基葡萄糖-6-磷酸具有较高的催化活力(最高达1.64U/mg)，相对于其他磷酸单糖(葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-1-磷酸，果糖-6-磷酸)的酶活力提升不显著或者下降，从而其对氨基葡萄糖-6-磷酸的底物专一性较其亲本磷酸酶有了较大的提升。该氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸酶突变体(栖热腔菌磷酸酶突变体)在一定程度上改变了嗜热菌来源的磷酸酶对氨基葡萄糖-6-磷酸活力较低，底物专一性较差的酶学特性，利用该磷酸酶突变体，可以应用于氨基葡萄糖的体外多酶定向合成反应，具有较好的应用前景。
具体实施方式
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
上游基因克隆表达等操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒等购自上海生工；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂：葡萄糖-1-磷酸，氨基葡萄糖-6-磷酸购自Sigma-Aldrich公司；葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸购于百灵威科技有限公司；其他常用试剂购自阿拉丁试剂有限公司。
实施例1：磷酸酶突变体库的构建
1、磷酸酶突变位点的选取
栖热腔菌磷酸酶(ThGlmP，NCBI登录号WP_075666102.1，氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列SEQ ID NO.2)催化磷酸单糖磷酸键水解反应时，对葡萄糖-6-磷酸(G6P)，葡萄糖-1-磷酸(G1P)，果糖-6-磷酸(F6P)，氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcN6P)的水解活力分别为0.14U/mg，0.82U/mg，0.72U/mg，0.32U/mg。
本发明通过生物信息学分析，确定磷酸酶Cap区域的关键氨基酸残基，进一步在催化口袋附近筛选出可能影响酶活及反应专一性的8个氨基酸残基：L7、G9、R42、I103、V172、G210、D211、N212。
2、定点饱和突变
以含栖热腔菌磷酸酶(ThGlmP)基因的质粒为模板，选取7、9、42、103、172、210、211、212位点进行定点饱和突变。引物序列如表1(其中，N＝A/G/C/T，K＝G/T，M＝A/C)所示。
表1引物设计
名称 引物序列(5’-3’)
7-F TTCGTTTTTGAC<u>NNK</u>GATGGT
7-R CAGGGTACCATC<u>MNN</u>GTCAAAAA
9-F TGACCTGGAT<u>NNK</u>ACCCTGCTGAAC
9-R AGTTGTTGTTCAGCAGGGT<u>MNN</u>ATCC
42-F TTTTCGCGAGCGGC<u>NNK</u>ATGCTG
42-R AATGCTGATCAGCAT<u>MNN</u>GCCGCTC
103-F TGCACCGTCAG<u>NNK</u>TACGTTG
103-R ATCGTCAACGTA<u>MNN</u>CTGACGG
172-F GGAAATTGAC<u>NNK</u>TTTAAGAGC
172-R CCATGCTCTTAAA<u>MNN</u>GTCAAT
210-F GGCGTTT<u>NNK</u>GACAACTATAACGATAT
210-R TTGTC<u>MNN</u>AAACGCCACAATCTCGC
211-F GGCGTTTGGC<u>NNK</u>AACTATAACGATAT
211-R ACAGCGGAATATCGTTATAGTT<u>MNN</u>GCCAA
212-F GCGTTTGGCGAC<u>NNK</u>TATAACGATA
212-R CAGCGGAATATCGTTATA<u>MNN</u>GTCGCCAAA
通过PCR对模板进行全质粒扩增，PCR反应体系(50μL)：2×Phanta Max Bufier(含Mg2+)25μL，dNTPs 10mM，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，ddH2O 21μL。
PCR程序设定：96℃预变性2min；96℃变性10s，Tm 53℃退火5s，72℃延伸6.5min，30个循环；72℃终延伸10min。4℃保存。
3.磷酸酶突变体重组工程菌的构建与表达
PCR产物经过0.9％琼脂糖凝胶电泳分析为阳性后，取PCR反应液45μL，加入1μL限制性内切酶Dpn I于37℃酶切0.5-1h去除模板质粒DNA，而后clean up PCR产物。取5μL纯化后的PCR产物，加入100μL冰浴的大肠杆菌BL21感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。每个平板均获得约200个克隆的突变体库。挑取重组大肠杆菌单菌落接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD600约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素的100mL LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD600至0.6-0.8，于培养液中加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，收集湿菌体，备用。其中，LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加2％琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。
实施例2：栖热腔菌磷酸酶突变体磷酸酶活力及水解反应专一性的高通量筛选
利用磷钼酸显色法高通量筛选磷酸酶ThGlmP突变体的水解活力，反应原理为：游离磷酸根离子与钼酸铵反应形成磷钼黄络合物，被抗坏血酸还原为磷钼蓝络合物，如下述化学反应方程式所示：
7PO4 3-+21NH4 ++12Mo7O24 6-+72H+＝7(NH4)3[PMo12O40]+36H2O
(NH4)3[PMo12O40]→H3PO4·Mo2O5+H3PO4·10MoO3·Mo2O5+NH4 +
分别以G6P，G1P，F6P，GlcN6P为底物，在加入栖热腔菌磷酸酶突变体的重组菌的反应体系中，通过850nm分光光度计检测磷酸根离子的特异性吸收峰，从而反应栖热腔磷酸酶突变体对不同磷酸单糖的水解活力差异。具体操作过程如下：
(1)配制工作液：A液：20mM钼酸铵和100mM乙酸锌(pH＝5.0)的混合物。B液：10％抗坏血酸超纯水溶液。
(2)测定步骤：挑取单菌落至96深孔板中，每孔含1mL含有50μg/mL卡那抗性的LB培养基，在37℃、200rpm摇床上培养8h后，每孔吸取500uL菌液，转移到另一块96深孔板中，每孔含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和终浓度为1mM IPTG诱导剂的LB培养基，工作体积为500uL。在28℃、200rpm的摇床上培养12h后，离心，收取菌体弃上清后，每孔加入1mL 100mMN-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸钠盐(HEPES)缓冲液(pH＝7.0)，用移液枪反复吹打，将96深孔板收集的菌体重悬。每孔取出30μL的菌液于96孔板内，加入10mM磷酸糖，10mM MgSO4，100mM HEPES缓冲液(pH＝7.0)补齐至1mL。将96孔板置于70℃反应4h后，离心，取20μL上清液于另一检测96孔板内，加入100μL A液，加入25μL B液，测定850nm处的吸光值，筛选对GlcN6P水解活力较高的突变菌株，同时比较突变体对其他磷酸单糖(G6P，G1P，F6P)的水解活力，筛选对GlcN6P水解偏好性更高的突变体。
定点饱和突变共产生～1600个克隆，经测序，包含了所有20种天然氨基酸。高通量结果显示，对氨基葡萄糖-6-磷酸活性及专一性影响较大的突变位点为R42、D211、N212。其中，包含R42、D211和N212位点突变的磷酸酶突变体：(1)第42位精氨酸突变为天冬氨酸，(2)第211位天冬氨酸突变为缬氨酸，(3)第212位天冬酰胺突变为天冬氨酸或甘氨酸时磷酸酶的活力或者底物专一性得到提升。
实施例3：栖热腔菌磷酸酶突变体在不同磷酸单糖水解反应中的活力表征及应用
将实施例2中筛选获得活力较高且反应专一性较好的栖热腔菌磷酸酶突变体，按照实施例1的操作方法对磷酸酶重组大肠杆菌进行培养及诱导表达。采用超声破碎方法对离心收集的湿菌体进行超声破碎，取0.3g湿菌体，用10mL HEPES(pH＝7.0，100mM)缓冲液悬浮，在冰水混合物上超声破碎15min。超声破碎条件：功率为400W，破碎2s，暂停4s，获得粗酶液。70℃保温20min，4℃、8000r/min离心10min，收集上清液。取少量样液SDS-PAGE进行验证，取适量用BCA法测定蛋白浓度，取适量用于磷酸酶活力的测定。
酶活测定反应体系(1mL)：100mM HEPES缓冲液(pH＝7.0)中，加入10mM磷酸糖、10mM MgSO4和200μg酶。反应条件：于70℃条件下反应10min，加5mM H28O4终止反应，12000r/min离心1min，检测不同磷酸单糖(G6P，G1P，F6P，GlcN6P)作为底物条件下不同磷酸酶的酶活差异。
酶活定义：一个酶活单位定义为70℃，100mM HEPES缓冲液(pH＝7.0)条件下，每分钟转化生产1μmol产物所需的酶量。
产物氨基葡萄糖、果糖、葡萄糖的高效液相色谱(HPLC-RI)分析方法：
色谱条件：色谱柱型号：Aminex HPX-87H column，300×7.8mm，9μm。流动相：5mM硫酸溶液。流速：0.6mL/min。柱温：60℃。进样量：10μL。
根据以上分析方法，检测到栖热腔菌磷酸酶突变体对不同磷酸单糖的比酶活，如表2所示。
表2栖热腔菌磷酸酶突变体对不同磷酸单糖的比酶活(U/mg)
ThGlmP G1P G6P F6P GlcN6P
野生型 0.14 0.82 0.72 0.32
R42D 0.04 0.25 0.07 0.09
D211V 0.03 0.16 0.21 0.19
N212G 0.15 5.48 8.57 1.22
N212D 0.28 3.95 2.14 1.64
从表2结果分析，突变体R42D较野生型磷酸酶对四种磷酸单糖的水解活力都有一定程度下降，但相较于其他磷酸单糖，对GlcN6P水解活力保持为0.09U/mg，相对而言，提升了磷酸酶对GlcN6P的水解反应专一性。
突变体D211V较野生型磷酸酶对四种磷酸单糖的水解活力都有一定程度下降，但相较于其他磷酸单糖，对GlcN6P水解活力保持为0.19U/mg，相对而言，提升了磷酸酶对GlcN6P的水解反应专一性。
突变体N212G对GlcN6P的酶活为1.22U/mg，是野生型磷酸酶酶活的3.81倍，对其他磷酸糖(G1P，G6P，F6P)的酶活也有所提高，尤其对F6P的水解活力有较大提升，达到8.57U/mg，是野生型磷酸酶的11.90倍。
突变体N212D对四种磷酸单糖的水解活力较野生型有显著提升，其中对G1P的水解活力提升了1.0倍，对G6P的水解活力提升了3.81倍，对F6P的水解活力提升了1.96倍，尤其对GlcN6P的酶活提升最为显著，达1.64U/mg，较野生型酶活提升了4.12倍。该突变体在显著提升酶活力的同时也提高了对GlcN6P的水解反应的专一性，具有较好的应用前景。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 265
<212> PRT
<213> 栖热腔菌(Thermosipho)
<400> 1
Met Val Phe Val Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Leu Asn Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Thr Ile Ser Glu Lys Thr Ile Asn Phe Ile Lys Ser Leu Glu Lys Cys
20 25 30
Gly His Lys Leu Val Phe Ala Ser Gly Arg Met Leu Ile Ser Ile Lys
35 40 45
Lys Val Val Glu Lys Phe Phe Glu Lys Glu Tyr Pro Ile Ile Ala Tyr
50 55 60
Asn Gly Gly Met Val Tyr Leu Pro Glu Glu Gly Ile Val Phe Glu Lys
65 70 75 80
Phe Leu Asp Phe Ser Ser Ala Lys Lys Val Ile Glu Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Glu Asn Val His Arg Gln Ile Tyr Val Asp Asp Lys Leu Tyr Gly Glu
100 105 110
Glu Asp Asn Asp Glu Ile Lys Phe Tyr Ala Lys His Ala Ser Val Asp
115 120 125
Tyr Tyr Ile Val Asp Asp Leu Val Lys Leu Leu Arg Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Val Lys Ile Leu Ser Ile Val Asp Lys Glu Lys Ile Lys Leu Leu Lys
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asn Ser Leu Asn Leu Glu Ile Asp Val Phe Lys Ser Met
165 170 175
Asp Ile Phe Leu Asp Ile Val Pro Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ala
180 185 190
Leu Glu Phe Leu Ile Lys Lys Leu Asp Leu Lys Gly Glu Ile Val Ala
195 200 205
Phe Gly Asp Asn Tyr Asn Asp Ile Pro Leu Phe Lys Val Ala Asn Ile
210 215 220
Ser Ile Ala Met Gly Asn Ala Ser Asn Asp Val Lys Arg Glu Ala Asp
225 230 235 240
Tyr Ile Ala Pro Ser Asn Asn Glu Asp Gly Val Tyr Ser Ala Leu Val
245 250 255
Glu Leu Phe Ser Asp Cys Ile Ser Cys
260 265
<210> 2
<211> 798
<212> DNA
<213> 栖热腔菌(Thermosipho)
<400> 2
atggtgttcg tttttgacct ggatggtacc ctgctgaaca acaactacac catcagcgag 60
aagaccatca actttattaa aagcctggaa aagtgcggtc acaaactggt tttcgcgagc 120
ggccgtatgc tgatcagcat taagaaagtg gttgagaagt tctttgagaa agaatacccg 180
atcattgcgt ataacggtgg catggtgtac ctgccggagg aaggtatcgt tttcgaaaag 240
tttctggatt tcagcagcgc gaagaaagtt atcgagtttc tgcgtagcga aaacgtgcac 300
cgtcagattt acgttgacga taaactgtat ggcgaggaag acaacgatga gatcaagttc 360
tatgcgaaac acgcgagcgt ggactactat attgtggacg atctggttaa gctgctgcgt 420
aagaaactgc cggtgaaaat cctgagcatt gttgacaagg agaaaatcaa gctgctgaaa 480
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gatattgttc cgaaggatat caacaaaggc gaggcgctgg aatttctgat caagaaactg 600
gacctgaaag gcgagattgt ggcgtttggc gacaactata acgatattcc gctgttcaag 660
gttgcgaaca tcagcattgc gatgggtaac gcgagcaacg acgtgaaacg tgaagcggat 720
tacatcgcgc cgagcaacaa cgaggacggc gtgtatagcg cgctggttga actgttcagc 780
gattgcatta gctgctaa 798
<210> 3
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val Phe Val Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Leu Asn Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Thr Ile Ser Glu Lys Thr Ile Asn Phe Ile Lys Ser Leu Glu Lys Cys
20 25 30
Gly His Lys Leu Val Phe Ala Ser Gly Arg Met Leu Ile Ser Ile Lys
35 40 45
Lys Val Val Glu Lys Phe Phe Glu Lys Glu Tyr Pro Ile Ile Ala Tyr
50 55 60
Asn Gly Gly Met Val Tyr Leu Pro Glu Glu Gly Ile Val Phe Glu Lys
65 70 75 80
Phe Leu Asp Phe Ser Ser Ala Lys Lys Val Ile Glu Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Glu Asn Val His Arg Gln Ile Tyr Val Asp Asp Lys Leu Tyr Gly Glu
100 105 110
Glu Asp Asn Asp Glu Ile Lys Phe Tyr Ala Lys His Ala Ser Val Asp
115 120 125
Tyr Tyr Ile Val Asp Asp Leu Val Lys Leu Leu Arg Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Val Lys Ile Leu Ser Ile Val Asp Lys Glu Lys Ile Lys Leu Leu Lys
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asn Ser Leu Asn Leu Glu Ile Asp Val Phe Lys Ser Met
165 170 175
Asp Ile Phe Leu Asp Ile Val Pro Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ala
180 185 190
Leu Glu Phe Leu Ile Lys Lys Leu Asp Leu Lys Gly Glu Ile Val Ala
195 200 205
Phe Gly Asp Asp Tyr Asn Asp Ile Pro Leu Phe Lys Val Ala Asn Ile
210 215 220
Ser Ile Ala Met Gly Asn Ala Ser Asn Asp Val Lys Arg Glu Ala Asp
225 230 235 240
Tyr Ile Ala Pro Ser Asn Asn Glu Asp Gly Val Tyr Ser Ala Leu Val
245 250 255
Glu Leu Phe Ser Asp Cys Ile Ser Cys
260 265
<210> 4
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtgttcg tttttgacct ggatggtacc ctgctgaaca acaactacac catcagcgag 60
aagaccatca actttattaa aagcctggaa aagtgcggtc acaaactggt tttcgcgagc 120
ggccgtatgc tgatcagcat taagaaagtg gttgagaagt tctttgagaa agaatacccg 180
atcattgcgt ataacggtgg catggtgtac ctgccggagg aaggtatcgt tttcgaaaag 240
tttctggatt tcagcagcgc gaagaaagtt atcgagtttc tgcgtagcga aaacgtgcac 300
cgtcagattt acgttgacga taaactgtat ggcgaggaag acaacgatga gatcaagttc 360
tatgcgaaac acgcgagcgt ggactactat attgtggacg atctggttaa gctgctgcgt 420
aagaaactgc cggtgaaaat cctgagcatt gttgacaagg agaaaatcaa gctgctgaaa 480
gataagctga acagcctgaa cctggaaatt gacgtgttta agagcatgga catcttcctg 540
gatattgttc cgaaggatat caacaaaggc gaggcgctgg aatttctgat caagaaactg 600
gacctgaaag gcgagattgt ggcgtttggc gacgactata acgatattcc gctgttcaag 660
gttgcgaaca tcagcattgc gatgggtaac gcgagcaacg acgtgaaacg tgaagcggat 720
tacatcgcgc cgagcaacaa cgaggacggc gtgtatagcg cgctggttga actgttcagc 780
gattgcatta gctgctaa 798
<210> 5
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Val Phe Val Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Leu Asn Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Thr Ile Ser Glu Lys Thr Ile Asn Phe Ile Lys Ser Leu Glu Lys Cys
20 25 30
Gly His Lys Leu Val Phe Ala Ser Gly Arg Met Leu Ile Ser Ile Lys
35 40 45
Lys Val Val Glu Lys Phe Phe Glu Lys Glu Tyr Pro Ile Ile Ala Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Phe Leu Asp Phe Ser Ser Ala Lys Lys Val Ile Glu Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Glu Asn Val His Arg Gln Ile Tyr Val Asp Asp Lys Leu Tyr Gly Glu
100 105 110
Glu Asp Asn Asp Glu Ile Lys Phe Tyr Ala Lys His Ala Ser Val Asp
115 120 125
Tyr Tyr Ile Val Asp Asp Leu Val Lys Leu Leu Arg Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Val Lys Ile Leu Ser Ile Val Asp Lys Glu Lys Ile Lys Leu Leu Lys
145 150 155 160
Asp Lys Leu Asn Ser Leu Asn Leu Glu Ile Asp Val Phe Lys Ser Met
165 170 175
Asp Ile Phe Leu Asp Ile Val Pro Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ala
180 185 190
Leu Glu Phe Leu Ile Lys Lys Leu Asp Leu Lys Gly Glu Ile Val Ala
195 200 205
Phe Gly Asp Gly Tyr Asn Asp Ile Pro Leu Phe Lys Val Ala Asn Ile
210 215 220
Ser Ile Ala Met Gly Asn Ala Ser Asn Asp Val Lys Arg Glu Ala Asp
225 230 235 240
Tyr Ile Ala Pro Ser Asn Asn Glu Asp Gly Val Tyr Ser Ala Leu Val
245 250 255
Glu Leu Phe Ser Asp Cys Ile Ser Cys
260 265
<210> 6
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggtgttcg tttttgacct ggatggtacc ctgctgaaca acaactacac catcagcgag 60
aagaccatca actttattaa aagcctggaa aagtgcggtc acaaactggt tttcgcgagc 120
ggccgtatgc tgatcagcat taagaaagtg gttgagaagt tctttgagaa agaatacccg 180
atcattgcgt ataacggtgg catggtgtac ctgccggagg aaggtatcgt tttcgaaaag 240
tttctggatt tcagcagcgc gaagaaagtt atcgagtttc tgcgtagcga aaacgtgcac 300
cgtcagattt acgttgacga taaactgtat ggcgaggaag acaacgatga gatcaagttc 360
tatgcgaaac acgcgagcgt ggactactat attgtggacg atctggttaa gctgctgcgt 420
aagaaactgc cggtgaaaat cctgagcatt gttgacaagg agaaaatcaa gctgctgaaa 480
gataagctga acagcctgaa cctggaaatt gacgtgttta agagcatgga catcttcctg 540
gatattgttc cgaaggatat caacaaaggc gaggcgctgg aatttctgat caagaaactg 600
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gttgcgaaca tcagcattgc gatgggtaac gcgagcaacg acgtgaaacg tgaagcggat 720
tacatcgcgc cgagcaacaa cgaggacggc gtgtatagcg cgctggttga actgttcagc 780
gattgcatta gctgctaa 798
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> k stands for g or t.
<400> 7
ttcgtttttg acnnkgatgg t 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 8
cagggtacca tcmnngtcaa aaa 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k stands for g or t.
<400> 9
tgacctggat nnkaccctgc tgaac 25
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 10
agttgttgtt cagcagggtm nnatcc 26
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> k stands for g or t.
<400> 11
ttttcgcgag cggcnnkatg ctg 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 12
aatgctgatc agcatmnngc cgctc 25
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> k stands for g or t.
<400> 13
tgcaccgtca gnnktacgtt g 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 14
atcgtcaacg tamnnctgac gg 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k stands for g or t.
<400> 15
ggaaattgac nnktttaaga gc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 16
ccatgctctt aaamnngtca at 22
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> k stands for g or t.
<400> 17
ggcgtttnnk gacaactata acgatat 27
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 18
ttgtcmnnaa acgccacaat ctcgc 25
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> k stands for g or t.
<400> 19
ggcgtttggc nnkaactata acgatat 27
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 20
acagcggaat atcgttatag ttmnngccaa 30
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> k stands for g or t.
<400> 21
gcgtttggcg acnnktataa cgata 25
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> m stands for a or c.
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n stands for a, g, c or t.
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n stands for a, g, c or t.
<400> 22
cagcggaata tcgttatamn ngtcgccaaa 30

Claims (8)

1.一种栖热腔菌磷酸酶突变体，由来源于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型磷酸酶经突变所得，所述突变为以下一种：N212G或N212D。
2.权利要求1所述栖热腔菌磷酸酶突变体在催化合成氨基葡萄糖中的应用。
3.编码权利要求1所述栖热腔菌磷酸酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，突变为N212D时，核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，突变为N212G时，核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
6.权利要求3～5任一所述基因在催化合成氨基葡萄糖中的应用。
7.一种基因工程菌，其特征在于，包括宿主菌和导入宿主菌内进行外源表达的外源基因，所述外源基因是权利要求3～5任一所述基因。
8.一种催化合成氨基葡萄糖的方法，其特征在于，底物氨基葡萄糖-6-磷酸使用权利要求1所述栖热腔菌磷酸酶突变体催化去磷酸生成产物氨基葡萄糖。
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Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5939257A (en) * 1994-04-18 1999-08-17 Amersham Life Science, Inc. Thermostable alkaline phosphatases
US5968799A (en) * 1990-09-28 1999-10-19 Roche Molecular Systems, Inc. Purified thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermosipho africanus
US20110008869A1 (en) * 2003-08-06 2011-01-13 University Of Maryland College Park Engineered proteases for affinity purification and processing of fusion proteins
US20120197535A1 (en) * 2011-01-03 2012-08-02 Goodlett David R Methods for identifying bacteria
CN103555687A (zh) * 2013-09-12 2014-02-05 浙江工业大学 一种酸性磷酸酶突变体、编码基因、载体及应用
CN106466476A (zh) * 2007-01-30 2017-03-01 安-法玛公司 碱性磷酸酶在治疗肾功能减退中的用途
WO2018085888A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-17 Griffith University Subtilase cytotoxin b subunit mutant
WO2019060903A1 (en) * 2017-09-25 2019-03-28 Agrospheres, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING AND EVOLVING ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL PRODUCTS
CN110300800A (zh) * 2017-01-06 2019-10-01 绿光生物科技股份有限公司 糖的无细胞生产
CN112481234A (zh) * 2020-12-03 2021-03-12 重庆工业职业技术学院 一种高效的焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用
CN112877272A (zh) * 2021-04-28 2021-06-01 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法
CN113122519A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种耐热6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶突变体及其应用
CN113583997A (zh) * 2021-07-27 2021-11-02 浙江工业大学 一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用
CN113604454A (zh) * 2021-07-27 2021-11-05 浙江工业大学 一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备果糖中的应用

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5968799A (en) * 1990-09-28 1999-10-19 Roche Molecular Systems, Inc. Purified thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermosipho africanus
US5939257A (en) * 1994-04-18 1999-08-17 Amersham Life Science, Inc. Thermostable alkaline phosphatases
US20110008869A1 (en) * 2003-08-06 2011-01-13 University Of Maryland College Park Engineered proteases for affinity purification and processing of fusion proteins
CN106466476A (zh) * 2007-01-30 2017-03-01 安-法玛公司 碱性磷酸酶在治疗肾功能减退中的用途
US20120197535A1 (en) * 2011-01-03 2012-08-02 Goodlett David R Methods for identifying bacteria
CN103555687A (zh) * 2013-09-12 2014-02-05 浙江工业大学 一种酸性磷酸酶突变体、编码基因、载体及应用
WO2018085888A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-17 Griffith University Subtilase cytotoxin b subunit mutant
CN110300800A (zh) * 2017-01-06 2019-10-01 绿光生物科技股份有限公司 糖的无细胞生产
WO2019060903A1 (en) * 2017-09-25 2019-03-28 Agrospheres, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING AND EVOLVING ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL PRODUCTS
CN113122519A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种耐热6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶突变体及其应用
CN112481234A (zh) * 2020-12-03 2021-03-12 重庆工业职业技术学院 一种高效的焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用
CN112877272A (zh) * 2021-04-28 2021-06-01 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法
CN113583997A (zh) * 2021-07-27 2021-11-02 浙江工业大学 一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用
CN113604454A (zh) * 2021-07-27 2021-11-05 浙江工业大学 一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备果糖中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "MULTISPECIES: Cof-type HAD-IIB family hydrolase [unclassifiedThermosipho (in: Bacteria)]", 《GENBANK DATABASE》 *
WANG KAIKAI等: "Synergetic Fermentation of Glucose and Glycerol for High-Yield N-Acetylglucosamine Production in Escherichia coli", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》 *
ZHI-QIANG LIU等: "Enzymatic production of 5′-inosinic acid by a newly synthesised acid phosphatase/phosphotransferase", 《FOOD CHEMISTRY》 *
万逸尘等: "化学品体外生物合成途径设计、元件组装和应用", 《合成生物学》 *
李哲等: "氨基葡萄糖对绝经后骨质疏松模型大鼠的保护作用", 《中国海洋药物》 *
杨玉林等: "《肝脏疾病实验诊断》", 30 November 1996, 北京：中国医药科技出版社 *

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