JP7241368B2

JP7241368B2 - アオサ多糖リアーゼおよびそのコード遺伝子と応用

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Publication number: JP7241368B2
Application number: JP2021521492A
Authority: JP
Inventors: 鵬王; 京良張; 錫明徐; 健高
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN112029752B; WO2020244031A1; CN112029752A; JP2022512771A

Description

本発明はバイオ技術分野に関し、具体的にはアオサ多糖リアーゼおよびそのコード遺伝子と応用に関する。

アオサ多糖はアオサの細胞壁から抽出した高度に硫酸化された多糖類であり、主に硫酸化ラムノース、グルクロン酸、キシロースおよびイズロン酸によって構成される。研究によれば、アオサは抗酸化、抗凝血、抗腫瘍および免疫調節などの生理活性を有し、食品、医薬品など分野に幅広い利用価値を有する。しかし、高分子量のアオサ多糖は吸収され難く、粘度が大きいため、その開発利用が制限を受けている。

現在、アオサ多糖の分解方法としては、主に、酸分解法、マイクロ波補助法、アスコビル酸結合過酸化水素法、酵素法分解などが含まれる。酸分解法は簡単で行い易いが、硫酸基離脱の原因となり、オリゴ糖の構造を破壊し、且つ産物が複雑で、分離純化が難しく、環境汚染の原因となる。マイクロ波補助法とアスコビル酸結合過酸化水素法はオリゴ糖の構造を良く維持することができるが、産出量が低く、原価が高いため、大規模生産には不適である。酵素法分解は優れた基材特異性を有し、反応が高効率且つ安定で、反応条件が穏やかで、酵素分解産物の活性基の保存状態が良いだけでなく均一であり、分解・純化が易しく、産出量が高くて、品質も良く、理化学法に比べて著しい優位性がある。

本発明者は資料や文献調べたところ、アオサ多糖リアーゼはβ脱離を通じてアオサ多糖糖鎖中の硫酸化ラムノースとグルクロン酸との間の結合を解くことができ、アオサ多糖リアーゼはその分解特性と配列相似性によって３つの家族：多糖リアーゼ２４、２５、２８に分けられる。Ｌａｈａｙｅら（ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，１９９７）は第一種のアオサ多糖を分解できる海洋細菌を発見した。アオサ多糖リアーゼを発生させる菌株は主にアルテロモナス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、マリーンフラボバクテリウム属（Ｍａｒｉｎｅｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などから由来する。ＣＮ１０５６２４０６７はマリーンフラボバクテリウム属細菌から由来する硫酸化ラムノースを生産できる酵素を開示しているが、この酵素は硫酸化ラムノースを分解してオリゴ糖を生成し、その分子量は１１０．６ｋＤａであるが、発酵液の活力が低く、僅か３．５Ｕ／ｍＬしかない。現在野生菌の発酵によって製作されるアオサ多糖リアーゼは、酵素の活力が低く、コード遺伝子が得られない、組み換え発現と分子改造ができないなど色んな問題がある。そこで、工学細菌組み換え発現がアオサ多糖リアーゼ開発利用の新しい構想となり、Ｃｏｌｌｅｎら（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，２８６）は、アオサ生長に利用できる菌株Ｎｏｎｌａｂｅｎｓｕｌｖａｎｉｖｏｒａｎｓ中から、大腸系で発現したエンドヌクレアーゼ型アオサ多糖リアーゼを発見且つ利用したが、その分子量は４６ｋＤａ（ＪＮ１０４４８０）であり、この酵素は多糖リアーゼ２８家族に属していた。Ｋｏｐｅｌ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６）らはＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＬＯＲ由来のアオサ多糖リアーゼ（ＷＰ＿０３２０９６１６５．１）に対して大腸菌を利用して組み換え発現を行ったが、その発現プロテイン分子量は１１１ＫＤａであり、多糖リアーゼ２４家族に属していた。Ｆｏｒａｎ（ＡｌｇａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１７）らは、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＬＯＲ由来のアオサ多糖リアーゼ（ＷＰ＿０５２０１０１７８．１）に対して大腸菌を利用して組み換え発現を行ったが、多糖リアーゼ２５家族に属していた。ところが、これらの組み換え発現酵素家族中の成員数が全体的に少ない。アオサ多糖をより良く開発利用するために、新しいアオサ多糖リアーゼを発見し、より多くのアオサ多糖リアーゼ遺伝子を発掘するとともに、工学化表現を実現することは重要な研究の将来性と意義がある。

既存技術の欠点と問題に鑑みて、本発明はアオサ多糖リアーゼおよびコード遺伝子と応用を提供することを目的とする。本発明により提供されるアオサ多糖リアーゼは多糖リアーゼ２５家族に属し、酵素タンパク質配列と既存酵素配列との類似度が低く、新しいアオサ多糖リアーゼに属し、この酵素の活力は２３０Ｕ／ｍＬに達していて、優れた温度安定性とｐＨ安定性を有し、優れた研究応用の将来性を有する。

本発明が解決しようとする課題は、新しいアオサ多糖リアーゼおよびその遺伝子を提供することである。

また、本発明が解決しようとする課題は、上記アオサ多糖リアーゼの組み換え発現製作方法を提供することである。

さらに、本発明が解決しようとする課題は、上記アオサ多糖リアーゼの応用を提供することである。

本発明は上記技術問題を以下技術手段で解決する。
（ｉ）アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すとおりであり、
（ｉｉ）（ｉ）中のアミノ酸配列は、１つまたは幾つかのアミノ酸の置換、欠失または添加によって、活性を有する、アオサ多糖リアーゼ。

さらに、前記アオサ多糖リアーゼはＳＥＱＩＤＮＯ．１に示す酵素活性を有し、（ｉｉ）において、具体的に、第１１２部位のＨがＡに、第１４１部位のＴがＶに、第１６２部位のＨがＦに、第２００部位のＹがＱに、第２２０部位のＣがＳに、第２３２部位のＨがＣに置換されたアミノ酸中の少なくも一つである。

アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すとおりであり、ヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ．２示すとおりである、アオサ多糖リアーゼのコード遺伝子。

前記アオサ多糖リアーゼのコード遺伝子を含む組み換えキャリアであって、前記組み換えキャリアプラスミドは大腸菌プラスミドまたは枯草菌プラスミドであり、好ましくて、大腸菌プラスミドｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａである。

前記組み換えキャリアの宿主細胞の転化によって得られる細胞であって、前記宿主細胞は大腸菌または枯草菌であり、好ましくて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。

アオサ多糖リアーゼ遺伝子のクローンと分析：寄託番号がＣＣＴＣＣＭ２０１２１３２であるＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａゲノムを抽出して、ゲノム配列と機能遺伝子との比較分析によって、プライマーをデザインし、抽出されたゲノムＤＮＡをモデルとして、ＰＣＲを通じてアオサ多糖リアーゼ遺伝子を獲得する段階、
アオサ多糖リアーゼ組み換えキャリアの構築：獲得したアオサ多糖リアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列をダブル酵素消化を経て、その後大腸菌プラスミドｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａと結合させて、組み換えキャリアを獲得する段階、
アオサ多糖リアーゼ組み換え細胞の構築：アオサ多糖リアーゼ組み換えキャリアを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で転化して、大腸菌アオサ多糖リアーゼ組み換え細胞を獲得する段階、
アオサ多糖リアーゼの発現と純化：アオサ多糖リアーゼ遺伝子の組み換えキャリアを含有する細胞を生物反応器中に接種且つ培養して、発現を誘発し、発現産物を収集し、親和クロマトグラフィー・純化によって、ヒアルロン酸リアーゼ活性プロティンを獲得し、またイオン交換とゲルろ過純化によって、ヒアルロン酸リアーゼを獲得する段階、からなるアオサ多糖リアーゼの製作方法。

前記アオサ多糖リアーゼを含有する組成物であって、この組成物には食品または医薬品中に引き受けられる添加剤またはキャリアも含まれている。

アオサ多糖リアーゼ製作における前記アオサ多糖リアーゼ遺伝子または組み換えキャリアまたは組み換え細胞の応用。

緑藻多糖の触媒分解による緑藻オリゴ糖製作における前記アオサ多糖リアーゼの応用

前記緑藻多糖にはアオサ多糖、アオノリ多糖またはヒトエグサ多糖が含まれている。

本発明では同源プライマーをデザインすることによって、海洋細菌ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａＡ３２１のアオサ多糖リアーゼ遺伝子を獲得するが、この遺伝子のコード域長さは１３１４ｂｐであり、コード４３７個アミノ酸のアオサ多糖リアーゼは、多糖リアーゼ２５家族に属し、この酵素遺伝子配列は既存のアオサ多糖リアーゼに比べて顕著な違いがあり、全く新しいアオサ多糖リアーゼである。

本発明の技術手段によって、前記新しいアオサ多糖リアーゼの組み換えキャリアの構築および大腸菌の高効率発現を実現することができ、アオサ多糖リアーゼの規模化生産を実現することでき、アオサ多糖リアーゼの活力は２３０Ｕ／ｍＬにも達し、野生の菌株（０．１９Ｕ／ｍＬ）に比べて著しく向上され、すでに開示されているアオサ多糖リアーゼの酵素活力に比べて明らかに高いだけでなく、理化学的性質に優れているため、緑藻多糖リアーゼを高効率に分解して緑藻オリゴ糖を製作することができ、食品や医薬品、化工および多糖構造分析など分野に幅広く使用することができる。

寄託情報：細菌ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａＡ３２１、この菌株は２０１２年４月２３日に中国典型培養物菌種寄託センターに寄託されており、住所：中国・武漢、武漢大学、ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａＡ３２１の寄託番号：ＣＣＴＣＣＮＯ．Ｍ２０１２１３２。

以下、図面を参照して本発明の具体的な実施形態についてさらに詳しく説明する。
アオサ多糖リアーゼ遺伝子の１％アガロースゲル中の電気泳動図を示したものである。左側Ｍはマーカー、右側１はサンプルである。アオサ多糖リアーゼのアミノ酸配列の比較図である。そのうち、ＡＬＴ３６９５：本発明アオサ多糖リアーゼのアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）、ＷＰ＿０５２０１０１７８．１：ｕｌｖａｎｌｙａｓｅ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＬＯＲ），ＰＬ２５家族、ＷＰ＿０３３１８６９９５．１：ｕｌｖａｎｌｙａｓｅ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＰＬＳＶ），ＰＬ２５家族、ＡＭＡ１９９９１：ｕｌｖａｎｌｙａｓｅ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＬＯＲ），ＰＬ２４家族、ＷＰ＿０３８５３０５３０．１：ｕｌｖａｎｌｙａｓｅ（Ｍａｒｉｎｅｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），ＰＬ２８家族。組み換えキャリアｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａ－ＡＬＴ３６９５である。純化されたアオサ多糖リアーゼＳＤＳ－ＰＡＧＥの電気泳動図である。左側Ｍは標準タンパク質の分子量、右側１は純化されたアオサ多糖リアーゼタンパク質である。はアオサ多糖リアーゼに対する温度の影響を示した図であり、横座標は異なる温度、従座標は相対酵素活性である。はアオサ多糖リアーゼの温度安定性を示した図であり、横座標は異なる時間、従座標は相対酵素活性である。はアオサ多糖リアーゼに対するｐＨの影響を示した図であり、横座標は異なるｐＨ、従座標は相対酵素活性である。はアオサ多糖リアーゼのｐＨ安定性を示した図であり、横座標は異なるｐＨ、従座標は相対酵素活性である。はアオサオリゴ糖の質量スペクトルであり、横座標はｍ／ｚ、従座標はイオン流強さである。はアオサオリゴ糖の紫外線走査スペクトルであり、横座標は波長、従座標は吸光度である。

本発明では新しいアオサ多糖リアーゼを提供して、新しいアオサ多糖リアーゼの高い酵素活力組み換え発現を実現し、本発明の技術手段によって、組み換えアオサ多糖リアーゼの規模化生産を実現する。

本文の前記「アオサ多糖リアーゼ活性」とは酵素を活力単位として定義したものである。
紫外線法を利用して酵素活力を測定し、質量体積分数が０．１％であるアオサ多糖リアーゼを４ｍＬ取って基材（ｐＨ＝８，２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）とし、０．１ｍＬの酵素液を入れて、３５℃下で５ｍｉｎ保温した後、直ちに５ｍｉｎ沸かして反応を終了させ、不活性酵素液を添加したものをブランク対照として、紫外分光光度計で２３５ｎｍ下での吸光度を測定する。実験条件において、１ｍｉｎごとにアオサ多糖分解によって１μｍｏｌ不飽和二重結合を発生させることに必要である酵素量を１つの酵素活力単位（Ｕ）と定義する。発酵液の酵素活力単位は、１ｍｌの発酵液に含有する酵素活力単位（Ｕ／ｍＬ）である。

本文に現れる各種アミノ酸配列中のアミノ酸は、それらの周知の３つの文字または単一文字の略称で表示するが、例えば、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）を３つの文字でＬｙｓと略称し、単一文字でＫと略称する。各種ＤＮＡ断片中のヌクレオチドは、本分野にて通常使用される単一文字マーカーで表示する。

本発明にはアオサ多糖リアーゼの断片が含まれており、本文に使用されるものは、本発明のアオサ多糖リアーゼと大体同じ生物学的機能または活性を有するタンパク質またはマルチペプチドを言う。本発明のタンパク質またはマルチペプチド断片は、（ｉ）１つまたは複数の保存または非保存アミノ酸残基（好ましくて保存アミノ残基）が置換されたタンパク質またはマルチペプチドであるが、このような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号でエンコーディングされるか、エンコーディングされない。または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基中に置換基を有するタンパク質またはマルチペプチド、または（ｉｉｉ）付加のアミノ酸配列をこのタンパク質またはマルチペプチド配列に融合させて形成したタンパク質またはマルチペプチド（プリアンブル配列または分泌配列または純化に用いるこのマルチペプチドの配列またはタンパク質の原の配列、または融合タンパク質）である。本文の定義によって、これらの断片、派生物および類似物は本分野に馴染んだ技術者にとっては周知の範囲である。

本文の目的に鑑みて、得られるタンパク質がアオサ多糖リアーゼ活性さえあれば、アミノ酸の置換はいずれのアミノ酸で行える。アミノ酸の置換には保存的置換が含まれるが、それは酵素活性を除去しない。本文の説明では、結合部位または触媒センターなどタンパク質の特性を変える置換も考慮されており、これらの置換は一般的に非保存的置換であるが、本分野の技術者により容易にやり遂げることである。

適切なアミノ酸置換は本分野の技術者にとって周知のものであり、一般的に得られる分子の生物活性（酵素活性）を変えない状況下で行われる。本分野の技術者は、マルチペプチドは一般的に非必要エリアにて行われるアミノ酸の置換は生物学的活性をほとんど変えずに、保存アミノ酸置換を行えるとともに、本分野の技術者によって容易にやり遂げられるものであるので、やはり本発明の保護範囲に属するということを理解すべきである。実施可能な保存アミノ酸置換は表１のとおりである。Ｙ３５Ｆ：アミノ酸配列３５部位のＹ（Ｔｙｒ）がＦ（Ｐｈｅ）に、Ｄ１２６Ｅ：アミノ酸配列１２６部位のＤ（Ａｓｐ）がＥ（Ｇｌｕ）に、Ｎ１５０Ｑ：アミノ酸配列１５０部位のＮ（Ａｓｎ）がＥ（Ｇｌｎ）に、Ｖ１６７Ｌ：アミノ酸配列１６７部位のＶ（Ｖａｌ）がＬ（Ｌｅｕ）に置換、Ｓ１９８Ｔ：アミノ酸配列１９８部位のＳ（Ｓｅｒ）がＴ（Ｔｈｒ）に、Ｋ３１３Ｒ：アミノ酸配列３１３部位のＫ（Ｌｙｓ）がＲ（Ａｒｇ）に置換される。その他の保存アミノ酸置換も許され、経験によって確定するか、或いは既知の保存的置換で確定することができる。

タンパク質の特性を変える置換は、酵素タンパク質の触媒活性や安定性などの生物活性を変えることができ、酵素タンパク質置換の重要な方式であり、本分野の技術者によって容易にやり遂げられるものであって、やはり本発明の保護範囲に属する。タンパク質の特性を変えられるアミノ酸置換は以下のとおりである。Ｈ１１２Ａ：アミノ酸配列１１２部位のＨ（Ｈｉｓ）がＡ（Ａｌａ）に、Ｔ１４１Ｖ：アミノ酸配列１４１部位のＴ（Ｔｈｒ）がＶ（Ｖａｌ）に、Ｈ１６２Ｆ：アミノ酸配列１６２部位のＨ（Ｈｉｓ）がＦ（Ｐｈｅ）に、Ｙ２００Ｑ：アミノ酸配列２００部位のＹ（Ｔｙｒ）がＱ（Ｇｌｎ）に、Ｃ２２０Ｓ：アミノ酸配列２２０部位のＣ（Ｃｙｓ）がＳ（Ｓｅｒ）に、Ｈ２３２Ｃ：アミノ酸配列２３２部位のＨ（Ｈｉｓ）がＣ（Ｃｙｓ）に置換される。その他の置換も許され、経験によって確定するか、或いは既知のタンパク質特性を変えられる置換で確定することができる。

以下、具体的な実施例を参照して、本発明の技術手段についてさらに詳しく説明するものとする。理解させて置きたいことは、これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。以下実施例に具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に、ＪｏｓｅｐｈＳａｍｂｒｏｏｋらの著、分子クローン実験ガイドライン、第三版、科学出版社、２００２中に記載の条件または製造メーカーにより提案される条件に従う。

＜実施例１＞ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａＡ３２１ゲノムの抽出
対数生長期まで培養したＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａＡ３２１（この菌株の寄託番号：ＣＣＴＣＣＮＯ．Ｍ２０１２１３２）の菌液を取って、ＴＩＡａｍｐＢａｃｔｅｒｉａＤＮＡＫｉｔ（ＴＩＡＮＧＥＮＢＩＯＴＥＣＨ（ＢＥＩＪＩＮＧ）ＣＯ．，ＬＴＤ）試薬キットのマニュアルによって、ＤＮＡを抽出し、その後、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣＯ．，）でゲノムＤＮＡ濃度と純度の測定を行う。その結果、抽出されたゲノムＤＮＡ濃度は３８０ｎｇ／ｍＬ、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比は１．８２であった。さらに、１％の寒天ゲル電気泳動によるＤＮＡバンド分析を行い、分析条件：サンプル量５μＬ、電圧１２０Ｖ、電気泳動３０ｍｉｎ、ゲル結像システムにてバンドを観察したが、バンドの均一性が良好であった。そこで抽出されたＤＮＡサンプルに対するシーケンシングを行った。

＜実施例２＞アオサ多糖リアーゼ遺伝子のクローンと分析
ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａＡ３２１全ＤＮＡをモデルとして、シーケンシング結果と機能遺伝子分析によって、制限エンドヌクレアーゼの酵素消化部位を含有するプライマーＦとＲでアオサ多糖リアーゼ遺伝子（シグナルペプチドは除外）の増幅を行う。

F:CCGGAATTCCGGCCCAATAATACTGTCGACTTCGCTAACA （ＳＥＱＤＮＯ．３）
R:GGGGTACCCCTTACTTATTCTCGCTTCGTATTGGTCC （ＳＥＱＩＤＮＯ．４）

そのうち、ＧＡＡＴＴＣは制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの酵素消化部位、ＧＧＴＡＣＣは制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩの酵素消化部位である。

ＰＣＲで増幅を行い、５０μＬ反応システム：
５０μＬの反応システム中にＤＮＡモデルを１μＬ、Ｆ（１０μＭ）を１ μＬ、Ｒ（１０μＭ）を１μＬ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）を４μＬ、Ｔａｑ（２Ｕ／μＬ）を１μＬ、１０×Ｔａｑｂｕｆｆｅｒを５μＬ含有し、ｄｄＨ２Ｏを５０μＬまで入れる。

ＰＣＲ増幅プログラム：９４℃事前変性３ｍｉｎ、９４℃変性３０Ｓ、６０℃焼鈍し３０ｓ、７２℃伸ばし２ｍｉｎ、循環増幅３５回、７２℃最終伸ばし５ｍｉｎ。

１％寒天電気泳動検定によって、ＰＣＲ産物が単一特異性バンドであることを検定した後、シーケンシング（電気泳動図は図１を参照）を行い、ＰＣＲ増幅により長さ１３１４ｂｐであるアオサ多糖リアーゼ遺伝子を獲得する。その配列は配列表ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２に示すとおりであり、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２に示す遺伝子配列と全ゲノム配列と対照した結果、全ゲノムシーケ中の機能遺伝子配列と一致していた。この遺伝子コードは一つの４３７個アミノ酸からなるタンパク質であり、その配列は表ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に示すとおりである。ＮＣＢＩデータベース中のＢｌａｓｔ配列分析によれば、このタンパク質は多糖リアーゼ２５家族に属し、そのアミノ酸配列は、その他のすでに開示されたアオサ多糖リアーゼのアミノ酸配列との類似度が最高６４．１４％（シュードアルテロモナス・アオサ多糖リアーゼ：ＷＰ＿０３３１８６９９５．１）しかないため、このタンパク質は新しいタンパク質であり、この遺伝子は新しい遺伝子であることを説明する。本発明のアオサ多糖リアーゼとすでに開示されたアオサ多糖リアーゼのアミノ酸配列との対照結果は図２のとおりである。対照結果によれば、本発明のアオサ多糖リアーゼ遺伝子のアミノ酸配列は開示されたアオサ多糖リアーゼのアミノ酸配列に比べて著しい違いがあって、この酵素タンパク質が新しい酵素タンパク質であることをさらに説明する。

＜実施例３＞アオサ多糖リアーゼの組み換えキャリアの構築
アオサ多糖リアーゼ遺伝子のＰＣＲ産物は、Ｃｙｃｌｅ－ＰｕｒｅＫｉｔ（ＯＭＥＧＡＢｉｏ－ＴｅｋＣｏ．）純化試薬キットに所定の操作方法に従って純化を行う。

ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩを利用して、純化済みアオサ多糖リアーゼ遺伝子とキャリアｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａに対するダブル酵素消化を行い、酵素消化条件：３７℃、６ｈ。酵素消化産物を寒天電気泳動を行い、電気泳動条件：８０Ｖ、１ｈ。Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＯＭＥＧＡＢｉｏ－ＴｅｋＣｏ．）ゲル抽出試薬キットに所定の操作方法に従ってゲル回収を行う。

Ｔ４リガーゼを用いて、酵素消化済みアオサ多糖リアーゼ遺伝子配列断片とｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａを結合し、結合条件：１６℃、１６ｈ。アオサ多糖リアーゼ遺伝子を含有する組み換えキャリアｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａ－ＡＬＴ３６９５（図３を参照）を獲得する。
＜実施例４＞組み換えアオサ多糖リアーゼの大腸菌における発現

組み換えキャリアを熱転化（４２℃、６０ｓ）を経て大腸菌ＤＨ５α受容性細胞に転入し、その後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含有するＬＢ固定プレート上にて、３７℃下で１２ｈ培養するが、転化されていない菌株はプレート上にて生長できないので、ＰＣＲを利用して陽性菌のスクリーニングを行う。ＰＣＲ増幅プログラム：９４℃事前変性３ｍｉｎ、９４℃変性３０ｓ、６０℃焼鈍し３０ｓ、７２℃伸ばし２ｍｉｎ、循環増幅３５回、７２℃最終伸ばし５ｍｉｎ。陽性菌株をＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて１２ｈ培養し、ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔ（ＯＭＥＧＡＢｉｏ－ＴｅｋＣｏ．）でプラスミドを抽出し、組み換えキャリアｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａ－ＡＬＴ３６９５を獲得する。

大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主細胞として、先ず熱転化（４２℃，６０ｓ）を行い、その後孵化（３７℃，４５ｍｉｎ）し、最後に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含有するＬＢ固定プレート上にて、３７℃下で１２ｈ培養し、菌株を選んで、ＰＣＲを利用して陽性菌株スクリーニングを行う。ＰＣＲ増幅プログラム：９４℃事前変性３ｍｉｎ、９４℃変性３０ｓ、６０℃焼鈍し３０ｓ、７２℃伸ばし２ｍｉｎ、循環増幅３５回、７２℃最終伸ばし５ｍｉｎ。陽性クローン菌株ＡＬＴ３６９５－ＢＬ２１（ＤＥ３）を獲得する。

フラスコ発酵：ＡＬＴ３６９５－ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム）に接種し、３７℃下でＯＤ６００が０．６～０．７になるまで培養し、最終濃度が１ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ下で２４ｈ培養し、発酵液を４℃下で８０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、上清液を捨ててから、同じ体積のｐＨ＝７．５、２０ｍＭＴｒｉ－ＨＣｌ再懸濁菌糸体をを用いて、アイスバスにて細胞を破砕し、破砕後の菌液を４℃下で、８０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、上清液を収集する。酵素活力測定方法に従って酵素活力を測定したが、酵素活力は１．３４Ｕ／ｍＬである。

発酵槽発酵：ＡＬＴ３６９５－ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム）に接種し、３７℃下で１２ｈ培養した後、２％接種料で３Ｌの培地が入った５Ｌ発酵槽（２０ｇ／Ｌ酵母エキス粉、５ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌブドウ糖、１０ｇ／ＬＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、６ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム）に入れて、ｐＨを７．２とし、３７℃にて培養し、初期培地中の糖がなくなった時点で最終濃度が１ｍＭになるまでＩＰＴＧを入れて、温度を２８℃に調節し、２４ｈ発効した後菌糸体の濃度が増えない時点で発酵を中止する。発酵液を４℃下で、８０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、上清液を捨ててから、同じ体積のｐＨ＝７．５、２０ｍＭＴｒｉ－ＨＣｌ再懸濁菌糸体を用いて、アイスバスにて細胞を破砕し、破砕後の菌液を４℃下で、８０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、上清液を収集する。酵素活力測定方法に従って酵素活力を測定したが、酵素活力は２３０Ｕ／ｍＬである。

＜実施例５＞アミノ酸配列の変異
アオサ多糖リアーゼのアミノ酸配列（シグナルペプチドは除外）の保存部位と空間構造に対する分析によって、また、ＳＥＱＩＤＮＯ．１アオサ多糖リアーゼのアミノ酸配列とＳＥＱＩＤＮＯ．２アオサ多糖リアーゼのヌクレオチド・配列によって、この遺伝子変異の位置および方式をＨ１１２Ａ、Ｔ１４１Ｖ、Ｈ１６２Ｆ、Ｙ２００Ｑ、Ｃ２２０Ｓ、Ｈ２３２Ｃ、Ｎ７６Ｑ、Ｋ３１３Ｒとデザインし、菌株のコドン使用頻度を参照し、ＣＥＤｅｓｉｇｎＶ１．０４を利用して、ＳＥＱＩＤＮＯ．５－ＳＥＱＩＤＮＯ．２０に示す異変プライマーをデザインする。

H112A-F:TAATACAGCGTATGGCCGCAATATTCATGCT (SEQ ID NO. 5)
H112A-R:GGCCATACGCTGTATTACCTAAAGGGTTTTTGCCA (SEQ ID NO. 6)
T141V-F:GGTGTGTATAACCAAGCTGTAAAAATGGATAACG (SEQ ID NO. 7)
T141V-R:GCTTGGTTATACACACCAAATACCGATATATTATCTAATTCTTCC (SEQ ID NO. 8)
H162F-F:ATGGCGCGTTTAGAAGCGATTGGGTTTATCAAAA (SEQ ID NO. 9)
H162F-R:GCTTCTAAACGCGCCATGTCGGTAGAA (SEQ ID NO. 10)
Y200Q-F:ATAGTTGGCAGGCCTGGGTAGGTAAAGGACAGG (SEQ ID NO. 11)
Y200Q-R:CCAGGCCTGCCAACTATCCACGGCTTTAATATCA (SEQ ID NO. 12)
C220S-F:CCATATTAGCTGGGATGGTGGTGCTGGTG (SEQ ID NO. 13)
C220S- R:CATCCCAGCTAATATGGTAATCATAAGAAATAATGATATCG (SEQ ID NO. 14)
H232C-F:GAGGCTGCACAACTGAACGCCATGATGCC (SEQ ID NO. 15)
H232C-R:TTCAGTTGTGCAGCCTCGGCCATTAACACCA (SEQ ID NO. 16)
N76Q-F:AATAGATCAGCACGGCAAACCTACCATGTTG (SEQ ID NO. 17)
N76Q-R:TGCCGTGCTGATCTATTTTAGAGCGGGTAGGGTCT (SEQ ID NO. 18)
K313R-F:TGGGCCACGTCAAACTAGTTATTTCCGTTGGAATGG (SEQ ID NO. 19)
K313R-R:TAGTTTGACGTGGCCCACCTGTTTTTTGAC (SEQ ID NO. 20)

アオサ多糖リアーゼ遺伝子を含有する組み換えキャリアｐＰｒｏＥＸ－ＨＴａ－ＡＬＴ３６９５をモデルとして、ＳＥＱＩＤＮＯ．５－ＳＥＱＩＤＮＯ．２０プライマーを利用して、ＰＣＲでプラスミド全長を増幅する方法で変異を行うが、５０μＬ反応システムは以下のとおりである。

プラスミドモデルを０．５μＬ、２×ＰｈａｎｔａＭａｘＢｕｆｆｅｒを２５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘ（１０ｍＭｅａｃｈ）を１μＬ、Ｆ（１０μＭ）を２ μＬ、Ｒ（１０μＭ）を２ μＬ、ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを１μＬ、ｄｄＨ_２Ｏを５０μＬまで入れる。

ＰＣＲ増幅プログラム：９５℃事前変性３ｍｉｎ、９５℃変性１５ｓ、６１℃焼鈍し１５ｓ、７２℃伸ばし４ｍｉｎ、循環増幅３５回、７２℃最終伸ばし５ｍｉｎ。

上記ＰＣＲ反応産物を０．５μＬＤｐｎＩ酵素で３７℃下で２ｈ酵素分解してモデルのプラスミドを消化し、酵素分解産物をＣｙｃｌｅ－ＰｕｒｅＫｉｔ（ＯＭＥＧＡＢｉｏ－ＴｅｋＣｏ．）純化試薬キットに所定のマニュアルに従って、ＰＣＲ産物純化を行う。

上記純化産物をＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ヴァゼムバイオテック社）でプラスミド結合を行うが、２０μＬシステム：
５×ＣＥＩＩＢｕｆｆｅｒを４μＬ、ＥｘｎａｓｅＩＩを２μＬ、純化産物を５μＬ、ｄｄＨ_２Ｏを２０μＬまで入れる。プラスミド組み換え条件：３７℃下で３０ｍｉｎ。

変異後の組み換えプラスミドを熱転化（４２℃，６０ｓ）を経て大腸菌ＤＨ５α受容状態細胞に転入し、その後、１００μＬのアンピシリンナトリウムを含有するＬＢ固定プレート上で３７℃下で１２ｈ培養し、転化されていない菌株はプレート上で生長できないので、ＰＣＲを利用して変異菌株に対するスクリーニングを行う。ＰＣＲ増幅プログラム：９４℃事前変性３ｍｉｎ、９４℃変性３０ｓ、６０℃焼鈍し３０ｓ、７２℃伸ばし２ｍｉｎ、循環増幅３５回、７２℃最終伸ばし５ｍｉｎ。そして、変異配列を鑑定したが、変異後のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２１－ＳＥＱＩＤＮＯ．２８のとおりであり、対応する変異アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２９－ＳＥＱＩＤＮＯ．３６のとおりである。その後、陽性変異菌株をＬＢ液体培地に接種し、３７℃下で１２ｈ培養し、ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔ（ＯＭＥＧＡＢｉｏ－ＴｅｋＣｏ．）を用いてプラスミド抽出を行って、変異組み換えプラスミドを獲得する。

大腸菌発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主細胞として、先ず熱転化（４２℃，６０ｓ）を行い、その後孵化（３７℃，１６０ｒｐｍ，４５ｍｉｎ）し、最後に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含有するＬＢ固定プレート上にて、３７℃下で１２ｈ培養し、菌株を選んで、ＰＣＲを利用して陽性菌株スクリーニングを行う。ＰＣＲ増幅プログラム：９４℃事前変性３ｍｉｎ、９４℃変性３０ｓ、６０℃焼鈍し３０ｓ、７２℃伸ばし２ｍｉｎ、循環増幅３５回、７２℃最終伸ばし５ｍｉｎ。陽性クローン菌株を獲得する。

陽性クローン菌株をＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム）に接種し、３７℃下でＯＤ６００が０．６～０．７になるまで培養し、最終濃度が１ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ下で２４ｈ培養し、発酵液を４℃下で８０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、上清液を捨ててから、同じ体積のｐＨ＝７．５、２０ｍＭＴｒｉ－ＨＣｌ再懸濁菌糸体を用いて、アイスバスにて細胞を破砕し、破砕後の菌液を４℃下で、８０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、上清液を収集する。酵素活力測定方法に従って酵素活力を測定したが、酵素活力の結果は表２のとおりである。

タンパク質の特性を変える変異結果によれば、変異体Ｙ２００ＱとＨ２３２Ｃの酵素活力は、変異前菌株のフラスコ発酵酵素活力に比べて著しく向上し、変異体Ｈ１６２ＦとＣ２２０Ｓの酵素活力は、変異前菌株のフラスコ発酵酵素活力に比べてある程度低下しており、変異体Ｈ１１２ＡとＴ１４１Ｖの酵素活力は、変異前菌株のフラスコ発酵酵素活力に比べて明らかに低下していた。ということは、これらのアミノ酸部位は酵素反応中の重要な部位であり、酵素の活性に対して大きな影響があることを説明する。

アミノ酸の保存的置換結果によれば、変異体Ｎ７６ＱとＫ３１３Ｒの酵素活力は変異前菌株の酵素活力に比べて、ほとんど変わらない。これらのアミノ酸は酵素の空間構造を維持するために必須となるアミノ酸であるが、酵素活力にはほとんど影響がない。

＜実施例６＞組み換え酵素の純化
実施例４のフラスコ発酵上清液をニッケルカラムで親和クロマトグラフィー（ＧＥ社）を行い、ニッケルカラム純化説明書に従って初歩的な純化を行い、分離純化産物を収集する。純化済みアオサ多糖リアーゼをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、単一のタンパク質バンド（電気泳動図は図４を参照）を獲得したが、その位置は予測の分子量と合致し、分量は約５３ｋＤａであった。酵素活性回収率は４３％、比活性は２０５３Ｕ／ｍｇ、純化倍数は６．７倍である。

＜実施例７＞アオサ多糖リアーゼの酵素学的性質
１．アオサ多糖リアーゼに対する温度の影響
それぞれ３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０℃の条件において、酵素活力測定ｇ方法に従って、実施例５にて製作されたサンプルの酵素活力を測定し、相対酵素活力で図を作成して比較（最高酵素活力を１００％とする）する。実験結果は図５のとおりであり、実験結果によれば、３０～５５℃の温度範囲内で優れた酵素活力を示し、最適反応温度は５０℃である。

実施例５により製作されたサンプルを２５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃下で、それぞれ２ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ孵化し、酵素活力測定方法に従って、酵素活力を測定し、酵素の温度安定性を調べ、温度処理（０ｍｉｎ）をしていない酵素活力を１００％と定義して、相対酵素活力で図を作成して比較する。実験結果は図６のとおりであり、実験結果によれば、この酵素は４０℃未満の温度において優れた安定性を示し、２ｈ以内の酵素活力はいずれも９０％以上を維持していたが、４５℃以上では酵素活力を失ったので、できるだけ避けるべきである。

２．アオサ多糖リアーゼに対するｐＨの影響
それぞれｐＨ４、５、６、７、７．５、８、８．５、９、１０である５０ｍＭのリン酸塩緩衝液で調製したアオサ多糖リアーゼ基材を用いて、酵素活力測定方法に従って、実施例５により製作されたサンプルを異なるｐＨにおける酵素活力を測定し、相対酵素活力で図を作成して比較（最高酵素活力を１００％とする）する。実験結果は図７のとおりであり、実験結果によれば、最適なｐＨは８．０であり、ｐＨ７～９．０範囲内でいずれも優れた酵素活力を（相対酵素活力≧８０％）有する。

４℃条件下で、実施例５により製作されたサンプルをｐＨ４～１０下で３ｈ孵化し、酵素活力測定方法に従って酵素活力を測定して、酵素のｐＨ安定性を調べ、ｐＨ孵化処理を行っていない酵素液の酵素活力を１００％と定義し、相対酵素活力で図を作成して比較する。実験結果は図８のとおりであり、実験結果によれば、異なるｐＨ下で３ｈ孵化した、この酵素はいずれも９０％以上の酵素活力を有しており、ｐＨ安定性に優れており、産業化応用に適している。

＜実施例８＞アオサオリゴ糖の製作におけるアオサ多糖リアーゼの応用
１％のアオサ多糖水溶液１０ｍＬを取って、その中に１．５×１０^３Ｕの純化済みアオサ多糖リアーゼ酵素液を入れて、１００ｒｐｍ、３５℃の水槽にて酵素分解を８ｈ行い、沸騰水槽にて１０ｍｉｎ酵素を不活化し、１００００ｒｐｍで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、冷凍乾燥してアオサオリゴ糖を製作し得る。製作されたアオサオリゴ糖サンプルに対して質量スペクトル分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を行う。質量スペクトラムは図９のとおりであり、質量スペクトラムによると、ｍ／ｚ：４０１．１ピークが代表するのは単一電荷付きアオサ二糖（一分子硫酸化ラムノースと一分子の不飽和グルクロン酸からなる）の１個電荷付きであり、ｍ／ｚ：５７７．１は単一電荷付きアオサ三糖（一分子硫酸化ラムノースと一分子の不飽和グルクロン酸および一分子のキシロースからなる）、ｍ／ｚ：３７９ピークが代表するのはアオサ四糖（二分子硫酸化ラムノースと一分子の不飽和グルクロン酸および一分子のキシロースからなる）の２個電荷付きであり、ｍ／ｚ：７８１．１ピークが代表するのはアオサ四糖（二分子硫酸化ラムノースと一分子の不飽和グルクロン酸および一分子のキシロースからなる）の１個電荷付きであり、質量スペクトル結果によれば、アオサ多糖リアーゼによって分解されるアオサ多糖の主な産物は不飽和アオサ二糖、三糖および四糖である。紫外線走査スペクトルは図１０のとおりであり、結果によれば、アオサオリゴ糖は２３５ｎｍの所に特徴的な吸収があり、二重結合を生成することを表明する。質量スペクトルと紫外線走査結果はこの酵素が分解酵素であることを表明し、アオサ多糖を分解する主な産物は不飽和アオサ二糖、三糖および四糖である。

＜実施例９＞アオノリオリゴ糖製作におけるアオサ多糖リアーゼの応用
１％のアオノリオリゴ糖水溶液を１００ｍＬ取って、その中に３×１０^３Ｕの純化済みアオサ多糖リアーゼ酵素液を入れて、１００ｒｐｍ、３５℃水槽にて酵素分解を行う。それぞれ０ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎごとにサンプリングし、沸騰水槽にて１０ｍｉｎ不活化し、１００００ｒ／ｍｉｎで遠心分離を１０ｍｉｎ行い、ＨＰＬＣを用いて分子量を測定し記録する。結果は表３のとおりであり、この酵素を利用して異なる分子量のアオノリオリゴ糖を製作できることを表明する。

上記実施例は本発明の技術手段を説明するためのものであり、本発明を制限するためのものではない。前記実施例を参照して本発明について詳しく説明したものの、本分野の普通技術者なら、前記実施例に記載の技術手段を修正、またはその一部の技術特徴に対して、同等置換を行うことができるが、これらの修正、または同等置換は対応する技術手段が本発明によって請求される技術手段のアイディアと範囲を本質的に離れない。

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ．１のアミノ酸配列において、
第１１２部位のＨのＡへの置換、第１４１部位のＴのＶへの置換、第１６２部位のＨのＦへの置換、第２００部位のＹのＱへの置換、第２２０部位のＣのＳへの置換、及び第２３２部位のＨのＣへの置換のうちの少なくとも１の置換がされ、且つ多糖リアーゼ活性を有する、ことを特徴とするアオサ多糖リアーゼ。
請求項１に記載のアオサ多糖リアーゼをコードする遺伝子。
請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
緑藻多糖の触媒分解による緑藻オリゴ糖の製作における、請求項１に記載のアオサ多糖リアーゼの使用。
前記緑藻多糖はアオサ多糖、アオノリ多糖またはヒトエグサ多糖である、ことを特徴とする請求項４に記載の使用。