KR101462894B1

KR101462894B1 - 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법

Info

Publication number: KR101462894B1
Application number: KR1020110012324A
Authority: KR
Inventors: 이성국; 비누셀비 파리수탐
Original assignee: 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-11
Filing date: 2011-02-11
Publication date: 2014-11-20
Also published as: KR20120092335A

Abstract

본 발명은 chb 오페론 또는 asc 오페론의 유도성 프로모터가 구성적 프로모터로 치환된 변이대장균의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 대장균 및 이를 이용한 바이오연료의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변이대장균은 야생형 대장균과는 달리 셀로바이오스를 이용할 수 있으므로, 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 효소당화공정에 효소를 사용하지 않을 수 있으며, 동시당화발효과정(SSF)에서 셀로바이오스 축적에 따른 수율 저하를 막을 수 있다.

Description

셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법 {METHOD FOR PREPARING MUTANT ESCHERICHIA COLI UTILIZING CELLOBIOSE}

본 발명은 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전공학적 방법으로 야생형 대장균이 셀로바이오스를 이용할 수 있도록 변이시키는 방법, 상기 방법에 따라 변이된 대장균 및 이를 이용하여 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법에 관한 것이다.

석유 화학 연료가 고갈됨에 따라 세계 각국에서는 대체 에너지에 상당한 관심을 쏟고 있다. 이러한 대체 에너지로서의 연료용 에탄올은 섬유소계(cellulose) 바이오매스로부터 전환될 수 있는데, 이 섬유소계는 광합성을 통해 고정되어 매년 방대한 양이 얻어질 수 있고 재생가능하다는 점에서 기능적으로나 경제적으로 매우 유리한 물질이다. 현재 섬유소계 바이오매스 중 많이 이용되고 있는 물질로는 목질계(lignocellulose) 바이오매스가 있으며, 이에 포함된 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 리그닌을 효율적으로 분해시키는 방법과 새로운 균주의 탐색 및 당화발효 공정에 많은 연구가 집중되어 있다.

섬유소계 연료 생산에 있어 주요 단계는 i) 적어도 3가지 효소(엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제 및 β-글루카나아제)를 이용한 바이오매스의 효소 당화 공정과 ii) 얻어진 당류의 미생물 발효 공정으로 나눌 수 있다. 최근에는 효소당화 공정과 발효 공정을 한 반응기에서 동시에 수행하여 시설 비용과 효소의 억제 작용을 감소시켜 에탄올 생산 효율을 증가시킨 동시당화발효(simultaneous saccharification and fermentation, SSF) 방법이 많이 연구되고 있다. 또한, 위 과정 중 효소적 당화 과정이 가장 비용이 많이 들기 때문에 당화에 사용되는 상기 효소의 기능을 향상시키거나 이의 사용을 절감하기 위하여 이를 생산하는 발효 균주의 개발을 모색하고 있다. 특히 최근 유전 공학 기술을 이용하여 당화 관련 효소의 유전자를 발효균주에 도입하여 이를 생산하게 함으로써 당화와 발효를 동시에 수행할 수 있는 균주를 개발하고 있다. 하지만, 당화 관련 유전자와 같은 외래 유전자의 발현 효율이 매우 낮으며 또한 과발현시 세포 성장과 대사에 부정적인 영향을 미치는 문제가 있다. 따라서, 외래 유전자를 도입하는 것보다 발효 균주 내의 내생 경로의 조절을 변형시키는 것이 더 유리할 것이다.

대장균(E. coli)은 식물 바이오매스로부터 생성된 6탄당 및 5탄당을 이용하여 에탄올 뿐만 아니라 유용한 생물 연료를 생산할 수 있으며, 유전자 조작이 용이하고, 성장 속도와 대사 활성이 우수한 장점이 있다. 또한, 셀룰로오스로부터 유래된 이당류인 셀로바이오스(cellobiose) 이용을 위한 잠재적 유전자(cryptic gene)가 존재한다(Hall BG et al., Genetics, 115(3), 431-439, 1987).

야생형(wild-type) 대장균은 셀로바이오스를 이용할 수 없지만 셀로바이오스를 단일 탄소원으로 하는 최소 셀로바이오스 배지에서 일정한 기간 동안 배양하는 경우 셀로바이오스 이용 표현형(phenotype)을 획득하는 것으로 보고되었다(Kachroo AH et al., Molecular Microbiology, 66(6), 1382-1395, 2007). 셀로바이오스 이용 표현형은 N,N'-디아세틸키토바이오스의 이화에 관여하는 chb 오페론에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. chb 오페론은 포스포에놀 피루베이트 의존성 전달체(ChbABC), 가수분해효소(chbF), 조절인자(chbR) 및 기능이 알려져 있지 않은 단백질(chbG)을 코딩한다. 세 가지 단백질인 ChbR, CRP 및 NagC가 chb 오페론의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. ChbR은 AraC 계열의 조절인자로서 chb 오페론의 이중 활성인자 및 억제인자로 작용한다. N,N'-디아세틸키토바이오스가 존재하지 않는 경우, ChbR이 NagC와 함께 오페론의 전사를 억제하는 반면, N,N'-디아세틸키토바이오스가 존재하는 경우, ChbR이 CRP와 함께 chb 프로모터로부터의 전사를 활성화시킨다. 하지만, chb 오페론은 N,N'-디아세틸키토바이오스와는 달리 셀로바이오스에 대해서는 잠재성인데, 그 이유는 셀로바이오스가 ChbR을 통해 프로모터를 유도하지 못하기 때문이다. ChbR은 셀로바이오스를 인식할 수 없어서 NagC 억제를 제거하거나 프로모터를 유도할 수 없다.

종래에 NagC나 chb 프로모터의 NagC 결합 부위 또는 ChbR이 변이된, 자연발생적인 셀로바이오스 이용 돌연변이가 분리된 바 있다(Kachroo AH et al., Molecular Microbiology, 66(6), 1382-1395, 2007). 하지만, 이들 균주들은 셀로바이오스 상에서 빠르게 성장할 수 없었다.

이에 본 발명자는 야생형 대장균의 염색체 상의 chb 오페론 프로모터나 asc 오페론 프로모터를 구성적(constitutive) 프로모터로 치환하는 경우 야생형 대장균이 셀로바이오스를 이용할 수 있도록 개량할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 셀로바이오스를 이용할 수 있는 변이대장균을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 변이된 셀로바이오스 이용 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이대장균을 이용하여 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 대장균에 하기로부터 선택되는 어느 하나의 변이를 유도하는 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균(E. coli)의 제조방법을 제공한다:

(a) chb 오페론 유도성 프로모터의 구성적(constitutive) 프로모터로의 치환;

(b) asc 오페론 유도성 프로모터의 구성적 프로모터로의 치환; 및

(c) chb 오페론 유도성 프로모터 및 asc 오페론 유도성 프로모터의 구성적 프로모터로의 치환.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 대장균에 하기로부터 선택되는 어느 하나의 변이가 도입된 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균을 제공한다:

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법에 있어서, 상기 변이대장균을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 변이대장균은 야생형 대장균과는 달리 셀로바이오스를 이용할 수 있으므로, 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 효소당화공정에 효소를 사용하지 않을 수 있으며, 동시당화발효과정(SSF)에서 셀로바이오스 축적에 따른 수율 저하를 막을 수 있다.

도 1은 chb 오페론의 유도성 프로모터를 구성적 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 2는 asc 오페론의 유도성 프로모터를 구성적 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3A는 본 발명에 따른 변이대장균 및 대조군(야생형 MG1655)의 β-글루코시다아제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3B는 본 발명에 따른 변이대장균 및 대조군(야생형 MG1655)의 글루코스 및 셀로바이오스 함유 배지에서의 성장 속도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 변이대장균 및 대조군(야생형 MG1655)의 글루코스 배지 및 셀로바이오스 배지에서의 성장 속도를 나타낸 것이다.
도 5는 변이대장균(CP12CHB) 및 상기 균주를 셀로바이오스 최소 배지에서 75일간 적응시킨 변이대장균(CP12CHB75)의 성장 속도를 나타낸 것이다.

이하 본 발명에 사용된 용어를 설명한다.

본 발명에서 '오페론'이란 단일 조절신호 또는 프로모터의 조절하에 있는 유전자 집단을 함유하는 게놈 물질의 기능 단위를 지칭한다. 본 발명에서 'chb 오페론' 및 'asc 오페론'은 각각의 구조와 기능이 당해 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명에서 '프로모터'는 특정 유전자의 전사를 돕는 DNA 영역을 지칭한다. 또한, '유도성(inducible) 프로모터'는 특정 인자의 존재 또는 부재에 의해 프로모터의 활성이 유도되는 프로모터를 지칭한다. 나아가, '구성적(constitutive) 프로모터'는 관련 유전자가 지속적으로 전사되게 하는 조절되지 않은 프로모터를 지칭하며, '항시적 프로모터' 또는 '항시발현용 프로모터'와 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에서 chb 오페론 유도성 프로모터와 asc 오페론 유도성 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.

본 발명은 야생형 대장균에 하기로부터 선택되는 어느 하나의 변이를 유도하는 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균(E. coli)의 제조방법을 제공한다:

통상적인 대장균은 셀로바이오스를 탄소원으로 이용하지 못하므로 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 당화공정에 사용될 수 없으나, 상기 변이대장균은 셀로바이오스를 효과적으로 이용, 즉 대사할 수 있으므로, 바이오연료 생산, 특히 목질계 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 과정, 더욱 바람직하게는 동시당화발효(SSF)에 사용될 수 있다.

이러한 특징은 대장균의 염색체 상의 chb 오페론의 유도성 프로모터나 asc 오페론의 유도성 프로모터를 구성적 프로모터로 치환함으로써 달성된다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 도 1에 나타낸 바와 같이 chb 오페론의 유도성 프로모터를 공지된 구성적 프로모터로 치환할 수 있다. 상기 chb 오페론 유도성 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, 본 발명에 사용되는 구성적 프로모터는 당업계에 대장균에서 특정 유전자를 항시적으로 전사시키는 것으로 알려진 프로모터라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 도 2에 나타낸 바와 같이 asc 오페론의 유도성 프로모터를 공지된 구성적 프로모터로 치환할 수 있다. 상기 asc 오페론 유도성 프로모터는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, 본 발명에 사용된 구성적 프로모터로는 당업계에 대장균에서 특정 유전자를 항시적으로 전사시키는 것으로 알려진 프로모터라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 chb 오페론 유도성 프로모터를 치환하는데 사용한 것과 동일한 프로모터가 사용할 수 있다.

상기 변이방법으로 얻어지는 대장균은 구성적 프로모터의 작용으로 인해 chb 오페론 또는 asc 오페론의 잠재적 유전자(cryptic gene)가 활성화되어 셀로바이오스를 이용할 수 있는 표현형을 획득하게 된다. 상기 대장균은 에세리키아 속에 속하는 대장균을 포함하며, 바람직하게는 E. coli MG1655가 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 변이대장균 제조 방법은 셀로바이오스 이용능을 향상시키기 위해, 상기 변이 이후에 대장균을 추가로 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양 또는 적응(adaptation)시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 셀로바이오스 최소 배지란 셀로바이오스를 유일한 탄소원으로 하는 배지를 지칭하며, 상기 배양 기간은 셀로바이오스 이용능이 향상될 수 있는 최소 기한으로서, 30일 이상, 바람직하게는 50 일 내지 90일간, 가장 바람직하게는 75일간 배양 또는 적응시킬 수 있다

본 발명은 또한 야생형 대장균에 하기로부터 선택되는 어느 하나의 변이가 도입된 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 이용 대장균을 제공한다:

본 발명의 대장균의 제조에 이용되는 대장균 및 구성적 프로모터는 상기에서 제조방법과 관련하여 상술한 바와 같다.

한편, 본 발명은 본 발명에 따른 변이대장균을 이용하여 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 바이오매스는 바람직하게는 섬유소계 바이오매스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 목질계 바이오매스일 수 있다. 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 본 발명은 효소 당화 공정과 발효 공정에서 본 발명에 따른 변이대장균을 이용하는 것을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 당화 공정에 효소 대신에 본 발명에 따른 변이대장균을 사용하여 수행하거나 효소 일부를 사용하지 않고 본 발명에 따른 변이대장균을 사용하여 당화 공정을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 발효 공정을 본 발명에 따른 변이대장균을 이용하여 수행할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 변이대장균은 당화공정과 발효공정을 한 반응기에서 동시에 수행하는 동시당화발효(SSF)에 사용될 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: chb 오페론 유도성 프로모터가 구성적 프로모터로 치환된 변이대장균의 제조

하기의 방식에 따라 대장균의 chb 오페론과 asc 오페론 내의 유도성 프로모터를 항시적으로 발현되는 구성적(constitutive) 프로모터로 치환하였다.

<1-1> chb 오페론 프로모터의 구성적 프로모터로의 치환

Datsenko KA 등(Datsenko KA et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(12), 6640-6645, 2000)에 개시되어 있는 λ-Red 재조합 시스템을 이용하여, Jensen PR 등(Jensen PR et al., Appl. Environ. Microbiol. 64(1), 82-87, 1998)에 개시되어 있는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 CP12 프로모터로 대장균 MG1655의 염색체 상의 chb 오페론의 잠재적 유도성 프로모터를 치환하였다. 카나마이신 마커 카세트를 포함하는 pKD13(Jensen PR et al., Appl. Environ. Microbiol. 64(1), 82-87, 1998)을 주형으로 이용하여, 표적부위와 상동하는 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머들로 PCR을 수행하여 카나마이신 마커 카세트를 제작하였다.

Datsenko KA 등의 문헌(Datsenko KA et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(12), 6640-6645, 2000)을 참조하여, 프로모터 치환를 위해, 두 개의 오버래핑 단편을 SOE(Splice Overlap Extension) PCR을 통해 증폭시켰다. 단편 1은 chb 오페론 프로모터의 하부 영역에 상동인 프라이머를 갖는 프로모터를 함유하며, 단편 2는 chb 오페론 프로모터의 상부 영역에 상동인 오버행(overhang)을 갖는 pKD13으로부터 유래한 카나마이신 카세트를 함유한다.

<1-2> 구성적 프로모터 치환 균주의 제작

araBAD 프로모터 하에 λ-Red system(pKD46)을 갖는 세포를 10 mM 아라비노스로 유도하여 전기충격용 대장균 세포(electrocompetent cell)을 만들고, 실시예 <1-2>에서 수득한 PCR 산물로 전기천공법으로 형질전환시켰다. 카나마이신 저항성 콜로니를 선별하고, PCR, 서열분석 및 기능 분석을 수행하여 부위 특이적 삽입 및 결실을 확인하였다. 상기 과정으로 얻어진 균주를 "CP12CHB"로 명명하였다.

실시예 2: 변이대장균의 셀로바이오스 이용 여부 확인

실시예 1에서 수득한 변이대장균 CP12CHB가 셀로바이오스를 이용하는지 여부를 확인하기 위하여, β-글루코시다아제 분석을 수행하였다. 대조군으로서 야생형 대장균 MG1655 균주는 LB 배지에서, 본 발명의 CP12CHB 균주는 최소 셀로바이오스 배지 및 최소 글루코스 배지에서 각각 37℃에서 하룻밤동안 배양한 다음, 용해시키고 이를 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 현탁시켜 조효소추출물을 수득하였다. 상기 수득된 조효소추출물을 37℃에서 1시간 동안 또는 노란색이 발현될 때까지 10 mM p-니트로 페닐 β-D-글루코피라노사이드(PNPG)와 함께 배양하였다. Na₂CO₃를 첨가하여 반응을 정지시키고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과를 도 3A에 나타내었다.

도 3A에서 보는 바와 같이, 본 발명의 CP12CHB 균주는 대조군인 MG1363 균주에 비해 β-글루코시다아제 활성이 매우 높은 것으로 나타났다. 이 결과는 본 발명의 변이대장균 균주가 야생형 대장균과는 달리 셀로바이오스를 이용할 수 있음을 의미한다. 다만, 최소 셀로바이오스 또는 최소 글루코스 배지에서 성장한 세포들간에는 효소 활성에 차이가 없었다. 이는 합성 프로모터의 조절하에 있는 chb 오페론의 발현이 글루코스에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 보여준다.

실시예 3: 변이대장균의 성장속도 분석

<3-1> 글루코스 및 셀로바이오스 함유 배지에서의 성장 속도 분석

야생형 대장균 MG1655와 본 발명의 변이대장균 CP12CHB의 성장 속도를 비교하기 위하여, 상기 두 균주를 동일한 조건(0.3% 셀로바이오스 및 0.1% 글루코스 함유 배지)하에서 배양하고 시간에 따른 성장 속도를 600 nm에서 OD를 측정하여 비교하였다. 측정결과를 도 3B에 나타내었다. 도 3B에서 사각형은 CP12CHB를 나타내고, 원은 MG1655를 나타낸다. 도 3B에서 보는 바와 같이, 본 발명의 CP12CHB 돌연변이는 모균주인 MG1655에 비해 성장속도가 우수한 것으로 나타났다. 한편, CP12CHB 돌연변이는 0.1% 글루코스 및 0.3% 셀로바이오스 함유 배지에서 성장시 이상성성장곡선(diauxie)을 나타내었다. 글루코스를 함유하는 배지에서 효소 활성 억제가 나타나지 않았음에도 불구하고, CP12CHB 돌연변이는 글루코스 존재시에 강한 대사산물 억제를 나타내었다.

<3-2> 글루코스 배지 및 셀로바이오스 배지에서의 성장 속도 분석

야생형 MG1655 균주와 본 발명의 CP12CHB 균주를 각각 0.4% 글루코스를 함유하는 배지와 0.4% 셀로바이오스를 함유하는 배지에서 일정한 기간 동안 배양하여 성장 속도를 비교하였다. 측정 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 사각형은 CP12CHB를, 원은 MG1655를 나타내며, 검은색은 글루코스 배지에서의 성장 속도를, 흰색은 셀로바이오스 배지에서의 성장 속도를 나타낸다. 도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 CP12CHB 균주는 MG1655 균주와 비교해볼 때 글루코스 배지에서는 그다지 큰 차이를 나타내지 않았다. 한편, MG1655 균주는 셀로바이오스 배지에서는 거의 성장을 못한 반면, 본 발명의 CP1CHB 균주는 셀로바이오스 배지에서도 성장이 우수한 것으로 나타났다. 상기 결과들은 본 발명의 변이대장균이 셀로바이오스를 효과적으로 이용한다는 것을 보여준다.

실시예 4: 변이대장균의 셀로바이오스 최소 배지에서의 적응에 따른 셀로바이오스 대사 향상 분석

본 발명의 변이대장균 CP12CHB의 셀로바이오스 대사를 향상시키기 위하여, 상기 균주를 최소 셀로바이오스 배지에서 75일간 적응시킨 다음, 셀로바이오스 단독 배지에서 성장 속도를 측정하였다. 상기 적응된 균주를 “CP12CHB75"로 명명하였다. 상기 균주의 성장 속도 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 사각형은 CP12CHB이고, 원은 75일간 적응시킨 CP12CHB75를 나타낸다. 도 5에서 보는 바와 같이, 75일간 적응 결과 성장 속도가 증가하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 변이대장균을 최소 셀로바이오스 배지에서 적응시키는 경우 잠재적 유전자(cryptic gene)가 활성화되어 셀로바이오스 이용능을 증가시킬 수 있음을 보여준다.

<110> Ulsan National Institute of Science and Technology Academy-Industry Research Corporation <120> METHOD FOR PREPARING MUTANT ESCHERICHIA COLI UTILIZING CELLOBIOSE <130> FPD201101-0044 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 142 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 cttaattatc ttcgcgaatt atttgcccga aatgtgaaga gggtcataac cacaggtcaa 60 ggagaaacaa tttataaggt caaagaaata ctattgctca ggtctatacc gtatactcct 120 ttcagccaca aaaaaagtca tg 142 <210> 2 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constitutive promoter <400> 2 catatacaag tttattcttg acactagtcg gccaaaatga tataatacct gagtactgtt 60 cacacaggaa acagctatg 79 <210> 3 <211> 253 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 ccctttacac gcaatcaacg cagtgtactg caccgtttgc cgattgtcct tgcacaatcg 60 gcgggaaaaa tattcaggtg accggtttca caaatataaa aaatgaacaa ttcactctct 120 tgcttattta gtgacaacta ttcatgattt tgtgaaaccg gtttcttaat tccgtttcag 180 catcggcatt tttccgtcac gtcgactgat aacaactaca tctaccctac tgataacagg 240 ataaaatccg atg 253

Claims

야생형 대장균(E. coli)에 하기로부터 선택되는 어느 하나의 변이를 유도하는 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법:
(a) chb 오페론 유도성 프로모터의 구성적(constitutive) 프로모터로의 치환;
(b) asc 오페론 유도성 프로모터의 구성적 프로모터로의 치환; 및
(c) chb 오페론 유도성 프로모터 및 asc 오페론 유도성 프로모터의 구성적 프로모터로의 치환.
제1항에 있어서, 상기 야생형 대장균이 대장균 MG1655인 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 구성적 프로모터가 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 변이 이후에 대장균을 추가로 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양하는 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법.
야생형 대장균에 하기로부터 선택되는 어느 하나의 변이가 도입된 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 이용 대장균:
(a) chb 오페론 유도성 프로모터의 구성적(constitutive) 프로모터로의 치환;
(b) asc 오페론 유도성 프로모터의 구성적 프로모터로의 치환; 및
(c) chb 오페론 유도성 프로모터 및 asc 오페론 유도성 프로모터의 구성적 프로모터로의 치환.
제5항에 있어서, 상기 야생형 대장균이 대장균 MG1655인 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 이용 대장균.
제5항에 있어서, 상기 구성적 프로모터가 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 이용 대장균.
제5항에 있어서, 상기 대장균이 변이 이후에 추가로 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양된 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 이용 대장균.
바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법에 있어서, 제5항의 대장균을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.