KR20160018568A - 발효 경로를 통한 플럭스의 증가를 나타내는 재조합 미생물 - Google Patents

발효 경로를 통한 플럭스의 증가를 나타내는 재조합 미생물 Download PDF

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마이클 코프케
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란자테크 뉴질랜드 리미티드
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Abstract

본 발명은 효소 반응을 최적화함으로써 발효 경로를 통해 플럭스를 증가시킴으로써 발효 생성물의 생성을 증가시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 발효 경로에서 대사 병목에 관여하는 효소들 및/또는 보인자들을 확인하는 것, 및 모 미생물과 비교할 때 상기 효소들 중 하나 이상의 효소의 활성 증가, 또는 상기 보인자들 중 하나 이상의 보인자의 이용률 증가를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시키는 것에 관한 것이다.

Description

발효 경로를 통한 플럭스의 증가를 나타내는 재조합 미생물{RECOMBINANT MICROORGANISMS EXHIBITING INCREASED FLUX THROUGH A FERMENTATION PATHWAY}
관련 출원에 대한 상호-참조
본원은 2013년 6월 5일자로 출원된 가출원 제61/831,591호로부터의 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 효소 반응을 최적화함으로써 발효 경로를 통해 플럭스(flux)를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 발효 경로에서 반응 병목을 확인하고 해결하는 것에 관한 것이다.
아세트산생성 미생물(acetogenic microorganism)은 예를 들어 일산화탄소, 이산화탄소 및 수소를 포함하는 기질의 발효에 의한 연료 및 다른 화학물질(예를 들어, 에탄올, 뷰탄올 또는 뷰탄다이올)의 생성에 유용한 것으로 공지되어 있다.
생성물 농도 및 기질 이용을 개선하기 위한 지금까지의 노력은 균주 선택, 매개변수 및 발효 조건의 최적화뿐만 아니라, 배지 제제 또는 과정 조건의 최적화에 초점을 두었다(Abubackar et al., 2012). 그러나, 천연 유기체의 대사는 높은 수율, 속도 및 역가의 상업용 목적을 달성하도록 진화하지 않았다(Nielsen, 2011). 유기체에서의 소정의 반응의 속도가 균주 선택 또는 과정 조건의 최적화에 의해 증가할 수 있지만, 통상적으로 영향을 받지 않고 속도 제한일 것인 몇몇 반응이 있다.
지난 십 년에, 게놈 규모 대사 복원을 조사하기 위해 다수의 인실리코(in silico) 예측 도구가 개발되었다. 이 구속-기반 모델은 대사 네트워크를 통해 플럭스를 연구하기 위한 화학량론적 접근법을 이용하고, 이 네트워크에서 모든 가능한 순 플럭스 분포(실행 가능한 플럭스 공간)는 관찰된 세포 유입 및 유출 측정(외부 플럭스), 및 질량 균형 및 열역학 방정식에 의해 구속된다. 플럭스 균형 분석(flux balance analysis: FBA)은 소정의 목적을 최적화하는(보통 성장의 최대화) 대사 플럭스 분포를 확인하기 위한 이 해결 공간을 탐색한다. 플럭스 균형 분석은 시스템에서의 대사물질의 농도 및 효소 동역학 매개변수의 면에서 매우 적은 정보를 필요로 한다. 그러나, 이러한 접근법의 하나의 제한은 속도 제한 반응(병목)을 확인할 수 없다는 것이다.
본 발명의 목적은 발효 반응의 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것, 또는 적어도 공중에게 유용한 선택을 제공하는 것이다.
제1 양상에서, 본 발명은 발효 생성물을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 적어도,
a) 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
b) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소, 보인자(co-factor) 또는 둘 다를 확인하는 단계;
c) 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) b)의 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) b)의 1종 이상의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아(carboxydotrophic Clostridia) 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계를 포함한다.
제2 양상에서, 본 발명은 발효 경로를 통해 플럭스를 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 적어도,
a) 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
b) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소, 보인자 또는 둘 다를 확인하는 단계;
c) 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) b)의 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) b)의 1종 이상의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시키는 단계를 포함한다.
제3 양상에서, 본 발명은 모 미생물에 비해 발효 경로를 통한 플럭스의 증가를 나타내도록 적합화된 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
a) 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
b) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소, 보인자 또는 둘 다를 확인하는 단계;
c) 모 미생물을 형질전환시켜, 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) b)의 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) b)의 1종 이상의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 미생물을 생성하는 단계를 포함하고;
발효 경로는 CO를 포함하는 기질로부터 1종 이상의 발효 생성물을 생성할 수 있다.
제4 양상에서, 본 발명은 발효 생성물을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계를 포함하고, 재조합 미생물은,
ⅰ) 모 미생물과 비교할 때, 발효 경로의 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 1종 이상의 효소, 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가; 또는
ⅱ) 모 미생물과 비교할 때, 발효 경로의 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 1종 이상의 보인자의 이용률 증가
중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은,
ⅰ) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체를 과발현시키는 것;
ⅱ) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 1종 이상의 외인성 효소를 발현시키는 것; 또는
ⅲ) ⅰ) 및 ⅱ) 둘 다에 적합화된다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 효소의 활성을 증가시키거나 1종 이상의 보인자의 이용률을 증가시키기 위한 효소 조작을 겪는다. 특정한 실시형태에서, 효소 조작의 방법은 유도 진화, 지식 기반 설계, 무작위 돌연변이유발 방법, 유전자 셔플링(gene shuffling), 코돈 최적화, 부위-특이적 라이브러리의 사용 및 부위 평가 라이브러리의 사용으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 모 미생물에 비해 발효 경로의 효율의 증가를 나타내도록 적합화된다. 바람직하게는, 효율의 증가는 발효 생성물의 생성 속도의 증가를 포함한다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 속도 제한 경로 반응은 발효 경로를 구성하는 2개 이상의 경로 반응의 효소 활성의 분석에 의해 결정된다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 속도 제한 경로 반응은 최저 효소 활성을 갖는 경로 반응이다.
제1 양상, 제3 양상 또는 제4 양상의 특정한 실시형태에서, 1종 이상의 발효 생성물은 에탄올, 뷰탄올, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 고차 알콜, 뷰탄다이올, 2,3-뷰탄다이올, 숙시네이트, 아이소프레노이드, 지방산, 또는 바이오중합체 중 적어도 1종이다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 발효 경로는 우드-리융다흘(Wood-Ljungdahl), 에탄올 또는 2,3-뷰탄다이올 발효 경로이다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 1종 이상의 효소는 알콜 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 알데하이드 탈수소효소(아실화)(EC 1.2.1.10), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), 알데하이드 페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.5), 포스포트랜스아세틸라제(EC 2.3.1.8), 아세테이트 키나제(EC 2.7.2.1), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2) 및 수소화효소(EC 1.12.7.2)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이 실시형태의 미생물은 에탄올을 생성시키는 발효 경로를 통한 플럭스의 증가를 나타내도록 적합화된다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 1종 이상의 효소는 피루베이트:페레독신 산화환원효소(피루베이트 생성효소)(EC 1.2.7.1), 피루베이트:폼에이트 분해효소(EC 2.3.1.54), 아세토락테이트 생성효소(EC 2.2.1.6), 아세토락테이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.5), 2,3-뷰탄다이올 탈수소효소(EC 1.1.1.4), 1차:2차 알콜 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2) 및 수소화효소(EC 1.12.7.2)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이 실시형태의 미생물은 2,3-뷰탄다이올을 생성시키는 발효 경로를 통한 플럭스의 증가를 나타내도록 적합화된다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 효소 또는 보인자의 생합성에 관여하는, 외인성 핵산을 발현시키거나, 내인성 핵산을 과발현시키도록 적합화된다. 특정한 실시형태에서, 내인성 핵산 또는 외인성 핵산은 상기 효소로부터 선택된 효소를 코딩한다.
이전 양상의 임의의 하나의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 1종 이상의 보인자의 이용률 증가를 나타내도록 적합화된다. 이용률 증가는 내인성 핵산의 변경된 발현, 또는 외인성 핵산의 발현의 결과로서 발생할 수 있고, 내인성 핵산 또는 외인성 핵산은 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 보인자의 생합성에 관여한다.
특정한 실시형태에서, 보인자는 테트라하이드로폴레이트(THF)를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 GTP 사이클로가수분해효소 I(EC 3.5.4.16), 알칼리 포스파타제(EC 3.1.3.1), 다이하이드로네오프테린 알돌라제(EC 4.1.2.25), 2-아미노-4-하이드록시-6-하이드록시메틸다이하이드로프테리딘 다이포스포키나제(EC 2.7.6.3), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(2.5.1.15), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(EC 2.5.1.15), 다이하이드로폴레이트 생성효소(EC 6.3.2.12), 폴릴폴리글루타메이트 생성효소(6.3.2.17), 다이하이드로폴레이트 환원효소(EC 1.5.1.3), 티미딜레이트 생성효소(EC 2.1.1.45) 또는 다이하이드로모나프테린 환원효소(EC 1.5.1.-) 중 적어도 1종의 발현 증가를 나타낸다. 모두가 관여된다.
특정한 실시형태에서, 보인자는 코발아민(B12)을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 5-아미노레뷸리네이트 생성효소(EC 2.3.1.37), 5-아미노레뷸리네이트:피루베이트 아미노전환효소(EC　2.6.1.43), 아데노실코빈아마이드 키나제/아데노실코빈아마이드-포스페이트 구아닐릴전환효소(EC 2.7.1.156/2.7.7.62), 아데노실코빈아마이드-GDP 리바졸전환효소(EC 2.7.8.26), 아데노실코빈아마이드-포스페이트 생성효소(EC 6.3.1.10), 아데노실코비르산 생성효소(adenosylcobyric acid synthase)(EC 6.3.5.10), 알파-리바졸 포스파타제(EC 3.1.3.73), 코브(I)알라민 아데노실전환효소(EC 2.5.1.17), 코브(II)인산 a,c-다이아마이드 환원효소(EC 1.16.8.1), 코발트-프레코린 5A 가수분해효소(EC 3.7.1.12), 코발트-프레코린-5B (C1)-메틸전환효소(EC 2.1.1.195), 코발트-프레코린-7 (C15)-메틸전환효소(EC 2.1.1.196), 코발토킬레타제 CobN(EC 6.6.1.2), 코비린산(cobyrinic acid) a,c-다이아마이드 생성효소(EC 6.3.5.9/6.3.5.11), 페리틴(EC 1.16.3.1), 글루타메이트-1-세미알데하이드 2,1-아미노뮤타제(EC 5.4.3.8), 글루타밀-tRNA 환원효소(EC 1.2.1.70), 글루타밀-tRNA 합성효소(EC 6.1.1.17), 하이드록시메틸빌란 생성효소(EC 2.5.1.61), 니코티네이트-뉴클레오타이드-다이메틸벤즈이미다졸 포스포리보실전환효소(EC 2.4.2.21), 산소-독립적 코프로포르피리노겐 III 산화효소(EC 1.3.99.22), 포르포빌리노겐 생성효소(EC 4.2.1.24), 프레코린-2 탈수소효소/시로하이드로클로린 페로킬레타제(EC 1.3.1.76/4.99.1.4), 프레코린-2/코발트-2 인자 C20-메틸전환효소(EC 2.1.1.130/2.1.1.151), 프레코린-3B 생성효소(EC 1.14.13.83), 프레코린-3B C17-메틸전환효소(EC 2.1.1.131), 프레코린-4 C11-메틸전환효소(EC 2.1.1.133), 프레코린-6X 환원효소(EC 1.3.1.54), 프레코린-6Y C5,15-메틸전환효소(EC 2.1.1.132), 프레코린-8W 탈탄산효소(EC 1.-.-.-), 프레코린-8X 메틸뮤타제(EC 5.4.1.2), 시로하이드로클로린 코발토킬레타제(EC 4.99.1.3), 트레오닌-포스페이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.81), 유로포르피리노겐 탈탄산효소(EC 4.1.1.37) 또는 유로포르피리노겐 III 메틸전환효소/생성효소(EC 2.1.1.107/4.2.1.75) 중 적어도 1종의 발현 증가를 나타낸다.
제5 양상에서, 본 발명은 제3 양상의 방법에 의해 생성된 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물을 제공한다.
제6 양상에서, 본 발명은,
a) 모 미생물과 비교할 때, 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가;
b) 모 미생물과 비교할 때, 1종 이상의 보인자의 이용률 증가; 또는
c) a) 및 b) 둘 다
중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물을 제공하고;
효소 또는 보인자는 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된다.
제7 양상에서, 본 발명은 반응 경로를 통한 플럭스를 증가시키기 위한, 제5 양상 또는 제6 양상에 따른 미생물의 용도를 제공한다.
제8 양상에서, 본 발명은 발효 생성물을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 적어도,
a) 우드-리융다흘, 에탄올 또는 2,3-뷰탄다이올 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
b) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소, 보인자 또는 둘 다를 확인하는 단계;
c) 모 미생물과 비교할 때, b)의 1종 이상의 효소 또는 보인자를 코딩하는 유전자 또는 이의 기능상 동등한 변이체를 발현시키거나 과발현시키도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 제8 양상의 효소는 AOR1이고, 발효 생성물은 에탄올이다.
본 발명은, 임의의 부분, 요소 및 특성(feature) 또는 이들의 2개 이상의 모든 조합으로, 개별적으로 또는 총체적으로, 본원의 명세서에 언급되거나 표시된 상기 부분, 요소 및 특성에 있다고 광범위하게 또한 언급될 수 있고, 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 등가물을 갖는 특정한 정수가 본 명세서에서 언급된 경우, 이러한 공지된 등가물은 개별적으로 기재된 것처럼 본 명세서에 포함된 것으로 간주된다.
본 발명의 실시형태는 첨부한 도면을 참조하여 오직 예의 방식으로 기재될 것이다:
도 1은 측정된 효소 활성을 기술하는 에탄올 생합성 경로의 플럭스 맵 및, 속도 제한 경로 반응의 확인을 허용하는, 아세틸-CoA를 통한 에탄올 형성에 대한 일산화탄소영양 세포를 통한 플럭스를 도시한다. 화살표의 두께는 특정한 경로 반응의 활성에 비례한다.
도 2는 측정된 효소 활성을 기술하는 플럭스 맵 및, 속도 제한 경로 반응의 확인을 허용하는, 피루베이트를 통한 2,3-뷰탄다이올 형성에 대한 일산화탄소영양 세포를 통한 플럭스를 도시한다.
도 3은 AOR1의 2개의 내부 NdeI 부위가 성공적으로 변경되고 이들이 돌연변이가 없다는 것을 확인시켜 주는, 발현 플라스미드 pMTL83157-AOR1AOR1의 인서트 및 프로모터의 서열 정렬을 나타낸다.
도 4는 재조합 미생물을 생성하는 성공적인 형질전환을 예시하는, 플라스미드 대조군 및 AOR1 과발현 균주 둘 다에서의 예상된 576bp 생성물의 존재를 나타낸다.
도 5는 pMTL83157-AOR1 형질전환체로부터 구제된 플라스미드의 NdeI 및 KpnI 분해 후의 예상된 단편의 존재를 나타낸다.
도 6은 AOR1의 과발현(십자, 10일에서의 상부선)이 플라스미드 대조군에 비해 클로스트리듐 아우토에타노게늄(C. autoethanogenum) DSM10061의 독립영양 성장을 개선한다는 것을 나타낸다.
도 7A는 AOR1 과발현을 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게늄 재조합 균주(사각형, 10일에서의 상부선)에 대한 클로스트리듐 아우토에타노게늄 야생형 균주(십자, 10일에서의 하부선)에서의 에탄올 생성을 나타낸다.
도 7B는 AOR1 과발현을 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게늄 재조합 균주(사각형, 10일에서의 상부선)에 대한 클로스트리듐 아우토에타노게늄 야생형 균주(십자, 10일에서의 하부선)에서의 아세테이트 생성을 나타낸다.
정의
본 명세서에 언급된 바와 같은, "발효 경로"는 기질, 바람직하게는 가스 기질이 발효 생성물로 전환되는 생화학 반응(본 명세서에서 "경로 반응"이라 칭함)의 캐스케이드이다. 경로 반응은 통상적으로 효소를 수반하고 보인자를 수반할 수 있고, 이에 의해 효소 또는 보인자는 경로 반응의 속도를 촉진하거나 증가시킨다.
본 명세서에 언급된 바와 같은, "속도 제한 경로 반응"은 발효 경로의 일부인 반응이고, 경로에서 "병목"이며, 이에 의해 전체 경로를 통한 플럭스는 속도 제한 경로 반응의 반응 속도에 의해 느려지고 결정된다. 모든 다른 인자가 일정하면서, 속도 제한 경로 반응의 반응 속도의 증가는 전체 발효 경로의 속도 및 가능하게는 1종 이상의 발효 생성물의 생성에 녹온(knock-on) 효과를 갖는다. "하나의" 또는 "이" (단수) 속도 제한 경로 반응이 본 명세서에서 언급되는 경우, 다수(예를 들어, 2개 이상)의 속도 제한 경로 반응이 또한 본 발명의 범위 내에 포함되고, 이러한 다수의 반응이 본 명세서에 기재된 방법에 따라 또한 결정되고 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 언급된 바와 같은, 반응 "플럭스"는 발효 경로에서 하나 이상의 반응을 통한 대사물질의 흐름을 의미한다. 각각의 경로 반응을 통한 플럭스는 상한 및 하한을 갖고, 따라서 플럭스는 효소 활성에 영향을 미치는 조건 또는 인자의 조정에 의해 변할 수 있다. 하나의 경로 반응을 통한 플럭스의 조정이 발효 경로의 전체 플럭스를 변경할 수 있다. 플럭스는 당해 분야의 당업자에게 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다. 예의 방식으로, 플럭스는 플럭스-균형 분석(FBA)을 이용하여 측정될 수 있다((Gianchandani et al., 2010). 특정한 실시형태에서, 플럭스는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 100% 증가한다. 경로를 통한 플럭스는 대사물질 및 생성물의 수준(대사체학)(Patti et al., 2012) 및/또는 C13으로서의 라벨링 실험(플럭소믹스(fluxomics))((Niittylae et al., 2009; Tang et al., 2009)에 의해 또한 측정될 수 있다.
용어 "니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드"(NADH)는 NAD+(산화 형태), NADH + H+(환원 형태), 또는 NAD+ 및 NADH + H+ 둘 다의 산화환원 커플을 의미한다.
용어 "니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트"(NADPH)는 NADP+(산화 형태), NADPH + H+(환원 형태), 또는 NADP+ 및 NADPH + H+ 둘 다의 산화환원 커플을 의미한다.
본 명세서에 언급된 바와 같은, "효소 보인자", 또는 단순히 "보인자"는 효소의 생물학적 기능 및 이에 따라 반응의 촉매작용을 촉진하기 위해 효소에 결합하는 비단백질 화합물이다. 보인자의 비제한적인 예는 NAD+, NADP+, 코발아민, 테트라하이드로폴레이트 및 페레독신을 포함한다. 보인자의 전체 이용률의 증가는 경로 반응의 속도를 증가시킬 수 있다. 보인자의 생성에 영향을 미칠 수 있는 인자는 보인자의 이용률 증가를 달성하도록 변경될 수 있는 보인자 생합성 유전자의 발현을 포함한다. 당해 분야의 당업자에게 공지된 다른 인자는 보인자의 이용률 증가를 달성하기 위해 또한 사용될 수 있다. 보인자의 이용률의 결여는 경로 반응에 속도 제한 효과를 가질 수 있다. 보인자의 이용률의 결정 방법은 당해 분야의 당업자에게 공지될 것이다.
용어 "적합화"는 본 발명의 재조합 미생물의 기능을 기술하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있고; 예를 들어, 미생물은 특정한 효소를 발현시키도록 "적합화"된다. 효소의 발현과 관련하여 사용될 때, 상기 용어는 효소가 연속하여 발현된다는 것을 함축하지 않고, 효소가 발현될 수 있고, 이러한 발현이 구성적이거나 유도될 수 있는 상황을 포괄하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 바와 같은, "발효 브로쓰"는 적어도 영양소 및 미생물 세포를 포함하는 배양 배지이다.
용어 "효율을 증가시킨다", "효율의 증가" 등은, 발효 경로 또는 과정과 관련하여 사용될 때, 발효에 영향을 미치는 미생물의 성장 속도의 증가; 증가한 생성물 농도에서의 성장 속도 또는 생성물 생성 속도의 증가; 발효 브로쓰에서의 발효 생성물 농도의 증가; 소모된 기질의 용적당 생성된 발효 생성물의 용적의 증가; 발효 생성물의 생성 속도 또는 생성 수준의 증가 중 적어도 하나를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 효율의 증가는 모 미생물을 사용할 때 측정되는 바와 같은 상응하는 변수에 대해 측정된다.
"효소 활성", "1종 이상의 효소의 활성" 및 유사한 구절은 개별 효소의 활성, 효소의 양, 또는 효소의 이용률(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 효소 활성을 언급하는 것으로 광범위하게 취해져야 한다. 따라서, 효소 활성을 "증가시키는 것"이 언급될 때, 이것은 특정한 반응을 촉매화하기 위한 개별 효소의 활성의 증가, 효소의 양의 증가 또는 효소의 이용률의 증가를 포함하도록 취해져야 한다.
구절 "촉매화하는 데 관여하는"은 반응을 직접적으로 촉매화하는(즉, 이를 촉진하거나 이의 속도를 증가시키는) 효소, 및 반응을 직접적으로 촉매화하지 않지만 연관 효소의 생물학적 기능을 촉진하는 보인자를 포함하도록 의도된다.
구절 "일산화탄소를 포함하는 기질" 및 유사한 용어는 예를 들어 성장 및/또는 발효를 위해 박테리아의 1종 이상의 균주에 일산화탄소가 이용 가능한 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
구절 "일산화탄소를 포함하는 가스 기질" 및 유사한 구절 및 용어는 일정한 수준의 일산화탄소를 함유하는 임의의 가스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 기질은 적어도 약 20용적% 내지 약 100용적%의 CO, 20용적% 내지 70용적%의 CO, 30용적% 내지 60용적%의 CO, 및 40용적% 내지 55용적%의 CO를 함유한다. 특정한 실시형태에서, 기질은 약 25용적%, 또는 약 30용적%, 또는 약 35용적%, 또는 약 40용적%, 또는 약 45용적%, 또는 약 50용적%의 CO, 또는 약 55용적%의 CO, 또는 약 60용적%의 CO를 포함한다.
기질이 임의의 수소를 함유하는 것이 필요하지 않긴 하지만, H2의 존재는 본 발명의 방법에 따라 생성물 형성에 해롭지 않아야 한다. 특정한 실시형태에서, 수소의 존재는 알콜 생성의 전체 효율을 개선한다. 예를 들어, 특정한 실시형태에서, 기질은 대략 2:1, 또는 1:1, 또는 1:2 비의 H2:CO를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 기질은 약 30용적% 이하의 H2, 20용적% 이하의 H2, 약 15용적% 이하의 H2 또는 약 10용적% 이하의 H2를 포함한다. 다른 실시형태에서, 기질 스트림은 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만과 같은 낮은 농도의 H2를 포함하거나, 실질적으로 수소를 포함하지 않는다. 기질은 예를 들어 약 1용적% 내지 약 80용적%의 CO2, 또는 1용적% 내지 약 30%용적의 CO2와 같은 약간의 CO2를 또한 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 기질은 약 20%용적 이하의 CO2를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 기질은 약 15%용적 이하의 CO2, 약 10%용적 이하의 CO2, 약 5용적% 이하의 CO2를 포함하거나, 실질적으로 CO2를 포함하지 않는다.
하기하는 설명에서, 본 발명의 실시형태는 "CO를 함유하는 가스 기질"을 전달하고 발효시키는 조건에서 기재되어 있다. 그러나, 가스 기질이 대안적인 형태로 제공될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, CO를 함유하는 가스 기질은 액체 중에 용해된 채 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 가스를 함유하는 일산화탄소에 의해 포화되고, 이후 이 액체는 바이오반응기에 첨가된다. 이는 표준 방법론을 이용하여 달성될 수 있다. 예의 방식으로, 마이크로버블 분산액 생성기(Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3/2002년 10월)를 사용할 수 있다. 추가의 예의 방식으로, CO를 함유하는 가스 기질은 고체 지지체에 흡착될 수 있다. 이러한 대안적인 방법은 용어 "CO를 함유하는 기질" 등의 사용에 의해 포괄된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, CO-함유 가스 기질은 산업 배기 가스 또는 폐가스이다. "산업 폐가스 또는 배기 가스"는 산업 공정에 의해 생성된 CO를 포함하는 임의의 가스를 포함하고, 철강 금속 제품 제조, 비철강 제품 제조, 석유 정련 공정, 석탄의 기화, 바이오매스의 기화, 전력 생성, 카본 블랙 생성 및 코크스 제조의 결과로서 생성된 가스를 포함하는 것으로 광범위하게 취해져야 한다. 추가의 예는 본 명세서의 어느 곳이든 제공될 수 있다.
문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 구절 "발효시키는", "발효 과정" 또는 "발효 반응" 등은 이 과정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 추가로 본 명세서에서 기재된 것처럼, 몇몇 실시형태에서, 바이오반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 그러므로, 발효 반응에 대한 금속 또는 조성물의 첨가는 이들 반응기 중 하나 또는 둘 다에 대한 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "바이오반응기"는 연속 교반 탱크 반응기(Continuous Stirred Tank Reactor: CSTR), 고정화 균체 반응기(Immobilized Cell Reactor: ICR), 삼상층 반응기(Trickle Bed Reactor: TBR), 버블 칼럼, 가스 리프트 발효기, 정적 혼합기, 또는 가스-액체 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함하는, 1개 이상의 용기 및/또는 탑(tower) 또는 배관 배열로 이루어진 발효 장치를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 바이오반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 그러므로, 바이오반응기 또는 발효 반응에 대한 기질의 첨가를 말할 때, 이것은 적절한 경우 이들 반응기 중 하나 또는 둘 다에 대한 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 언급된 바와 같은, "셔틀 미생물(shuttle microorganism)"은 메틸전환효소 효소가 발현되고, 목적 미생물과 구별되는 미생물이다.
본 명세서에 언급된 바와 같은, "목적 미생물(destination microorganism)"은 발현 작제물/벡터에 포함된 유전자가 발현되고, 셔틀 미생물과 구별되는 미생물이다.
"외인성 핵산"은 이것이 도입된 미생물의 외부에 기원하는 핵산이다. 외인성 핵산은 (예를 들어, 재조합 미생물이 유래한 모 미생물에서) 이것이 도입되고자 하는 미생물, 이것이 도입되고자 하는 유기체와 다른 미생물의 균주 또는 종(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 적절한 공급원으로부터 유도될 수 있거나, 이것은 인공적으로 또는 재조합으로 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, 외인성 핵산은 이것이 도입되고자 하는 미생물 내에 천연으로 존재하는 핵산 서열을 나타내고, 이것은 (예를 들어, 발현을 증가시키기 위해 서열(예를 들어, 유전자)의 카피수를 증가시키거나, 강한 또는 구성적 프로모터를 도입함으로써) 특정한 유전자의 발현을 증가시키거나 이를 과발현시키도록 도입된다. 또 다른 실시형태에서, 외인성 핵산은 이것이 도입되고자 하는 미생물 내에 천연으로 존재하지 않는 핵산 서열을 나타내고, 미생물 내에 천연으로 존재하지 않는 생성물의 발현 또는 (예를 들어, 조절 요소, 예컨대 프로모터의 도입의 경우에) 미생물에 네이티브인 유전자의 발현 증가를 허용한다. 외인성 핵산은 이것이 도입되고자 하는 미생물의 게놈으로 혼입되거나 염색체외 상태로 남아 있도록 적합화될 수 있다.
"외인성"은 단백질을 의미하도록 또한 사용될 수 있다. 이것은 재조합 미생물이 유래한 모 미생물에 존재하지 않는 단백질을 의미한다.
재조합 미생물 및 핵산 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "내인성"은 재조합 미생물이 유래한 모 미생물에 존재하는 임의의 핵산 또는 단백질을 의미한다.
산화환원효소(또는 탈수소효소, 산화효소)는 하나의 분자(환원제, 또한 전자 도너라 불림)로부터 또 다른 분자(산화제, 또한 전자 억셉터라 불림)로의 전자의 이동을 촉매화하는 효소를 포함한다. 산화환원효소는 효소의 EC 넘버 분류에서 EC 1로 분류된다.
본 명세서에 구체적으로 예시된 서열로부터 서열이 변하는 핵산(단, 이것이 실질적으로 동일한 기능을 수행함)을 이용하여 본 발명이 실행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 경우, 이것은 코딩된 단백질 또는 펩타이드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열의 경우, 변이체 서열은 1종 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 능력을 가질 것이다. 이러한 핵산은 본 명세서에서 "기능상 동등한 변이체"라 칭해질 수 있다. 예의 방식으로, 핵산의 기능상 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자의 단편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오타이드 치환 등) 및/또는 다형을 포함하는 유전자 및 기타를 포함한다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자는 본 명세서에 구체적으로 예시된 서열의 기능상 동등한 변이체의 예로서 또한 고려될 수 있다. 이것은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이예린키(Clostridium beijerinckii), 씨. 리융다흘리(이의 상세내용은 진뱅크 또는 NCBI와 같은 웹사이트에서 공중에게 이용 가능함)와 같은 종에서의 상동성 유전자를 포함한다. 구절 "기능상 동등한 변이체"는 특정한 유기체에 대한 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변하는 핵산을 포함하는 것으로 또한 취해져야 한다. 본 명세서에서 핵산의 "기능상 동등한 변이체"는 바람직하게는 확인된 핵산과 적어도 대략 70%, 바람직하게는 대략 80%, 더 바람직하게는 대략 85%, 바람직하게는 대략 90%, 바람직하게는 대략 95% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
본 명세서에 구체적으로 언급되거나 예시된 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 서열이 변하는 폴리펩타이드를 이용하여 본 발명이 실행될 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다. 이 변이체는 본 명세서에서 "기능상 동등한 변이체"라 칭해질 수 있다. 단백질 또는 펩타이드의 기능상 동등한 변이체는 확인된 단백질 또는 펩타이드와 적어도 40%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 60%, 바람직하게는 70%, 바람직하게는 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 동일성을 공유하고, 관심 있는 펩타이드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 변이체는 단백질 또는 펩타이드의 단편을 이의 범위 내에 포함하고, 단편은 폴리펩타이드의 절두 형태를 포함하고, 여기서 결실은 1개 내지 5개, 내지 10개, 내지 15개, 내지 20개, 내지 25개의 아미노산일 수 있고, 폴리펩타이드의 어느 말단에서 1개 내지 25개의 잔기로 연장될 수 있고, 결실은 구역 내의 임의의 길이일 수 있거나; 내부 위치에 있을 수 있다. 본 명세서에서 특정한 폴리펩타이드의 기능상 동등한 변이체는 예를 들어 이전 문단에서 예시된 바와 같은 박테리아의 다른 종에서 상동성 유전자에 의해 발현된 폴리펩타이드를 포함하도록 또한 취해져야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 동일한 기능"은 핵산 또는 폴리펩타이드가 이의 변이체인 핵산 또는 폴리펩타이드의 기능을 수행할 수 있다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 효소의 변이체는 그 효소와 동일한 반응을 촉매화할 것이다. 그러나, 변이체가 이의 변이체인 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 수준의 활성을 갖는다는 것을 의미하도록 취해져야 한다.
기능상 동등한 변이체가 당해 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 이의 변이체인 핵산 또는 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 기능을 갖는지를 평가할 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 수소화효소, 폼에이트 탈수소효소 또는 메틸렌-THF-탈수소효소 활성에 대한 시험에 대한 평가는 후앙(Huang) 등의 문헌(2012)에 기재되어 있다.
"과발현시킨다", "과발현" 및 유사한 용어 및 구절은, 본 발명과 관련하여 사용될 때, 동일한 조건 하에 모 미생물의 단백질(핵산 포함)의 발현 수준과 비교하여, 1종 이상의 단백질의 발현(이를 코딩하는 1종 이상의 핵산의 발현 포함)의 임의의 증가를 포함하는 것으로 광범위하게 취해져야 한다. 이것은 단백질(또는 핵산)이 임의의 특정한 수준으로 발현된다는 것을 의미하도록 취해져야 한다.
"재조합 미생물"은 모 미생물과 비교할 때 의도적인 유전자 변형을 겪은 미생물이다. "유전자 변형"은 예를 들어 핵산의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 것으로 광범위하게 취해져야 한다.
"모 미생물"은 본 발명의 재조합 미생물을 생성하도록 사용된 미생물이다. 모 미생물은 자연에서 발생하는 것(즉, 야생형 미생물) 또는 이전에 변형된 것(즉, 이것은 재조합 미생물임)일 수 있다. 본 발명의 재조합 미생물은 모 미생물에서 원하는 수준으로 발현되거나 과발현되지 않는 1종 이상의 효소를 발현시키거나 과발현시키도록 변형될 수 있거나, 1종 이상의 보인자의 이용률 증가를 나타내도록 변형될 수 있다.
용어 핵산 "작제물" 또는 "벡터" 및 유사한 용어는 유전자 물질을 세포로 운반하는 비히클로서 사용하기에 적합한 임의의 핵산(DNA 및 RNA 포함)을 포함하는 것으로 광범위하게 취해져야 한다. 상기 용어는 플라스미드, 바이러스(박테리오파지 포함), 코스미드 및 인공 염색체를 포함하는 것으로 취해져야 한다. 작제물 또는 벡터는 1종 이상의 조절 요소, 복제 기원, 다중클로닝 부위 및/또는 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 특정한 일 실시형태에서, 작제물 또는 벡터는 작제물 또는 벡터에 의해 코딩된 1종 이상의 유전자의 발현을 허용하도록 적합화된다. 핵산 작제물 또는 벡터는 네이키드 핵산, 및 세포에 대한 전달을 촉진하는 1종 이상의 물질과 제제화된 핵산(예를 들어, 리포솜 접합 핵산, 핵산이 함유된 유기체)을 포함한다. 벡터는 재조합 미생물을 생성하기 위해 핵산의 클로닝 또는 발현, 및 미생물의 형질전환에 사용될 수 있다.
발효 경로의 효율은 경로를 통한 반응 플럭스를 증가시킴으로써 증가할 수 있다. 증가한 플럭스는 하기 중 하나 이상을 발생시킨다: 발효에 영향을 미치는 미생물의 성장 속도의 증가; 증가한 생성물 농도에서의 성장 속도 및/또는 생성물 생성 속도의 증가; 발효 브로쓰에서의 발효 생성물 농도의 증가; 소모된 기질의 용적당 생성된 발효 생성물의 용적의 증가; 발효 생성물의 생성 속도 또는 생성 수준의 증가. 바람직하게는, 효율의 증가는 발효 생성물 생성 속도를 증가시킨다.
본 발명자들은 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 확인하는 방법을 입증하였고, 여기서 특정한 경로 반응은 전체 경로를 통한 플럭스에 영향을 미친다. 몇몇 상황에서, 이 속도 제한 경로 반응은 이의 커패시티(capacity)로 수행되지 않고, 이의 개별 속도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명은 발효 경로에서의 속도 제한 경로 반응(즉, 병목)이 확인되게 하고, 속도 제한 경로 반응에 관여하는 효소의 활성 및/또는 보인자의 이용률을 증가시키는 전략이 이용되게 한다. 본 발명은 따라서 병목을 확인하고, 속도 제한 경로 반응의 속도를 조정하여 경로를 통한 반응 플럭스에 수반 효과를 갖게 하는 것에 기여한다. 이는 속도 제한 경로 반응이 확인되고 재조합 일산화탄소영양 미생물을 이용하여 해결된 처음이다.
속도 제한 반응(병목)을 확인하는 일 방법은 기질로부터의 생성물의 발효 경로에 관여된 모든 반응에 대해 효소 활성을 측정하는 것이다. 이는 최저 속도를 갖는 반응을 확인하기 위해 과정 조건 하에 성장하는 세포에서 반응의 효소 활성을 분석함으로써 수행될 수 있다. 이후, 이것은 속도 제한이 아니게 조정될 수 있고, 따라서 시스템을 통한 플럭스를 증가시킨다. 이러한 종류의 경로 분석 및 병목 제거는 클로스트리디아 종에서 결코 수행되지 않았다.
본 명세서에 기재된 방법 및 재조합 미생물은 추가의 생화학 경로가 조사되고 바람직한 발효 생성물이 생성되게 한다. 상기 방법은 모 미생물에서의 생성물 수율이 실행 가능한 표적이기에 생성물 수율이 부족할 수 있거나, 수율이 검출 불가능할 정도로 너무 낮은 경로에 대해 특정한 이용성을 갖는다.
본 발명은 발효 생성물을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 적어도,
a) 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
b) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소, 보인자 또는 둘 다를 확인하는 단계;
c) 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) b)의 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) b)의 1종 이상의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명은 발효 경로를 통한 플럭스를 증가시키는 방법을 또한 제공하고, 상기 방법은, 적어도,
a) 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
b) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소, 보인자 또는 둘 다를 확인하는 단계;
c) 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) b)의 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) b)의 1종 이상의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시키는 단계를 포함한다.
본 발명자들은 발효 경로에 관여하는 효소의 활성을 분석하였고, 몇몇 경로 반응이 동일한 경로에서의 다른 반응보다 실질적으로 더 낮은 효소 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이것은 경로 반응이 발효 경로를 통한 전체 플럭스를 제한한다는 것을 나타내고, 속도 제한 경로 반응을 확인하는 방법을 제공한다.
효소 활성은 당해 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 효소 활성은 후앙 등의 문헌(2012)에 기재된 방법에 의해 측정되고, 실시예 1에 언급되어 있다.
효소 활성의 분석에 변경 가능한 발효 경로의 예는 우드-리융다흘 경로, 에탄올, 2,3-뷰탄다이올 또는 이의 전구체, 예컨대 아세틸-CoA 및 피루베이트를 생성하는 발효 경로, 및 발효 경로에 필요할 수 있는 보인자 테트라하이드로폴레이트 및 코발아민(B12)에 대한 생합성 경로를 포함한다.
우드-리융다흘 경로는 도 1 및 도 2에 기재된 바와 같은 효소에 의해 촉매화된 다수의 반응으로 이루어진다. 바람직한 발효 생성물을 생성시키는 우드-리융다흘 경로에 후속하는 단계는 또한 발효 경로의 일부인 것으로 생각된다.
특정한 실시형태에서, 발효 경로는 에탄올, 뷰탄올, 아세톤, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 2,3-뷰탄다이올, 숙시네이트, 아이소프레노이드, 지방산 및 바이오중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 발효 생성물을 생성시킨다.
일 실시형태에서, 경로 반응 중 하나 이상이 발효 경로를 통한 플럭스의 속도를 제한하는지를 결정하기 위해, 적어도 2개 이상의 개별 경로 반응을 촉매화하는 효소의 효소 활성을 비교한다. 비교 시, 1종 이상의 효소가 동일한 반응 경로에서 다른 효소보다 적은 활성을 나타내는 것으로 밝혀진 경우, 이는 반응이 커패시티로 수행되지 않는다는 것을 나타낸다. 특정한 실시형태에서, 효소의 활성은 경로에서의 다른 효소의 활성보다 5%, 10% 또는 20% 작다. 특정한 실시형태에서, 활성은 69% 미만이다. 또 다른 실시형태에서 활성은 86% 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 활성은 90% 미만이거나, 활성의 차이는 90% 초과이다.
그러므로, 특정한 실시형태에서, 속도 제한 경로 반응은 발효 경로를 구성하는 2개 이상의 경로 반응의 효소 활성을 분석한 후 속도 제한 경로 반응으로서 더 낮은/최저 활성을 갖는 효소를 지정함으로써 결정된다.
효소 활성의 결여는 반응을 촉매화하는 자유 효소의 결여; 경쟁 기질에 의한 효소의 저해 또는 불활성화; 반응을 촉진하는 보인자의 결여 또는 효소 기질의 결여를 포함하는 다수의 인자에 의해 야기될 수 있다.
본 발명은 또한 속도 제한 경로 반응의 문제를 해결하는 방법을 제공한다. 속도 제한 경로 반응에서의 효소 활성의 결핍은 ⅰ) 효소 또는 이의 기능상 동등한 변이체의 활성 또는 ⅱ) 속도 제한 경로 반응에 관여하는 보인자의 이용률의 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 클로스트리디아 미생물을 제공함으로써 해결될 수 있다. 이는 경로를 통한 플럭스의 전체 증가를 발생시킨다.
따라서, 본 발명은 모 미생물에 비해 발효 경로를 통한 플럭스 증가를 나타내도록 적합화된 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
a) 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
b) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소, 보인자 또는 둘 다를 확인하는 단계;
c) 모 미생물을 형질전환시켜, 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) b)의 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) b)의 1종 이상의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 미생물을 생성하는 단계를 포함하되;
발효 경로는 CO를 포함하는 기질로부터 1종 이상의 발효 생성물을 생성할 수 있다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은,
ⅰ) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 과발현;
ⅱ) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 외인성 효소 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능상 동등한 변이체의 발현; 또는
ⅲ) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 1종 이상의 보인자의 이용률 증가
중 적어도 하나를 수행하도록 적합화된다.
이러한 방식으로, 본 발명자들은 발효 경로를 통한 플럭스를 증가시키고 궁극적으로 발효의 효율을 증가시키는 방식으로, ⅰ) 낮은 효소 활성 또는 이의 결여 또는 ⅱ) 보인자의 낮은 이용률 또는 이의 결여 중 적어도 하나를 극복하는 방법을 입증하였다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 1종 이상의 효소는 알콜 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 알데하이드 탈수소효소(아실화)(EC 1.2.1.10), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), 알데하이드 페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.5), 포스포트랜스아세틸라제(EC 2.3.1.8), 아세테이트 키나제(EC 2.7.2.1), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2) 및 수소화효소(EC 1.12.7.2)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이 실시형태의 미생물은 에탄올을 생성시키는 발효 경로를 통한 플럭스 증가를 나타내도록 적합화된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 1종 이상의 효소는 피루베이트:페레독신 산화환원효소(피루베이트 생성효소)(EC 1.2.7.1), 피루베이트:폼에이트 분해효소(EC 2.3.1.54), 아세토락테이트 생성효소(EC 2.2.1.6), 아세토락테이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.5), 2,3-뷰탄다이올 탈수소효소(EC 1.1.1.4), 1차:2차 알콜 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2) 및 수소화효소(EC 1.12.7.2)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이 실시형태의 미생물은 2,3-뷰탄다이올을 생성시키는 발효 경로를 통한 플럭스 증가를 나타내도록 적합화된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 외인성 핵산을 발현시키거나, 내인성 핵산을 과발현시키도록 적합화되고, 상기 핵산은 효소 또는 이의 기능상 동등한 변이체를 코딩하거나, 보인자의 생합성에 관여하고, 상기 효소 또는 보인자는 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여한다.
본 발명에서 사용하기 위한 재조합 미생물을 생성하는 방법은 이하 기재되어 있다.
상기 기재된 효소를 코딩하는 핵산은 당해 분야의 당업자에게 공지될 것이고, 유전자 정보 데이터베이스, 예컨대 NCBI, KEGG, 유니프로트(UniProt)를 이용하여 용이하게 확인될 수 있다.
본 발명자들은 보인자 이용률의 증가가 발효 경로를 통한 전체 플럭스에 대한 효과를 갖는다는 것을 놀랍게도 또한 밝혀냈다. 이러한 경우에, 발효 경로 또는 이 발효 경로 내의 반응은 소정의 보인자의 이용률에 의존하고 이에 의해 제한될 수 있다. 반응에서의 사용에 이용 가능한 보인자의 풀(pool)은 이 보인자의 생합성 경로에 관여하는 단백질 및 유전자의 발현을 변경함으로써 증가할 수 있다. 보인자 이용률의 증가의 결과로서, 이 보인자에 의존하는 반응이 더 이상 제한되지 않는다.
특정한 실시형태에서, 보인자는 테트라하이드로폴레이트를 포함한다. 상기 기재된 바대로, 이러한 보인자의 생합성에 관여하는 효소는, 바람직하게는 효소를 코딩하는 상응하는 유전자를 발현시키거나 과발현시킴으로써, 과발현될 수 있다. 테트라하이드로폴레이트의 생합성에 관여하는 효소는 하기 기재되어 있다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 GTP 사이클로가수분해효소 I(EC 3.5.4.16), 알칼리 포스파타제(EC 3.1.3.1), 다이하이드로네오프테린 알돌라제(EC 4.1.2.25), 2-아미노-4-하이드록시-6-하이드록시메틸다이하이드로프테리딘 다이포스포키나제(EC 2.7.6.3), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(2.5.1.15), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(EC 2.5.1.15), 다이하이드로폴레이트 생성효소(EC 6.3.2.12), 폴릴폴리글루타메이트 생성효소(6.3.2.17), 다이하이드로폴레이트 환원효소(EC 1.5.1.3), 티미딜레이트 생성효소(EC 2.1.1.45), 다이하이드로모나프테린 환원효소(EC 1.5.1.-)의 발현 증가를 나타낸다. 모두 thf에 관여한다.
특정한 실시형태에서, 보인자는 코발아민(B12)을 포함한다. 코발아민의 생합성에 관여하는 효소가 하기 기재되어 있다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 5-아미노레뷸리네이트 생성효소(EC 2.3.1.37), 5-아미노레뷸리네이트:피루베이트 아미노전환효소(EC　2.6.1.43), 아데노실코빈아마이드 키나제/아데노실코빈아마이드-포스페이트 구아닐릴전환효소(EC 2.7.1.156/2.7.7.62), 아데노실코빈아마이드-GDP 리바졸전환효소(EC 2.7.8.26), 아데노실코빈아마이드-포스페이트 생성효소(EC 6.3.1.10), 아데노실코브르산 생성효소(EC 6.3.5.10), 알파-리바졸 포스파타제(EC 3.1.3.73), 코브(I)알라민 아데노실전환효소(EC 2.5.1.17), 코브(II)인산 a,c-다이아마이드 환원효소(EC 1.16.8.1), 코발트-프레코린 5A 가수분해효소(EC 3.7.1.12), 코발트-프레코린-5B (C1)-메틸전환효소(EC 2.1.1.195), 코발트-프레코린-7 (C15)-메틸전환효소(EC 2.1.1.196), 코발토킬레타제 CobN(EC 6.6.1.2), 코비린산 a,c-다이아마이드 생성효소(EC 6.3.5.9/6.3.5.11), 페리틴(EC 1.16.3.1), 글루타메이트-1-세미알데하이드 2,1-아미노뮤타제(EC 5.4.3.8), 글루타밀-tRNA 환원효소(EC 1.2.1.70), 글루타밀-tRNA 합성효소(EC 6.1.1.17), 하이드록시메틸빌란 생성효소(EC 2.5.1.61), 니코티네이트-뉴클레오타이드-다이메틸벤즈이미다졸 포스포리보실전환효소(EC 2.4.2.21), 산소-독립적 코프로포르피리노겐 III 산화효소(EC 1.3.99.22), 포르포빌리노겐 생성효소(EC 4.2.1.24), 프레코린-2 탈수소효소/시로하이드로클로린 페로킬레타제(EC 1.3.1.76/4.99.1.4), 프레코린-2/코발트-2 인자 C20-메틸전환효소(EC 2.1.1.130/2.1.1.151), 프레코린-3B 생성효소(EC 1.14.13.83), 프레코린-3B C17-메틸전환효소(EC 2.1.1.131), 프레코린-4 C11-메틸전환효소(EC 2.1.1.133), 프레코린-6X 환원효소(EC 1.3.1.54), 프레코린-6Y C5,15-메틸전환효소(EC 2.1.1.132), 프레코린-8W 탈탄산효소(EC 1.-.-.-), 프레코린-8X 메틸뮤타제(EC 5.4.1.2), 시로하이드로클로린 코발토킬레타제(EC 4.99.1.3), 트레오닌-포스페이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.81), 유로포르피리노겐 탈탄산효소(EC 4.1.1.37), 유로포르피리노겐 III 메틸전환효소/생성효소(EC 2.1.1.107/4.2.1.75)의 발현 증가를 나타낸다.
상기 언급된 단백질을 코딩하는 생합성 유전자는 당해 분야의 당업자에게 공지될 것이고, 유전자 정보 데이터베이스를 이용하여 용이하게 확인될 수 있다.
이론에 구속되고자 함이 없이, 보인자의 이용률의 증가는 상기 보인자의 생합성 경로에 관여하는 효소 또는 유전자의 과발현을 통해 달성되는 것으로 생각된다. 그 결과, 이 보인자에 의존하는 반응이 더 이상 제한되지 않는다.
더 높은 활성을 달성하는 효소의 변형
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 속도 제한 경로 반응을 촉매화할 수 있는 효소의 효소 활성을 증가시키기 위한 효소 조작을 겪는다. 효소 조작은 1종 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및 치환(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 효소 활성 증가를 달성하기 위한 적합한 방법은 예의 방식이 아니게 당해 분야의 당업자에게 공지될 것이고, 효소 조작의 방법은 유도 진화, 설계에 기초한 지식, 무작위 돌연변이유발 방법, 유전자 셔플링, 코돈 최적화, 부위-특이적 라이브러리의 이용 및 부위 평가 라이브러리의 이용으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
재조합 미생물
본 발명은 추가의 양상에서 상기 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물을 제공하고, 재조합 미생물은 모 미생물에 비해 발효 경로를 통한 플럭스 증가를 나타내도록 적합화된다.
특정한 실시형태에서, 효소의 발현 증가 및/또는 보인자의 이용률 증가는 상기 효소를 코딩하거나 상기 보인자의 생합성에 관여하는 핵산의 발현 및/또는 과발현에 의해 실행된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 반응 경로를 통한 플럭스를 증가시키기 위한, 본 발명의 미생물의 용도를 제공한다.
본 발명의 특정한 일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 클로스트리듐 리융다흘리, 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum)을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 씨. 리융다흘리, 및 "씨. 라그스달레이"의 종 및 관련 단리물을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 클러스터로부터 선택된다. 이것은 균주 클로스트리듐 아우토에타노게늄 JAI-1T(DSM10061)(Abrini et al., 1994), 클로스트리듐 아우토에타노게늄 LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200), 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 클로스트리듐 리융다흘리 PETCT(DSM13528 = ATCC 55383)(Tanner et al., 1993), 클로스트리듐 리융다흘리 ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 제5,593,886호), 클로스트리듐 리융다흘리 C-01(ATCC 55988)(미국 특허 제6,368,819호), 클로스트리듐 리융다흘리 O-52(ATCC 55989)(미국 특허 제6,368,819호), 또는 "클로스트리듐 라그스달레이 P11T"(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055), 및 관련 단리물, 예컨대 "클로스트리듐 코스카티(C. coskatii)"(미국 특허 제2011/0229947호) 또는 "클로스트리듐 종 MT351"(Tyurin & Kiriukhin, 2012) 및 이의 돌연변이체 균주, 예컨대 클로스트리듐 리융다흘리 OTA-1(Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이들 균주는, DNA-DNA 재회합 및 DNA 핑거프린팅 실험에 의해 결정된 명확한 종이지만(WO 2008/028055, 미국 특허 제2011/0229947호), 16S rRNA 유전자 수준에서 적어도 99%의 동일성을 갖는 클로스트리디아 rRNA 클러스터 I(Collins et al., 1994) 내에 하위클러스터를 형성한다.
이 클러스터의 균주는 유사한 유전자형 및 표현형 둘 다를 갖는 일반 특징에 의해 정의되고, 이들은 모두 에너지 보전 및 발효 대사의 동일한 방식을 공유한다. 이 클러스터의 균주는 시토크롬이 결여되고, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보전한다.
이 클러스터의 모든 균주는 대략 4.2MBp의 게놈 크기(Kopke et al., 2010) 및 대략 32몰%의 GC 조성(Tanner et al., 1993; Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2010)(WO 2008/028055; 미국 특허 제2011/0229947호), 및 우드-리융다흘 경로의 효소(일산화탄소 탈수소효소, 폼일-테트라하이드로폴레이트 합성효소, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 탈수소효소, 폼일-테트라하이드로폴레이트 사이클로가수분해효소, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 환원효소 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소), 수소화효소, 폼에이트 탈수소효소, Rnf 복합체(rnfCDGEAB), 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 알데하이드:페레독신 산화환원효소(Kopke et al., 2010, 2011)를 코딩하는 보존된 필수적인 중요한 유전자 오페론을 갖는다. 가스 흡수를 책임지는 우드-리융다흘 경로 유전자의 조직 및 수는 핵산 및 아미노산 서열의 차이에도 불구하고 모든 종에서 동일한 것으로 밝혀졌다(Kopke et al., 2011).
균주는 모두 유사한 형태학 및 크기(로그 성장 세포는 0.5-0.7 x 3-5㎛임)를 갖고, 중온성(최적 성장 온도는 30-37℃임)이고, 엄격히 혐기균이다(Tanner et al., 1993; Abrini et al., 1994)(WO 2008/028055). 더욱이, 이들은 모두 동일한 주요 계통발생 특질, 예컨대 동일한 pH 범위(pH 4-7.5, 5.5-6의 최적 초기 pH를 가짐), 유사한 성장 속도를 갖는 CO 함유 가스에서의 강한 독립영양 성장, 및 주요 발효 최종 생성물로서의 에탄올 및 아세트산을 갖고, 소정의 조건 하에 형성된 소량의 2,3-뷰탄다이올 및 락트산을 갖는 대사 프로필(Tanner et al., 1993; Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2011)(WO 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘), 또는 다른 기질(예를 들어, 베타인, 뷰탄올)의 기질 이용이 다르다)을 공유한다. 몇몇 종은 소정의 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대해 영양요구주이지만, 다른 것은 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 상응하는 알콜로의 카복실산의 환원이 이 유기체의 범위에서 밝혀졌다(Perez et al., 2012).
따라서, 기재된 특질은 클로스트리듐 아우토에타노게늄 또는 클로스트리듐 리융다흘리와 같은 하나의 유기체에 특이적인 것이 아니고, 오히려 일산화탄소영양, 에탄올 합성 클로스트리디아에 대한 일반적인 특질이다. 따라서, 본 발명은 이들 균주에 걸쳐 작용하는 것으로 예상될 수 있지만, 이들은 성능이 다를 수 있다.
소정의 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 클로스트리듐 리융다흘리 및 클로스트리듐 라그스달레이를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 상기 군은 또한 클로스트리듐 코스카티를 포함한다. 특정한 일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게늄이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 효소를 발현하거나 보인자의 이용률을 증가시키도록 적합화된 재조합 미생물을 제공하고, 여기서 효소 발현 또는 보인자 이용률은 핵산의 발현에 의존한다. 재조합 미생물은 또한 효소의 발현 및/또는 보인자의 이용률을 증가시키도록 적합화된 핵산 작제물 또는 벡터를 발현시킬 수 있다. 특정한 일 실시형태에서, 핵산 작제물 또는 벡터는 발현 작제물 또는 벡터이지만, 다른 작제물 및 벡터, 예컨대 클로닝에 사용된 것이 본 발명에 의해 포함된다. 특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물 또는 벡터는 플라스미드이다.
본 발명의 발현 작제물/벡터가 프로모터 이외에 임의의 수의 조절 요소, 및 원하는 경우 추가의 단백질의 발현에 적합한 추가의 유전자를 함유할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 1개의 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 2개 이상의 프로모터를 포함한다. 특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 발현시키고자 하는 각각의 유전자에 대한 1개의 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 1개 이상의 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 발현시키고자 하는 각각의 유전자에 대한 리보솜 결합 부위를 포함한다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열 및 작제물/벡터 서열이 표준 링커 뉴클레오타이드, 예컨대 리보솜 결합 부위 및/또는 제한 부위에 필요한 것을 함유할 수 있다는 것이 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 링커 서열은 필요한 것으로서 해석되지 않아야 하고, 한정된 서열에 제한을 제공하지 않는다.
본 발명의 발현 작제물/벡터를 포함하는, 핵산 및 핵산 작제물은 당해 분야의 임의의 수의 기법 표준을 이용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 화학 합성 또는 재조합 기법이 이용될 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌(Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기재되어 있다. 본질적으로, 개별 유전자 및 조절 요소는 서로에 작동적으로 연결되어서, 유전자는 원하는 단백질을 형성하도록 발현될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 벡터는 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 그러나, 예의 방식으로, 하기 벡터가 적합할 수 있다: pMTL80000 벡터, pIMP1, pJIR750, 및 이하 본 명세서에서 실시예 부문에 예시된 플라스미드.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산이 RNA, DNA, 또는 cDNA를 포함하는 임의의 적절한 형태일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
재조합 미생물을 생성하는 방법
모 미생물의 유전자 변형의 방법은 분자 방법, 예컨대 이종성 유전자 발현, 게놈 삽입 또는 결실, 변경된 유전자 발현 또는 유전자의 불활성화, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소 조작 방법을 포함한다. 이러한 기법은 예를 들어 샘브룩 등의 문헌(Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001), Pleiss, (2011), 파크, 에스(Park, S.) 및 크로찬, 제이.알.(Crochan, J.R.)의 문헌(2010, Protein engineering and design, CRC Press, ISBN 1420076582)에 기재되어 있다.
1종 이상의 외인성 핵산은 네이키드 핵산으로서 모 미생물에 전달될 수 있거나, 형질전환 과정을 촉진하는 1종 이상의 물질(예를 들어, 리포솜 접합 핵산, 핵산이 함유된 유기체)과 제제화될 수 있다. 1종 이상의 핵산은 적절한 경우 DNA, RNA, 또는 이들의 조합일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 제한 저해제가 이용될 수 있고; 예를 들어 문헌[Murray, N.E. et al . (2000) Microbial . Molec . Biol . Rev. 64, 412)]을 참조한다.
본 발명의 미생물은 재조합 미생물을 생성하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 수의 기법을 이용하여 모 미생물 및 1종 이상의 외인성 핵산으로부터 제조될 수 있다. 오직 예의 방식으로, 형질전환(형질유도 또는 형질감염 포함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글라이콜 매개 형질전환, 화학 또는 천연 능력, 원형질체 형질전환, 프로파지 유도 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 적합한 형질전환 기법은 예를 들어 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 기재되어 있다.
전기천공은 클로스트리듐 리융다흘리(Kopke et al. 2010, Poc . Nat. Acad . Sci . U.S.A. 107: 13087-92; (Leang et al., 2011) PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), 클로스트리듐 아우토에타노게늄(PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), 아세토박테리아 우디(Acetobacterium woodii)(Straetz et al., 1994, Appl . Environ . Microbiol. 60:1033-37) 또는 모렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica)(Kita et al., 2012)로서의 몇몇 일산화탄소영양 아세트산생성균에 대해 기재되어 있고, 많은 클로스트리디아, 예컨대 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Mermelstein et al., 1992, Biotechnology, 10, 190-195), 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰(C. cellulolyticum)(Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 3071-3080) 또는 클로스트리듐 써모셀륨(C. thermocellum)(Tyurin et al., 2004, Appl . Environ . Microbiol . 70: 883-890)에서 사용되는 표준 방법이다. 프로파지 유도는 클로스트리듐 스카톨로게네스의 경우에 일산화탄소영양 아세트산생성균에 대해 또한 입증되었지만(Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University), 접합은 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)(Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol . Lett . 229: 103-110) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Williams et al., 1990, J. Gen . Microbiol . 136: 819-826)을 포함하는 많은 클로스트리디아에 대한 선택의 방법으로서 기재되어 있고, 일산화탄소영양 아세트산생성균에 대해 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 형질전환시키고자 하는 미생물에서 활성인 제한 시스템으로 인해, 미생물로 도입하고자 하는 핵산을 메틸화하는 것이 필요하다. 이는 하기 기재된 것을 포함하는 다양한 기법을 이용하여 수행될 수 있다.
예의 방식으로, 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다:
(ⅰ) 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 발현 작제물/벡터 및 (ⅱ) 메틸전환효소 유전자를 포함하는 메틸화 작제물/벡터의, 셔틀 미생물로의 도입;
메틸전환효소 유전자의 발현; 셔틀 미생물로부터의 1종 이상의 작제물/벡터의 단리; 및 목적 미생물로의 1종 이상의 작제물/벡터의 도입.
일 실시형태에서, 단계 B의 메틸전환효소 유전자는 구성적으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, 단계 B의 메틸전환효소 유전자의 발현이 유도된다.
셔틀 미생물은 미생물, 바람직하게는 발현 작제물/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 촉진하는 제한 음성 미생물이다. 특정한 실시형태에서, 셔틀 미생물은 제한 음성 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)이다.
메틸화 작제물/벡터는 메틸전환효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 셔틀 미생물로 도입되면, 메틸화 작제물/벡터에 존재하는 메틸전환효소 유전자가 유도된다. 유도는 임의의 적합한 프로모터 시스템에 의할 수 있지만, 본 발명의 특정한 일 실시형태에서, 메틸화 작제물/벡터는 유도성 lac 프로모터를 포함하고, 락토스 또는 이의 유사체, 더 바람직하게는 아이소프로필-β-D-티오-갈락토사이드(IPTG)의 첨가에 의해 유도된다. 다른 적합한 프로모터는 ara, tet, 또는 T7 시스템을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시형태에서, 메틸화 작제물/벡터 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정한 실시형태에서, 메틸화 작제물/벡터는 셔틀 미생물의 정체에 특이적인 복제 기원을 가져서, 메틸화 작제물/벡터에 존재하는 임의의 유전자는 셔틀 미생물에서 발현된다. 바람직하게는, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물의 정체에 특이적인 복제 기원을 가져서, 발현 작제물/벡터에 존재하는 임의의 유전자는 목적 미생물에서 발현된다.
메틸전환효소 효소의 발현은 발현 작제물/벡터에 존재하는 유전자를 메틸화시킨다. 이후, 발현 작제물/벡터는 다수의 공지된 방법 중 임의의 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 오직 예의 방식으로, 이후 기재된 실시예 부문에 기재된 방법론은 발현 작제물/벡터를 단리시키도록 이용될 수 있다.
특정한 일 실시형태에서, 작제물/벡터 둘 다는 동시에 단리된다.
발현 작제물/벡터는 임의의 수의 공지된 방법을 이용하여 목적 미생물로 도입될 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 이후 기재된 실시예 부문에 기재된 방법론이 이용될 수 있다. 발현 작제물/벡터가 메틸화되므로, 발현 작제물/벡터에 존재하는 핵산 서열은 목적 미생물로 혼입되고 성공적으로 발현될 수 있다.
메틸전환효소 유전자가 셔틀 미생물로 도입되고 과발현될 수 있는 것으로 고안된다. 따라서, 일 실시형태에서, 생성된 메틸전환효소 효소는 공지된 방법을 이용하여 수집될 수 있고, 발현 플라스미드를 메틸화하기 위해 실험실내 이용될 수 있다. 이후, 발현 작제물/벡터는 발현을 위해 목적 미생물로 도입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 메틸전환효소 유전자가 셔틀 미생물의 게놈으로 도입된 후, 발현 작제물/벡터가 셔틀 미생물로 도입되고, 셔틀 미생물로부터 1종 이상의 작제물/벡터가 단리되고, 이후 발현 작제물/벡터가 목적 미생물로 도입된다.
상기 규정된 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 물질의 조성물을 제공하기 위해 조합될 수 있는 것으로 고안된다. 이러한 조성물은 본 발명의 재조합 미생물을 생성하기 위한 제한 장벽 메커니즘을 피하는 것에 있어서 특정한 이용성을 갖는다.
특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터는 플라스미드이다.
당해 분야의 당업자는 본 발명의 미생물을 생성하는 데 있어서 사용하기 위한 다수의 적합한 메틸전환효소를 이해할 것이다. 그러나, 예의 방식으로, 이후 실시예에 기재된 바실러스 서브틸리스 파지 ΦT1 메틸전환효소 및 메틸전환효소를 이용할 수 있다. 일 실시형태에서, 메틸전환효소는 WO/2012/053905에 기재되어 있다.
메틸전환효소 유전자의 발현을 허용하도록 적합화된 임의의 수의 작제물/벡터는 메틸화 작제물/벡터를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 이후 실시예 부문에 기재된 플라스미드를 이용할 수 있다.
생성 방법
상기 기재된 바대로, 본 발명은 또한 CO를 포함하는 기질의 발효에 의한 1종 이상의 생성물의 생성을 위한 방법을 제공한다.
특정한 실시형태에서, CO를 포함하는 기질은 CO를 포함하는 가스 기질이다. 임의의 상기 양상의 특정한 실시형태에서, 기질은 통상적으로 주된 비율의 CO, 예컨대 적어도 약 20용적% 내지 약 100용적%의 CO, 20용적% 내지 70용적%의 CO, 30용적% 내지 60용적%의 CO, 및 40용적% 내지 55용적%의 CO를 함유할 것이다. 특정한 실시형태에서, 기질은 약 25용적%, 또는 약 30용적%, 또는 약 35용적%, 또는 약 40용적%, 또는 약 45용적%, 또는 약 50용적%의 CO, 또는 약 55용적%의 CO, 또는 약 60용적%의 CO를 포함한다.
가스 기질은 산업 공정의 부산물로서의, 또는 몇몇 다른 공급원, 예컨대 자동차 배기 가스로부터 얻어진 CO-함유 폐가스일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 산업 공정은 철강 금속 제품 제조, 예컨대 제강소, 비철강 제품 제조, 석유 정련 공정, 석탄의 기화, 전력 생성, 카본 블랙 생성, 암모니아 생성, 메탄올 생성 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시형태에서, CO-함유 가스는 임의의 편리한 방법을 이용하여 대기로 방출되기 전에 산업 공정으로부터 포획될 수 있다. CO는 합성가스의 성분(일산화탄소 및 수소를 포함하는 가스)일 수 있다. 산업 공정으로부터 생성된 CO는 보통 점화되어 CO2를 생성하고, 따라서 본 발명은 CO2 온실 가스 방출을 감소시키고 바이오연료를 생성하는 데 있어서 특정한 이용성을 갖는다. CO-함유 가스 기질의 조성에 따라, 임의의 원치 않는 불순물, 예컨대 먼지 입자를 발효로 도입하기 전에 이 불순물을 제거하도록 이것을 처리하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 가스 기질은 공지된 방법을 이용하여 여과되거나 스크러빙될 수 있다.
박테리아의 성장 및 생성물의 생성이 발생하도록, CO-함유 기질 가스 이외에, 적합한 액체 영양소 배지가 바이오반응기로 공급될 필요가 있는 것으로 이해될 것이다.
방법 양상의 특정한 실시형태에서, 발효는 수성 배양 배지에서 발생한다. 방법 양상의 특정한 실시형태에서, 기질의 발효는 바이오반응기에서 발생한다.
기질 및 배지는 연속, 뱃지 또는 유가 방식으로 바이오반응기로 공급될 수 있다. 영양소 배지는 사용된 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 비타민 및 미네랄을 함유할 것이다. CO를 이용한 발효에 적합한 혐기성 배지가 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 배지는 비에벨(Biebel)의 문헌(2001)에 기재되어 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 배지는 이후 실시예 부문에 기재되어 있다.
발효는 바람직하게는 발효 생성물의 생성이 발생하는 적절한 발효 조건 하에 수행되어야 한다. 고려해야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종 수준, 액상에서의 CO가 제한이 되지 않는다는 것을 보장하는 최대 가스 기질 농도, 및 생성물 저해를 피하는 최대 생성물 농도를 포함한다.
또한, 기질 스트림의 CO 농도(또는 가스 기질에서의 CO 분압)를 증가시키고 따라서 CO가 기질인 발효 반응의 효율을 증가시키는 것이 대개 바람직하다. 증가한 압력에서의 조작은 기상으로부터 액상으로의 CO 운반의 속도의 상당한 증가를 허용하고, 이 액상에서 이것은 발효의 생성을 위해 탄소원으로서 미생물에 의해 흡수될 수 있다. 이는 결국 바이오반응기가 대기압보다는 승압에서 유지될 때 보유 시간(입력 가스 유속으로 나눈 바이오반응기의 액체 용적으로 정의됨)이 감소할 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 사용된 본 발명의 특정한 미생물에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로, 발효가 상압보다 높은 압력에서 수행되는 것이 바람직하다. 또한, 소정의 CO 전환 속도가 부분적으로 기질 보유 시간의 함수이고, 원하는 보유 시간의 달성이 결국 바이오반응기의 필요한 용적을 지시하므로, 가압 시스템의 사용은 필요한 바이오반응기의 용적 및 결과적으로 발효 설비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. 미국 특허 제5,593,886호에 제공된 실시예에 따르면, 반응기 용적은 반응기 조작 압력의 증가에 선형 비례로 감소할 수 있고, 즉 10기압의 압력에서 조작되는 바이오반응기가 1기압의 압력에서 조작되는 것의 용적의 오직 1/10일 필요가 있다.
예의 방식으로, 승압에서의 에탄올로의 가스 발효를 수행하는 것의 이점이 기재되어 있다. 예를 들어, WO 02/08438은 각각 150g/ℓ/일 및 369g/ℓ/일의 에탄올 생산성을 제공하는 30psig 및 75psig의 압력 하에 수행되는 에탄올로의 가스 발효를 기술한다. 그러나, 대기압에서의 유사한 배지 및 유입 가스 조성물을 이용하여 수행된 예시적인 발효는 매일 1리터당 10배 내지 20배 적은 에탄올을 생성하는 것으로 밝혀졌다.
CO-함유 가스 기질의 도입의 속도가 액상에서의 CO의 농도가 제한이 되지 않는다는 것을 보장하는 것이 또한 바람직하다. CO-제한 조건의 결과가 배양에 의해 1종 이상의 생성물이 소모된다는 것일 수 있기 때문이다.
발효 반응을 공급하기 위해 사용되는 가스 스트림의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, O2는 혐기성 발효 과정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전 또는 후의 발효 과정의 단계에서의 원치않거나 불필요한 가스의 공정처리는 이러한 단계에 부담을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 여기서 가스 스트림은 바이오반응기에 진입하기 전에 압축되고, 발효에 필요하지 않은 가스를 압축하도록 불필요한 에너지가 이용될 수 있다). 따라서, 기질 스트림, 특히 산업 공급원으로부터 유도된 기질 스트림을 처리하는 것, 원치 않는 성분을 제거하고 바람직한 성분의 농도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 박테리아의 배양은 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,173,429호 및 제5,593,886호 및 WO 02/08438에 기재되어 있고, 이후 실시예 부문에 기재되어 있다.
또한, 활성탄으로의 아세트산의 흡착을 증대시키기 위해 브로쓰의 pH가 상기 기재된 바대로 조정되는 경우, pH는 바이오반응기로 복귀하기 전에 발효 바이오반응기에서의 브로쓰와 유사한 pH로 재조정되어야 한다.
실시예
실시예 1 - 병목의 확인
효소 검정을 이용하여 병목에 대해 에탄올 및 2,3-뷰탄다이올의 생성에 대한 일산화탄소영양 박테리아, 예컨대 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 클로스트리듐 리융다흘리 또는 클로스트리듐 라그스달레이의 발효 경로를 분석하였다. 이를 위해, 산화환원효소 반응이 특히 적합한 데, 왜냐하면 이것이 환원 또는 산화가 측정될 수 있는 1종 이상의 보인자와 커플링되기 때문이다. 이 목적에 합성 산화환원 염료, 예컨대 메틸비올로겐 또는 벤질비올로겐을 또한 사용할 수 있다.
우드-리융다흘 경로 및 에탄올 및 2,3-뷰탄다이올에 대한 발효 경로의 산화환원효소 효소 단계를 이의 활성을 결정하기 위해 평가하였다. 이들 경로에서의 효소는 CO, CO2, 및 H2 가스의 흡수 및 이용을 포함하는 독립영양 성장, 및 생성물 형성에 관여한다.
평가된 효소 및 이의 활성이 도 1에 기재되어 있다. 메틸 비올로겐(MV) 또는 벤질 비올로겐(BV)인 대조군으로서의 합성 산화환원 염료를 사용하여 수행된 모든 검정을 시험하였다. 보인자 페레독신(Fd), NADH 및 NADPH 또는 이들의 조합을 하기 기재한 바대로 시험하였다. CO 및 수소에 독립영양으로 성장하는 하기 기재한 바와 같은 발효로부터의 미정제 추출물을 사용하여 효소 검정을 수행하였다:
발효
클로스트리듐 아우토에타노게늄에 의한 발효를 1.5ℓ의 바이오반응기 내에서 하기 기재된 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 CO-함유 제강소 가스 및 37℃에서 수행하였다. 1리터당 MgCl, CaCl2(0.5mM), KCl(2mM), H3PO4(5mM), Fe(100μM), Ni, Zn(5μM), Mn, B, W, Mo, Se(2μM)를 함유하는 발효 배지를 배양 성장에 사용하였다. 배지를 바이오반응기로 옮기고, 45분 동안 121℃에서 오토클레이빙하였다. 오토클레이빙 후, 배지를 티아민, 판토테네이트(0.05㎎), 비오틴(0.02㎎)으로 보충하고, 3mM 시스테인-HCl에 의해 환원시켰다. 혐기성을 달성하기 위해, 반응기 용기를 0.2㎛ 필터를 통해 질소로 스파징하였다. 접종 전에, 가스를 반응기에 연속하여 공급하면서 CO-함유 제강소 가스로 전환하였다. 공급 가스 조성은 2%의 H2, 42%의 CO, 20%의 CO2 및 36% N2이다. 배양물의 pH를 5 내지 5.2로 유지시켰다.
세포의 수확
세포를 수확 시(3.9g의 세포/발효 브로쓰(ℓ)의 바이오매스), 가스 소비는 5몰의 CO ℓ-1일-1 및 10밀리몰의 H2 ℓ-1일-1이고, 하기 대사물질이 생성되었다: 14g ℓ-1일-1의 아세테이트 및 19.5g ℓ-1일-1의 에탄올. 배양물의 pH를 K2CO3에 의해 pH 6으로 조정하고, 반응기를 얼음-물 욕 내에서 차갑게 하였다. 대략 1.2ℓ의 배양물을 얼음에서 수집하였다. 배양물을 2개의 1ℓ 원심분리 병 사이에 분할하고(이것 및 모든 후속 단계를 혐기성 챔버 내에서 수행하여, 무산소성 조건을 보장하여 효소의 불활성화를 피함), 세포를 5000rpm에서 10분 동안 펠렛화하였다. 상청액을 경사 여과시키고, 잔류 액체를 제거하였다. 각각의 펠렛을 대략 30㎖의 50mM KPO4(pH 7.0)와 10mM DTT 중에 재현탁시켰다. 재현탁물을 미리 중량 측정된 50㎖의 팔콘 관으로 옮기고, 세포를 15분 동안 최대 속도(5000g)로 재펠렛화하였다. 관을 혐기성 챔버로부터 제거하고, 평가 전에 액체 N2에서 즉시 냉동시켰다.
미정제 세포 추출물의 제조 및 효소 검정
세포를 무산소성 조건 하에 연속 반응기로부터 수확하였다. 이것을 후앙 등의 문헌(2012)에 의해 기재된 바대로 프렌치 프레스(French press)를 통해 3회 통과시켜 파괴시켰다. 파괴되지 않은 세포 및 세포 부스러기를 20,000 x g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 효소 검정에 상청액을 사용하였다. 표시된 것을 제외하고는, 모든 검정을 후앙 등의 문헌(2012)에 의해 기재된 바대로 1.2 x 105Pa에서 0.8㎖의 반응 혼합물 및 0.7㎖의 N2 또는 H2 또는 CO가 충전된 고무 스톱퍼로 밀폐된 1.5㎖의 혐기성 큐벳 내에서 37℃에서 수행하였다. 효소를 하기 기재된 바대로 또는 후앙 등의 문헌(2012)에 의해 기재된 바대로 평가할 수 있다. 효소에 의한 반응의 시작 후, NAD(P)+ 또는 NAD+의 환원을 340㎚(ε = 6.2mM-1㎝-1) 또는 380㎚(ε = 1.2mM-1㎝-1)에서, 클로스트리듐 파스테우리아눔(C. pasteurianum) 페레독신 환원을 430㎚(εΔ ox - red ≒ 13.1mM-1㎝-1)에서, 메틸 비올로겐 환원을 578㎚(ε = 9.8mM-1㎝-1)에서, 벤질 비올로겐 환원을 578㎚(ε = 8.6mM-1㎝- 1)에서 분광광도법으로 모니터링하였다.
100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 2mM DTT 및 약 30μM 페레독신 및/또는 1mM NAD+ 또는 1mM NADP+를 함유하는 검정 혼합물을 사용하여 CO 탈수소효소를 측정하였다. 기상은 100%의 CO이다.
100mM 트리스/HCl(pH 7.5) 또는 100mM 인산칼륨, 2mM DTT 및 25μM 페레독신 및/또는 1mM NADP+ 및/또는 10mM 메틸 비올로겐의 검정 혼합물을 사용하여 수소화효소 활성을 측정하였다. 기상은 100%의 H2이다.
100mM 인산칼륨, 2mM DTT 및 30mM [14C]K2CO3(24,000dpm/μmol)을 함유하는 검정 혼합물에 의해 폼에이트로의 H2에 의한 CO2의 환원에 대한 폼에이트-수소 분해효소 활성을 측정하였다. 기상은 100%의 H2이다. 혈청 병을 200rpm에서 연속하여 진탕시켜서 기상과 액상의 평형을 보장하였다. 효소에 의한 반응의 시작 후, 100㎕의 액체 샘플을 1.5분마다 인출하고, 100㎕의 150mM 아세트산을 함유하는 1.5㎖의 안전한 시일 마이크로 관에 첨가하여 산성화에 의한 반응을 중지시켰다. 이후, 200㎕의 혼합물을 형성된 14C-폼에이트 뒤에 남은 모든 14CO2를 제거하기 위해 열혼합기(Thermomixer) 내에서 1,400rpm에서 진탕시키면서 40℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 후속하여, 100㎕의 혼합물을 5㎖의 퀵세이브 에이(Quicksave A) 섬광 유체(Zinsser Analytic, 독일 프랑크푸르트)에 첨가하고, 벡만(Beckman) LS6500 액체 섬광 계수기(캘리포니아주 플러톤) 내에서 14C 방사능에 대해 분석하였다.
100mM 트리스/HCl(pH 7.5) 또는 100mM 인산칼륨, 2mM DTT, 20mM 폼에이트 및, 표시된 바대로, 25μM 페레독신, 1mM NADP+, 1mM NAD+ 및/또는 10mM 메틸 비올로겐를 함유하는 검정 혼합물에 의해 폼에이트 탈수소효소 측정을 수행하였다. 기상은 100%의 N2이다.
100mM MOPS/KOH(pH 6.5), 50mM 2-머캅토에탄올, 0.4mM 테트라하이드로폴레이트, 10mM 폼데하이드 및 0.5mM NADP+ 또는 0.5mM NAD+를 함유하는 검정 혼합물을 사용하여 메틸렌-H4F 탈수소효소를 측정하였다. 기상은 100%의 N2이다.
메틸렌-H4F 환원효소를 하기 조건 하에 평가하였다. 검정 혼합물은 100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 20mM 아스코르베이트, 10μM FAD, 20mM 벤질 비올로겐 및 1mM 메틸-H4F를 함유하였다. 효소에 의한 반응의 시작 전에, 벤질 비올로겐을 나트륨 다이티오나이트에 의해 0.3의 ΔA555로 환원시켰다.
100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 2mM DTT, 1.1mM 아세트알데하이드 및 약 25μM 페레독신을 함유하는 혼합물을 사용하여 알데하이드:페레독신 산화환원효소를 평가하였다. 기상은 100%의 N2이다.
100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 2mM DTT, 1.1mM 아세트알데하이드, 1mM 조효소 A, 및 1mM NADP+ 또는 1mM NAD+를 함유하는 혼합물을 사용하여 CoA 아세틸화 아세트알데하이드 탈수소효소를 측정하였다. 기상은 100%의 N2이다.
100mM 인산칼륨(pH 6), 2mM DTT, 각각 1.1mM 아세트알데하이드 또는 아세토인, 및 1mM NADPH 또는 1mM NADH에 의해 검정에서 알콜 및 뷰탄다이올 탈수소효소를 측정하였다. 기상은 100%의 N2이다.
페레독신을 문헌[Schonheit, Wascher, & Thauer(1978)]에 의해 기재된 바대로 클로스트리듐 파스테우리아눔으로부터 정제하였다.
결과
메틸렌-THF 환원효소를 제외하고(본 발명자들이 아직 공지되지 않은 커플링 부위를 필요로 한다(Kopke et al., 2010; Poehlein et al., 2012)고 믿고, 이 효소의 활성은 이전에 다른 유기체에서 검출될 수 없었음), 일산화탄소영양 박테리아 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 에탄올 및 2,3-뷰탄다이올로의 경로에서의 모든 산화환원효소 반응을 분석하고 성공적으로 검출하였다. 결과는 도 1 및 도 2에 제공되어 있다. 발효 과정 동안 통상적으로 발생하는 이 경로에서의 병목을 분석하고 결정하기 위해 이 데이터를 이용하였다.
실시예 2 - 에탄올 생성에 대한 병목
도 1에 도시된 에탄올 발효 경로에서 볼 수 있는 것처럼, 에탄올 생성에 대한 병목은 알콜 탈수소효소 반응이다. 모든 다른 측정된 반응이 적어도 1.1U/㎎의 활성을 나타내지만, 알콜 탈수소효소 반응 단계는 오직 NADH에 의해 0.35U/㎎(또는 31%), 0.2U/㎎(18%) 및 NADPH에 의해 0.15U/㎎(13%)의 전체 활성을 갖는다. 이는 경로에서의 모든 다른 반응보다 69% 낮다. 유사한 방식으로, 알데하이드 탈수소효소 반응은 오직 NADH에 의해 0.16U/㎎(14%), 0.08U/㎎(7%) 및 NADPH에 의해 0.08U/㎎(7%)의 전체 활성을 갖는다. 이는 경로에서의 모든 다른 반응보다 86% 낮다. 그러나, 이 반응은 아세테이트 및 알데하이드:페레독신 산화환원효소(AOR)(1.9U/㎎의 활성을 갖고, 아세테이트 키나제 반응에서 기질 수준 인산화를 통해 ATP를 생성시키고 따라서 세포에 더 많은 에너지를 제공하는 이점을 가짐)를 통해 우회될 수 있다. 적어도 이 병목을 극복하고 발효 반응의 효율을 증가시키는 방향으로 가기 위해, 내인성 알콜 및/또는 알데하이드 탈수소효소 효소를 재조합 미생물에서 과발현시키거나, 외인성 알콜 및/또는 알데하이드 탈수소효소 효소를 도입하고 발현시킬 수 있다.
실시예 3 - 병목을 제거함으로써 에탄올 생성 경로를 통한 플럭스의 증가
아세트알데하이드로의 아세틸-coA의 전환 및 에탄올로의 아세트알데하이드의 전환을 촉매화하는 반응은 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 클로스트리듐 리융다흘리 또는 클로스트리듐 라그스달레이에서의 에탄올 형성에서 속도 제한 단계인 것으로 확인되었다. 이는 하기에 의해 극복될 수 있다:
ⅰ. 네이티브 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소의 과발현,
ii. 이종성 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소의 발현, 또는
ⅲ. 이종성 알데하이드 탈수소효소 및 알콜 탈수소효소의 발현.
이러한 극복은 하기 기재된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
클로스트리듐 아우토에타노게늄에서의 네이티브 2작용성 알콜 / 알데하이드 탈수소효소의 과발현
이것은 클로스트리듐 아우토에타노게늄(서열 번호 1)의 네이티브 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자를 과발현시키고, 클로스트리듐 아우토에타노게늄에서의 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(진뱅크 핵산 번호: CP002661.1 및 아미노산 서열 번호 AEI34903.1)의 이종성 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자를 발현시키도록 선택되었다.
(WO2012053905에 기재된 바대로) Not1과 Nde1 제한 효소 부위 사이의 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 클로스트리듐 아우토에타노게늄 포스페이트 아세틸전환효소 유전자의 487bp의 프로모터 서열을 함유하는 플라스미드 pMTL83155를 사용하여 유전자 변형을 수행하였다. 이 플라스미드를 신규한 메틸전환효소를 사용하여 생체내 메틸화하고, 이후 클로스트리듐 아우토에타노게늄으로 형질전환시켰다.
코돈 변경된 클로스트리듐 아우토에타노게늄 2작용성 알콜 / 알데하이드 탈수소효소 유전자의 설계, 합성 및 클로닝
클로스트리듐 아우토에타노게늄 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자의 핵산 서열을 코돈 변경하여 다른 클로스트리디아(서열 번호 2)에 적합하게 하고 합성하였다. 이는 유전자의 염색체 카피와 에피솜 카피 간의 상동성 재조합의 가능성을 감소시키도록 수행되었다. 코돈 변경된 클로스트리듐 아우토에타노게늄 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자는 비변경된 것과 81%의 서열 동일성을 공유한다. 코돈 변경된 유전자를 Nde1 및 Nhe1 제한 효소를 사용하여 단리하였다. 2613bp 단편을 ZYMO 겔 추출 키트(ZYMO Gel Extraction kit)를 사용하여 겔 추출하였다. 플라스미드 pMTL83155를 또한 Nde1 및 Nhe1 제한 효소로 처리한 후 FASTAP 알칼리 포스파타제(퍼멘타스(Fermentas))로 처리하였다. 절단 및 포스파타제 처리된 플라스미드를 ZYMO 클린 앤드 컨센트레이트 키트(Clean and Concentrate kit)를 사용하여 세정하였다. 16℃에서 1시간으로 T4 DNA 분해효소(퍼멘타스)를 사용하여 절단 인서트 및 벡터로 결찰을 설정하고, 이후 이. 콜라이 TOP10(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 형질전환시키도록 결찰 혼합물을 사용하였다. TOP10 콜로니를 플라스미드 단리(ZYMO 플라스미드 제조용 키트(ZYMO Plasmid Prep kit)), Nde1/Nhe1 효소에 의한 제한 분해 및 마지막으로 서열 분석에 의해 정확한 삽입을 갖는 플라스미드에 대해 스크리닝하였다.
정확한 플라스미드, pMTL83155-cod.alt.naBiAADH를 메틸전환효소 유전자를 갖는 플라스미드 pGS20m을 이미 함유하는 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan 균주로 도입하였다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰 2작용성 알콜 / 알데하이드 탈수소효소 유전자의 클로닝
씨. 아세토부틸리쿰으로부터의 게놈 DNA를 제조업자의 지시에 따라 라이프 테크놀로지스로부터의 퓨어링크 게놈 DNA 미니 키트(Purelink Genomic DNA mini kit)를 사용하여 단리하였다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자를 프라이머 caBiAADH-F(서열 번호 7) 및 caBiAADH-R(서열 번호 8) 및 iProof DNA 중합효소(바이오라드(BioRad))를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 프라이머는 Nde1 및 Nhe1 제한 효소 부위를 함유한다. 2589bp PCR 생성물을 ZYMO 클린 앤드 컨센트레이트 키트를 사용하여 세정하였다. PCR 생성물 및 플라스미드 pMTL83155를 Nde1 및 Nhe1 제한 효소(퍼멘타스)로 처리하였다. 플라스미드를 추가로 FASTAP 알칼리 포스파타제(퍼멘타스)로 처리하였다. 절단 및 포스파타제 처리된 플라스미드 및 절단 PCR 생성물을 ZYMO 클린 앤드 컨센트레이트 키트를 사용하여 세정하였다. 16℃에서 1시간으로 T4 DNA 분해효소(퍼멘타스)를 사용하여 절단 인서트 및 벡터로 결찰을 설정하고, 이후 이. 콜라이 TOP10(라이프 테크놀로지스)을 형질전환시키도록 결찰 혼합물을 사용하였다. TOP10 콜로니를 플라스미드 단리(ZYMO 플라스미드 제조용 키트), Nde1/Nhe1 효소에 의한 제한 분해 및 마지막으로 서열 분석에 의해 정확한 삽입을 갖는 플라스미드에 대해 스크리닝하였다.
정확한 플라스미드, pMTL83155-caBiAADH를 메틸전환효소 유전자를 갖는 플라스미드 pGS20m을 이미 함유하는 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan 균주로 도입하였다.
클로스트리듐 아우토에타노게늄의 형질전환:
DNA의 메틸화:
유도성 lac 프로모터(WO2012053905로부터의 서열 번호 27)에 융합된 하이브리드 메틸전환효소 유전자를 미국 특허 출원 제13/049,263호에 기재된 바대로 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 클로스트리듐 리융다흘리 및 클로스트리듐 라그스달레이로부터의 메틸전환효소 유전자의 정렬에 의해 설계하였다. 메틸전환효소의 발현은 WO2012053905로부터의 서열 번호 28의 서열을 갖는 단백질을 생성시킨다. 하이브리드 메틸전환효소 유전자를 화학적으로 합성하고, EcoRI를 사용하여 벡터 pGS20(ATG:바이오신서틱스 게엠베하(ATG:biosynthetics GmbH), 독일 메르츠하우젠 - WO2012053905로부터의 서열 번호 29)로 클로닝하였다. 생성된 메틸화 플라스미드 pGS20-메틸전환효소를 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan 균주(스트라타진(Stratagene))로 도입하고, 이 형질전환체를 플라스미드 pMTL83155-cod.alt.naBiAADH 및 pMTL83155-caBiAADH로 다시 형질전환시켰다. 생체내 메틸화를 1mM IPTG의 첨가에 의해 유도하고, 메틸화 플라스미드를 단리하고(퀴아젠(Qiagen) 미니 프리프 키트), 클로스트리듐 아우토에타노게늄을 전기천공하도록 사용하였다.
전기천공:
완전한 형질전환 실험 동안, 클로스트리듐 아우토에타노게늄을 환원제의 존재 하에 문헌[Hungate (1969) 및 Wolfe (1971)]에 기재된 표준 혐기성 기법을 이용하여 37℃에서 30psi의 제강소 폐가스(뉴질랜드 글렌브룩에서의 뉴질랜드 스틸(New Zealand Steel) 부지로부터 수집됨; 조성: 44%의 CO, 32%의 N2, 22%의 CO2, 2%의 H2)에 의해 YTF 배지(표 2) 중에 성장시켰다.
Figure pct00001
능률적인 세포를 만들기 위해, 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 50㎖의 배양물을 연속 5일 동안 새로운 YTF 배지로 계대배양하였다. 이 세포를 사용하여 0.05의 OD600㎚에서 40mM DL-트레오닌을 함유하는 50㎖의 YTF 배지를 접종하였다. 배양물이 0.5의 OD600㎚에 도달할 때, 세포를 30분 동안 얼음에서 항온처리하고 이후 혐기성 챔버로 옮기고, 4,700 x g 및 4℃에서 수확하였다. 배양물을 얼음의 차가운 전기천공 완충제(270mM 수크로스, 1mM MgCl2, 7mM 인산나트륨, pH 7.4)에 의해 2회 세척하고, 마지막으로 600㎕의 새로운 전기천공 완충제의 용적 중에 현탁시켰다. 이 혼합물을 2㎍의 메틸화 플라스미드 혼합물 및 1㎕의 타입 1 제한 저해제(에피센트레 바이오테크놀로지스(Epicentre Biotechnologies))를 함유하는 0.4㎝ 전극 갭을 갖는 예비 냉각된 전기천공 큐벳으로 옮기고, 즉시 하기 설정으로 유전자 펄서 엑스셀 전기천공 시스템(Gene pulser Xcell electroporation system)(바이오라드)을 사용하여 펄스화하였다: 2.5kV, 600Ω 및 25μF. 3.7-4.0ms의 시간 상수를 달성하였다. 배양물을 5㎖의 새로운 YTF 배지로 옮겼다. 세포의 재생성을 관 홀더가 장착된 스펙트로닉 헬리오스 엡실론 스펙트로포토미터(Spectronic Helios Epsilon Spectrophotometer)(써모(Thermo))를 사용하여 600㎚의 파장에서 모니터링하였다. 바이오매스에서의 초기 감소 후, 세포는 다시 성장하기 시작하였다. 바이오매스가 그 시점으로부터 2배가 되면, 약 200㎕의 배양물을 5g/ℓ의 프럭토스(표 3)를 함유하는 PETC 한천 플레이트 및 YTF-한천 플레이트(둘 다 1.2% 박토(Bacto)(상표명) 한천(BD) 및 15㎍/㎖의 티암페니콜 함유)에 분산시켰다. 37℃에서 30psi의 제강소 가스에 의한 항온처리 3-4일 후 콜로니가 보였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
콜로니를 5g/ℓ의 프럭토스 및 15㎍/㎖의 티암페니콜을 또한 함유하는 새로운 PETC 한천 플레이트에서 스트라이킹(streaking)하였다. 37℃에서 단일 콜로니를 30psi의 제강소 가스와 2일 항온처리 후, 단일 콜로니를 5g/ℓ의 프럭토스 및 15㎍/㎖의 티암페니콜을 함유하는 2㎖의 PETC 액체 배지로 산세(picking)하였다. 성장이 발생할 때, 배양 용적을 탄소원으로서 5g/ℓ의 프럭토스, 15㎍/㎖의 티암페니콜 및 30psi의 제강소 가스를 함유하는, 5㎖, 25㎖ 및 이어서 50㎖의 PETC 배지로 순차적으로 규모 확대하였다.
각각 플라스미드 pMTL83155-cod.alt.naBiAADH에 대한 프라이머 fD1(서열 번호 3) 및 rP2(서열 번호 4); naBi-f(서열 번호 5) 및 naBi-r(서열 번호 6), 및 pMTL83155-caBiAADH에 대한 프라이머 caBiAADH-F(서열 번호 7) 및 caBiAADH-R(서열 번호 8)을 갖는 PCR에 의해 형질전환체에서의 플라스미드의 동일성 및 존재를 확인하였다.
pMTL83155 - cod . alt . naBiAADH 및 pMTL83155 - caBiAADH 를 함유하는 클로스트리듐 아우토에타노게늄에 의한 발효 실험
발효를 1.5ℓ의 바이오반응기 내에서 하기 기재된 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 CO-함유 제강소 가스 및 37℃에서 수행하였다. 리터당 MgCl, CaCl2(0.5mM), KCl(2mM), H3PO4(5mM), Fe(100μM), Ni, Zn(5μM), Mn, B, W, Mo, Se(2μM)를 함유하는 한정 배지를 배양 성장에 사용하였다. 배지를 바이오반응기로 옮기고, 45분 동안 121℃에서 오토클레이빙하였다. 오토클레이빙 후, 배지를 티아민, 판토테네이트(0.05㎎), 비오틴(0.02㎎)으로 보충하고, 3mM 시스테인-HCl에 의해 환원시켰다. 혐기성을 달성하기 위해, 반응기 용기를 0.2㎛ 필터를 통해 질소로 스파징하였다. 접종 전에, 가스를 반응기에 연속하여 공급하면서 CO-함유 제강소 가스로 스위칭하였다. 공급 가스 조성은 2%의 H2, 42%의 CO, 20%의 CO2, 36% N2이다. 배양물의 pH를 5 내지 5.2로 유지시켰다. 가스 흐름을 초기에 80㎖/분으로 설정하고, 중간 지수 단계 동안 200㎖/분으로 증가시키면서, 교반을 200rpm으로부터 350rpm으로 증가시켰다. Na2S를 0.25㎖/시간으로 바이오반응기에 투입하였다. OD600이 0.5에 도달하면, 바이오반응기를 1.0㎖/분의 속도로(희석률: 0.96 d-1) 연속 방식으로 스위칭하였다. 성장이 안전할 때, 반응기를 10g/ℓ의 아세토인의 라세미체 혼합물로 스파이킹하였다. 배지 샘플을 취하여 HPLC에 의해 바이오매스 및 대사물질을 측정하였다.
35℃에서 조작되는 RID(시차 굴절 검출기: Refractive Index Detector)가 구비된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템 및 32℃에서 유지되는 알테크 IOA-2000 유기산 칼럼(Alltech IOA-2000 Organic acid column)(150x6.5㎜, 입자 크기 5㎛)을 사용하여 대사물질의 분석을 HPLC에 의해 수행하였다. 유속이 0.25㎖/분인 이동상으로서 약간 산성화된 물(0.005M H2SO4)을 사용하였다. 단백질 및 다른 세포 잔류물을 제거하기 위해, 400㎕의 샘플을 100㎕의 2 %(w/v) 5-설포살리실산과 혼합하고, 14,000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 침전된 잔류물을 분리시켰다. 이후, 10㎕의 상청액을 에탄올, 아세테이트, 2,3-뷰탄다이올 및 락테이트와 같은 중요한 대사물질의 분석을 위해 HPLC로 주입하였다.
클로스트리듐 아우토에타노게늄에서 아세틸-coA를 에탄올로 바꾸는 속도 제한 반응은 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 코돈 변경된 네이티브 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자의 과발현 또는 이종성 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자의 발현으로 인해 완화된다. 따라서, 에탄올로의 증대된 생성 플럭스가 예상되고, 이 유전적으로 변형된 클로스트리듐 아우토에타노게늄 균주에서 더 높은 에탄올 역가가 생성된다.
클로스트리듐 아우토에타노게늄에서의 이종성 알데하이드 탈수소효소 및 알콜 탈수소효소의 발현
이를 위해, 본 발명자들은 클로스트리듐 아우토에타노게늄에서 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)(진뱅크 핵산 서열 번호 NC_006526.2 및 아미노산 서열 번호 YP_163331.1)로부터의 이종성 NAD/NADH 의존적 알데하이드 탈수소효소 유전자 및 클로스트리듐 베이예린키(진뱅크 핵산 서열 번호 CP000721.1 및 아미노산 서열 번호 ABR35947.1)로부터의 NAD/NADH 의존적 알콜 탈수소효소를 과발현시키도록 선택하였다.
코돈 최적화된 자이모모나스 모빌리스 알데하이드 탈수소효소 유전자의 설계, 합성 및 클로닝
자이모모나스 모빌리스 알데하이드 탈수소효소 유전자의 핵산 서열은 클로스트리디아에서의 최대 발현에 대해 코돈 최적화된다. 코돈 변경된 클로스트리듐 아우토에타노게늄 2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소 유전자는 비변경된 것과 81%의 서열 동일성을 공유한다. 코돈 최적화된 유전자를 Nde1(퍼멘타스사 제공) 및 Nhe1(퍼멘타스사 제공) 제한 효소를 사용하여 단리시켰다. 1152bp의 단편을 ZYMO 겔 추출 키트를 사용하여 겔 추출하였다. 플라스미드 pMTL83155를 또한 Nde1 및 Nhe1 제한 효소에 의해 처리한 후, FASTAP 알칼리 포스파타제(퍼멘타스)로 처리하였다. 절단 및 포스파타제 처리된 플라스미드를 ZYMO 클린 앤드 컨센트레이트 키트를 사용하여 세정하였다. T4 DNA 분해효소(퍼멘타스)를 사용하여 절단 인서트 및 벡터로 결찰을 설정하고, 이후 이. 콜라이 TOP10(라이프 테크놀로지스)을 형질전환시키도록 결찰 혼합물을 사용하였다. TOP10 콜로니를 플라스미드 단리(ZYMO 플라스미드 제조용 키트), Nde1/Nhe1 효소에 의한 제한 분해 및 마지막으로 서열 분석에 의해 정확한 삽입을 갖는 플라스미드에 대해 스크리닝하였다.
정확한 플라스미드, pMTL83155-zmAld를 상기 설명된 바와 같은 메틸전환효소 유전자를 갖는 플라스미드 pGS20m을 이미 함유하는 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan 균주로 도입하였다.
클로스트리듐 베이예린키 알콜 탈수소효소 유전자의 클로닝
클로스트리듐 베이예린키로부터의 게놈 DNA를 제조업자의 지시에 따라 라이프 테크놀로지스로부터의 퓨어링크 게놈 DNA 미니 키트를 사용하여 단리하였다. 클로스트리듐 베이예린키 알콜 탈수소효소 유전자를 프라이머 cbAdh-F(서열 번호 9) 및 cbAdh-R(서열 번호 10) 및 iProof DNA 중합효소(바이오라드)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 프라이머는 Nde1 및 Nhe1 제한 효소 부위를 함유한다. 2589bp PCR 생성물을 ZYMO 클린 앤드 컨센트레이트 키트를 사용하여 세정하였다. PCR 생성물 및 플라스미드 pMTL83155를 Nde1 및 Nhe1 제한 효소(퍼멘타스)로 처리하였다. 플라스미드를 추가로 FASTAP 알칼리 포스파타제(퍼멘타스)로 처리하였다. 절단 및 포스파타제 처리된 플라스미드 및 절단 PCR 생성물을 ZYMO 클린 앤드 컨센트레이트 키트를 사용하여 세정하였다. 16℃에서 1시간으로 T4 DNA 분해효소(퍼멘타스)를 사용하여 절단 인서트 및 벡터로 결찰을 설정하고, 이후 이. 콜라이 TOP10(라이프 테크놀로지스)을 형질전환시키도록 결찰 혼합물을 사용하였다. TOP10 콜로니를 플라스미드 단리(ZYMO 플라스미드 제조용 키트), Nde1/Nhe1 효소에 의한 제한 분해 및 마지막으로 서열 분석에 의해 정확한 삽입을 갖는 플라스미드에 대해 스크리닝하였다.
정확한 플라스미드, pMTL83155-cbAdh를 메틸전환효소 유전자를 갖는 플라스미드 pGS20m을 이미 함유하는 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan 균주로 도입하였다.
하나의 플라스미드로의 코돈 최적화된 자이모모나스 모빌리스 알데하이드 탈수소효소 및 클로스트리듐 베이예린키 알콜 탈수소효소 유전자의 클로닝
코돈 최적화된 자이모모나스 모빌리스 알데하이드 탈수소효소 및 클로스트리듐 베이예린키 알콜 탈수소효소 유전자를 pMTL85155 플라스미드에서 이전에 설명된 바와 같은 적합한 제한 부위 사이에 조립하여 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 포스페이트 아세틸전환효소 프로모터 하에 오페론을 형성하였다. 생성된 플라스미드, pMTL83155-zmAld-cbAdh를 메틸전환효소 유전자를 갖는 플라스미드 pGS20m을 이미 함유하는 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan 균주로 도입하였다.
클로스트리듐 아우토에타노게늄의 형질전환
플라스미드 pMTL83155-zmAld, pMTL83155-cbAdh 및 pMTL83155-zmAld-cbAdh를 모두 전기천공에 의해 클로스트리듐 아우토에타노게늄으로 도입하고, 생성된 콜로니를 상기 설명된 바대로 스크리닝하였다.
pMTL83155 - zmAld , pMTL83155 - cbAdh 및 pMTL83155 - zmAld - cbAdh 를 함유하는 클로스트리듐 아우토에타노게늄 형질전환체에 의한 발효 실험
발효를 실시예 1에 설명된 바대로 수행하였다. 발효의 상이한 단계에서의 대사물질을 에탄올, 아세테이트, 2,3-뷰탄다이올 및 락테이트에 대해 HPLC에 의해 분석하였다.
2작용성 알콜/알데하이드 탈수소효소의 발현과 유사하게, 클로스트리듐 아우토에타노게늄에서 아세틸-coA를 에탄올로 바꾸는 속도 제한 반응은, 개별적으로 또는 오페론과 함께, 코돈 최적화된 자이모모나스 모빌리스 알데하이드 탈수소효소 유전자 및 클로스트리듐 베이예린키 알콜 탈수소효소의 발현으로 인해 완화된다. 따라서, 에탄올로의 증대된 생성 플럭스가 예상되고, 이 유전적으로 변형된 클로스트리듐 아우토에타노게늄 균주에서 더 높은 에탄올 역가가 생성된다.
실시예 4 - 2,3-뷰탄다이올 생성에 대한 병목
도 2에서 볼 수 있는 것처럼, 2,3-뷰탄다이올 생성에 대한 병목은 피루베이트:페레독신 환원효소(PFOR) 효소에 의해 촉매화된 아세틸 CoA로부터의 피루베이트로의 반응이다. 모든 다른 측정된 반응이 적어도 1.1U/㎎의 활성을 나타내지만, 이 속도 제한 반응은 페레독신의 존재 하에 오직 0.11U/㎎(10%)의 효소 활성을 나타낸다. 이는 경로에서의 모든 다른 반응보다 90% 낮다. 적어도 이 병목을 극복하고 발효로부터의 생성물 수율을 증가시키는 방향으로 가기 위해, 내인성 PFOR 효소를 과발현시키거나, 외인성 PFOR 효소를 도입하고 발현시킬 수 있다.
실시예 5 - 병목의 제거에 의한 2,3- 뷰탄다이올 생성 경로를 통한 플럭스의 증가
피루베이트로의 아세틸-coA의 전환을 촉매화하는 반응은 클로스트리듐 아우토에타노게늄, 클로스트리듐 리융다흘리 또는 클로스트리듐 라그스달레이에서 2,3-뷰탄다이올 형성에서 속도 제한 단계인 것으로 도 2에서 확인되었다. 이는 클로스트리듐 아우토에타노게늄에서 피루베이트:페레독신 산화환원효소(PFOR)를 코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 극복될 수 있다. 클로스트리듐 아우토에타노게늄에서 네이티브로 발견된 것의 아미노산 서열(서열 번호 11)을 갖는 단백질을 발현시키도록 코돈에 의해 유전자를 합성하였다.
네이티브 유전자와의 상동성을 감소시키고 원치 않는 통합 사건을 피하고 발현에 의한 문제를 최소화하기 위해(서열 번호 12), 유전자를 코돈 최적화하고 합성하였다. 유전자를 pMTL83155로의 서브클로닝을 위해 XbaI(3'-말단) 및 NheI(5'-말단)인 제한 효소 절단 부위에 의해 플랭킹하였다. 합성된 작제물 및 pMTL83155를 XbaI 및 NheI(퍼멘타스)에 의해 분해하고, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 유전자를 T4 DNA 분해효소(퍼멘타스)에 의해 pMTL83155로 결찰하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 TOP10(인비트로겐(Invitrogen), 라이프 테크놀로지스)을 형질전환시키고, 원하는 플라스미드를 함유하는 콜로니를 플라스미드 미니프리프(자이모 리서치(Zymo Research)) 및 제한 분해(퍼멘타스)에 의해 확인하였다. 원하는 플라스미드를 메틸화하고, 실시예 3에 기재된 바대로 클로스트리듐 아우토에타노게늄에서 형질전환시켰다. 티암페니콜 내성 및, 플라스미드가 존재할 때 1584개의 염기 쌍 생성물을 생성시키는, 프라이머 repHF(서열 번호 13) 및 CatR(서열 번호 14)에 의한 PCR 분석에 의해 성공적인 형질전환체를 확인하였다.
원하는 플라스미드를 함유하는 것으로 확인된 형질전환체를 밀 가스(mill gas)의 존재 하에 PETC-MES 배지를 함유하는 혈청 병에서 성장시키고, HPLC 분석에 의해 측정된, 이의 대사물질 생성을 플라스미드를 보유하지 않는 모 유기체와 비교하였다. 형질전환된 균주에서의 PFOR 활성을 (실시예 1에 기재된 바대로) 미정제 추출물에서 또한 측정하여, 모 균주에서 관찰된 병목이 완화된다는 것을 확인시켜준다. PFOR의 과발현은 세포 내의 전체 활성을 증가시켜서, 경로에서의 병목을 완화시키고, 피루베이트를 통한 플럭스를 증가시키고, 2,3-뷰탄다이올 생성을 증가시킨다.
실시예 6 - 전체 생성물 수율의 증가를 위한 아세틸- CoA 전구체를 증가시키기 위한 병목
도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 것처럼, 각각 2.7 및 2.4U/㎎의 활성으로 일산화탄소 탈수소효소, 수소화효소 및/또는 폼에이트:수소 분해효소를 통해 일산화탄소영양 박테리아에 의해 가스 CO 및 H2를 용이하게 이용하였다. 그러나, 우드-리융다흘 경로의 메틸 브랜치의 측정된 효소(폼에이트 탈수소효소, 메틸렌-THF 탈수소효소)는 오직 대략 1.1U/㎎ 활성을 나타냈다. 모든 다운스트림 생성물에 대한 전구체인, 아세틸-CoA의 수준을 증가시키기 위해, 우드-리융다흘 경로의 메틸 브랜치의 내인성 효소(폼에이트 탈수소효소, 폼일-THF 합성효소, 메틸렌-THF, 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소, 메틸렌-THF 환원효소, 아세틸-CoA 생성효소)를 과발현시키거나, 실질적으로 동일한 기능을 갖는 외인성 효소를 도입하고 발현시킬 수 있다. 또 다른 전략은 생합성 유전자의 발현을 증가시킴으로써 필요한 보인자 테트라하이드로폴레이트 및 코발아민의 이용률을 증가시키는 것일 것이다.
실시예 7 - 더 우수한 생성 및 성장 속도를 달성하기 위한 최적화된 시스템에 대한 마지막 병목의 제거
선행 실시예는 우드-리융다흘 경로 및 일산화탄소 탈수소효소, 수소화효소 및/또는 폼에이트:수소 분해효소의 활성을 각각 2.7 및 2.4U/㎎의 활성과 일치시키기 위한 에탄올 및 2,3-뷰탄다이올 발효 경로를 포함하는 시스템을 통한 플럭스를 어떻게 최적화하는지를 기술한다.
이러한 이전의 병목을 해결하면서, 본 발명자들은 이제 추가의 속도 제한 경로 반응; 알데하이드:페레독신 산화환원효소(AOR) 반응(도 1 참조)에 의지한다. 이 반응은 1.9U/㎎의 활성을 갖고, 이는 일산화탄소 탈수소효소의 활성보다 약 30% 낮다. 알데하이드:페레독신 산화환원효소(AOR) 및 일산화탄소 탈수소효소 둘 다가 보인자로서 페레독신을 사용하는 소수의 효소 중 하나이므로, 둘 다의 활성을 일치시키는 것이 특히 중요하다. 이는 페레독신의 유한 풀(pool)이 존재하여서, 사이클의 최대 효율을 보장하도록 페레독신이 순환하는 산화 및 환원 반응이 균형을 이루어야 하기 때문이다. 본 발명자들은 이것이 알데하이드:페레독신 산화환원효소 유전자(AOR1 - 서열 번호 16)를 과발현시킴으로써 달성될 수 있다는 것을 발견하였다. 과발현은 에탄올 생성을 31% 개선하였다. 이 병목의 제거는 발효에 의한 에탄올 생성을 개선할 뿐만 아니라, 페레독신 풀이 더 우수하게 균형을 이루면서 유기체의 성장 속도를 개선하였다. 결과는 하기 자세히 기재되어 있다.
AOR1 발현 플라스미드의 작제
우드-리융다흘 프로모터(PWL)(서열 번호 15) 및 알데하이드::페레독신 산화환원효소 1 유전자(AOR1)(서열 번호 16)의 DNA 서열을 클로스트리듐 아우토에타노게늄 DSM10061의 게놈 DNA로부터 퓨젼 하이 피델리티 DNA 폴리머라제(Phusion High Fidelity DNA Polymerase(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)))를 사용하여 표 4에서의 올리고뉴클레오타이드에 의해 PCR에 의해 증폭시켰다. 게놈 DNA를 문헌[Bertram and Durre (1989)]에 의해 변형된 방법을 이용하여 단리시켰다. 100㎖의 밤샘 배양물을 수확하고(6,000 x g, 15분, 4℃), 인산칼륨 완충제(10mM, pH 7.5)로 세척하고, 1.9㎖의 STE 완충제(50mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 200mM 수크로스; pH 8.0) 중에 현탁시켰다. 300㎕의 리소자임(약 100,000U)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 30분 동안 항온처리하고, 280㎕의 10%(w/v) SDS 용액을 첨가하고, 10분 동안 다시 항온처리하였다. RNA를 240㎕의 EDTA 용액(0.5M, pH 8), 20㎕의 트리스-HCl(1M, pH 7.5) 및 10㎕의 RNase A(퍼멘타스)를 첨가함으로써 실온에서 분해시켰다. 이후, 100㎕의 프로테이나제 케이(Proteinase K)(0.5U)를 첨가하고, 37℃에서 1-3시간 동안 단백분해가 일어났다. 마지막으로, 600㎕의 과염소산나트륨(5M)을 첨가하고, 이후 페놀-클로로폼을 추출하고 아이소프로판올을 침전시켰다. DNA 분량 및 품질을 분광광도법으로 조사하였다. 증폭된 573bp 프로모터 PWL를 NotI 및 NdeI 제한 부위 및 이. 콜라이 균주 DH5α-T1R(인비트로겐)을 사용하여 이. 콜라이-클로스트리듐 셔틀 벡터 pMTL 83151(진뱅크 수탁 번호 FJ797647; Heap et al., 2009)로 클로닝하여, 플라스미드 pMTL83157을 생성시켰다. AOR1의 코딩 서열이 2개의 내부 NdeI 부위를 함유하므로, 스플라이스 오버랩핑(splice overlapping: SOE) PCR(Warrens et al., 1997)을 이용하여 코돈을 변경하지 않으면서 이 NdeI 부위를 제거하였다. AOR1 및 플라스미드 pMTL83157의 1849bp PCR 생성물 둘 다 NdeI 및 EcoR1로 분해하고 결찰하여 플라스미드 pMTL83157-AOR1(서열 번호 17)을 생성하였다. 발현 플라스미드 pMTL83157-AOR1의 인서트 및 프로모터를 표 4에 제공된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 완전히 서열분석하고, 결과는 AOR1의 2개의 내부 NdeI 부위가 성공적으로 변경되고 이들이 돌연변이가 없다는 것을 확인시켜준다(도 3).
Figure pct00005
Figure pct00006
클로스트리듐 아우토에타노게늄 DSM10061에서의 AOR1의 과발현:
플라스미드 pMTL83157 및 pMTL83157-AOR1을 상기 기재된 바대로 클로스트리듐 아우토에타노게늄 DSM10061로 도입하였다. 7.5㎍/㎖의 티암페니콜을 사용하여 클로스트리듐 아우토에타노게늄 형질전환체를 선택하였다. 콜로니가 항온처리 3일 후 관찰되었고, 이것을 정제에 대해 동일한 선택적 한천 배지로 재스트라이킹하였다. 형질접합체의 정체를 확인하기 위해, PCR을 수행하여 프라이머 adhE1-F(서열 번호 28; ATGTGGACAAAGTTACAAAAGTTCTTGAGGAAC) 및 adhE1-R(서열 번호 29; GTAAATATTCAAATATCAACTTTACTGCTTCAAGGGC)을 사용하여 클로스트리듐 아우토에타노게늄 DSM10061의 adhE1(CAETHG_3747)을 검출하였다. 도 4는 플라스미드 대조군 및 AOR1 과발현 균주 둘 다에서의 예상된 576bp 생성물의 존재를 나타낸다. 더욱이, 플라스미드 DNA를 클로스트리듐 아우토에타노게늄 형질전환체로부터 추출하고, 플라스미드 제한 분해 분석을 수행하기 전에 이. 콜라이 XL1-블루 MRF'(스트라타진)로 다시 형질전환시켰다. 클로스트리디아로부터 단리된 플라스미드가 제한 분해 분석에 대한 충분한 품질을 갖지 않으므로, 이는 흔히 '플라스미드 구제'라 칭한다. 도 5는 pMTL83157-AOR1 형질전환체로부터 구제된 플라스미드의 NdeI 및 KpnI 분해 후의 예상된 단편의 존재를 나타낸다.
AOR1의 과발현은 성장 속도를 개선한다:
클로스트리듐 아우토에타노게늄 플라스미드 대조군(pMTL83157) 및 AOR1 과발현 균주(pMTL83157-AOR1)가 100%의 CO 중에 독립영양으로 성장하는 능력을 50㎖의 PETC 배지(표 3)를 함유하는 250㎖의 혈청 병 중에 3회 시험하고, 30psi CO로 가압하였다. 티암페니콜을 2개의 플라스미드 보유 균주에 대해 최종 농도 7.5㎍/㎖로 보충하였다. 400㎕의 활성 배양물을 각각의 혈청 병으로 접종하고, 600㎚의 파장에서의 OD 측정 및 HPLC에 의한 대사물질 분석을 위해 액상 샘플을 수확하였다.
도 6은 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 효소 AOR1의 과발현이 100%의 CO 조건 하에 플라스미드 대조군에 비해 클로스트리듐 아우토에타노게늄 DSM10061의 독립영양 성장을 개선한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, AOR1 과발현 균주가 13일에 1.73의 피크 OD600에 도달하는 반면, 플라스미드 대조군은 22일에 오직 0.78의 피크 OD600을 달성하였다.
AOR1 의 과발현은 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 에탄올 생성을 증가시킨다
또한, 100%의 CO 중에, 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 AOR1 과발현 균주는 클로스트리듐 아우토에타노게늄 야생형 균주와 매우 유사한 1.7-1.8의 OD600에 도달하지만, 클로스트리듐 아우토에타노게늄의 AOR1 과발현 균주는 야생형(십자, 10일에서의 하부선)보다 31% 더 많은 에탄올(도 7A, 사각형, 10일에서의 상부선)을 생성하였다. 아세테이트 생성은 재조합 미생물(도 7B, 사각형, 10일에서의 하부선)과 야생형 미생물(도 7B, 십자, 10일에서의 상부선) 사이에 유사하여서, AOR 과발현 균주는 대략 30% 더 높은 전체 생성물 역가를 생성하였다.
요약하면, 상기 실시예는 본 발명자들이 처음에 속도 제한 경로 반응 및 그 반응에 관여하는 연관 효소/보인자를 확인하는 방법을 성공적으로 입증하였다는 것을 나타낸다. 둘째로, 본 발명자들은 효소가 활성 증가를 나타내고 따라서 발효 경로를 통한 플럭스의 속도(및 이에 따라 전체 효율)를 증가시키는 재조합 미생물을 생성하였다.
본 발명은 부당한 실험 없이 독자가 본 발명을 실행하는 것이 가능하게 하도록 소정의 바람직한 실시형태를 참조하여 본 명세서에 기재되어 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 많은 구성성분 및 매개변수가 소정의 정도로 변하거나 변형되거나, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 공지된 등가물에 대해 치환될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 이러한 변형 및 등가물은 개별적으로 기재된 것처럼 본 명세서에서 포함된 것으로 이해되어야 한다. 표제, 제목 등은 본 문헌의 독자의 이해를 향상시키기 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 읽혀져서는 안 된다.
있다면, 상기 및 하기 인용된 모든 출원, 특허 및 공보의 전체 개시내용은 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다. 그러나, 본 명세서에서의 임의의 출원, 특허 및 공보에 대한 언급은, 이것이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계의 다른 나라에서의 일반 상식의 부분을 형성한다는 확인 또는 임의의 형태의 제안이 아니고, 이것으로서 취해지지 않아야 한다.
본 명세서 및 하기 임의의 청구항에 걸쳐, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함한다", "포함하는" 등은 배타적인 의미와 반대인 포괄적인 의미로, 즉 "포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다"의 의미로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> LANZATECH NEW ZEALAND LIMITED <120> RECOMBINANT MICROORGANISMS EXHIBITING INCREASED FLUX THROUGH A FERMENTATION PATHWAY <130> WO2014/197746 <140> PCT/US2014/041188 <141> 2014-06-05 <150> US 61/831,591 <151> 2013-06-05 <160> 29 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 2613 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 1 atgaaagtta caaacgtaga agaactaatg aaaagactag aagaaataaa ggatgctcaa 60 aagaaatttg ctacatatac tcaagaacaa gtggatgaaa tttttagaca agcagctatg 120 gcagctaata gtgctagaat agaactagct aaaatggcag tagaagaaag cggaatggga 180 attgtagaag acaaggttat taaaaatcac tttgcttcag aatatatata taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgtgg agttttagag agagatgcag gctttggtat agttagaatt 300 gcggaacctg taggagttat tgcagcagta gttccaacaa ctaatccaac atctacagca 360 atatttaaat cactaatagc tttaaaaact agaaatggta taattttttc accccatcca 420 agggcaaaga aatcaactat tgcagcagct aaaatagtac ttgacgctgc agttaaagct 480 ggtgctcctg aaggaattat aggatggata gatgaacctt ccattgaact ttcacaggtg 540 gtaatgggag aagcaaattt 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ctttaatagc attaaaaact agaaatggaa taatttttag tcctcatcct 420 agagcaaaaa aaagtactat agcagctgca aaaattgtat tagatgcagc tgtaaaagct 480 ggtgcacctg aaggtataat aggatggata gatgaaccta gtatagaatt aagtcaagta 540 gtaatgggag aagcaaatct tatacttgca actggtggac ctggaatggt aaaagcagca 600 tatagtagtg gaaaacctgc agttggagta ggacctggaa atactcctgc agtaatagat 660 gaaagtgcag atataaaaat ggcagtaaat agtatattac ttagtaaaac ttttgataat 720 ggaatgatat gtgcaagtga acaaagtgta atagtattag atagtatata tgaagaagta 780 aaaaaagaat ttgcatatag aggtgcatat atactttcaa aagatgaaac tgataaagta 840 ggaaaaataa tacttaaaaa tggtgctctt aatgctggaa tagtaggaca gcctgcattt 900 aaaatagcac aattagctgg tgtagatgta cctgaaaaag caaaagtatt aattggagaa 960 gtagaaagtg tagaattaga agaacctttt agtcatgaaa aacttagtcc tgtattagca 1020 atgtatagag caagaaattt tgaagatgca atagcaaaaa ctgataaatt agtaagagct 1080 ggaggatttg gacatactag ttcattatat ataaatccta tgactgaaaa agctaaagtt 1140 gaaaaattta gtactatgat gaaaactagt agaactataa taaatactcc tagtagtcaa 1200 ggtggaattg gagatatata taattttaaa ttagcaccta gtttaacttt aggatgtgga 1260 agttggggag gaaatagtgt atctgaaaat gtaggaccta aacatttatt aaatataaaa 1320 agtgtagcag aaagaagaga aaatatgctt tggtttagag taccagaaaa agtatatttt 1380 aaatatggaa gtcttggagt agcattaaaa gaattaaaag taatgaataa gaaaaaagta 1440 tttatagtta cagataaagt attatatcaa ttaggatatg tagataaagt tactaaagta 1500 cttgaagaat taaaaataag ttataaagta tttactgatg tagaacctga tcctacttta 1560 gcaacagcaa aaaaaggtgc tgcagaatta ttaagttatg aacctgatac tataataagt 1620 gttggaggtg gaagtgcaat ggatgcagca aaaataatgt gggtaatgta tgaacatcct 1680 gaagtaaaat ttgaagattt agcaatgaga tttatggata taagaaaaag agtatacgta 1740 tttcctaaaa tgggagaaaa agcaatgatg ataagtgtag caactagtgc tggaactgga 1800 agtgaagtaa ctccttttgc agtaataact gatgaaaaaa caggtgcaaa atatccttta 1860 gcagattatg aattaactcc tgatatggca atagtagatg cagaacttat gatgggaatg 1920 cctagaggat taactgcagc aagtggaata gatgcattaa ctcatgcatt agaagcttat 1980 gtaagtataa tggcaactga atttactaat ggattagcat tagaagcagt aaaacttata 2040 tttgaatatt tacctaaagc 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atgtaaattt 1260 tggggattag gaagtgatgg aactgttgga gcaaataaat ctgcaataaa aataatagga 1320 gatcatactg atatgtatgc acaaggatat tttgcttatg atagtaaaaa aagtggagga 1380 ataactgtaa gtcatttaag atttggaaaa agtcctataa aaagtcctta tttaatagat 1440 aaagcagatt ttgtagcagt acataatcaa agttatgttc ataaatatga tgtattagca 1500 ggattaaaaa aaggaggaaa ttttttatta aatactgtat ggactcaaga agaattagaa 1560 aaagaattac ctgcaagtat gaaaaagtat atagcaaata atgatataaa gttttatact 1620 ttaaatgcag taaaaatagc acaagaaata ggattaggag gaagaataaa tatgatatgt 1680 caaagtgcat tttttaaaat agcaaatata atacctatag atgatgcagt aaaatattta 1740 aaagaagcag tagtaactag ttatggaaaa aaaggacaaa aagttgtaga tatgaataat 1800 gcagcaatag ataaaggagt aaatgcagta gtaaaaatag atgtacctgc aagttggaaa 1860 gatgctgaag atgaagcagc agcaactaaa gaattaccta aatttataga aaaaatagta 1920 aatcctatga atagacaaga aggagataaa ttacctgtaa gtgcatttgt aggaatggaa 1980 gatggaactt ttcctgctgg aactgcagct tatgaaaaaa gaggaatagc aataaatgta 2040 cctgaatggc aagtagataa atgtatacaa tgtaatcaat gtagttttgt 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autoethanogenum <400> 15 aagcggccgc agatagtcat aatagttcca gaatagttca atttagaaat tagactaaac 60 ttcaaaatgt ttgttaaata tataccaaac tagtatagat attttttaaa tactggactt 120 aaacagtagt aatttgccta aaaaattttt tcaatttttt ttaaaaaatc cttttcaagt 180 tgtacattgt tatggtaata tgtaattgaa gaagttatgt agtaatattg taaacgtttc 240 ttgatttttt tacatccatg tagtgcttaa aaaaccaaaa tatgtcacat gcaattgtat 300 atttcaaata acaatattta ttttctcgtt aaattcacaa ataatttatt aataatatca 360 ataaccaaga ttatacttaa atggatgttt attttttaac acttttatag taaatatatt 420 tattttatgt agtaaaaagg ttataattat aattgtattt attacaatta attaaaataa 480 aaatagggtt ttaggtaaaa ttaagttatt ttaagaagta attacaataa aaattgaagt 540 tattgcttta aggagggaat tattcatatg gaa 573 <210> 16 <211> 1824 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 16 atgtatggtt atgatggtaa agtattaaga attaatttaa aagaaagaac ttgcaaatca 60 gaaaatttag atttagataa agctaaaaag tttataggtt gtaggggact aggtgttaaa 120 actttatttg atgaaataga tcctaaaata gatgcattat caccagaaaa taaatttata 180 attgtaacag gtcctttaac 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gctgcagcta tggaacttta tcaaagagga 1080 tatataaaag acgaagaaat agctggagat aacctatctc tcaagtgggg tgatacggaa 1140 tctatgattg gctggataaa gagaatggta tatagtgaag gctttggagc aaagatgaca 1200 aatggttcat ataggctttg tgaaggttat ggagcaccgg agtattctat gacagttaaa 1260 aagcaggaaa ttccagcata tgatccaagg ggaatacagg gacacggtat tacctatgca 1320 gttaataata gaggaggctg tcatattaag ggatacatga ttaaccctga aatattaggt 1380 tatcctgaaa aacttgatag atttgcatta gatggtaaag cagcttatgc caaattattt 1440 catgatttaa ctgctgtaat tgattcttta ggattgtgca tattcactac atttgggctt 1500 ggaatacagg attatgtaga tatgtataat gcagtagtag gagaatctac ttatgatgca 1560 gattcactat tagaggcagg agatagaatc tggactcttg agaaattatt taatcttgca 1620 gctggaatag acagcagcca ggatactcta ccaaagagat tgttagaaga acctattcca 1680 gatggcccat caaagggaga agttcatagg ctagatgttc ttctgccaga atattactca 1740 gtacgaggat ggagtaaaga gggtatacct acagaagaaa cattaaagaa attaggatta 1800 gatgaatata taggtaagtt ctag 1824 <210> 17 <211> 6832 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic plasmid <400> 17 cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60 atcaggaaac agctatgacc gcggccgcag atagtcataa tagttccaga atagttcaat 120 ttagaaatta gactaaactt caaaatgttt gttaaatata taccaaacta gtatagatat 180 tttttaaata ctggacttaa acagtagtaa tttgcctaaa aaattttttc aatttttttt 240 aaaaaatcct tttcaagttg tacattgtta tggtaatatg taattgaaga agttatgtag 300 taatattgta aacgtttctt gattttttta catccatgta gtgcttaaaa aaccaaaata 360 tgtcacatgc aattgtatat ttcaaataac aatatttatt ttctcgttaa attcacaaat 420 aatttattaa taatatcaat aaccaagatt atacttaaat ggatgtttat tttttaacac 480 ttttatagta aatatattta ttttatgtag taaaaaggtt ataattataa ttgtatttat 540 tacaattaat taaaataaaa aatagggttt taggtaaaat taagttattt taagaagtaa 600 ttacaataaa aattgaagtt atttctttaa ggagggaatt attcatatgt atggttatga 660 tggtaaagta ttaagaatta atttaaaaga aagaacttgc aaatcagaaa atttagattt 720 agataaagct aaaaagttta taggttgtag gggactaggt gttaaaactt tatttgatga 780 aatagatcct aaaatagatg cattatcacc agaaaataaa tttataattg taacaggtcc 840 tttaactgga gctccggttc caactagtgg aaggtttatg gtagttacta aagcaccgct 900 tacaggaact ataggaattt caaattcggg tggaaaatgg ggagtagact taaaaaaagc 960 tggttgggat atgataatag tagaggataa ggctgattca ccagtttaca ttgaaatagt 1020 agatgataag gtagaaatta aagacgcgtc acagctttgg ggaaaagtta catcagaaac 1080 tacaaaagag ttagaaaaga taactgagaa taaatcaaag gtattatgta taggacctgc 1140 tggtgaacga ttgtctctta tggcagcagt tatgaatgat gtagatagaa ctgcagcaag 1200 aggcggcgtt ggtgcagtta tgggatctaa aaacttaaaa gctattacag ttaaaggaac 1260 tggaaaaata gctttagctg ataaagaaaa agtaaaaaaa gtgtccgtag aaaaaattac 1320 aacattaaaa aatgatccag tagctggtca gggaatgcca acttatggta cagctatact 1380 ggttaatata ataaatgaaa atggagttca tcctgtaaag aattttcaag agtcttatac 1440 gaatcaagca gataaaataa gtggagagac tcttactgct aaccaactag taaggaaaaa 1500 tccttgttac agctgtccta taggttgtgg aagatgggtt agactaaaag atggcacaga 1560 gtgcggagga ccagaatatg aaacactgtg gtgttttgga tctgactgtg gttcttatga 1620 tttagatgct ataaatgaag ctaatatgtt atgtaatgaa tatggtattg atactattac 1680 ttgtggtgca acaattgctg cagctatgga actttatcaa agaggatata taaaagacga 1740 agaaatagct ggagataacc tatctctcaa gtggggtgat acggaatcta tgattggctg 1800 gataaagaga atggtatata gtgaaggctt tggagcaaag atgacaaatg gttcatatag 1860 gctttgtgaa ggttatggag caccggagta ttctatgaca gttaaaaagc aggaaattcc 1920 agcttatgat ccaaggggaa tacagggaca cggtattacc tatgcagtta ataatagagg 1980 aggctgtcat attaagggat acatgattaa ccctgaaata ttaggttatc ctgaaaaact 2040 tgatagattt gcattagatg gtaaagcagc ttatgccaaa ttatttcatg atttaactgc 2100 tgtaattgat tctttaggat tgtgcatatt cactacattt gggcttggaa tacaggatta 2160 tgtagatatg tataatgcag tagtaggaga atctacttat gatgcagatt cactattaga 2220 ggcaggagat agaatctgga ctcttgagaa attatttaat cttgcagctg gaatagacag 2280 cagccaggat actctaccaa agagattgtt agaagaacct attccagatg gcccatcaaa 2340 gggagaagtt cataggctag atgttcttct gccagaatat tactcagtac gaggatggag 2400 taaagagggt atacctacag aagaaacatt aaagaaatta ggattagatg aatatatagg 2460 taagttctag tttgattcgg gtacccgggg atcctctaga gtcgacgtca cgcgtccatg 2520 gagatctcga ggcctgcaga catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 2580 actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 2640 gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 2700 atggcgaatg gcgctagcat aaaaataaga agcctgcatt tgcaggcttc ttatttttat 2760 ggcgcgccgc cattattttt ttgaacaatt gacaattcat ttcttatttt ttattaagtg 2820 atagtcaaaa ggcataacag tgctgaatag aaagaaattt acagaaaaga aaattataga 2880 atttagtatg attaattata ctcatttatg aatgtttaat tgaatacaaa aaaaaatact 2940 tgttatgtat tcaattacgg gttaaaatat agacaagttg aaaaatttaa taaaaaaata 3000 agtcctcagc tcttatatat taagctacca acttagtata taagccaaaa cttaaatgtg 3060 ctaccaacac atcaagccgt tagagaactc tatctatagc aatatttcaa atgtaccgac 3120 atacaagaga aacattaact atatatattc aatttatgag attatcttaa cagatataaa 3180 tgtaaattgc aataagtaag atttagaagt ttatagcctt tgtgtattgg aagcagtacg 3240 caaaggcttt tttatttgat aaaaattaga agtatattta ttttttcata attaatttat 3300 gaaaatgaaa gggggtgagc aaagtgacag aggaaagcag tatcttatca aataacaagg 3360 tattagcaat atcattattg actttagcag taaacattat gacttttata gtgcttgtag 3420 ctaagtagta cgaaaggggg agctttaaaa agctccttgg aatacataga attcataaat 3480 taatttatga aaagaagggc gtatatgaaa acttgtaaaa attgcaaaga gtttattaaa 3540 gatactgaaa tatgcaaaat acattcgttg atgattcatg ataaaacagt agcaacctat 3600 tgcagtaaat acaatgagtc aagatgttta cataaaggga aagtccaatg tattaattgt 3660 tcaaagatga accgatatgg atggtgtgcc ataaaaatga gatgttttac agaggaagaa 3720 cagaaaaaag aacgtacatg cattaaatat tatgcaagga gctttaaaaa agctcatgta 3780 aagaagagta aaaagaaaaa ataatttatt tattaattta atattgagag tgccgacaca 3840 gtatgcacta aaaaatatat ctgtggtgta gtgagccgat acaaaaggat agtcactcgc 3900 attttcataa tacatcttat gttatgatta tgtgtcggtg ggacttcacg acgaaaaccc 3960 acaataaaaa aagagttcgg ggtagggtta agcatagttg aggcaactaa acaatcaagc 4020 taggatatgc agtagcagac cgtaaggtcg ttgtttaggt gtgttgtaat acatacgcta 4080 ttaagatgta aaaatacgga taccaatgaa gggaaaagta taatttttgg atgtagtttg 4140 tttgttcatc tatgggcaaa ctacgtccaa agccgtttcc aaatctgcta aaaagtatat 4200 cctttctaaa atcaaagtca agtatgaaat cataaataaa gtttaatttt gaagttatta 4260 tgatattatg tttttctatt aaaataaatt aagtatatag aatagtttaa taatagtata 4320 tacttaatgt gataagtgtc tgacagtgtc acagaaagga tgattgttat ggattataag 4380 cggccggcca gtgggcaagt tgaaaaattc acaaaaatgt ggtataatat ctttgttcat 4440 tagagcgata aacttgaatt tgagagggaa cttagatggt atttgaaaaa attgataaaa 4500 atagttggaa cagaaaagag tattttgacc actactttgc aagtgtacct tgtacctaca 4560 gcatgaccgt taaagtggat atcacacaaa taaaggaaaa gggaatgaaa ctatatcctg 4620 caatgcttta ttatattgca atgattgtaa accgccattc agagtttagg acggcaatca 4680 atcaagatgg tgaattgggg atatatgatg agatgatacc aagctataca atatttcaca 4740 atgatactga aacattttcc agcctttgga ctgagtgtaa gtctgacttt aaatcatttt 4800 tagcagatta tgaaagtgat acgcaacggt atggaaacaa tcatagaatg gaaggaaagc 4860 caaatgctcc ggaaaacatt tttaatgtat ctatgatacc gtggtcaacc ttcgatggct 4920 ttaatctgaa tttgcagaaa ggatatgatt atttgattcc tatttttact atggggaaat 4980 attataaaga agataacaaa attatacttc ctttggcaat tcaagttcat cacgcagtat 5040 gtgacggatt tcacatttgc cgttttgtaa acgaattgca ggaattgata aatagttaac 5100 ttcaggtttg tctgtaacta aaaacaagta tttaagcaaa aacatcgtag aaatacggtg 5160 ttttttgtta ccctaagttt aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 5220 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 5280 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 5340 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 5400 gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 5460 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 5520 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 5580 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 5640 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 5700 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 5760 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 5820 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 5880 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 5940 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 6000 gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 6060 gggccccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc tttttcgcac 6120 gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc caacggcgtc 6180 agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc ttcactgtcc 6240 cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg ccggctaccg 6300 ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc aggaagggca 6360 gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag gaaaaggcgg 6420 cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc tacaaaatca 6480 cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agctggcccg catcaatggc gacctgggcc 6540 gcctgggcgg cctgctgaaa ctctggctca ccgacgaccc gcgcacggcg cggttcggtg 6600 atgccacgat cctcgccctg ctggcgaaga tcgaagagaa gcaggacgag cttggcaagg 6660 tcatgatggg cgtggtccgc ccgagggcag agccatgact tttttagccg ctaaaacggc 6720 cggggggtgc gcgtgattgc caagcacgtc cccatgcgct ccatcaagaa gagcgacttc 6780 gcggagctgg tgaagtacat caccgacgag caaggcaaga ccgatcgggc cc 6832 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 18 aagcggccgc agatagtcat aatagttcc 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 19 ttccatatga ataattccct ccttaaagc 29 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 20 aattcatatg tatggttatg atggtaaagt attaag 36 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 21 ctaaatcata agaaccacag tcagatcc 28 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 22 ctgactgtgg ttcttatgat ttagatgc 28 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 23 cctgtattcc ccttggatca taagc 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 24 gcttatgatc caaggggaat acagg 25 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 25 ctagaattcc gaatcaaact agaacttacc 30 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 26 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 27 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 28 atgtggacaa agttacaaaa gttcttgagg aac 33 <210> 29 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 gtaaatattc aaatatcaac tttactgctt caagggc 37

Claims (20)

  1. 발효 생성물을 생성하는 방법으로서,
    a) 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
    b) 상기 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 적어도 1종의 효소, 보인자(co-factor) 또는 둘 다를 확인하는 단계;
    c) 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) 상기 (b)의 적어도 1종의 효소 또는 이의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) 상기 (b)의 적어도 1종의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아(carboxydotrophic Clostridia) 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계를 포함하는, 발효 생성물을 생성하는 방법.
  2. 발효 생성물을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물에 의해 CO-포함 기질을 발효시켜 발효 생성물을 생성하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 미생물은,
    a) 모 미생물과 비교할 때, 발효 경로의 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 적어도 1종의 효소, 또는 이의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가; 또는
    b) 모 미생물과 비교할 때, 발효 경로의 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 적어도 1종의 보인자의 이용률 증가
    중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된, 발효 생성물을 생성하는 방법.
  3. 모 미생물에 비해 발효 경로를 통한 플럭스(flux)의 증가를 나타내도록 적합화된 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물을 생성하는 방법으로서,
    a) 상기 발효 경로에서 속도 제한 경로 반응을 결정하는 단계;
    b) 상기 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 적어도 1종의 효소, 보인자 또는 둘 다를 확인하는 단계;
    c) 모 미생물을 형질전환시켜, 모 미생물과 비교할 때, ⅰ) 상기 (b)의 적어도 1종의 효소 또는 이의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가, 또는 ⅱ) 상기 (b)의 적어도 1종의 보인자의 이용률 증가 중 적어도 하나를 나타내도록 적합화된 재조합 미생물을 생성하는 단계를 포함하되;
    상기 발효 경로는 CO를 포함하는 기질로부터 적어도 1종의 발효 생성물을 생성할 수 있는, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물을 생성하는 방법.
  4. 제3항의 방법에 의해 생성된 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  5. 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물로서,
    a) 모 미생물과 비교할 때, 적어도 1종의 효소 또는 이의 기능상 동등한 변이체의 활성 증가;
    b) 모 미생물과 비교할 때, 적어도 1종의 보인자의 이용률 증가; 또는
    c) a) 및 b) 둘 다
    중 적어도 하나를 나타내도록 적합화되고,
    상기 적어도 1종의 효소 또는 보인자는 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 속도 제한 경로 반응은 상기 발효 경로에서 2개 이상의 경로 반응의 효소 활성을 비교하고 최저 효소 활성을 갖는 것을 선택하는 것에 의해 확인된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은,
    ⅰ) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 상기 적어도 1종의 효소 또는 이의 기능상 동등한 변이체를 과발현시키는 것;
    ⅱ) 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는 것으로서 확인된, 적어도 1종의 외인성 효소를 발현시키는 것; 또는
    ⅲ) ⅰ) 및 ⅱ) 둘 다에 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 상기 적어도 1종의 효소의 활성을 증가시키거나 상기 적어도 1종의 보인자의 이용률을 증가시키기 위한 효소 조작을 겪은, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 상기 모 미생물에 비해 상기 발효 경로의 효율의 증가를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 효율의 증가는 발효 생성물의 생성 속도의 증가를 포함하는, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 발효 생성물은 에탄올, 뷰탄올, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 고차 알콜, 뷰탄다이올, 2,3-뷰탄다이올, 숙시네이트, 아이소프레노이드, 지방산, 바이오중합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 속도 제한 경로 반응은 우드-리융다흘(Wood-Ljungdahl), 에탄올 또는 2,3-뷰탄다이올 발효 경로에 존재하는, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  13. 제5항에 있어서, 상기 적어도 1종의 효소는 알콜 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 알데하이드 탈수소효소(아실화)(EC 1.2.1.10), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), 알데하이드 페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.5), 포스포트랜스아세틸라제(EC 2.3.1.8), 아세테이트 키나제(EC 2.7.2.1), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2) 및 수소화효소(EC 1.12.7.2)로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  14. 제5항에 있어서, 상기 적어도 1종의 효소는 피루베이트:페레독신 산화환원효소(피루베이트 생성효소)(EC 1.2.7.1), 피루베이트:폼에이트 분해효소(EC 2.3.1.54), 아세토락테이트 생성효소(EC 2.2.1.6), 아세토락테이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.5), 2,3-뷰탄다이올 탈수소효소(EC 1.1.1.4), 1차:2차 알콜 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2) 및 수소화효소(EC 1.12.7.2)로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  15. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 상기 속도 제한 경로 반응을 촉매화하는 데 관여하는, 상기 적어도 1종의 효소 또는 보인자의 생합성에 관여하는, 외인성 핵산을 발현시키거나, 내인성 핵산을 과발현시키도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  16. 제5항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 상기 적어도 1종의 보인자의 이용률 증가를 나타내도록 적합화된, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 1종의 보인자는 테트라하이드로폴레이트(THF)인, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 미생물은 GTP 사이클로가수분해효소 I(EC 3.5.4.16), 알칼리 포스파타제(EC 3.1.3.1), 다이하이드로네오프테린 알돌라제(EC 4.1.2.25), 2-아미노-4-하이드록시-6-하이드록시메틸다이하이드로프테리딘 다이포스포키나제(EC 2.7.6.3), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(2.5.1.15), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(EC 2.5.1.15), 다이하이드로폴레이트 생성효소(EC 6.3.2.12), 폴릴폴리글루타메이트 생성효소(6.3.2.17), 다이하이드로폴레이트 환원효소(EC 1.5.1.3), 티미딜레이트 생성효소(EC 2.1.1.45) 또는 다이하이드로모나프테린 환원효소(EC 1.5.1.-) 중 적어도 1종의 발현 증가를 나타내는, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 적어도 1종의 보인자는 코발아민(B12)인, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 5-아미노레뷸리네이트 생성효소(EC 2.3.1.37), 5-아미노레뷸리네이트:피루베이트 아미노전환효소(EC 2.6.1.43), 아데노실코빈아마이드 키나제/아데노실코빈아마이드-포스페이트 구아닐릴전환효소(EC 2.7.1.156/2.7.7.62), 아데노실코빈아마이드-GDP 리바졸전환효소(EC 2.7.8.26), 아데노실코빈아마이드-포스페이트 생성효소(EC 6.3.1.10), 아데노실코비르산 생성효소(adenosylcobyric acid synthase)(EC 6.3.5.10), 알파-리바졸 포스파타제(EC 3.1.3.73), 코브(I)알라민 아데노실전환효소(EC 2.5.1.17), 코브(II)인산 a,c-다이아마이드 환원효소(EC 1.16.8.1), 코발트-프레코린 5A 가수분해효소(EC 3.7.1.12), 코발트-프레코린-5B (C1)-메틸전환효소(EC 2.1.1.195), 코발트-프레코린-7 (C15)-메틸전환효소(EC 2.1.1.196), 코발토킬레타제 CobN(EC 6.6.1.2), 코비린산(cobyrinic acid) a,c-다이아마이드 생성효소(EC 6.3.5.9/6.3.5.11), 페리틴(EC 1.16.3.1), 글루타메이트-1-세미알데하이드 2,1-아미노뮤타제(EC 5.4.3.8), 글루타밀-tRNA 환원효소(EC 1.2.1.70), 글루타밀-tRNA 합성효소(EC 6.1.1.17), 하이드록시메틸빌란 생성효소(EC 2.5.1.61), 니코티네이트-뉴클레오타이드-다이메틸벤즈이미다졸 포스포리보실전환효소(EC 2.4.2.21), 산소-독립적 코프로포르피리노겐 III 산화효소(EC 1.3.99.22), 포르포빌리노겐 생성효소(EC 4.2.1.24), 프레코린-2 탈수소효소/시로하이드로클로린 페로킬레타제(EC 1.3.1.76/4.99.1.4), 프레코린-2/코발트-2 인자 C20-메틸전환효소(EC 2.1.1.130/2.1.1.151), 프레코린-3B 생성효소(EC 1.14.13.83), 프레코린-3B C17-메틸전환효소(EC 2.1.1.131), 프레코린-4 C11-메틸전환효소(EC 2.1.1.133), 프레코린-6X 환원효소(EC 1.3.1.54), 프레코린-6Y C5,15-메틸전환효소(EC 2.1.1.132), 프레코린-8W 탈탄산효소(EC 1.-.-.-), 프레코린-8X 메틸뮤타제(EC 5.4.1.2), 시로하이드로클로린 코발토킬레타제(EC 4.99.1.3), 트레오닌-포스페이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.81), 유로포르피리노겐 탈탄산효소(EC 4.1.1.37) 및 유로포르피리노겐 III 메틸전환효소/생성효소(EC 2.1.1.107/4.2.1.75) 중 적어도 하나의 발현 증가를 나타내는, 재조합 일산화탄소영양 클로스트리디아 미생물.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2816119A1 (en) * 2013-06-18 2014-12-24 Johann Wolfgang Goethe-Universität Method for storing gaseous hydrogen through producing methanoate (formate)
ES2836800T3 (es) * 2014-12-08 2021-06-28 Lanzatech New Zealand Ltd Microorganismos recombinantes que exhiben un flujo aumentado a través de una ruta de fermentación
CN104515851B (zh) * 2015-01-08 2016-09-14 河南农业大学 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置
CN105624182A (zh) * 2015-12-15 2016-06-01 重庆大学 生产四氢叶酸的重组质粒、基因工程菌株构建及应用
CN108603178A (zh) * 2016-01-06 2018-09-28 株式会社西化学 Co水合酶以及使用其产生甲酸的方法
KR102514023B1 (ko) * 2016-05-14 2023-03-23 란자테크, 인크. 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제 활성이 변경된 미생물 및 관련 방법
CN108330094B (zh) * 2018-01-10 2020-04-21 上海晶诺生物科技有限公司 一种产烟酸的游离型重组耻垢分枝杆菌及其构建方法
CN109810991B (zh) * 2019-03-02 2021-11-12 昆明理工大学 二氢蝶酸合酶基因folP的用途
EP3942058A1 (en) 2019-03-20 2022-01-26 Global Bioenergies Improved means and methods for producing isobutene from acetyl-coa
CN111089914A (zh) * 2019-11-07 2020-05-01 河北首朗新能源科技有限公司 微生物发酵生产乙醇中代谢物的高效液相检测方法
CN111235169A (zh) * 2020-02-03 2020-06-05 昆明理工大学 一种GTP环化水解酶I基因folE及应用
CN114480562B (zh) * 2022-01-27 2023-09-19 西南医科大学附属医院 一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法及其应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173429A (en) 1990-11-09 1992-12-22 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Clostridiumm ljungdahlii, an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism
US5593886A (en) 1992-10-30 1997-01-14 Gaddy; James L. Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
UA72220C2 (uk) 1998-09-08 2005-02-15 Байоенджініерінг Рісорсиз, Інк. Незмішувана з водою суміш розчинник/співрозчинник для екстрагування оцтової кислоти, спосіб одержання оцтової кислоти (варіанти), спосіб анаеробного мікробного бродіння для одержання оцтової кислоти (варіанти), модифікований розчинник та спосіб його одержання
MXPA03000711A (es) 2000-07-25 2003-06-04 Bioengineering Resources Inc Metodos para incrementar la produccion de etanol de una fermentacion microbiana.
AU2001281018A1 (en) * 2000-08-04 2002-02-18 Genencor International, Inc. Enhanced 2-keto-l-gulonic acid production
US7700319B2 (en) * 2003-12-04 2010-04-20 Novozymes A/S Production of 3-hydroxypropionic acid using beta-alanine/pyruvate aminotransferase
JP4633519B2 (ja) * 2005-03-31 2011-02-16 明治製菓株式会社 ミデカマイシン高生産菌
US7704723B2 (en) 2006-08-31 2010-04-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Isolation and characterization of novel clostridial species
EA022710B1 (ru) 2007-11-13 2016-02-29 Ланзатек Нью Зиленд Лимитед Штамм бактерии clostridium autoethanogenum, способный продуцировать этанол и ацетат путем анаэробной ферментации субстрата, содержащего co
BRPI0909334B1 (pt) * 2008-03-12 2019-10-29 Lanzatech New Zealand Ltd método para a conversão de ácido em álcool correspondente
BRPI0915017B1 (pt) * 2008-06-09 2018-12-26 Lanzatech New Zealand Ltd método para produzir 2,3-butanodiol pela fermentação microbiana de um substrato gasoso compreendendo co
US8039239B2 (en) * 2008-12-16 2011-10-18 Coskata, Inc. Recombinant microorganisms having modified production of alcohols and acids
EP2373781A4 (en) * 2008-12-16 2012-10-10 Genomatica Inc MICRO-ORGANISMS AND METHODS OF CONVERTING SYNGAS AND OTHER CARBON RESOURCES IN USEFUL PRODUCTS
JP2013504326A (ja) * 2009-09-09 2013-02-07 ジェノマティカ・インコーポレイテッド イソプロパノールならびに第一級アルコール、ジオールおよび酸の共生成のための微生物ならびに方法
US8143037B2 (en) 2010-03-19 2012-03-27 Coskata, Inc. Ethanologenic Clostridium species, Clostridium coskatii
AU2010355249B9 (en) * 2010-06-09 2014-12-11 Synata Bio, Inc. Cloning and expression of the genes encoding key Clostridial catalyzing mechanisms for syngas to ethanol production and functional characterization thereof
US20110236941A1 (en) * 2010-10-22 2011-09-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganism and methods of production thereof
CN103443283B (zh) * 2010-12-03 2016-06-22 伊内奥斯生物股份公司 包含氢气的气态底物的发酵操作方法
US8993303B2 (en) * 2011-02-24 2015-03-31 South Dakota State University Genetically engineered cyanobacteria
EP2678432B1 (en) * 2011-02-25 2018-08-01 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
WO2012177599A2 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing n-propanol 1, 3-propanediol, 1,2-propanediol or glycerol and methods related thereto

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