ES2836800T3 - Microorganismos recombinantes que exhiben un flujo aumentado a través de una ruta de fermentación - Google Patents

Microorganismos recombinantes que exhiben un flujo aumentado a través de una ruta de fermentación Download PDF

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Abstract

Una bacteria Clostridium recombinante, carboxidotrófica que comprende: (a) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1); (b) una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5); (c) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6); (d) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5); (e) una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5); o (f) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1), una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5); en donde cada enzima es una enzima endógena sobreexpresada o una enzima exógena; y en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii y Clostridium ragsdalei.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismos recombinantes que exhiben un flujo aumentado a través de una ruta de fermentación
Antecedentes
Los microorganismos carboxidotróficos pueden diseñarse para producir productos, tales como combustibles y productos químicos, a través de fermentación de un sustrato gaseoso. Los esfuerzos para mejorar la concentración del producto y la utilización del sustrato se han centrado históricamente en la selección de cepas y la optimización de las condiciones de fermentación (Abubackar, Bioresour Technol, 114: 518-522, 2012). El metabolismo de los microorganismos naturales, sin embargo, no evolucionó para lograr objetivos comerciales de altos rendimientos, tasas y títulos, de tal manera que ciertos objetivos comerciales no pueden lograrse mediante la mera selección de cepas y la optimización de las condiciones de fermentación. En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de microorganismos y métodos mejorados para la producción de productos útiles, tales como combustibles y productos químicos.
Sumario de la invención
La invención proporciona una bacteria Clostridium carboxidotrófica recombinante que comprende:
(a) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1);
(b) una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
(c) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6);
(d) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
(e) una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5); o
(f) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1), una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
en donde cada enzima es una enzima endógena sobreexpresada o una enzima exógena; y
en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, y Clostridium ragsdalei.
En una realización preferida, la bacteria recombinante deriva de C. autoethanogenum depositado con el número de registro DSMZ DSM23693 (C. autoethanogenum LZ1561).
La invención proporciona además un método para producir un producto de fermentación, que comprende fermentar la bacteria recombinante en presencia de un sustrato gaseoso que comprende CO para producir uno o más de etanol, butanol, isopropanol, isobutanol, alcoholes superiores, 2,3-butanodiol, succinato, isoprenoides, ácidos grasos, biopolímeros y mezclas de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un mapa de flujo de la ruta de biosíntesis de etanol que detalla las actividades enzimáticas medidas y el flujo a través de un microorganismo carboxidotrófico para la formación de etanol a través de acetil-CoA, que permite la identificación de reacciones de la ruta que limita la velocidad. El grosor de las flechas es proporcional a la actividad de la reacción de la ruta particular.
La Figura 2 es un mapa de flujo que detalla las actividades enzimáticas medidas y el flujo a través de un microorganismo carboxidotrófico para la formación de 2,3-butanodiol a través del piruvato, que permite la identificación de reacciones de la ruta que limita la velocidad.
La Figura 3 es un diagrama que muestra la ruta del 2,3-butanodiol y la ruta de biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada asociada. El piruvato se convierte en a-acetolactato, el intermedio tanto para el 2,3-butanodiol como para las rutas de biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada. Se realizaron experimentos para sobreexpresar PFOR, als S y als D.
La Figura 4 es una representación esquemática del plásmido pMTL83159. El plásmido contiene un gen (ColE1) de origen de replicación gramnegativo, un gen (repH) de origen de replicación grampositivo, el gen de transferencia traJ, el gen catP que codifica la resistencia al cloranfenicol/tiamfenicol, un sitio de clonación múltiple que se ubica dentro de la secuencia de codificación alfa de lac Z y, un promotor del gen de ferredoxina (P« x ).
La Figura 5 es un conjunto de gráficos que muestran los perfiles de crecimiento y metabolitos (biomasa, 2,3-butanodiol (BDO), ácido acético y etanol) frente al tiempo de cinco cepas cultivadas en botellas Schott.
La Figura 6 es un conjunto de gráficos que muestran el perfil de metabolitos (gráficos superiores) y el perfil de gas (gráficos inferiores) de la cepa de sobreexpresión de PFOR, als S y als D combinados y la cepa de control del plásmido a una absorción de CO de 4 mol/l/d en el transcurso de 20 días.
La Figura 7 es un conjunto de gráficos que muestran los perfiles del metabolito y gas del cultivo de sobreexpresión con una absorción de CO de 8 mol/l/d durante el transcurso de 11 días.
La Figura 8 es un conjunto de gráficos que muestran la producción de biomasa y butanodiol de cultivos que expresan alsD de A. hydrophila (cuadrados abiertos), alsD de L. lactis (cuadrados cerrados) y control de plásmido vacío (triángulos). Los valores son el promedio de tres repeticiones y las barras de error representan una desviación estándar.
Descripción detallada de la invención
Una ruta de fermentación es una cascada de reacciones bioquímicas (reacciones de ruta) por las cuales un sustrato, preferentemente un sustrato gaseoso, se convierte en un producto de fermentación. Las reacciones de la ruta generalmente implican enzimas que catalizan o aumentan la velocidad de la reacción de la ruta.
"Flujo" se refiere al flujo de metabolitos a través de una o más reacciones en una ruta de fermentación. El flujo a través de reacciones de rutas individuales tiene un límite superior e inferior. Por lo tanto, el flujo puede cambiarse ajustando las condiciones o factores que afectan a la actividad enzimática. El ajuste del flujo a través de una reacción de ruta puede alterar el flujo general de la ruta de fermentación. El flujo puede medirse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. A modo de ejemplo, el flujo puede medirse usando un análisis de equilibrio de flujo (FBA) (Gianchandani, Systems Biol Medicine, 2: 372-382, 2010). El flujo a través de la ruta también puede medirse por el nivel de metabolitos y productos (metabolómica) (Patti, Nat Rev Molec Cell Biol, 13: 263-269, 2012) y/o experimentos de marcaje como C13 (flujómica) (Niittylae, Methods Mol Biol, 553: 355-372, 2009; Tang, Mass Spectrom Rev, 28:362-375, 2009).
La eficiencia de una ruta de fermentación puede aumentarse aumentando el flujo de reacción a través de la ruta. El flujo aumentado da como resultado uno o más de: una velocidad del crecimiento aumentada de microorganismos que realizan la fermentación, una velocidad del crecimiento y/o una velocidad de producción del producto aumentadas a concentraciones elevadas de producto, una concentración de producto de fermentación aumentada en el caldo de fermentación, un volumen de producto de fermentación aumentado producido por volumen de sustrato consumido, una velocidad de producción o nivel de producción aumentados del producto de fermentación. Preferentemente, el aumento de la eficiencia da como resultado una velocidad de producción del producto de fermentación aumentada.
Un método para identificar reacciones que limitan la velocidad (cuellos de botella) es medir las actividades enzimáticas para todas las reacciones implicadas en la ruta de fermentación desde el sustrato hasta el producto. Esto puede hacerse analizando la actividad enzimática de reacciones en células que crecen en condiciones de proceso para identificar las reacciones con las velocidades más bajas. Estas pueden ajustarse después para no limitar la velocidad, aumentando de esta manera el flujo a lo largo del sistema. La actividad enzimática puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, tales como los métodos descritos en Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012.
Los inventores han analizado la actividad de las enzimas implicadas en las rutas de fermentación y han descubierto que algunas reacciones de la ruta exhiben una actividad enzimática sustancialmente menor que otras reacciones en la misma ruta. Los microorganismos recombinantes y los métodos descritos en el presente documento tienen una utilidad particular para las que el rendimiento del producto en un microorganismo parental puede carecer del rendimiento del producto para ser una diana comercial viable.
Algunos ejemplos de rutas de fermentación que son susceptibles de análisis de la actividad enzimática incluyen la ruta Wood-Ljungdahl, rutas de fermentación para producir etanol, 2,3-butanodiol o un precursor de los mismos tales como acetil-CoA y piruvato y rutas de biosíntesis para los cofactores tetrahidrofolato y cobalamina (B12) que pueden ser necesarios en las rutas de fermentación. La ruta Wood-Ljungdahl se compone de una serie de reacciones catalizadas por enzimas, como se describe en la Figura 1 y la Figura 2. Las etapas posteriores a la ruta Wood-Ljungdahl que conducen a la producción de productos de fermentación deseables también se consideran parte de la ruta de fermentación. En una realización particular, la ruta de fermentación da como resultado la producción de un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste en etanol, butanol, isopropanol, isobutanol, alcoholes superiores, 2,3-butanodiol, succinato, isoprenoides, ácidos grasos, biopolímeros y mezclas de los mismos.
La invención proporciona una una bacteria Clostridium carboxidotrófica recombinante que comprende:
(a) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1);
(b) una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
(c) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6);
(d) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
(e) una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5); o
(f) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1), una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
en donde cada enzima es una enzima endógena sobreexpresada o una enzima exógena; y
en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, y Clostridium ragsdalei. En una realización preferida, la bacteria recombinante deriva de C. autoethanogenum depositado con el número de registro DSMZ DSM23693 (C. autoethanogenum LZ1561).
Un "microorganismo parental" es un microorganismo usado para generar un microorganismo recombinante de la invención. El microorganismo parental puede ser uno que se encuentre en la naturaleza (es decir, un microorganismo de tipo silvestre) o uno que haya sido modificado previamente (es decir, un microorganismo recombinante). Los microorganismos recombinantes de la invención pueden modificarse para expresar o sobreexpresar una o más enzimas que se expresaron o sobreexpresaron o no en el microorganismo parental, o pueden modificarse para exhibir una disponibilidad aumentada de uno o más cofactores. En una realización, el organismo parental puede ser C. autoethanogenum, C. ljungdahlii o C. ragsdalei. En una realización particularmente preferida, el organismo parental es C. autoethanogenum LZ1561, que se deposita bajo el registro de DSMZ DSM23693.
Un "microorganismo recombinante" es un microorganismo que se ha sometido a una modificación genética en comparación con un microorganismo parental. La modificación genética incluye inserción, deleción o sustitución de ácidos nucleicos, por ejemplo.
En general, la expresión "derivado de" indica que un ácido nucleico, proteína, o microorganismo se modifica o se adapta a partir de un ácido nucleico, proteína o microrganismo diferentes (es decir, parental o de tipo silvestre), respectivamente, para producir un nuevo microorganismo recombinante.
Los métodos de modificación genética de un microorganismo parental incluyen métodos moleculares tales como la expresión de genes heterólogos, inserción o deleción del genoma, expresión génica alterada o inactivación de genes, o métodos de ingeniería enzimática. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Pleiss, Curr Opin Biotechnol, 22: 611-617, 2011; Park, Protein Engineering and Design, CRC Press, 2010. Las construcciones/vectores de expresión pueden contener, por ejemplo, uno o más promotores o sitios de unión ribosómica. Los ácidos nucleicos y las secuencias de construcción/vector descritas en el presente documento también pueden contener nucleótidos enlazadores convencionales tales como aquellos requeridos para los sitios de unión a ribosomas y/o sitios de restricción.
Los ácidos nucleicos y las construcciones de ácidos nucleicos, incluyendo construcciones/vectores de expresión pueden construirse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse síntesis química o técnicas recombinantes. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Esencialmente, los genes individuales y los elementos reguladores pueden unirse operativamente entre sí de manera que los genes puedan expresarse para formar las proteínas deseadas. Los vectores adecuados se apreciarán por aquellos expertos en la materia. Sin embargo, a modo de ejemplo, los siguientes vectores pueden ser adecuados: vectores pMTL80000, plMP1, pJIR750 y otros plásmidos.
Los ácidos nucleicos pueden administrarse a un microorganismo usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden administrarse a un microorganismo como ácidos nucleicos desnudos o pueden formularse con uno o más agentes (por ejemplo, liposomas) para facilitar el proceso de transformación en el microorganismo. Los ácidos nucleicos pueden ser a Dn , ARN, ADNc o combinaciones de los mismos, según sea apropiado. Pueden usarse inhibidores de restricción (Murray, Microbiol Molec Biol Rev, 64:412-434,2000). Los vectores adicionales incluyen plásmidos, virus (incluyendo bacteriófagos), cósmidos y cromosomas artificiales. Los ácidos nucleicos pueden administrarse a un microorganismo usando un plásmido. Solamente a modo de ejemplo, la transformación (incluyendo transducción o transfección) puede lograrse mediante electroporación, ultrasonidos, transformación mediada por polietilenglicol, competencia química o natural, transformación de protoplastos, inducción o conjugación de profagos. Las técnicas de transformación adecuadas se describen, por ejemplo, en, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Se ha informado del uso de electroporación para varios acetógenos carboxidotróficos, incluyendo C. ljungdahlii (Koepke, PNAS, 107:13087-13092, 2010; documento WO 2012/053905), C. autoethanogenum (documento WO/2012/053905), C. aceticum (Schiel-Bengelsdorf, Synthetic Biol, 15: 2191-2198, 2012) y A. woodii (Stratz, Appl Environ Microbiol, 60: 1033-1037, 1994). El uso de electroporación también se ha informado en Clostridia, incluyendo C. acetobutylicum (Mermelstein, Biotechnol, 10: 190-195, 1992) y C. cellulolyticum (Jennert, Microbiol, 146: 3071­ 3080, 2000). Adicionalmente, se ha demostrado la inducción de profagos para acetógenos carboxidotróficos, incluyendo C. scatologenes (Parthasarathy, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project, Western Kentucky University, 2010) y la conjugación se ha descrito para muchos Clostridia, incluyendo C. difficile (Herbert, FEMS Microbiol Lett, 229: 103-110, 2003) y C. acetobuylicum (Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826, 1990). Podrían usarse métodos similares en acetógenos carboxidotróficos.
La invención proporciona una bacteria Clostridium carboxidotrófica recombinante adaptada para exhibir un flujo aumentado a través de una vía de fermentación en relación con un microorganismo parental. En una realización particular de la invención, el microorganismo parental se selecciona del grupo de Clostridia carboxidotróficas que comprenden C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii y C. ragsdalei.
La bacteria recombinante puede derivar del grupo de Clostridia carboxidotróficos que comprende las especies C. autoethanogenum, C. ljungdahlii, C. ragsdalei, y aislados relacionados. Estos incluyen pero no se limitan a las cepas de C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (documento WO 2009/064200), C. autoethanogenum LZ1561 (DSM23693), C. Ijungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), C. Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (Patente de EE.UU. 5.593.886), C. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) (Patente de EE.UU. 6.368.819), C. Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989) (Patente de EE.UU. 6.368.819), C. ragsdalei P11T (ATCC BAA-622) (documento WO 2008/028055), aislados relacionados tales como "C. coskatii" (Publicación de EE.UU. 2011/0229947), o cepas mutadas tales como C. Ijungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium Ijungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010). Estas cepas forman un subgrupo dentro del grupo I de ARNr Clostridial y su gen de ARNr 16S es más del 99 % idéntico con un bajo contenido en Gc similar de alrededor del 30 %. Sin embargo, la reasociación de ADN-ADN y los experimentos de huella de ADN mostraron que estas cepas pertenecían a especies distintas (documento WO 2008/028055). Las cepas de este grupo se definen por características comunes, teniendo ambas un genotipo y un fenotipo similares, y todas comparten el mismo modo de conservación de energía y metabolismo fermentativo. Las cepas de este grupo carecen de citocromos y conservan energía a través de un complejo Rnf.
Todas las especies del grupo anteriormente mencionado tienen una morfología y tamaño similares (el crecimiento logarítmico de las células varía de 0,5-0,7 x 3-5 mm), son mesófilas (temperatura óptima de crecimiento entre 30­ 37 °C) y estrictamente anaerobias (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232­ 236, 1993; y el documento WO 2008/028055). Por otra parte, todas ellas comparten los mismos rasgos filogenéticos principales, tales como el mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), un fuerte crecimiento autotrófico en gases que contienen CO con tasas de crecimiento similares, y un perfil metabólico similar con etanol y ácido acético como productos finales de fermentación principal, y pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formadas en determinadas condiciones (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993; y el documento WO 2008/028055). La producción de indol también se observó con las tres especies. Sin embargo, las especies se diferencian en la utilización del sustrato de diversos azúcares (por ejemplo, ramnosa, arabinosa), ácidos (por ejemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina) u otros sustratos (por ejemplo, betaína, butanol). Además se encontró que algunas de las especies eran auxótrofas a ciertas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina) mientras que otras no. La organización y el número de genes de la ruta Wood-Ljungdahl, responsable de la absorción de gases, se ha encontrado que son los mismos en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias de los ácidos nucleicos y aminoácidos (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011). También, se ha demostrado la reducción de ácidos carboxílicos en sus correspondientes alcoholes en una variedad de estos microorganismos (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Estos rasgos por lo tanto no son específicos de un organismo como C. autoethanogenum o C. ljungdahlii, sino rasgos generales para carboxidotróficos, Clostridia sintetizadores de etanol y puede anticiparse que los mecanismos funcionan de manera similar en estas cepas, aunque puede haber diferencias en el rendimiento.
En una realización, el microorganismo parental es C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. Preferentemente, el microorganismo parental es C. autoethanogenum de tipo silvestre o C. autoethanogenum depositado con el número de registro de DSMZ DSM10061 o DSM23693 (C. autoethanogenum LZ1561). En una realización, la bacteria recombinante deriva de C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. Preferentemente, la bacteria recombinante deriva de C. autoethanogenum de tipo silvestre o C. autoethanogenum depositado con el número de registro de DSMZ DSM23693 (C. autoethanogenum LZ1561).
Las enzimas y genes usados en la invención pueden ser enzimas y genes endógenos sobreexpresados, o enzimas y genes exógenos.
"Endógeno" se refiere a un ácido nucleico o proteína que está presente en la bacteria de tipo silvestre o parental a partir de la cual deriva la bacteria recombinante de la invención. La expresión de un gen endógeno puede estar controlada por un elemento regulador exógeno, tal como un promotor exógeno.
"Endógeno" se refiere a un ácido nucleico o proteína que no está presente en la bacteria de tipo silvestre o parental a partir de la cual deriva la bacteria recombinante de la invención. Un gen o enzima exógeno puede derivar de una cepa o especie heteróloga e introducirse al o expresarse en la bacteria recombinante. Puede crearse un gen o enzima exógeno de forma artificial o recombinante. Los ácidos nucleicos exógenos pueden adaptarse para integrarse en el genoma de la bacteria o permanecer en un estado extracromosómico en la bacteria, por ejemplo, en un plásmido.
"Actividad enzimática" se refiere ampliamente a la actividad enzimática, incluyendo, pero no limitado, a la actividad de una enzima, la cantidad de una enzima, o la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción. En consecuencia, "aumentar" la actividad enzimática incluye un aumento en la actividad de una enzima, un aumento en la cantidad de una enzima o un aumento en la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción.
Los genes y enzimas usados en la invención pueden desarrollarse o diseñar usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, evolución dirigida, diseño basado en el conocimiento, métodos de mutagénesis aleatoria, aleatorización de genes, optimización de codones, uso de bibliotecas específicas del sitio y uso de bibliotecas de evaluación del sitio.
"Mutado" se refiere a un ácido nucleico o proteína que se ha modificado en la bacteria recombinante de la invención en comparación con la bacteria de tipo silvestre o parental de la que se deriva la bacteria recombinante de la invención. La mutación puede ser una deleción, inserción o sustitución en un gen que codifica una enzima. La mutación puede ser una deleción, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos en una enzima.
"Optimización de codones" se refiere a la mutación de un ácido nucleico, tal como un gen, para la traducción optimizada o mejorada del ácido nucleico en una cepa o especie particular. La optimización de codones puede dar como resultado velocidades de traducción más rápidas o una mayor precisión de traducción.
Los genes que codifican las enzimas pueden tener codones optimizados para la expresión en Clostridium, particularmente C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii y/o C. ragsdalei. Los genes que codifican las enzimas pueden tener codones optimizados para la expresión en C. autoethanogenum LZ1561.
"Sobreexpresado" se refiere a cualquier aumento en la expresión de un ácido nucleico o proteína en la bacteria recombinante de la invención en comparación con la bacteria de tipo silvestre o parental de la que deriva la bacteria recombinante de la invención. La sobreexpresión puede lograrse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo la modificación del número de copias del gen, la velocidad de transcripción de genes, la velocidad de traducción de genes o la velocidad de degradación enzimática.
"Enzima endógena sobreexpresada" se refiere a una enzima endógena que está presente a niveles más altos en la bacteria recombinante de la invención en comparación con la bacteria de tipo silvestre o parental de la que deriva la bacteria recombinante de la invención. La enzima endógena sobreexpresada también puede codificarse por un gen endógeno, que puede modificarse, por ejemplo, para controlarse por un promotor fuerte o constitutivo. De forma similar, "gen endógeno sobreexpresado" se refiere a un gen endógeno que está presente o transcrito a velocidades o niveles más altos en la bacteria recombinante de la invención en comparación con la bacteria de tipo silvestre o parental de la que deriva la bacteria recombinante de la invención.
"Enzima endógena mutada" se refiere a una enzima endógena que está mutada o modificada en la bacteria recombinante de la divulgación en comparación con la bacteria de tipo silvestre o parental de la que deriva la bacteria recombinante de la divulgación. De forma similar, "gen endógeno mutado" se refiere a un gen endógeno que está mutado o modificado en la bacteria recombinante de la divulgación en comparación con la bacteria de tipo silvestre o parental de la que deriva la bacteria recombinante de la divulgación.
"Enzima exógena" se refiere a una enzima que no está presente en la bacteria de tipo silvestre o parental de la que deriva la bacteria recombinante de la invención. De forma similar, "gen exógeno" se refiere a un gen que no está presente en la bacteria de tipo silvestre o parental a partir de la cual deriva la bacteria recombinante de la invención. Típicamente, la enzima o gen exógeno deriva de una cepa o especie heteróloga y se introduce en o se expresa en la bacteria recombinante.
La invención puede ponerse en práctica usando ácidos nucleicos variantes o proteínas cuya secuencia varía de las secuencias específicamente ejemplificadas en el presente documento siempre que realicen sustancialmente la misma función. Para las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína o péptido, esto significa que la proteína o péptido codificado tiene sustancialmente la misma función. Para secuencias de ácido nucleico que representan secuencias promotoras, la secuencia variante tendrá una capacidad similar para promover la expresión de uno o más genes. Tales ácidos nucleicos o proteínas pueden denominarse en el presente documento "variantes funcionalmente equivalentes". A modo de ejemplo, las variantes funcionalmente equivalentes de un ácido nucleico incluyen variantes alélicas, fragmentos de un gen, genes que incluyen mutaciones (deleción, inserción, sustituciones de nucleótidos y similares) y/o polimorfismos y similares. Los genes homólogos de otros microorganismos también pueden considerarse ejemplos de variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias ejemplificadas específicamente en el presente documento. Estos incluyen genes homólogos en especies tales como C. acetobutylicum, C. beijerinckii o C. Ijungdahlii, cuyos detalles están disponibles públicamente en sitios web tales como Genbank o NCBI. Las variantes funcionalmente equivalentes también incluyen ácidos nucleicos cuya secuencia varía como resultado de la optimización de codones para un organismo particular. Una variante de un ácido nucleico funcionalmente equivalente tendrá preferentemente al menos aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 98 % o más de identidad de secuencia del ácido nucleico con el ácido nucleico de especificado. Una variante de una proteína funcionalmente equivalente preferentemente tendrá al menos aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 98 % o más de identidad de aminoácidos con la proteína especificada. Tales variantes incluyen un fragmento de una proteína o péptido en donde el fragmento comprende una forma truncada de la proteína o péptido en donde las deleciones pueden ser de 1 a 5, a 10, a 15, a 20, a 25 aminoácidos y puede extenderse desde el resto 1 al 25 en cualquier extremo del polipéptido, y en donde las deleciones pueden tener cualquier longitud dentro de la región o pueden estar en una ubicación interna. La equivalencia funcional de un ácido nucleico o proteína variantes puede evaluarse usando cualquier método conocido en la técnica. Sin embargo, a modo de ejemplo, los ensayos para probar la actividad de determinadas enzimas se describen en Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012.
Puede ser necesario metilar un ácido nucleico antes de la introducción del ácido nucleico en un microorganismo.
Generalmente, la metilación se realiza usando un microorganismo lanzadera, preferentemente un microorganismo lanzadera de restricción negativa, tales como E. coli, B. subtillis, o L. lactis, que facilita la metilación de las secuencias de ácidos nucleicos que componen el constructo/vector de expresión. La construcción/vector de metilación comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una metiltransferasa. Una vez que la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación se introducen en el microorganismo lanzadera, se induce el gen de la metiltransferasa presente en la construcción/vector de metilación. La inducción puede ser por cualquier sistema promotor adecuado, por ejemplo, la construcción/vector de metilación puede comprender un promotor lac inducible y se induce mediante la adición de lactosa o un análogo de la misma, más preferentemente isopropil-p-D-tio-galactósido (IPTG). Otros promotores adecuados incluyen el sistema ara, tet, o T7. La construcción de metilación/promotor de vector puede ser un promotor constitutivo.
La construcción/vector de metilación puede tener un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo lanzadera, de modo que cualquier gen presente en la construcción/vector de metilación se exprese en el microorganismo lanzadera. Preferentemente, la construcción/vector de expresión tiene un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo de destino, de modo que cualquier gen presente en la construcción/vector de expresión se exprese en el microorganismo de destino.
La expresión de la enzima metiltransferasa da como resultado la metilación de los genes presentes en la construcción/vector de expresión. La construcción/vector de expresión puede aislarse después del microorganismo lanzadera de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Ambos constructos/vectores pueden aislarse al mismo tiempo. La construcción/vector de expresión puede introducirse en el microorganismo de destino usando cualquier método conocido en la técnica. Dado que la construcción/vector de expresión está metilado, las secuencias de ácido nucleico presentes en la construcción/vector de expresión pueden incorporarse al microorganismo de destino y expresarse con éxito.
Puede introducirse un gen de metiltransferasa en un microorganismo lanzadera y sobreexpresarse. Por lo tanto, la enzima metiltransferasa resultante puede recolectarse usando métodos conocidos y usarse in vitro para metilar un plásmido de expresión. La construcción/vector de expresión puede introducirse después en el microorganismo de destino para la expresión. El gen de la metiltransferasa puede introducirse en el genoma del microorganismo lanzadera seguido de la introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo lanzadera, aislamiento de una o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera y luego introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo de destino.
La construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación pueden combinarse para proporcionar una composición de materia. Dicha composición tiene una utilidad particular para eludir los mecanismos de barrera de restricción para producir los microorganismos recombinantes de la invención. La construcción/vector de expresión y/o la construcción/vector de metilación pueden ser plásmidos. Pueden usarse varias metiltransferasas adecuadas, incluyendo, por ejemplo, la metiltransferasa de B. subtilis fago OT1 o la metiltransferasa descrita en el documento WO 2012/053905. De forma similar, pueden usarse varias construcciones/vectores adaptados para permitir la expresión de un gen de metiltransferasa para generar la construcción/vector de metilación.
A modo de ejemplo, un microorganismo recombinante de la invención puede producirse mediante un método que comprende (a) la introducción en un microorganismo lanzadera de (i) una construcción/vector de expresión que comprende un ácido nucleico como se describe en el presente documento y (ii) una construcción/vector de metilación que comprende un gen de metiltransferasa; y (b) expresión del gen de la metiltransferasa; aislamiento de una o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera; e introducción de una o más construcciones/vectores en un microorganismo de destino. El gen de la metiltransferasa de la etapa (b) puede expresarse de forma constitutiva. Puede inducirse la expresión del gen de la metiltransferasa de la etapa (b).
La bacteria recombinante de la invención comprende uno o más de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa y/o acetolactato descarboxilasa, y además opcionalmente acetolactato sintasa.
La piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (PFOR o POR) (EC 1.2.7.1) es una enzima perteneciente a una familia de oxidorreductasas que cataliza la transferencia de electrones de una molécula (el reductor o donador de electrones) a otra (el oxidante o aceptor de electrones). Específicamente, la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa cataliza la interconversión de piruvato y acetil-CoA: piruvato CoA 2 ferredoxina oxidada ^ acetil-CoA CO2 2 ferredoxina reducida 2 H+. La conversión de acetil-CoA en piruvato enlaza la ruta Wood-Ljungdahl de la fijación autótrofa de CO (2) al ciclo reductor del ácido tricarboxílico, que en anaerobios autótrofos es el escenario para la biosíntesis de todas las macromoléculas celulares (Furdi, J Biol Chem, 15: 28494-28499, 2000). La piruvato:ferredoxina oxidorreductasa también puede conocerse como piruvato:ferredoxina 2-oxidorreductasa (CoA-acetilante), piruvato oxidorreductasa, piruvato sintasa, piruvato sintetasa o pirúvico-ferredoxina oxidorreductasa.
La enzima piruvato:ferredoxina oxidorreductasa usada en la invención puede ser una enzima endógena sobreexpresada, una enzima endógena mutada o una enzima exógena. De forma similar, la enzima piruvato:ferredoxina oxidorreductasa usada en la invención puede estar codificada por un gen de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa endógeno que se ha diseñado para la sobreexpresión, puede estar codificada por un gen de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa endógeno mutado, o puede estar codificada por un gen de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa exógeno. La enzima piruvato: ferredoxina oxidorreductasa puede ser piruvato:ferredoxina oxidorreductasa sobreexpresada endógena, tales como piruvato:ferredoxina oxidorreductasa sobreexpresada endógena de C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. Las enzimas piruvato:ferredoxina oxidorreductasa son a menudo inestables en presencia de oxígeno. La enzima piruvato:ferredoxina oxidorreductasa puede ser estable al oxígeno o demostrar al menos cierto grado de insensibilidad al oxígeno. La enzima piruvato:ferredoxina oxidorreductasa puede ser piruvato: ferredoxina oxidorreductasa exógena de Desulfovibrio africanus o una enzima derivada de la misma. La expresión de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa de D. africanus se ha demostrado en E. coli (Pieulle, J Bacteriol, 179: 5684-5692, 1997), pero no en un microorganismo Clostridium.
La acetolactato sintasa (Als) (EC 2.2.1.6) es una enzima que cataliza la primera etapa en la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada, tales como valina, leucina e isoleucina. En particular, la acetolactato sintasa es una transcetolasa que tiene formas tanto catabólicas como anabólicas, y cataliza la conversión de dos moléculas de piruvato en una molécula de acetolactato y dióxido de carbono: 2 CHaCOCOO’ ^ CHaCOCOHCHaCOO’ + CO2. La acetolactato sintasa también puede conocerse como acetohidroxiácido sintasa.
La enzima acetolactato sintasa usada en la invención puede ser una enzima endógena sobreexpresada, una enzima endógena mutada o una enzima exógena. De forma similar, la enzima acetolactato sintasa usada en la invención puede estar codificada por un gen de acetolactato sintasa endógeno que se ha diseñado para sobreexpresión, puede estar codificado por un gen de acetolactato sintasa endógeno mutado o puede estar codificado por un gen de acetolactato sintasa exógeno. La acetolactato sintasa puede ser anabólica o catabólica. La enzima acetolactato sintasa puede ser acetolactato sintasa endógena sobreexpresada, tal como acetolactato sintasa sobreexpresada endógena de C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. En particular, la enzima acetolactato sintasa puede ser llvB, ILvB ORF2059, llvB ORF2336, llvC, llvN, llvBN o AlsS acetolactato sintasa endógenas sobreexpresadas. La enzima acetolactato sintasa puede ser acetolactato sintasa endógena mutada, tales como la acetolactato sintasa mutada derivada de cualquier acetolactato sintasa endógena de C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. En particular, la acetolactato sintasa endógena mutada puede ser acetolactato sintasa IIvN insensible a la retroalimentación. La enzima acetolactato sintasa puede ser acetolactato sintasa exógena, tales como síntesis de acetolactato de Bacillus subtilis, particularmente AlsS acetolactato sintasa de B. subtilis insensible a la retroalimentación. La expresión de AlsS de B. subtilis se ha mostrado en Synechococcus elongatus sp. cepa PCC 7942 (Oliver, Metabol Eng, 22:76-82, 2014), pero no en un microorganismo Clostridium.
La acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5) es una enzima que pertenece a una familia de liasas, específicamente las carboxi-liasas, que escinden enlaces carbono-carbono. La acetolactato descarboxilasa cataliza la reacción de (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato a (R)-2-acetoína y CO2 : (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato ^ (R)-2-acetoína CO2. La acetolactato descarboxilasa también puede conocerse como alfa-acetolactato descarboxilasa o (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato carboxilasa.
La enzima acetolactato descarboxilasa usada en la invención puede ser una enzima endógena sobreexpresada, una enzima endógena mutada o una enzima exógena. De forma similar, la enzima acetolactato descarboxilasa usada en la invención puede estar codificada por un gen de acetolactato descarboxilasa endógeno que se ha diseñado para sobreexpresión, puede estar codificado por un gen de acetolactato descarboxilasa endógeno mutado o puede estar codificado por un gen de acetolactato descarboxilasa exógeno. La enzima acetolactato descarboxilasa puede ser acetolactato descarboxilasa endógena sobreexpresada, tal como acetolactato descarboxilasa sobreexpresada endógena de C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. La acetolactato descarboxilasa endógena sobreexpresada puede ser acetolactato descarboxilasa BudA o acetolactato descarboxilasa AlsD. La enzima acetolactato descarboxilasa puede ser acetolactato descarboxilasa exógena, tales como acetolactato descarboxilasa de Aeromonas hydrophila o acetolactato descarboxilasa de Leuconostoc lactis. La expresión de AlsD de B. subtilis se ha mostrado en Synechococcus elongatus sp. cepa PCC 7942 (Oliver, Metabol Eng, 22: 76-82, 2014), pero no en un microorganismo Clostridium.
Las enzimas piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, acetolactato sintasa y acetolactato deshidrogenasa pueden comprender o pueden derivar de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la siguiente tabla. De forma similar, los genes que codifican las enzimas piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, acetolactato sintasa y acetolactato deshidrogenasa pueden comprender o pueden derivar de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos en la siguiente tabla. Por otra parte, cualquiera de las enzimas o genes pueden ser variantes de las secuencias de la siguiente tabla. Por ejemplo, las enzimas o genes pueden tener aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias en la siguiente tabla.
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La bacteria recombinante de la invención también puede comprender cualquier combinación de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa y/o acetolactato descarboxilasa, y además opcionalmente acetolactato sintasa. La bacteria puede comprender piruvato:ferredoxina oxidorreductasa y acetolactato sintasa, pero no acetolactato descarboxilasa. La bacteria puede comprender piruvato:ferredoxina oxidorreductasa y acetolactato descarboxilasa, pero no acetolactato sintasa. La bacteria puede comprender acetolactato sintasa y acetolactato descarboxilasa, pero no piruvato:ferredoxina oxidorreductasa. Finalmente, la bacteria puede comprender cada uno de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, acetolactato sintasa y acetolactato descarboxilasa.
La bacteria recombinante de la invención puede además expresar o manipularse para expresar o sobreexpresar una o más de alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), aldehído deshidrogenasa (acilante) (EC 1.2.1.10), formiato deshidrogenasa (EC 1.2.1.2), formil-THF sintetasa (EC 6.3.2.17), metilen-THF deshidrogenasa/formil-THF ciclohidrolasa (EC: 6.3.4.3), metilen-THF reductasa (EC 1.1,1.58), Co deshidrogenasa/acetil-CoA sintasa (EC 2.3.1.169), aldehído ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.5), fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8), acetato quinasa (EC 2.7.2.1), Co deshidrogenasa (EC 1.2.99.2), hidrogenasa (EC 1.12.7.2), piruvato:formiato liasa (EC 2.3.1.54), 2,3butanodiol deshidrogenasa (EC 1.1.1.4), alcohol primario:secundario deshidrogenasa (EC 1.1.1.1), formiato deshidrogenasa (EC 1.2.1.2), formil-THF sintetasa (EC 6.3.2.17), metilen-THF deshidrogenasa/formil-THF ciclohidrolasa (EC: 6.3.4.3), metilen-THF reductasa (EC 1.1,1.58), C o deshidrogenasa/acetil-CoA sintasa (EC 2.3.1.169), CO deshidrogenasa (EC 1.2.99.2) e hidrogenasa (EC 1.12.7.2).
Un "cofactor enzimático" o simplemente un "cofactor" es un compuesto no proteico que se une a una enzima para facilitar la función biológica de la enzima y, por tanto, la catálisis de una reacción. Los ejemplos no limitantes de cofactores incluyen NAD+, NADP+, cobalamina, tetrahidrofolato y ferredoxina. "Dinucleótido de nicotinamida y adenina" (NADH) se refiere a NAD+ (forma oxidada), NADH H+ (forma reducida) o el par redox de NAD+ y NADH H+. "Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato" (NADPH) se refiere a NADP+ (forma oxidada), NADPH H+ (forma reducida) o el par redox de NADP+ y NADPH H+. El aumento de la disponibilidad general del cofactor puede aumentar la velocidad de una reacción de la ruta. Los factores que pueden afectar la producción del cofactor incluyen la expresión de genes de biosíntesis del cofactor que pueden alterarse para lograr una mayor disponibilidad del cofactor. También pueden usarse otros factores conocidos por un experto en la técnica para
lograr una mayor disponibilidad del cofactor. La falta de disponibilidad de cofactores puede tener efectos limitantes de la velocidad de las reacciones de la ruta. Los métodos para la determinación de la disponibilidad de cofactores se conocen en la técnica.
La bacteria recombinante de la invención puede además expresar o manipularse para expresar o sobreexpresar una enzima implicada en la biosíntesis de un cofactor. El cofactor puede comprender tetrahidrofolato. Las enzimas que participan en la biosíntesis del tetrahidrofolato se detallan a continuación. El microorganismo recombinante puede exhibir una mayor expresión de GTP ciclohidrolasa I (EC 3.5.4.16), fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1), dihidroneopterina aldolasa (EC 4.1.2.25), 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetildihidropteridina difosfoquinasa (EC 2.7.6.3), dihidropteroato sintasa (2.5.1.15), dihidropteroato sintasa (EC 2.5.1.15), dihidrofolato sintasa (EC 6.3.2.12), folilpoliglutamato sintasa (6.3.2.17), dihidrofolato reductasa (EC 1.5.1.3), timidilato sintasa (EC 2.1.1.45), dihidromonapterina reductasa (EC 1.5.1.-). El cofactor puede comprender cobalamina (B12). Las enzimas que participan en la biosíntesis de cobalamina se detallan a continuación. El microorganismo recombinante puede exhibir una expresión aumentada de 5-aminolevulinato sintasa (EC 2.3.1.37), 5-aminolevulinato:piruvato aminotransferasa (EC 2.6.1.43), adenosilcobinamida quinasa I adenosilcobinamida-fosfato guanililtransferasa (EC 2.7.1.156/2.7.7.62), adenosilcobinamida-GDP ribazoltransferasa (EC 2.7.8.26), adenosilcobinamida-fosfato sintasa (EC 6.3.1.10), ácido adenosilcobírico sintasa (EC 6.3.5.10), alfa-ribazol fosfatasa (EC 3.1.3.73), cob(l)alamina adenosiltransferasa (EC 2.5.1.17), cob(ll)ácido pirínico а, c-diamida reductasa (EC 1.16.8.1), cobalto-precorrin 5A hidrolasa (EC 3.7.1.12), cobalto-precorrin-5B (C1)-metiltransferasa (EC 2.1.1.195), cobalto-precorrin-7 (C15)-metiltransferasa (EC 2.1.1.196), cobaltoquelatasa CobN (EC 6.6.1.2), ácido cobirínico a,c-diamida sintasa (EC 6.3.5.9/6.3.5.11), ferritina ( e C 1.16.3.1), glutamato-1-semialdehído 2,1-aminomutasa (EC 5.4.3.8), glutamil-ARNt reductasa (EC 1.2.1.70), glutamil-ARNt sintetasa (EC б. 1.1.17), hidroximetilbilano sintasa (EC 2.5.1.61), nicotinato-nucleótido-dimetilbencimidazol fosforribosiltransferasa (EC 2.4.2.21), coproporfirinógeno III oxidasa independiente de oxígeno (EC 1.3.99.22), porfobil inógeno sintasa (EC 4.2.1.24), precorrin-2 deshidrogenasa/sirohidroclorin ferroquelatasa (EC 1.3.1.76/4.99.1.4), precorrin-2/factor de cobalto-2 C20-metiltransferasa (EC 2.1.1.130/2.1.1.151), precorrin-3B sintasa (EC 1.14.13.83), precorrin-3B C17-metiltransferasa (EC 2.1.1.131), precorrin-4C11-metiltransferasa (EC 2.1.1.133), precorrin-6X reductasa (EC 1.3.1.54), precorrin-6Y C5,15-metiltransferasa (EC 2.1.1.132), precorrin-8W descarboxilasa (EC 1.-.-.-), precorrin-8X metilmutasa (EC 5.4.1.2), sirohidroclorina cobaltoquelatasa (EC 4.99.1.3), treonina-fosfato descarboxilasa (EC 4.1.1.81), uroporfirinógeno descarboxilasa (EC 4.1.1.37), uroporfirinógeno III metiltransferasa I sintasa (EC 2.1.1.107/4.2.1.75). Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que un aumento en la disponibilidad de un cofactor se logra mediante la sobreexpresión de enzimas o genes implicados en la ruta de biosíntesis de dicho cofactor. Como resultado, las reacciones dependientes de este cofactor ya no son limitantes.
La invención también proporciona métodos para la producción de uno o más productos por fermentación de un sustrato que comprende CO. Preferentemente, el producto es uno o más de etanol, butanol, isopropanol, isobutanol, alcoholes superiores, 2,3-butanodiol, succinato, isoprenoides, ácidos grasos, biopolímeros y mezclas de los mismos.
El sustrato que comprende CO puede ser un sustrato gaseoso que comprende CO. El sustrato normalmente contendrá una proporción importante de CO, tal como aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 100 % de CO en volumen, del 20 % al 70 % de CO en volumen, del 30 % al 60 % de CO en volumen y del 40 % al 55 % de CO en volumen. El sustrato puede comprender aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 % de CO, aproximadamente el 55 % de CO o aproximadamente el 60 % de CO en volumen.
Si bien no es necesario que el sustrato contenga hidrógeno, la presencia de hidrógeno no debe ser perjudicial para la formación del producto de acuerdo con los métodos de la invención. La presencia de hidrógeno puede dar como resultado una eficiencia de la producción de alcohol global mejorada. Por ejemplo, el sustrato puede comprender una relación de aproximadamente 2:1, 1:1 o 1:2 relación de H2 :CO. El sustrato puede comprender aproximadamente el 30 % o menos de H2 en volumen, el 20 % o menos de H2 en volumen, aproximadamente el 15 % o menos de H2 en volumen o aproximadamente el 10 % o menos de H2 en volumen. La corriente de sustrato puede comprender bajas concentraciones de H2 , por ejemplo, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % de H2. La corriente de sustrato puede estar sustancialmente libre de hidrógeno. El sustrato también puede contener algo de CO2 , por ejemplo, aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 80 % de CO2 en volumen o del 1 % a aproximadamente el 30 % de CO2 en volumen.
El sustrato puede comprender menos de o igual a aproximadamente el 20 % de CO2 en volumen. El sustrato puede comprender menos de o igual a aproximadamente el 15 % de CO2 por volumen, menos de o igual a aproximadamente el 10 % de CO2 en volumen, menos de o igual a aproximadamente el 5 % de CO2 en volumen o sustancialmente sin CO2.
Las realizaciones de la invención se describen en términos de administración y fermentación de un "sustrato gaseoso que contiene CO". Sin embargo, debe apreciarse que el sustrato gaseoso puede proporcionarse en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato gaseoso que contiene CO puede proporcionarse disuelto en un líquido. Esencialmente, un líquido se satura con un gas que contiene monóxido de carbono y después ese líquido se añade al biorreactor. Esto puede realizarse usando metodología convencional. A modo de ejemplo, podría usarse un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak, Appl Biochem Biotechnol, 101: 211-227, 2002). A modo de ejemplo adicional, el sustrato gaseoso que contiene CO puede adsorberse sobre un soporte sólido. Tales métodos alternativos están englobados por la expresión "sustrato que comprende CO" y similares.
El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO obtenido como subproducto de un proceso industrial o de alguna otra fuente, tales como los de los gases de escape de los automóviles o la gasificación de biomasa. El proceso industrial puede seleccionarse del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tales como la fabricación de una acería, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinamiento de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. El gas que contiene CO puede capturarse del proceso industrial antes de ser emitido a la atmósfera, usando cualquier método conveniente. El CO puede ser un componente del gas de síntesis (gas que comprende monóxido de carbono e hidrógeno). El CO producido en los procesos industriales normalmente se quema para producir CO2 y por tanto la invención tiene una utilidad particular para reducir las emisiones de gases de efecto invernadero y CO2 y la producción de biocombustible. Dependiendo de la composición del sustrato gaseoso que contiene CO, también puede ser deseable tratarlo para retirar cualquier impureza no deseada, tales como partículas de polvo antes de introducirlo en la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse usando métodos conocidos.
Típicamente, la fermentación se realiza en un biorreactor. El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o torres o tuberías, tales como un reactor de tanque agitado continuo (CSTR, por sus siglas en inglés), reactor de células inmovilizadas (ICR, por sus siglas en inglés), reactor de lecho percolador (TBR, por sus siglas en inglés), columna de burbujeo, fermentador de elevación de gases, mezclador estático u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido. El biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, cuando se hace referencia a la adición de sustrato al biorreactor o la reacción de fermentación, debe entenderse que incluye la adición a uno o ambos de estos reactores, cuando sea apropiado. Como se usan en el presente documento, los términos y expresiones "fermentación", "proceso de fermentación", "reacción de fermentación", y similares abarcan tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis del producto del proceso de fermentación.
Un cultivo de una bacteria de la invención puede mantenerse en un medio de cultivo acuoso que contiene nutrientes, vitaminas y/o minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo. Preferentemente el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento microbiano anaeróbico mínimo. Los medios adecuados son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.173.429, la patente de EE.UU. N.° 5.593.886 y el documento WO 2002/008438.
Es deseable que la fermentación se lleve a cabo en condiciones de fermentación apropiadas para que se produzca la producción del producto de fermentación. Las condiciones de reacción que deben considerarse incluyen presión, temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH de los medios, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque agitado de flujo continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato gaseoso para garantizar que el CO en la fase líquida no se vuelve limitante y concentraciones máximas del producto para evitar la inhibición del producto.
Además, a menudo es deseable aumentar la concentración de CO de una corriente de sustrato (o presión parcial de CO en un sustrato gaseoso) y así aumentar la eficiencia de las reacciones de fermentación donde el C o es un sustrato. El funcionamiento a presiones aumentadas permite un aumento significativo en la tasa de transferencia de CO desde la fase gaseosa a la fase líquida, donde el microorganismo puede absorberlo como fuente de carbono para la producción de fermentación. Esto a su vez significa que el tiempo de retención (definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido entre el caudal de gas de entrada) puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de a presión atmosférica. Las condiciones óptimas de reacción dependerán en parte del microorganismo particular de la invención usado. Sin embargo, en general, se prefiere que la fermentación se realice a una presión superior a la presión ambiente. También, dado que una tasa de conversión de CO es en parte una función del tiempo de retención del sustrato, y que a su vez conseguir el tiempo de retención deseado dictamina el volumen necesario de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen necesario del biorreactor y, en consecuencia, el coste de capital del equipo de fermentación. De acuerdo con los ejemplos dados en la patente de EE.UU. 5.593.886, el volumen del reactor puede reducirse en proporción lineal a los aumentos en la presión de funcionamiento del reactor, es decir, los biorreactores que funcionan a 10 atmósferas de presión solo necesitan ser una décima parte del volumen de los que funcionan a 1 atmósfera de presión.
A modo de ejemplo, los beneficios de llevar a cabo una fermentación de gas a etanol a presiones elevadas se han descrito. Por ejemplo, el documento WO 2002/008438 describe fermentaciones de gas a etanol realizadas a presiones de 0,20 MPa (30 psig) y 0,51 MPa (75 psig), dando productividades de etanol de 150 g/l/día y 369 g/l/día, respectivamente. Sin embargo, se descubrió que las fermentaciones de ejemplo realizadas utilizando medios similares y composiciones de gases de entrada a presión atmosférica producían entre 10 y 20 veces menos etanol por litro al día.
También es deseable que la tasa de introducción del sustrato gaseoso que contiene CO se controle para asegurar que la concentración de CO en la fase líquida no se vuelva limitante, ya que los productos pueden consumirse por el cultivo en condiciones limitadas en CO.
La composición de las corrientes de gas usadas para suministrar a una reacción de fermentación, puede tener un impacto significativo sobre la eficiencia y/o el coste de la reacción. Por ejemplo, el O2 puede reducir la eficiencia de un proceso de fermentación anaerobia. El procesamiento de gases no deseados o innecesarios en las etapas de un proceso de fermentación antes o después de la fermentación puede aumentar la carga en dichas etapas. Por ejemplo, cuando la corriente de gas se comprime antes de entrar en un biorreactor, puede usarse energía innecesaria para comprimir gases que no son necesarios en la fermentación. En consecuencia, puede ser deseable tratar las corrientes de sustrato, particularmente corrientes de sustrato procedentes de fuentes industriales, para retirar componentes no deseados y aumentar la concentración de componentes deseables.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no debe interpretarse como una limitación de su alcance de ninguna manera.
Ejemplo 1
Este ejemplo describe el análisis de las rutas de fermentación de bacterias carboxidotróficas tales como C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii, o C. ragsdalei para los cuellos de botella en la producción de etanol y 2,3-butanodiol.
Se evaluaron las etapas de la enzima oxidorreductasa de la ruta Wood-Ljungdahl y las rutas de fermentación a etanol y 2,3-butanodiol para determinar su actividad. Las reacciones de oxidorreductasa son particularmente adecuadas ya que están acopladas con uno o más cofactores cuya reducción u oxidación puede medirse. También puede usarse para este propósito un colorante redox sintético como el metilviológeno o el bencilviológeno. Las enzimas en estas rutas están implicadas en el crecimiento autótrofo, incluyendo la captación y utilización de gases CO, CO2y H2 , así como la formación de productos.
Las enzimas ensayadas y sus actividades se detallan en la Figura 1. Todos los ensayos se realizaron usando un tinte redox sintético como control, viológeno de metilo (MV) o viológeno de bencilo (BV). Los co-factores ferredoxina (Fd), NADH y NADPH o una combinación de los mismos se probaron después. Los ensayos enzimáticos se realizaron utilizando extractos brutos de una fermentación que crecía autotróficamente en CO e hidrógeno.
Las fermentaciones con C. autoethanogenum se llevaron a cabo en biorreactores de 1,5 l a 37 °C usando gas de acería que contiene CO como única fuente de energía y carbono. El medio de fermentación contenía, por litro, MgCI, CaCI2 (0,5 mM), KCI (2 mM), H3PO4 (5 mM), Fe (100 mM), Ni, Zn (5 mM), Mn, B, W, Mo y Se (2 mM). El medio se transfirió a un biorreactor y se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 45 minutos. Después de esterilizar en autoclave, el medio se complementó con tiamina, pantotenato (0,05 mg) y biotina (0,02 mg) y se redujo con cisteína-HCl 3 mM. Para lograr condiciones anaeróbicas, el recipiente del reactor se roció con nitrógeno a través de un filtro de 0,2 mm. Antes de la inoculación, el gas se cambió a gas de acería que contiene CO, suministrando continuamente al reactor. La composición del gas de alimentación fue 2 % de H2 , 42 % de CO, 20 % de CO2 y 36 % de N2. El pH del cultivo se mantuvo entre 5 y 5,2.
En el momento de la recolección de las células (biomasa de 3,9 g células/l de caldo de fermentación), el consumo de gas fue de 5 moles de CO l-1 día' 1 y 10 milimoles de H2 l-1 día' 1, con los siguientes metabolitos producidos: 14 g L' 1 día-1 de acetato y 19,5 g l-1 día-1 de etanol. El pH del cultivo se ajustó a pH 6 con K2CO3 y el reactor se enfrió en un baño de agua helada. Se recogieron aproximadamente 1,2 l de cultivo en hielo. El cultivo se dividió en dos botellas de centrífuga de 1 l (este y todos los pasos posteriores se llevaron a cabo en una cámara anaeróbica para asegurar condiciones anóxicas para evitar la inactivación de las enzimas) y las células se sedimentaron a 5000 rpm durante 10 min. Se decantó el sobrenadante y se retiró el líquido residual. Cada sedimento se resuspendió en aproximadamente 30 ml de KPO450 mM pH 7,0 con DTT 10 mM. Las resuspensiones se transfirieron a tubos Falcon de 50 ml pesados previamente y las células se resuspendieron a velocidad máxima (5000 g) durante 15 min. Los tubos se retiraron de la cámara anaeróbica e inmediatamente se congelaron en N2 líquido antes de ensayar.
Las células se recogieron de un reactor continuo en condiciones anóxicas. Fueron interrumpidos por tres pases a través de una prensa francesa. Las células sin romper y los restos celulares se retiraron por centrifugación a 20.0003 g y 4 °C durante 30 min. El sobrenadante se usó para ensayos enzimáticos. Excepto cuando se indique, todos los ensayos se realizaron a 37 °C en cubetas anaeróbicas de 1,5 ml cerradas con un tapón de goma con 0,8 ml de mezcla de reacción y 0,7 ml de N2 o H2 o CO a 1,2 x 105 Pa. Las enzimas se ensayaron como se describe a continuación o por Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012. Después del inicio de la reacción con la enzima, la reducción de NAD(P)+ 0 NAD+ se monitorizó espectrofotométricamente a 340 nm (£ = 6,2 mM-1 cirr1) o a 380 nm (£ = 1,2 mM' 1 cirr1), C. pasteurianum reducción de ferredoxina a 430 nm (£áox-rojo = 13,1 mM' 1 cm-1), reducción de viológeno de metilo a 578 nm (£ = 9,8 mM' 1 cm-1) y reducción de viológeno de bencilo a 578 nm (£ = 8,6 mM' 1 cm-1).
La CO deshidrogenasa se midió usando una mezcla de ensayo que contenía Tris/HCl 100 mM (pH 7,5), DTT 2 mM y ferredoxina aproximadamente 30 mM y/o NAD 1 mM+ o NADP+ 1 mM. La fase gaseosa fue un 100 % de CO.
La actividad de la hidrogenasa se midió usando una mezcla de ensayo de Tris/HCl 100 mM (pH 7,5) o fosfato de potasio 100 mM, TDT 2 mM y, ferredoxina 25 mM y/o NADP 1 mM+ y/o viológeno de metilo 10 mM. La fase gaseosa era un 100 % de H2.
Actividad de formiato-hidrógeno liasa para la reducción de CO2 con H2 a formiato se midió con una mezcla de ensayo que contenía fosfato de potasio 100 mM, DTT 2 mM y [14C]K2CO330 mM (24.000 dpm/mmol). La fase gaseosa era un 100 % de H2. Las botellas de suero se agitaron continuamente a 200 rpm para asegurar el equilibrio de la fase gaseosa con la fase líquida. Después inicio de la reacción con la enzima, se retiraron muestras líquidas de 100 ml cada 1,5 min y se añadieron a un microtubo de cierre seguro de 1,5 ml que contenía 100 ml de ácido acético 150 mM para detener la reacción por acidificación. Después la mezcla de 200 ml se incubó a 40 °C durante 10 min con agitación a 1.400 rpm en un Termomezclador para retirar todo el 14CO2 dejando atrás el 14C-formiato formado. Posteriormente, se añadieron 100 ml de la mezcla a 5 ml de líquido de centelleo Quicksave A (Zinsser Analytic, Frankfurt, Alemania) y se analizó para 14C radiactividad en un contador de centelleo líquido Beckman LS6500 (Fullerton, CA).
La medición de la formiato deshidrogenasa se llevó a cabo con una mezcla de ensayo que contenía Tris/HCl 100 mM (pH 7,5) o fosfato de potasio 100 mM, DTT 2 mM, formiato 20 mM y, donde se indique ferredoxina 25 mM, NADP+ 1 mM, NAD+ 1 mM y/o viológeno de metilo 10 mM. La fase gaseosa era un 100 % de N2.
Se midió la metilen-H4F deshidrogenasa usando una mezcla de ensayo que contenía MOPS/KOH 100 mM (pH 6,5), 2-mercaptoetanol 50 mM, tetrahidrofolato 0,4 mM, formaldehído 10 mM y NADP+ 0,5 mM o NAD+ 0,5 mM. La fase gaseosa era un 100 % de N2.
La Metileno-H4F reductasa se ensayó en las siguientes condiciones. Las mezclas de ensayo contenían Tris/HCl 100 mM (pH 7,5), ascorbato 20 mM, FAD 10 mM. viológeno de bencilo 20 mM y metil-H4F 1 mM. Antes del inicio de la reacción con la enzima, el viológeno de bencilo se redujo a un AA555 de 0,3 con ditionito de sodio.
Se ensayó la aldehído:ferredoxina oxidorreductasa usando una mezcla que contenía Tris/HCl 100 mM (pH 7,5), DTT 2 mM, acetaldehído 1,1 mM y ferredoxina aproximadamente 25 mM. La fase gaseosa era un 100 % de N2.
Se midió la acetaldehído deshidrogenasa de acetilación de CoA usando una mezcla que contenía Tris/HCl 100 mM (pH 7,5), DTT 2 mM, acetaldehído 1,1 mM, coenzima A 1 mM y NADP+ 1 mM o NAD+ 1 mM. La fase gaseosa era un 100 % de N2.
El alcohol y las butanodiol deshidrogenasas se midieron en un ensayo con fosfato de potasio 100 mM (pH 6), DTT 2 mM, Acetaldehído o acetoína 1,1 mM respectivamente y NADPH 1 mM o NADH 1 mM. La fase gaseosa era un 100 % de N2.
La ferredoxina se purificó de C. pasteurianum como lo describe Schonheit, FEBS Lett, 89: 219-222, 1978.
Todas las reacciones de oxidorreductasa en las rutas del etanol y el 2,3-butanodiol de la bacteria carboxidotrófica C. autoethanogenum fueron analizados y detectados con éxito, con la excepción de la metilen-THF reductasa que los inventores creen que requiere un sitio de acoplamiento aún desconocido (Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010; Poehlein, PLoS One, 7: e33439, 2012). La actividad de esta enzima no pudo detectarse previamente en otros organismos. Los resultados se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Estos datos se usaron para analizar y determinar los cuellos de botella en estas rutas que normalmente se producirían durante un proceso de fermentación.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra el aumento del flujo a través de una ruta de fermentación.
Los métodos generales descritos en el Ejemplo 3 de PCT/US2014/041188 también pueden usarse para introducir el gen de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, acetolactato sintasa y/o acetolactato descarboxilasa en el microorganismo Clostridium recombinante de la invención.
Ejemplo 3
Este ejemplo identifica la conversión de acetil CoA en piruvato mediante la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa como un cuello de botella en la producción de 2,3-butanodiol.
Como se observa en la Figura 2, el cuello de botella para la producción de 2,3-butanodiol es la reacción de acetil CoA a piruvato catalizada por piruvato:ferredoxina oxidorreductasa. Si bien todas las demás reacciones medidas mostraron al menos una actividad de 1,1 U/mg, esta reacción limitante de la velocidad exhibió una actividad enzimática de solo 0,11 U/mg (10 %) en presencia de ferredoxina. Esto es un 90 % menos que todas las otras reacciones en la ruta. Para avanzar al menos de alguna manera hacia la superación de este cuello de botella y aumentar el rendimiento del producto de la fermentación, puede sobreexpresarse una enzima piruvato:ferredoxina oxidorreductasa endógena o puede introducirse y expresarse una enzima piruvato:ferredoxina oxidorreductasa exógena.
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra el aumento del flujo a través de la ruta de producción del 2,3-butanodiol al eliminar los cuellos de botella.
La reacción que cataliza la conversión de acetil-CoA en piruvato se ha identificado en la Figura 2 como la etapa limitante de la velocidad en la formación de 2,3-butanodiol en C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. Esto puede superarse sobreexpresando el gen que codifica la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa en C. autoethanogenum.
El gen tiene codones optimizados para minimizar los problemas de expresión y está diseñado para reducir la homología con el gen nativo para evitar eventos de integración no deseados. El gen está flanqueado por sitios de corte de enzimas de restricción, XbaYo (extremo 3') y Nhe\ (extremo 5') para subclonar en pMTL83155. La construcción sintetizada y pMTL83155 se digieren con Xba\ y Nhe\ (Fermentas) y el gen PFOR se liga en pMTL83155 con ADN ligasa de t 4 (Fermentas). La mezcla de ligación se usa para transformar E. coli TOP10 (Invitrogen, LifeTechnologies) y las colonias que contienen el plásmido deseado se identifican mediante minipreparación de plásmido (Zymo Research) y digestión de restricción (Fermentas). El plásmido deseado se metila y se transforma en C. autoethanogenum. Los transformantes exitosos se identifican mediante la resistencia al tiamfenicol y el análisis de PCR con los cebadores repHF y CatR que producirán un producto de 1584 pares de bases cuando el plásmido está presente.
Los transformantes identificados como que contienen el plásmido deseado se cultivan en botellas de suero que contienen medio PETC-MES en presencia de gas de molienda y su producción de metabolitos, medidas por análisis de HPLC, se compara con el de un microorganismo parental que no alberga el plásmido. La actividad piruvato:ferredoxina oxidorreductasa en la cepa transformada también se mide en extractos brutos para confirmar que se alivia el cuello de botella observado en la cepa parental. La sobreexpresión de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa aumenta la actividad general dentro de la célula, aliviando el cuello de botella en la ruta y conduciendo a un aumento en el flujo a través del piruvato, y un aumento en la producción de 2,3-butanodiol.
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra un aumento en el flujo de piruvato a 2-hidroxi-2-metil-3-cetobutirato (acetolactato) a través de la sobreexpresión de acetolactato sintasa catabólica nativa.
El gen de acetolactato sintasa catabólico nativo (a/sS) de C. autoethanogenum se clona en los sitios Ndel y Nhel de pMTL83155 (documento WO 2013/185123) para generar un plásmido de sobreexpresión, expresando a/sS bajo el control de la región promotora del operón fosfotransacetilasa-acetato quinasa.
El plásmido de sobreexpresión puede producirse de manera similar usando una acetolactato sintasa catabólica de otro microorganismo, una acetolactato sintasa anabólica nativa o una acetolactato sintasa anabólica de otro microorganismo.
El uso de una acetolactato sintasa catabólica de otro microorganismo o una acetolactato sintasa anabólica de otro microorganismo puede tener una mayor afinidad hacia el piruvato y una cinética de reacción más rápida. Una acetolactato sintasa anabólica de otro microorganismo puede ser una enzima que se identifica como insensible a la inhibición por retroalimentación. La pequeña subunidad del mutante acetolactato sintasa anabólico que es insensible a las inhibiciones por retroalimentación también puede estar sobreexpresada.
El plásmido de sobreexpresión se introduce en C. autoethanogenum. Esto da como resultado una cepa de C. autoethanogenum adaptada para aumentar el flujo de piruvato a acetolactato.
Ejemplo 6
Este ejemplo describe un enfoque de ingeniería metabólica para la sobreexpresión de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, acetolactato sintasa y/o acetolactato descarboxilasa.
Para impulsar la producción de 2,3-butanodiol, el conjunto de piruvato, una molécula precursora del 2,3-butanodiol, se aumentó. La primera diana fue el gen PFOR que codifica la enzima PFOR, que cataliza la conversión de acetil-CoA en piruvato. En el genoma de C. autoethanogenum, hay dos copias del gen PFOR. Se sabe que el gen PFOR (CAETHG 0928) se expresa constitutivamente a un nivel alto, mientras que el otro gen (CAETHG 3029) solo se regula positivamente al final del crecimiento en un cultivo discontinuo (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011). Por lo tanto, se eligió el gen PFOR altamente expresado para sobreexpresarlo.
La acetolactato sintasa, que enlaza dos moléculas de piruvato para formar a-acetolactato, se propone que exista en tres formas codificadas por tres genes diferentes en C. autoethanogenum y en microorganismos estrechamente relacionados (Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010; Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011): una acetolactato sintasa catabólica y dos formas anabólicas de acetolactato sintasa. Se predice que codifica el gen als S (CAETHG 1740) codifica la acetolactato sintasa catabólica y participa en la formación de 2,3-butanodiol. Se prevé que los dos genes ilvBN (CAETHG 0406) e ilvH (CAETHG 0124) codifiquen acetolactato sintasas anabólicas que probablemente estén implicadas en la formación de aminoácidos de cadena ramificada.
El a-acetolactato se descarboxila a acetoína a través de la actividad de la acetolactato descarboxilasa codificada por el gen alsD (CAETHG 2932). En otros microorganismos, se ha encontrado que los niveles de transcripción del gen alsD y la actividad enzimática están regulados por la concentración de aminoácidos de cadena ramificada presentes en la célula. Todavía se desconoce si los aminoácidos de cadena ramificada en C. autoethanogenum producir cualquier inhibición por retroalimentación de la transcripción del gen alsD o la actividad de la enzima correspondiente.
La etapa de reducción de acetoína a 2,3-butanodiol por la acción de 2,3-butanodiol deshidrogenasa (EC 1.1.1.4) no es una etapa limitante de la velocidad. Esto se ha demostrado en cultivos discontinuos y continuos de C. autoethanogenum mediante la adición de acetoína al medio de fermentación. En cultivos discontinuos, se añadieron hasta 40 g/l de acetoína y se convirtió cuantitativamente en 2,3-butanodiol después de 24 horas de incubación. De hecho, se encontró que el supuesto gen de la 2,3-butanodiol deshidrogenasa se expresa de manera constitutiva tanto durante el crecimiento como durante la fase estacionaria en un cultivo discontinuo (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011).
Adicionalmente, se ha demostrado que C. autoethanogenum contiene una alcohol primario-secundario deshidrogenasa estrictamente dependiente de NADPH que también reduce la acetoína y otras cetonas a 2,3-butanodiol y otros alcoholes secundarios (Kopke, Catalyst Rev, 27: 7-12, 2014).
Los tres genes nativos, PFOR, a/sS y alsD, se sobreexpresaron individualmente y en combinación de alsS-alsD y en combinación de los tres genes. Para introducir los genes en C. autoethanogenum, los genes se clonaron en un plásmido recombinante que portaba un gen resistente a antibióticos como marcador de selección. Por este motivo, la cepa de control para este conjunto de experimentos portaba el plásmido con el gen de resistencia a los antibióticos pero sin ninguna inserción activa del gen 2,3-butanodiol, por lo que podría estar expuesto al estrés de los antibióticos y compararse con el rendimiento de las cepas de sobreexpresión. Un aspecto importante de la sobreexpresión es la elección del promotor para regular la expresión de genes insertados. En esta investigación, el promotor del gen ferredoxina (Pfdx) se eligió porque se sabe que es uno de los promotores más fuertes en Clostridia. Adicionalmente, para evitar la recombinación homóloga entre el gen nativo en el genoma y el gen presente en el plásmido, la secuencia de ADN de los genes añadidos se alteró de acuerdo con un proceso de optimización patentado (GeneOptimizer) de la compañía de síntesis de ADN (GeneArt).
También se dirigieron cuatro genes heterólogos. Se ha demostrado que un gen PFOR aislado de Desulfovibrio africanus produce una enzima PFOR que es altamente estable en presencia de oxígeno, lo que podría ser ventajoso en la fermentación anaerobia comercial (Pieulle, J Bacteriol, 179: 5684-5692, 1997). También se probó el gen aIsS aislado de Bacillus subtilis y dos genes heterólogos alsD aislados de Leuconostoc lactis y de Aeromonas hydrophila. El gen alsS aislado de Bacillus subtilis se usó para construir la vía del 2,3-butanodiol en diversos hospedadores heterólogos (Ng, Microb Cell Factories, 11: 68, 2012; Oliver, PNAS, 110: 1249-1254, 2013). Se demostró que el alsD aislado de Aeromonas hydrophila tiene la mayor actividad enzimática entre varios otros alsD heterólogos aislados de otros microorganismos en un estudio reciente (Oliver, PNAS, 110: 1249-1254, 2013). Estas propiedades hacen que estos genes sean candidatos ideales para experimentos de manipulación genética.
Ejemplo 7
Este ejemplo describe la clonación, conjugación y caracterización de cepas que sobreexpresan piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, acetolactato sintasa y/o acetolactato descarboxilasa.
En esta investigación se usó la cepa LZ1561 (DSM23693) de C. autoethanogenum. Dos cepas donadoras de E. coli se usaron como herramientas para la manipulación genética; la cepa TOP 10 (Invitrogen) se usó para la clonación del plásmido y la cepa CA434 se usó para la conjugación con C. autoethanogenum.
Se eligió un plásmido lanzadera de Clostridium-E. coli de la serie lanzadera pMTL83159 (4600 pares de bases) para sobreexpresar los genes PFOR, alsS, y alsD (Heap, J Microbiol Meth, 78: 79-85, 2009). El plásmido se diseñó para contener un replicón grampositivo, un replicón gramnegativo, un gen traJ, un gen resistente a los antibióticos, los múltiples sitios de clonación ubicados dentro de la secuencia codificante de lacZ alfa y el promotor del gen de ferredoxina (Pfdx). El replicón grampositivo (gen repH) se originó en el plásmido pCB102 de C. butylicum. Para clonar el plásmido en E. coli se eligió el replicón gramnegativo ColE1debido al alto número de copias de plásmidos que produce. Un traJ o gen de transferencia permite que el material genético se transfiera entre la célula donadora y la receptora. El gen catP codificado para la resistencia al cloranfenicol/tiamfenicol fue el marcador de selección.
Los tres genes, PFOR, alsS y alsD, fueron sintetizados por una empresa de síntesis de ADN (GeneArt). Para clonarlos en el plásmido pMTL83159, se añadieron un par de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción y una secuencia de sitio de unión ribosómica a cada secuencia de genes y se sintetizaron junto con el gen. Los plásmidos originales que llevan el gen se transformaron primero en la cepa TOP 10 de E. coli. Se usó un kit de minipreparación de plásmidos ZYPPY™ (Zymo Research) para extraer los plásmidos. Para transferir el gen diana de su plásmido original a un plásmido pMTL83159, ambos plásmidos se cortaron con el mismo par de enzimas de restricción. El ADN digerido se separó mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,6 % que funcionó a 75 voltios durante una hora. Después de que el plásmido pMTL83159 (vector) y la secuencia de ADN (inserto) de cada gen se recuperaron del gel, se ligaron entre sí usando ADN ligasa de T4 (Invitrogen). Los plásmidos ligados se transformaron después en el cultivo Top10 de E. coli. Para asegurarse de que los plásmidos extraídos contenían el inserto, se digirió 1 ml del plásmido con las enzimas de restricción apropiadas y después se separó el plásmido digerido mediante electroforesis en gel sobre un gel de agarosa al 0,8 %.
Los plásmidos se transformaron en células donantes CA434 de E. coli y después se conjugan con C. autoethanogenum. Para confirmar la presencia del plásmido diana en los transformantes C. autoethanogenum, la PCR se realizó utilizando muestras tomadas de los cultivos en frascos de suero.
La caracterización inicial de todas las cepas de sobreexpresión génica y alteración génica se realizó primero en botellas de 1 l-Schott para seleccionar qué cepa había producido la concentración más alta de 2,3-butanodiol. Estas cepas se probaron después en cultivos continuos CSTR, lo que permite un control preciso de los parámetros de fermentación de modo que puedan calcularse las selectividades de metabolitos y biomasa.
Las metas de los experimentos de sobreexpresión fueron sobreexpresar tres genes nativos en la ruta del 2,3-butanodiol individualmente y en combinaciones de dos y tres genes.
Cepa de sobreexpresión Disponibilidad de cepas Disponibilidad de datos de
botellas Schott
Control de plásmidos
PFOR nativa
AlsS nativa
AlsD nativa
AlsS-AlsD nativas
PFOR-AlsS-AlsD
nativas -
En experimentos con botellas de Schott, la DO, concentraciones de metabolitos en los medios, el pH del medio y la presión del espacio de cabeza se controlaron durante el transcurso de ocho días analizando muestras diarias. En ese momento, no se observó crecimiento adicional o actividad metabólica significativa, el pH de todos los cultivos había caído entre 3,8 y 4, y no se midió más consumo de gas. En la Figura 5 se muestra una representación gráfica de los perfiles de crecimiento y metabolitos frente al tiempo de las cinco cepas. Las cinco cepas con disponibilidad de datos de botellas Schott crecieron rápidamente durante los primeros dos días de incubación. En lo sucesivo, la tasa de crecimiento se redujo significativamente y después cesó el día 4. Los valores máximos de densidad óptica fueron aproximadamente 0,75. De manera similar a la biomasa, las concentraciones de ácido acético aumentaron abruptamente durante los dos primeros días en todos los cultivos. Entre el día 3 y el día 4, el plásmido control y las cepas de sobreexpresión de a/sS parecían haber detenido todas las actividades metabólicas, ya que no se observaron cambios adicionales en las concentraciones de metabolitos. Las otras tres cepas mostraron actividad hasta el final de los experimentos.
La conversión de acetato en etanol (actividad AOR) todavía pudo observarse en tres cepas después de que el crecimiento se ralentizó. La caída más notable de acetato se observó en la cepa de sobreexpresión de alsD y como resultado, esta cepa alcanzó la concentración más alta de etanol de alrededor de 7 g/l. Dos cepas, las cepas de sobreexpresión de alsD y a/sS-alsD combinadas, produjo mayores cantidades de 2,3-butanodiol que las otras cepas, produciendo la mayor parte durante la fase de crecimiento activo. En lo sucesivo, durante la fase estacionaria desde el día 4 continuaron produciendo 2,3-butanodiol a velocidades más lentas hasta el final del experimento el día 8. La cepa de sobreexpresión de PFOR fue la otra cepa que produjo 2,3-butanodiol a una concentración más alta que la cepa del plásmido control. En contraste con las dos primeras cepas, la cepa de sobreexpresión de PFOR comenzó a producir la mayor parte del 2,3-butanodiol durante el inicio de la fase estacionaria. La tasa de producción fue similar a las tasas de las otras dos cepas durante la fase estacionaria.
La sobreexpresión del gen alsS solo no pareció aumentar la cantidad de 2,3-butanodiol. Estos resultados sugieren que el aumento de 2,3-butanodiol observado está asociado principalmente a la sobreexpresión del gen alsD. La sobreexpresión de ambos genes a/sS y alsD dio como resultado una concentración de 2,3-butanodiol ligeramente más alta que simplemente sobreexpresar el gen alsD solo. Un efecto adicional positivo del alsS podría ser factible. La sobreexpresión del gen PFOR pareció haber contribuido a una mayor producción de 2,3-butanodiol durante la fase estacionaria en donde no se observó más crecimiento. Debido a todos estos resultados positivos y al hecho de que no se han observado efectos perjudiciales en estas cepas, la cepa de sobreexpresión que lleva los tres genes se ensayó adicionalmente en el cultivo continuo en CSTR.
Para explorar todo el potencial del microbio usando un sustrato gaseoso que contiene CO, la cepa de sobreexpresión que lleva los tres genes nativos y la cepa de plásmido control se caracterizaron adicionalmente en cultivos continuos basados en CSTR. El pH del medio se controló durante toda la fermentación añadiendo una base (solución de NH4OH 5 M) para compensar la producción de ácido y reponer los niveles de nitrógeno de los medios. El sustrato se suministró continuamente burbujeando una mezcla de gas que contiene CO a través del caldo de fermentación agitado. La composición gaseosa del gas nuevo entrante y del gas saliente usado se controló cada hora mediante cromatografía de gases. Sobre la base de las diferencias en la composición del gas entre los gases de entrada y salida, el caudal del gas entrante y el volumen de líquido de la fermentación; la utilización de gas y la tasa de síntesis del producto en el momento del muestreo se calcularon. Los valores se expresan en mol/l/d.
La DO y las concentraciones de metabolitos se midieron tres veces al día y la tasa de dilución y la tasa de crecimiento específico se midieron y calcularon diariamente para determinar la productividad de cada metabolito. La selectividad de producto de cada metabolito se calculó utilizando el consumo de CO, la producción de CO2 y la productividad del metabolito. Se establecieron tasas de absorción de CO de 4 mol/l/d y 8 mol/l/d para determinar si la selectividad del producto depende de la productividad volumétrica. Con una absorción de CO de 4 mol/l/d, la tasa de dilución del sistema se mantuvo en 1 d'1 y la tasa de crecimiento específica a 0,5 d-1. Con una mayor absorción de CO de 8 mol/l/d y tasas de producción de metabolitos correspondientemente más altas, la tasa de dilución del cultivo aumentó a 1,7 d‘ 1 para reducir las concentraciones de metabolitos a un intervalo similar al de los experimentos de 4 mol/l/d. La tasa de crecimiento específico también se aumentó a 0,75 d-1.
El perfil de metabolitos y gases de la cepa de sobreexpresión de PFOR, alsS y alsD combinados y la cepa de control del plásmido se controlaron con una absorción de CO de 4 mol/l/d durante el transcurso de 20 días (Figura 6). Aunque la preparación del inóculo de cada cepa pasó bien por varias rondas de subcultivo en botellas de suero a intervalos regulares, los cultivos de CSTR exhibieron una fase de retraso inusual, casi idéntica de cinco días. Alrededor del día 5,5, ambos cultivos CSTR comenzaron un crecimiento exponencial normal (con unas horas de diferencia entre sí).
A pesar de la larga fase de retraso en ambos cultivos y la fluctuación en el patrón de crecimiento de la cepa de sobreexpresión entre los días 8 y 10, ambos cultivos se mantuvieron con una absorción de gas estable de 4 mol/l/d durante 10 días. Con una tasa de dilución de 1 d_1 y una velocidad de crecimiento específica de 0,5 d-1, se necesitan aproximadamente seis días para reemplazar el 95 % de la carga bacteriana en los fermentadores. Con la absorción constante de gas medida durante este período, los últimos valores se utilizaron para el análisis. Los resultados finales mostraron que la cepa de sobreexpresión producía consistentemente niveles más altos de 2,3-butanodiol en comparación con la cepa del plásmido control.
El metabolito y los perfiles de gas del cultivo de sobreexpresión se monitorizaron con una absorción de CO de 8 mol/l/d en el transcurso de 11 días (Figura 7). El cultivo se inoculó a partir del cultivo de absorción de CO 4 mol/l/d. No se observó fase de retraso en este cultivo y se aplicó un suministro de CO específico y una tasa de dilución apropiados durante el crecimiento exponencial para mantener el cultivo en condiciones óptimas de crecimiento. Por tanto, se alcanzó una producción estable de ácido acético después del tercer día de incubación, mientras que otros metabolitos continuaron acumulándose. El objetivo de absorción de CO se duplicó de 4 mol/l/d a 8 mol/l/d.
Para evitar la inhibición del producto, la tasa de dilución global del cultivo aumentó de 1 d_1 a 1,7 d_1 y la tasa de crecimiento específico se aumentó proporcionalmente. Las concentraciones de metabolitos aumentaron lentamente y alcanzaron una tasa de producción estable después de siete días. Tanto la captación de hidrógeno como la captación de CO se mantuvieron de manera estable durante seis días, lo que indica que la fermentación de la cepa de sobreexpresión tiene el potencial de funcionar de manera estable durante períodos de tiempo prolongados.
Entre los productos líquidos, el etanol se produjo a la tasa más alta, seguido del acetato. La estrategia específica de suministro de CO tenía como objeto mantener una cierta proporción de acetato a etanol que permita que la fermentación se opere de manera estable durante períodos de tiempo prolongados. La cepa LZ1561 y el plásmido control exhibieron perfiles de biomasa y 2,3-butanodiol similares. Las relaciones de tasa de producción de 2,3butanodiol a biomasa estaban entre 1,26 y 1,47 en estos cultivos. Sin embargo, en la tensión de sobreexpresión, esta relación fue 2,45 con una absorción de CO de 4 mol/l/d y 2,24 con un cultivo de absorción de CO de 8 mol/l/d.
Cepa LZ1561 Control Sobreexpresión LZ1561 Sobreexpresión Tasa de absorción de gas (m ol/l/d)
Consumo de CO 4 4 4 8 8 Producción de CO2 2,45 2,53 2,43 4,53 4,34 Producto Tasa de producción (10-3 mol/l/d)
2,3-Butanodiol 52 57 81 122 168
Biomasa 37 44 33 83 75
Etanol 447 450 367 798 823
Ácido acético 128 133 125 258 214
La selectividad del producto para 2,3-butanodiol, biomasa, etanol y acetato para las cepas de sobreexpresión, control y LZ1561 se midieron a una absorción de gas de 4 mol/l/d y 8 mol/l/d. Con los parámetros de fermentación optimizados, más del 50 % del carbono se dirigió a la formación de etanol. Los datos muestran que la selectividad de 2,3-butanodiol de la cepa de sobreexpresión aumentó desde una media del 15 % en el LZ1561 y los cultivos del plásmido control hasta el 22,5 %. La elevada selectividad de 2,3-butanodiol de la cepa de sobreexpresión pareció mantenerse a diferentes velocidades de absorción de CO. El aumento de la selectividad del 2,3-butanodiol contribuye a la disminución de la selectividad del etanol a 4 mol/l/do la disminución de la selectividad del acetato a 8 mol/l/d. La contribución exacta de etanol y acetato no se puede separar, porque su selectividad puede verse fácilmente influenciada por los suministros de gas específicos, que a su vez se ven fácilmente influenciados por pequeñas diferencias entre los parámetros de ejecución. Por ejemplo, pH, posición del impulsor, ubicación de la sonda, entre otros, pueden afectar todos a estos resultados.
Ejemplo 8
Este ejemplo demuestra la expresión de acetolactato descarboxilasa exógena para aumentar el flujo hacia el 2,3-butanodiol.
Los genes de acetolactato descarboxilasa de A. hydrophila y L. lactis fueron sintetizados con codones seleccionados para expresión en C. autoethanogenum (GeneArt) y se clonó en pMTL83159 como se describió anteriormente. Los plásmidos resultantes y pMTL83159 como control, se transformaron en C. autoethanogenum cepa LZ1561 como se describe anteriormente.
Las cepas se cultivaron en botellas Schott de 1 l que contenían 40 ml de medio PETC-MES sin extracto de levadura y el espacio de cabeza se reemplazó con gas sintético de molino de 1,5 bar (presión manométrica) (50 % de CO, 29 % de N2 , 18 % de CO2 y 3 % de H2) como fuente de carbono y energía. Para mantener el plásmido, se añadió tiamfenicol 15 mg l-1. Las concentraciones de biomasa y metabolitos se registraron mediante el crecimiento de los cultivos.
La expresión de acetolactato descarboxilasa exógena condujo a un aumento de la producción de 2,3-butanodiol durante el crecimiento en gas de molienda sintético en comparación con la cepa que alberga el plásmido vacío como control. La expresión de alsD a partir de A. hydrophila y L. lactis condujo a una producción de 2,360,08 y 1,660,16 g M de 2,3-butanodiol, respectivamente, en comparación con una producción de 0,3 6 0,12 g M por la cepa del plásmido control vacío (Figura 8).
La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debería tomarse como, un reconocimiento de que esa técnica anterior forma parte del conocimiento general común en el campo de la actividad en cualquier país.
Se ha de interpretar que el uso de los términos "un", "uno/una" y "el/la" y las referencias similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Las expresiones "que comprende/n", "que tiene/n", "que incluye/n", y "que contiene/n" se han de interpretar como expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye/n, pero sin limitación") a menos que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento. Todos los métodos que se describen en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionados en el presente documento, tiene por objeto simplemente ilustrar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención, a menos que se reivindique de otro modo. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva ha de interpretarse como una indicación de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una bacteria Clostridium recombinante, carboxidotrófica que comprende:
(a) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1);
(b) una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
(c) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6);
(d) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
(e) una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5); o
(f) una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1), una acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y una acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5);
en donde cada enzima es una enzima endógena sobreexpresada o una enzima exógena; y
en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii y Clostridium ragsdalei.
2. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa es una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa endógena sobreexpresada.
3. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa es una piruvato:ferredoxina oxidorreductasa de Desulfovibrio africanus exógena.
4. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la acetolactato sintasa es una acetolactato sintasa endógena llvB ORF2059 sobreexpresada, una acetolactato sintasa de llvB ORF2336 endógena sobreexpresada, una acetolactato sintasa de llvN endógena sobreexpresada, o una acetolactato sintasa AlsS endógena sobreexpresada.
5. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la acetolactato sintasa es una acetolactato sintasa de Bacillus subtilis exógena.
6. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la acetolactato sintasa es una acetolactato descarboxilasa AlsD endógena sobreexpresada o una acetolactato descarboxilasa BudA endógena sobreexpresada.
7. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la acetolactato descarboxilasa es una acetolactato descarboxilasa Aeromonas hydrophila exógena.
8. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la acetolactato descarboxilasa es una acetolactato descarboxilasa de Leuconostoc lactis exógena.
9. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la bacteria es Clostridium autoethanogenum derivada de Clostridium autoethanogenum depositado con el N.° de registro de DSMZ DSM23693.
10. Un método para producir 2,3-butanodiol por fermentación de CO usando la bacteria de la reivindicación 1.
11. El método de la reivindicación 10, en donde la bacteria produce además un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste en etanol, butanol, isopropanol, isobutanol, alcoholes superiores, succinato, isoprenoides, ácidos grasos, biopolímeros y mezclas de los mismos.
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