EA035950B1 - Рекомбинантные микроорганизмы, проявляющие повышенный поток при ферментационном пути - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантной, карбоксидотрофной бактерии Clostridium, которая экспрессирует одну или более пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу (ЕС 1.2.7.1), ацетолактатсинтазу (ЕС 2.2.1.6) и ацетолактат декарбоксилазу (ЕС 4.1.1.5). В изобретении дополнительно предложен способ получения продукта ферментации путем ферментации рекомбинантной бактерии в присутствии газообразного субстрата, содержащего CO, для получения одного или более из этанола, бутанола, изопропанола, изобутанола, высших спиртов, бутандиола, 2,3-бутандиола, сукцината, изопреноидов, жирных кислот, биополимеров и их смесей.

Description

Настоящая заявка заявляет приоритет заявки на патент США 62/089053, поданной 8 декабря 2014 года, и заявки на патент США 62/168969, поданной 1 июня 2015 года, все содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

Карбоксидотрофные микроорганизмы могут быть сконструированы для получения продуктов, таких как топливо и химические продукты, путем ферментации газообразного субстрата. Усилия по повышению концентрации продукта и использования субстрата исторически были сфокусированы на выборе штамма и оптимизации условий ферментации (Abubackar, Bioresour Technol, 114: 518-522, 2012). Однако метаболизм природных микроорганизмов не эволюционировал для достижения коммерческих целей с высокими выходами, скоростями и титрами, так что некоторые коммерческие цели не могут быть достигнуты путем простого отбора штаммов и оптимизации условий ферментации. Соответственно, остается потребность в улучшенных микроорганизмах и способах получения полезных продуктов, таких как топливо и химических продуктов.

Сущность изобретения

Изобретение обеспечивает рекомбинантную карбоксидотрофную бактерию Clostridium, содержащую один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из пируват:ферредоксиноксидоредуктазы (ЕС 1.2.7.1), ацетолактатсинтазы (ЕС 2.2.1.6) и ацетолактат декарбоксилазы (ЕС 4.1.1.5), причем каждый фермент представляет собой сверхэкспрессированный эндогенный фермент, мутантный эндогенный фермент или экзогенный фермент. Рекомбинантная бактерия может экспрессировать один, два или все три из этих ферментов.

Рекомбинантная бактерия может быть получена из любого микроорганизма Clostridium. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная бактерия является полученной от С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei. В предпочтительном варианте реализации изобретения, рекомбинантная бактерия получена из С. autoethanogenum, хранящейся под номером доступа DSMZ DSM23693 (С. autoethanogenum LZ1561).

Изобретение также относится к способу получения продукта ферментации, включающему ферментацию рекомбинантной бактерии в присутствии газообразного субстрата, содержащего CO, для получения одного или более из этанола, бутанола, изопропанола, изобутанола, высших спиртов, бутандиола, 2,3-бутандиола, сукцината, изопреноидов, жирных кислот, биополимеров и их смесей.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой карту потока пути биосинтеза этанола, в которой подробно измеряется активность фермента и поток через карбоксидотрофный микроорганизм для образования этанола через ацетил-КоА, что позволяет идентифицировать реакции, ограничивающие скорость реакции. Толщина стрелок пропорциональна активности конкретной реакции пути.

Фиг. 2 представляет собой карту пути, детализирующую измеренную активность фермента и поток через карбоксидотрофный микроорганизм для образования 2,3-бутандиола через пируват, что позволяет идентифицировать реакции с ограничением скорости.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму, демонстрирующую путь 2,3-бутандиола и соответствующий путь биосинтеза аминокислот с разветвленной цепью. Пируват превращается в α-ацетолактат, промежуточное звено как для путей биосинтеза аминокислот 2,3-бутандиола, так и для биосинтеза аминокислот с разветвленной цепью. Эксперименты проводились для сверхэкспрессии PFOR, alsS и alsD.

Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение плазмиды pMTL 83159. Плазмида содержит ген репликации (ColE1) грамотрицательного происхождения, ген репликации (repH) грамположительного происхождения, ген переноса traJ, ген catP, кодирующий устойчивость к хлорамфениколу/тиамфениколу, сайт множественного клонирования, расположенный в lacZ альфа кодирующей последовательности и промотора гена ферредоксина (P_fdx).

Фиг. 5 представляет собой набор графиков, демонстрирующих профили роста и метаболитов (биомасса, 2,3-бутандиол (BDO), уксусная кислота и этанол) в зависимости от времени пяти штаммов, выращенных в бутылках Schott.

Фиг. 6 представляет собой набор графиков, демонстрирующих профиль метаболита (верхние графики) и профиль газа (нижние графики) объединенного сверхэкспрессирующего штамма экспрессии PFOR, alsS и alsD и контрольный штамм плазмиды при поглощении СО 4 моль/л/день в течение 20 дней.

Фиг. 7 представляет собой набор графиков, демонстрирующих профили метаболита и газа сверхэкспрессирующей культуры при поглощении CO 8 моль/л/день в течение 11 дней.

Фиг. 8 представляет собой набор графиков, демонстрирующих биомассу и продуцирование бутандиолов культурами, экспрессирующими A. hydrophila alsD (открытые квадраты), L. lactis alsD (закрашенные квадраты) и контроль пустой плазмиды (треугольники). Значения представляют собой среднее значение трех повторений, а столбцы ошибок представляют одно стандартное отклонение.

Подробное описание изобретения

Ферментационный путь представляет собой каскад биохимических реакций (путей реакций), посредством которых субстрат, предпочтительно газообразный субстрат, превращается в продукт ферментации. Путь реакций обычно включает в себя ферменты, которые катализируют или увеличивают ско

- 1 035950 рость реакции пути.

Поток относится к потоку метаболитов через одну или более реакций в ферментационном пути. Поток через отдельные реакции путей имеет верхний и нижний пределы. Таким образом, поток может быть изменен путем регулирования условий или факторов, которые влияют на ферментативную активность. Регулирование потока через одну реакцию пути может изменить общий поток ферментационного пути. Поток может быть измерен в соответствии с любым способом, известным в данной области техники. В качестве примера, поток может быть измерен с использованием анализа баланса потока (FBA) (Gianchandani, Systems Biol Medicine, 2: 372-382, 2010). Поток через этот путь также может быть измерен с помощью уровня метаболитов и продуктов (метаболомика) (Patti, Nat Rev Molec Cell Biol, 13: 263-269, 2012) и/или экспериментов с такими метками, как С13 (флюксомика) (Niittylae, Methods Mol Biol, 553: 355-372, 2009; Tang, Mass Spectrom Rev, 28: 362-375, 2009).

Эффективность ферментационного пути может быть увеличена путем увеличения потока реакции через путь. Повышенный поток приводит к одному или более из: увеличения скорости роста микроорганизмов, выполняющих ферментацию, увеличения скорости роста и/или скорости образования продукта при повышенных концентрациях продукта, увеличения концентрации продукта ферментации в ферментационном бульоне, увеличения объема полученного продукта ферментации на каждый потребляемый объем субстрата, увеличения скорости производства или уровня производства продукта ферментации. Предпочтительно, повышенная эффективность приводит к увеличению скорости производства продукта ферментации.

Один из способов определения реакций ограничения скорости (узких мест) - это измерение активности ферментов для всех реакций, участвующих в пути ферментации от субстрата к продукту. Это можно сделать, анализируя ферментативную активность реакций в клетках, растущих в условиях процесса, чтобы идентифицировать реакции с самыми низкими скоростями. Затем они могут быть отрегулированы таким образом, чтобы не ограничивать скорость, тем самым увеличивая поток по всей системе. Ферментативная активность может быть измерена любым способом, известным в данной области техники, таким как способы, описанные в Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012.

Авторы изобретения проанализировали активность ферментов, участвующих в ферментационных путях, и обнаружили, что некоторые пути реакции проявляют существенно более низкую ферментативную активность, чем другие реакции на том же пути. Рекомбинантные микроорганизмы и способы, описанные в данном документе, особенно полезны для путей, где выход продукта в родительском микроорганизме может не иметь выхода продукта, чтобы быть жизнеспособной коммерческой мишенью.

Примеры путей ферментации, которые поддаются анализу активности ферментов, включают путь Вуд-Льюнгдаля, пути ферментации для получения этанола, 2,3-бутандиола или его предшественника, такого как ацетил-КоА и пируват, и пути биосинтеза кофакторов тетрагидрофолата и кобаламина (В₁₂), которые могут потребоваться в ферментационных путях. Путь Вуд-Льюнгдаля состоит из ряда реакций, катализируемых ферментами, как описано на фиг. 1 и фиг. 2. Шаги, следующие за путем Вуд-Льюнгдаля, которые приводят к получению желаемых продуктов ферментации, также считаются частью пути ферментации.

В конкретном варианте реализации изобретения, путь ферментации приводит к получению продукта ферментации, выбранного из группы, состоящей из этанола, бутанола, изопропанола, изобутанола, высших спиртов, бутандиола, 2,3-бутандиола, сукцината, изопреноидов, жирных кислот, биополимеров, и их смеси.

Изобретение обеспечивает рекомбинантную карбоксидотрофную бактерию Clostridium, содержащую один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из пируват:ферредоксиноксидоредуктазы (ЕС 1.2.7.1), ацетолактатсинтазы (ЕС 2.2.1.6) и ацетолактат декарбоксилазы (ЕС 4.1.1.5), причем каждый фермент представляет собой сверхэкспрессированный эндогенный фермент, мутантный эндогенный фермент или экзогенный фермент.

Родительский микроорганизм представляет собой микроорганизм, используемый для получения рекомбинантного микроорганизма по изобретению. Родительский микроорганизм может быть таким, который встречается в природе (т.е. микроорганизм дикого типа) или таким, который был ранее модифицирован (т.е. рекомбинантный микроорганизм). Рекомбинантные микроорганизмы по изобретению могут быть модифицированы для экспрессии или сверхэкспрессии одного или более ферментов, которые были или не были экспрессированы или сверхэкспрессированы в родительском микроорганизме, или могут быть модифицированы, чтобы продемонстрировать повышенную доступность одного или более кофакторов. В одном варианте реализации изобретения, родительский организм может быть С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei. В особенно предпочтительном варианте реализации изобретения, родительский организм представляет собой С. autoethanogenum LZ1561, который храниться под номером доступа DSMZ DSM23693.

Рекомбинантный микроорганизм представляет собой микроорганизм, который подвергся генетической модификации по сравнению с родительским микроорганизмом. Генетическая модификация включает, например, вставку, делецию или замещение нуклеиновых кислот.

В целом, термин полученный от означает, что нуклеиновая кислота, белок или микроорганизм

- 2 035950 модифицируют или адаптируют из другой (т. е. родительской или дикого типа) нуклеиновой кислоты, белка или микроорганизма, соответственно, с тем, чтобы создать новый рекомбинантный микроорганизм.

Способы генетической модификации родительского микроорганизма включают молекулярные методы, такие как экспрессия гетерологичных генов, вставка или делеция генома, измененная экспрессия генов или инактивация генов или способы ферментной инженерии. Такие методы описаны, например, в Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Pleiss, Curr Opin Biotechnol, 22: 611-617, 2011; Park, Protein Engineering and Design, CRC Press, 2010. Экспрессирующие конструкты/векторы могут содержать, например, один или более промоторов или сайтов связывания рибосом. Нуклеиновые кислоты и сконструированные/векторные последовательности, описанные в данном документе, могут также содержать стандартные линкерные нуклеотиды, такие как те, которые необходимы для сайтов связывания рибосом и/или сайтов рестрикции.

Нуклеиновые кислоты и конструкты нуклеиновой кислоты, включающие экспрессионные конструкты/векторы по изобретению, могут быть сконструированы с использованием любого способа, известного в данной области техники. Например, можно использовать химический синтез или рекомбинантные методы. Такие методы описаны, например, в Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. По существу, отдельные гены и регуляторные элементы могут быть функционально связаны друг с другом, так что гены могут быть экспрессированы с образованием желаемых белков. Подходящие векторы будут оценены специалистами в данной области техники. Однако, в качестве примера, могут быть пригодны следующие векторы: векторы pMTL80000, pIMP1, pJIR750 и другие плазмиды.

Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в микроорганизм с использованием любого способа, известного в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты могут доставляться в микроорганизм в виде голых нуклеиновых кислот или могут быть объединены с одним или несколькими агентами (например, липосомами) для облегчения процесса трансформации в микроорганизм. Нуклеиновые кислоты могут быть ДНК, РНК, кДНК или их комбинацией, как это необходимо. Ингибиторы рестрикции могут использоваться в некоторых вариантах реализации изобретения (Murray, Microbiol Molec Biol Rev, 64: 412-434, 2000). Дополнительные векторы включают в себя плазмиды, вирусы (включая бактериофаг), космиды и искусственные хромосомы. В предпочтительном варианте реализации изобретения, нуклеиновые кислоты доставляют в микроорганизм с использованием плазмиды. Только в качестве примера, трансформация (включая трансдукцию или трансфекцию) может быть достигнута путем электропорации, ультразвуковой обработки, опосредованной полиэтиленгликолем трансформации, химической или природной компетентности, трансформации протопластов, индукции профага или конъюгации. Подходящие способы трансформации описаны, например, в Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Сообщалось об использовании электропорации для ряда карбоксидотрофных ацетогенов, включая С. ljungdahlii (Koepke, PNAS, 107: 13087-13092, 2010; WO/2012/053905), С. autoethanogenum (WO/2012/ 053905), С. aceticum (Schiel-Bengelsdorf, Synthetic Biol, 15: 2191-2198, 2012) и A. woodii (Stratz, Appl Environ Microbiol, 60: 1033-1037, 1994). Сообщалось также об использовании электропорации у Clostridia, включая С. acetobutylicum (Mermelstein, Biotechnol, 10: 190-195, 1992) и С. cellulolyticum (Jennert, Microbiol, 146: 3071-3080, 2000). Кроме того, продемонстрирована индукция профага для карбоксидотрофных ацетогенов, включая С. scatologenes (Parthasarathy, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project, University of Western Kentucky, 2010), и описано конъюгирование для многих Clostridia, включая С. difficile (Herbert, FEMS Microbiol Lett, 229: 103-110, 2003) и С. acetobuylicum (Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826, 1990). Аналогичные способы могут быть использованы для карбоксидотрофных ацетогенов.

Изобретение обеспечивает рекомбинантную карбоксидотрофную бактерию Clostridium, адаптированную для проявления повышенного потока пути ферментации относительно родительского микроорганизма. В одном конкретном варианте реализации изобретения, родительский микроорганизм выбран из группы карбоксидотрофных Clostridia, включающей С. autoethanogenum, С. ljungdahlii, С. ragsdalei, С. carboxidivorans, С. drakei, С. scatologenes, С. aceticum, С. formicoaceticum и С. magnum.

Рекомбинантная бактерия может быть получена из группы карбоксидотрофных Clostridia, содержащей виды С. autoethanogenum, С. ljungdahlii, С. ragsdalei и родственные изоляты. К ним относятся, но не ограничиваются ими, штаммы С. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), С. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200), С autoethanogenum LZ1561 (DSM23693), С ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), С ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (патент США 5593886), С. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (патент США 6368819), С. ljungdahlii 0-52 (ATCC 55989) (патент США 6368819), С. ragsdalei P11T (ATCC BAA622) (WO 2008/028055), родственные изоляты, такие как С. coskatii (публикация США 2011/0229947), или мутированные штаммы, такие как С. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010). Эти штаммы образуют субкластер в кластере I Clostridial pPHK, а их ген 16S рРНК более чем на 99% идентичен с та

- 3 035950 ким же низком содержанием GC около 30%. Однако эксперименты по реассоциации ДНК и ДНК и фингерпринтингу ДНК показали, что эти штаммы принадлежат к различным видам (WO 2008/028055). Штаммы этого кластера определяются общими характеристиками, имеют одинаковый генотип и фенотип, и все они имеют одинаковый режим сохранения энергии и ферментативного метаболизма. Штаммы этого кластера лишены цитохромов и сохраняют энергию через комплекс Rnf.

Все виды вышеуказанного кластера имеют сходную морфологию и размер (логарифмически растущие клетки между 0,5-0,7х3-5 мкм), мезофильные (оптимальная температура роста между 30 до 37°С) и строго анаэробные (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993 и WO 2008/028055). Более того, все они разделяют одни и те же основные филогенетические черты, такие как, тот же диапазон рН (рН 4-7,5, с оптимальным начальным рН 5,5-6), интенсивный автотрофный рост на CO-содержащих газах с аналогичными скоростями роста, и аналогичный метаболический профиль с этанолом и уксусной кислотой в качестве основных конечных продуктов ферментации, и небольшие количества 2,3-бутандиола и молочной кислоты, образующихся при определенных условиях (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993 и WO 2008/028055). Продукция индола наблюдалось у всех трех видов. Однако виды различаются в использовании субстратов различных сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата), аминокислот (например, аргинина, гистидина) или других субстратов (например, бетаина, бутанола). Кроме того, некоторые из видов оказались ауксотрофными для некоторых витаминов (например, тиамина, биотина), в то время как другие не были. Было установлено, что организация и количество генов пути Вуд-Льюнгдаля, ответственных за поглощение газа, одинаково у всех видов, несмотря на различия в нуклеиновых и аминокислотных последовательностях (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011). Кроме того, восстановление карбоновых кислот в соответствующие спирты было показано у ряда этих микроорганизмов (Perez, Biotechnol Bioeng, 110: 1066-1077, 2012). Таким образом, эти признаки не специфичны для одного организма, такого как С. autoethanogenum или С. ljungdahlii, а скорее являются общими чертами для карбоксидотрофных, этанолсинтезирующих Clostridia, и можно ожидать, что механизмы работают аналогичным образом в отношении этих штаммов, хотя могут быть различия в продуктивности.

В одном варианте реализации изобретения, родительский микроорганизм представляет собой С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei. Предпочтительно, родительским микроорганизмом является С. autoethanogenum дикого типа или С. autoethanogenum, который хранится под номером доступа DSMZ DSM10061 или DSM23693 (С. autoethanogenum LZ1561). В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантная бактерия является полученной от С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei. Предпочтительно, рекомбинантную бактерию получают из С. autoethanogenum дикого типа или С. autoethanogenum, которая хранится под номером доступа DSMZ DSM23693 (С. autoethanogenum LZ1561).

Ферменты и гены по изобретению могут быть сверхэкспрессированными эндогенными ферментами и генами, мутантными эндогенными ферментами и генами или экзогенными ферментами и генами.

Термин эндогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, который присутствует в дикой или родительской бактерии, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. В одном варианте реализации изобретения, экспрессия эндогенного гена может контролироваться экзогенным регуляторным элементом, таким как экзогенный промотор.

Термин экзогенный относится к нуклеиновой кислоте или белку, который не присутствует в бактерии дикого типа или родительской, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. В одном варианте реализации изобретения, экзогенный ген или фермент может быть получен из гетерологичного штамма или вида и введен в или экспрессирован в рекомбинантной бактерии. В другом варианте реализации изобретения, экзогенный ген или фермент может быть искусственно или рекомбинантно создан. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут быть адаптированы для интегрирования в геном бактерии или для сохранения во внехромосомном состоянии в бактерии, например, в плазмиде.

Ферментативная активность в широком смысле относится к ферментативной активности, включая, но не ограничиваясь ими, активность фермента, количество фермента или доступность фермента, катализирующего реакцию. Соответственно, увеличивающаяся активность фермента включает в себя увеличение активности фермента, увеличение количества фермента или увеличение доступности фермента, катализирующего реакцию.

Гены и ферменты по изобретению могут быть разработаны или сконструированы с использованием любого способа, известного в данной области техники, включая, например, направленную эволюцию, основанную на знаниях конструкцию, способы случайного мутагенеза, перетасовку генов, оптимизацию кодонов, использование сайт-специфичных библиотек, и использование библиотек оценки сайта.

Мутированный относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые были модифицированы в рекомбинантной бактерии по изобретению по сравнению с бактерией дикого типа или родительской бактерией, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. В одном варианте реализации изобретения, мутацией может быть делеция, инсерция или замена в гене, кодирующем фермент. В другом варианте реализации изобретения, мутацией может быть делеция, инсерция или замена одной или нескольких аминокислот в ферменте.

- 4 035950

Оптимизация кодона относится к мутации нуклеиновой кислоты, такой как ген, для оптимизации или улучшения трансляции нуклеиновой кислоты в конкретном штамме или виде. Оптимизация кодона может привести к более быстрой трансляции или более высокой точности трансляции. В предпочтительном варианте реализации изобретения, гены, кодирующие ферменты по изобретению, представляют собой кодон, оптимизированный для экспрессии в Clostridium, в частности С. autoethanogenum, С. ljungdahlii и/или С. ragsdalei. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения, гены, кодирующие ферменты по изобретению, представляют собой кодон, оптимизированный для экспрессии в С. autoethanogenum LZ1561.

Сверхэкспрессированный относится к любому усилению экспрессии нуклеиновой кислоты или белка в рекомбинантной бактерии по изобретению по сравнению с бактерией дикого типа или родительской бактерией, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. Повышенная экспрессия может быть достигнута любыми способами, известными в данной области техники, включая модификацию числа копий гена, скорости транскрипции гена, скорости трансляции гена или скорости деградации фермента.

Сверхэкспрессированный эндогенный фермент относится к эндогенному ферменту, который присутствует в более высоких уровнях в рекомбинантной бактерии по изобретению по сравнению с бактерией дикого типа или родительской бактерией, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. Сверхэкспрессированный эндогенный фермент также может кодироваться эндогенным геном, который может быть модифицирован, например, для контроля с помощью сильного или конститутивного промотора. Аналогично, сверхэкспрессированный эндогенный ген относится к эндогенному гену, который присутствует или транскрибирован с более высокими степенями или уровнями в рекомбинантной бактерии по изобретению по сравнению с бактерией дикого типа или родительской бактерией, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению.

Мутированный эндогенный фермент относится к эндогенному ферменту, который мутирован или модифицирован в рекомбинантной бактерии по изобретению по сравнению с бактерией дикого типа или родительской бактерией, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. Аналогично, мутированный эндогенный ген относится к эндогенному гену, который мутирован или модифицирован в рекомбинантной бактерии по изобретению, по сравнению с бактерией дикого типа или родительской бактерией, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению.

Экзогенный фермент относится к ферменту, который отсутствует в бактерии дикого типа или родительской бактерии, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. Аналогично, экзогенный ген относится к гену, который отсутствует в бактерии дикого типа или родительской бактерии, из которой получена рекомбинантная бактерия по изобретению. Как правило, экзогенный фермент или ген получают из гетерологичного штамма или вида и вводят в или экспрессируют в рекомбинантной бактерии.

Изобретение может быть осуществлено на практике с использованием вариантных нуклеиновых кислот или белков, последовательность которых отлична от последовательностей, специально проиллюстрированных в данном документе, при условии, что они выполняют по существу одну и ту же функцию. Для последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют белок или пептид, это означает, что кодируемый белок или пептид имеет по существу одну и ту же функцию. Для последовательностей нуклеиновых кислот, которые представляют собой промоторные последовательности, вариантная последовательность будет обладать сходной способностью промотировать экспрессию одного или более генов. Такие нуклеиновые кислоты или белки могут упоминаться в данном документе как функционально эквивалентные варианты. В качестве примера, функционально эквивалентные варианты нуклеиновой кислоты включают аллельные варианты, фрагменты гена, гены, которые содержат мутации (делецию, инсерцию, нуклеотидные замены и т.п.) и/или полиморфизмы и т.п. Гомологичные гены из других микроорганизмов также можно рассматривать как примеры функционально эквивалентных вариантов последовательностей, специально иллюстрируемых в данном документе. К ним относятся гомологичные гены у таких видов, как С. acetobutylicum, С. beijerinckii или С. ljungdahlii, подробности которых доступны на веб-сайтах, таких как Genbank или NCBI. Функционально эквивалентные варианты включают также нуклеиновые кислоты, последовательность которых изменяется в результате оптимизации кодонов для конкретного организма. Функционально эквивалентный вариант нуклеиновой кислоты будет предпочтительно иметь по меньшей мере приблизительно 70 %, приблизительно 80 %, приблизительно 85 %, приблизительно 90 %, приблизительно 95 %, приблизительно 98 % или более идентичности последовательности нуклеиновой кислоты с указанной нуклеиновой кислотой. Функционально эквивалентный вариант белка предпочтительно будет иметь по меньшей мере приблизительно 70 %, приблизительно 80 %, приблизительно 85 %, приблизительно 90 %, приблизительно 95 %, приблизительно 98 % или более аминокислотной идентичности с указанным белком. Такие варианты включают фрагмент белка или пептида, причем фрагмент содержит усеченную форму белка или пептида, где делеции могут быть от 1 до 5, от 10 до 15, от 20 до 25 аминокислот и могут длиться от остатка 1 до 25 на любом конце полипептида и причем делеции могут быть любой длины в пределах участка или могут быть во внутреннем местоположении. Функциональная эквивалентность варианта нуклеиновой кислоты или белка может быть оценена с ис

- 5 035950 пользованием любого метода, известного в данной области техники. Однако, в качестве примера, анализы для проверки активности некоторых ферментов описаны в Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012.

В некоторых вариантах реализации изобретения, имеющих активные системы рестрикционных ферментов, может оказаться необходимым метилировать нуклеиновую кислоту перед введением нуклеиновой кислоты в микроорганизм.

Как правило, метилирование осуществляют с использованием челночного микроорганизма, предпочтительно с рестрикционным отрицательным челночным микроорганизмом, таким как E.coli, В. subtillis или L. lactis, что облегчает метилирование последовательностей нуклеиновых кислот, которые составляют экспрессионный конструкт/вектор. Метилирующий конструкт/вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую метилтрансферазу. После того как экспрессионный конструкт/вектор и метилирующий конструкт/вектор вводят в челночный микроорганизм, индуцируется ген метилтрансферазы, присутствующий в метилирующем конструкте/векторе. Индукция может происходить с помощью любой подходящей промоторной системой, хотя в одном конкретном варианте реализации изобретения метилирующий конструкт/вектор содержит индуцибельный lac-промотор и индуцируется добавлением лактозы или ее аналога, более предпочтительно изопропил-в-Э-тиогалактозида (ИПТГ). Другие подходящие промоторы включают систему ara, tet или Т7. В другом варианте реализации изобретения, метилирующий конструкт/вектор промотор является конститутивным промотором.

В конкретном варианте реализации изобретения, метилирующий конструкт/вектор имеет начало репликации, характерное для идентификации челночного микроорганизма, так что любые гены, присутствующие в метилирующем конструкте/векторе, экспрессируются в челночном микроорганизме. Предпочтительно, экспрессирующий конструкт/вектор имеет начало репликации, специфичное для идентификации целевого микроорганизма, так что любые гены, присутствующие в экспрессирующем конструкте/векторе, экспрессируются в целевом микроорганизме.

Экспрессия фермента метилтрансферазы приводит к метилированию генов, присутствующих в экспрессирующем конструкте/векторе. Экспрессирующий конструкт/вектор затем можно выделить из челночного микроорганизма в соответствии с любым способом, известным в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения, оба конструкта/вектора одновременно изолированы. Экспрессирующий конструкт/вектор можно вводить в целевой микроорганизм с использованием любого способа, известного в данной области техники. Поскольку экспрессирующий конструкт/вектор метилирован, последовательности нуклеиновых кислот, присутствующие в экспрессирующем конструкте/векторе, могут быть включены в целевой микроорганизм и успешно экспрессированы.

Ген метилтрансферазы может быть введен в челночный микроорганизм и сверхэкспрессирован. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения, полученный фермент метилтрансферазы может быть собран с использованием известных способов и использован in vitro для метилирования экспрессионной плазмиды. Затем экспрессирующий конструкт/вектор можно ввести в целевой микроорганизм для экспрессии. В другом варианте реализации изобретения, ген метилтрансферазы вводится в геном челночного микроорганизма с последующим введением экспрессирующего конструкта/вектора в челночный микроорганизм, выделением одного или более конструктов/векторов из челночного микроорганизма и последующим введением экспрессирующего конструкта/вектора в целевой микроорганизм.

Экспрессионный конструкт/вектор и метилирующий конструкт/вектор могут быть объединены для обеспечения композиции. Такая композиция особенно полезна при обходе механизмов рестрикционного барьера для получения рекомбинантных микроорганизмов по изобретению. В одном конкретном варианте реализации изобретения, экспрессионный конструкт/вектор и/или метилирующий конструкт/вектор представляют собой плазмиды. Может быть использован ряд подходящих метилтрансфераз, включая, например, фаг В. subtilis ФТ1-метилтрансферазы или метилтрансферазы, описанный в WO 2012/053905. Аналогично, для создания метилирующего конструкта/вектора можно использовать ряд конструктов/векторов, адаптированных для обеспечения экспрессии гена метилтрансферазы.

В качестве примера, в одном варианте реализации изобретения, рекомбинантный микроорганизм по изобретению может быть получен способом, включающим (а) введение в челночный микроорганизм (i) экспрессирующего конструкта/вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе и (ii) метилирующего конструкта/вектора, содержащего ген метилтрансферазы; и (b) экспрессию гена метилтрансферазы; выделение одного или более конструктов/векторов из челночного микроорганизма; и введение одного или более конструкта/вектора в целевой микроорганизм. В одном варианте реализации изобретения, ген метилтрансферазы стадии (b) экспрессируется конститутивно. В другом варианте реализации изобретения, индуцируется экспрессия гена метилтрансферазы стадии (b).

Рекомбинантная бактерия по изобретению содержит одну или более пируват:ферредоксиноксидоредуктазу, ацетолактатсинтазу и ацетолактат декарбоксилазу.

Пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза (PFOR или POR) (ЕС 1.2.7.1) представляет собой фермент, принадлежащий к семейству оксидоредуктаз, который катализирует перенос электронов с одной молекулы (восстановитель или донор электронов) на другую (окислитель или акцептор электронов). В частности, пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза катализирует взаимопревращение пирувата и ацетил-КоА: пирувата + КоА + 2 окисленных ферредоксин-ацетил-КоА + СО₂ + 2 восстановленных ферредоксина +

- 6 035950

2Н⁺. Превращение ацетил-КоА в пируват связывает путь Вуд-Льюнгдаля автотрофной фиксации СО(2) с циклом восстановления трикарбоновых кислот, который в автотрофных анаэробах является стадией биосинтеза всех клеточных макромолекул (Furdi, J Biol Chem, 15: 28494-28499, 2000). Пируват:ферредоксиноксидоредуктаза также может быть известна как пируват: ферредоксин-2-оксидоредуктаза (КоАацетилирование), пируват-оксидоредуктаза, пируват-синтаза, пируватсинтетаза или пировиноферредоксин-оксидоредуктаза.

Фермент пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза по изобретению может представлять собой сверхэкспрессированный эндогенный фермент, мутантный эндогенный фермент или экзогенный фермент. Аналогично, фермент пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза по изобретению может быть кодирован с помощью гена эндогенной пируватферредоксин-оксидоредуктазы, который был сконструирован для сверхэкспрессии, может быть кодирован мутированным геном эндогенной пируват:ферредоксиноксидоредуктазы или может быть кодирован геном экзогенной пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы. В предпочтительном варианте реализации изобретения, фермент пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза является сверхэкспрессированной эндогенной пируват:ферредоксин-оксидоредуктазой, такой как сверхэкспрессированная эндогенная пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei. Ферменты пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы часто нестабильны в присутствии кислорода. В предпочтительном варианте реализации изобретения, фермент пируват:ферредоксиноксидоредуктаза является кислородостойким или демонстрирует по меньшей мере некоторую степень кислородной нечувствительности. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения, фермент пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза представляет собой экзогенную пируват:ферредоксиноксидоредуктазу Desulfovibrio africanus или фермент, полученный из нее. Экспрессия пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы D. africanus была продемонстрирована у Е. coli (Pieulle, J Bacteriol, 179: 5684-5692, 1997), но не в микроорганизме Clostridium.

Ацетолактатсинтаза (Als) (EC 2.2.1.6) представляет собой фермент, который катализирует первую стадию синтеза аминокислот с разветвленной цепью, таких как валин, лейцин и изолейцин. В частности, ацетолактатсинтаза представляет собой транскетолазу, которая имеет как катаболические, так и анаболические формы, и катализирует превращение двух молекул пирувата в молекулу ацетолактата и диоксид углерода: 2 CH3COCOO^- θ CH3COCOHCH3COO^- + CO2. Ацетолактатсинтазу также можно назвать синтазой ацетогидроксикислоты.

Фермент ацетолактатсинтаза по изобретению может представлять собой сверхэкспрессированный эндогенный фермент, мутантный эндогенный фермент или экзогенный фермент. Аналогично, фермент ацетолактатсинтаза по изобретению может быть кодирован геном эндогенной ацетолактатсинтазы, который был сконструирован для сверхэкспрессии, может быть кодирован мутированным эндогенным геном ацетолактатсинтазы или может быть кодирован геном экзогенной ацетолактатсинтазы. Ацетолактатсинтаза может быть анаболической или катаболической. В предпочтительном варианте реализации изобретения, фермент ацетолактатсинтаза является сверхэкспрессируемой эндогенной ацетолактатсинтазой, такой как сверхэкспрессированная эндогенная ацетолактатсинтаза С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei. В частности, фермент ацетолактатсинтаза может быть сверхэкспрессированной эндогенной ILvB, ILvB ORF2059, IlvB ORF2336, IlvC, IlvN, IlvBN или AlsS ацетолактатсинтазой. В предпочтительном варианте реализации изобретения фермент ацетолактатсинтаза является мутированной эндогенной ацетолактатсинтазой, такой как мутированная ацетолактатсинтаза, полученная из любой эндогенной ацетолактатсинтазы С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei. В частности, мутированная эндогенная ацетолактатсинтаза может быть нечувствительной к обратной связи IlvN ацетилактат-синтазой. В предпочтительном варианте реализации изобретения, фермент ацетолактатсинтаза представляет собой экзогенную ацетолактатсинтазу, такую как ацетолактатсинтазу Bacillus subtilis, в частности, нечувствительную к обратной связи Bsillilis AlsS ацетолактат-синтазу. Экспрессирование В. subtilis AlsS было показано в Synechococcus elongatus sp. штамм PCC 7942 (Oliver, Metabol Eng, 22: 76-82, 2014), но не в микроорганизме Clostridium.

Ацетолактат декарбоксилаза (ЕС 4.1.1.5) представляет собой фермент, принадлежащий к семейству лиаз, в частности карбоксилиаз, которые расщепляют углерод-углеродные связи. Ацетолактат декарбоксилаза катализирует реакцию ^)-2-гидрокси-2-метил-3-оксобутаноата на (R) -2-ацетоин и СО₂: (S)-2гидрокси-2-метил-3-оксобутаноат (Е)-2-;щетоин + СО₂. Ацетолактат декарбоксилаза также может быть известна, как альфа-ацетолактатдекарбоксилаза или ^)-2-гидрокси-2-метил-3-оксобутаноат карбоксилиаза.

Фермент ацетолактат декарбоксилаза по изобретению может представлять собой сверхэкспрессированный эндогенный фермент, мутантный эндогенный фермент или экзогенный фермент. Аналогично, фермент ацетолактат декарбоксилаза по изобретению может быть кодирован эндогенным геном ацетолактат декарбоксилазы, который был сконструирован для сверхэкспрессии, может быть кодирован мутированным геном эндогенной ацетолактат декарбоксилазы или может быть кодирован геном экзогенной ацетолактат декарбоксилазы. В предпочтительном варианте реализации изобретения, фермент ацетолактат декарбоксилаза является сверхэкспрессированной эндогенной ацетолактат декарбоксилазой, такой как сверхэкспрессированная эндогенная ацетолактат декарбоксилаза С. autoethanogenum, С. ljungdahlii

- 7 035950 или С. ragsdalei. Сверхэкспрессированная эндогенная ацетолактат декарбоксилаза может представлять собой BudA ацетолактат декарбоксилазу или AlsD ацетолактат декарбоксилазу. В предпочтительном варианте реализации изобретения, фермент ацетолактат декарбоксилаза представляет собой экзогенную ацетолактат декарбоксилазу, такую как ацетолактат декарбоксилаза Aeromonas hydrophila или ацетолактат декарбоксилаза Leuconostoc lactis. Экспрессирование В. subtilis AlsD было показано в Synechococcus elongatus sp. штамм PCC 7942 (Oliver, Metabol Eng, 22: 76-82, 2014), но не в микроорганизме Clostridium.

Ферменты пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза, ацетолактатсинтаза и ацетолактат дегидрогеназа могут содержать или могут быть получены из любой аминокислотной последовательности в следующей таблице. Аналогично, гены, кодирующие ферменты пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу, ацетолактатсинтазу и ацетолактат дегидрогеназу, могут содержать или могут быть получены из любой последовательности нуклеиновых кислот в следующей таблице. Более того, любой из ферментов или генов может быть вариантами последовательностей в следующей таблице. Например, ферменты или гены могут иметь около 80%, около 90%, около 95% или около 99% идентичности последовательности с последовательностями в следующей таблице.___________________________________________

SEQ ID NO:	Описание
1	нативная пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
2	нативная пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
3	оптимизированная по кодону пируват:ферредоксин- оксидоредуктаза с Xbal и Nhel, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
4	оптимизированная по кодону пируват:ферредоксин- оксидоредуктаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
5	пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза с Xbal и Nehl, D. africanus, последовательность нуклеиновой кислоты
6	пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза, D. africanus, аминокислотная последовательность
7	нативная llvB ORF2059 ацетолактатсинтаза, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
8	нативная llvB ORF2059 ацетолактатсинтаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
9	нативная llvB ORF2336 ацетолактатсинтаза, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
10	нативная llvB ORF2336 ацетолактатсинтаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
11	нативная ΙΙνΝ ацетолактатсинтаза (регуляторная субъединица) с Ndel и Sacl, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
12	нативная ΙΙνΝ ацетолактатсинтаза (регуляторная субъединица), С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
13	мутантная ΙΙνΝ (G-10-D) ацетолактатсинтаза (регуляторная субъединица) с Ndel и Sacl, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
14	мутантная ΙΙνΝ (G-10-D) ацетолактатсинтаза (регуляторная субъединица), С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
15	нативная AlsS-ацетолактатсинтаза, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
16	нативная AlsS-ацетолактатсинтаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность

- 8 035950

17	оптимизированная по кодону AlsS-ацетолактатсинтаза с Ndel и Sacl, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
18	оптимизированная по кодону AlsS ацетолактатсинтаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
19	ацетолактатсинтаза с Ndel и Sacl, В. subtillis, последовательность нуклеиновой кислоты
20	ацетолактатсинтаза, В. subtillis, аминокислотная последовательность
21	нативная ацетолактат декарбоксилаза, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
22	нативная ацетолактат декарбоксилаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
23	оптимизированная по кодону ацетолактат декарбоксилаза с Sacl и Kpnl, С. autoethanogenum LZ1561, последовательность нуклеиновой кислоты
24	оптимизированная по кодону ацетолактат декарбоксилаза, С. autoethanogenum LZ1561, аминокислотная последовательность
25	ацетолактат декарбоксилаза, A. hydrophila, последовательность нуклеиновой кислоты
26	ацетолактат декарбоксилаза, A. hydrophila, аминокислотная последовательность
27	ацетолактат декарбоксилаза с Sacl и Kpnl, L. lactis, последовательность нуклеиновой кислоты
28	ацетолактат декарбоксилаза, L lactis, аминокислотная последовательность

Рекомбинантная бактерия по изобретению может также содержать любую комбинацию пируват: ферредоксин-оксидоредуктазы, ацетолактатсинтазы и ацетолактат декарбоксилазы. Бактерия может содержать пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу и ацетолактатсинтазу, но не ацетолактат декарбоксилазу. Бактерия может содержать пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу и ацетолактат декарбоксилазу, но не ацетолактатсинтазу. Бактерия может содержать ацетолактатсинтазу и ацетолактат декарбоксилазу, но не пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу. Наконец, бактерия может содержать каждую из пируват: ферредоксин-оксидоредуктазы, ацетолактатсинтазы и ацетолактат декарбоксилазы.

Рекомбинантная бактерия по изобретению может дополнительно экспрессировать или быть сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии одной или более алкогольдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.1), альдегиддегидрогеназы (ацилированние) (ЕС 1.2.1.10), формиатдегидрогеназы (ЕС 1.2.1.2), формилТГФ-синтетазы (ЕС 6.3.2.17), метилен-ТГФ-дегидрогеназа/формил-ТГФ-циклогидролазы (ЕС: 6.3.4.3), метилен-ТГФ-редуктазы (ЕС 1.1, 1.58), СО дегидрогеназы/ацетил-КоА-синтазы (ЕС 2.3.1.169), альдегид ферредоксин-оксидоредуктазы (ЕС 1.2.7.5), фосфотрансацетилазы (ЕС 2.3.1.8), ацетат киназы (ЕС 2.7.2.1), дегидрогеназы СО (ЕС 1.2.99.2), гидрогеназы (ЕС 1.12.7.2), пируват:формиат лиазы (ЕС 2.3.1.54), 2,3-бутандиолдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.4), первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.1), формиатдегидрогеназы (ЕС 1.2.1.2), формил-ТГФ синтетазы (ЕС 6.3.2.17), метилен-ТГФдегидрогеназы/формил-ТГФ-циклогидролазы (ЕС:6.3.4.3), метилен-ТГФ-редуктазы (ЕС 1.1,1.58), СО дегидрогеназы/ацетил-КоА-синтазы (ЕС 2.3.1.169), СО дегидрогеназы (ЕС 1.2.99.2) и гидрогеназы (ЕС 1.12.7.2).

Кофактор фермента или просто кофактор представляет собой небелковое соединение, которое связывается с ферментом для облегчения биологической функции фермента и, таким образом, для катализа реакции. Неограничивающие примеры кофакторов включают НАД⁺, НАДФ⁺, кобаламин, тетрагидрофолат и ферредоксин. Никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) относится к НАД⁺ (окисленная форма), НАДН⁺Н⁺ (восстановленная форма) или к окислительно-восстановительной паре НАД⁺ и НАДН⁺Н⁺. Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН) относится либо к НАДФ⁺ (окисленная форма), НАДФН⁺Н⁺ (восстановленная форма), либо к окислительно-восстановительной паре НАДФ⁺ и НАДФН⁺Н⁺. Увеличение общей доступности кофактора может увеличить скорость реакции пути. Факторы, которые могут влиять на продукцию кофактора, включают экспрессию генов биосинтеза кофактора,

- 9 035950 которые могут быть изменены для достижения повышенной доступности кофактора. Другие факторы, известные специалисту в данной области техники, могут также использоваться для достижения повышенной доступности кофактора. Отсутствие кофакторов может иметь ограничивающие скорость эффекты на пути реакции. Способы определения доступности кофакторов известны в данной области техники.

Рекомбинантная бактерия по изобретению может дополнительно экспрессировать или быть сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии фермента, участвующего в биосинтезе кофактора. В конкретном варианте реализации изобретения, кофактор включает тетрагидрофолат. Ферменты, участвующие в биосинтезе тетрагидрофолата, подробно описаны ниже. Соответственно, в конкретном варианте реализации изобретения, рекомбинантный микроорганизм проявляет повышенную экспрессию ГТФциклогидролазы I (ЕС 3.5.4.16), щелочной фосфатазы (ЕС 3.1.3.1), дигидронеоптерин-альдолазы (ЕС 4.1.2.25), 2-амино-4-6-гидроксиметилдигидроптеридиндифосфокиназы (ЕС 2.7.6.3), дигидроптеродатсинтазы (2.5.1.15), дигидроптероатсинтазы (ЕС 2.5.1.15), дигидрофолатсинтазы (ЕС 6.3.2.12), фолилполиглутаматсинтазы (6.3.2.17), дигидрофолатредуктазы (ЕС 1.5.1.3), тимидилатсинтазы (ЕС 2.1.1.45), дигидромонаптеринредуктазы (ЕС 1.5.1.-). В конкретном варианте реализации изобретения, кофактор содержит кобаламин (В12). Ферменты, участвующие в биосинтезе кобаламина, подробно описаны ниже. Соответственно, в конкретном варианте реализации изобретения, рекомбинантный микроорганизм проявляет повышенную экспрессию 5-аминолевулинатсинтазы (ЕС 2.3.1.37), 5-аминолевулинат:пируват аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.43), аденозилкобинамидкиназы/аденозилкобинамид-фосфатгуанилилтрансферазы (ЕС 2.7.1.156/2.7.7.62), аденозилкобинамид-ГДФ рибазолтрансферазы (ЕС 2.7.8.26), аденозилкобинамид-фосфатсинтазы (ЕС 6.3.1.10), синтазы аденозилкомовой кислоты (ЕС 6.3.5.10), альфарибазолфосфатазы (ЕС 3.1.3.73), ^©аланин-аденозил-трансферазы (ЕС 2.5.1.17), соЬ(11)уриновой кислоты a,c-диамидредукmазы (ЕС 1.16.8.1), гидролазы кобальта-прекоррина 5А (ЕС 3.7.1.12), кобальтпрекоррин-5В (С1) -метилтрансферазы (ЕС 2.1.1.195), кобальт-прекоррин-7 (С15) -метилтрансферазы (ЕС 2.1.1.196), кобальтохелатазы CobN (ЕС 6.6.1.2), кобириновой кислоты a,c-диамидсинmазы (ЕС 6.3.5.9/6.3.5.11), ферритина (ЕС 1.16.3.1), глютамат-1-полуальдегида 2,1-аминомутазы (ЕС 5.4.3.8), глутамил-тРНК-редуктазы (ЕС 1.2.1.70), глутамил-тРНК синтетазы (ЕС 6.1.1.17), гидроксиметилбилансинтазы (ЕС 2.5.1.61), никотинат-нуклеотид-диметилбензимидазол фосфорибозилтрансферазы (ЕС 2.4.2.21), кислородзависимой копропорфириноген-Ш оксидазы (ЕС 1.3.99.22), порфобилиногенсинтазы (ЕС 4.2.1.24), прекоррин-2 дегидрогеназы/сирогидрохлорин феррохелатазы (ЕС 1.3.1.76/4.99.1.4), прекоррин2/кобальт-фактор-2 С20-метилтрансферазы (ЕС 2.1.1.130/2.1.1.151), прекоррин^ синтазы (ЕС 1.14.13.83), ^е^ррин^ С17-метилтрансферазы (ЕС 2.1.1.131), прекоррин-4 С11-метилтрансферазы (ЕС 2.1.1.133), прекоррин-6X редуктазы (ЕС 1.3.1.54), прекоррин-6Y С5,15-метилтрансферазы (ЕС 2.1.1.132), прекоррин-8W декарбоксилазы (ЕС 1.-.-.-), прекоррин-8Х метилмутазы (ЕС 5.4.1.2), сирогидрохлорин кобальтохелатазы (ЕС 4.99.1.3), треонин-фосфат декарбоксилаза (ЕС 4.1.1.81), уропорфириноген декарбоксилазы (ЕС 4.1.1.37), уропорфириноген III метилтрансфераза/синтазы (ЕС 2.1.1.107/ 4.2.1.75). Не желая связывать себя теорией, полагают, что увеличение доступности кофактора достигается за счет избыточной экспрессии ферментов или генов, участвующих в пути биосинтеза указанного кофактора. В результате, реакции, зависящие от этого кофактора, уже не ограничиваются.

Изобретение также относится к способам получения одного или более продуктов путем ферментации субстрата, содержащего СО. Предпочтительно, продукт представляет собой один или более из этанола, бутанола, изопропанола, изобутанола, высших спиртов, бутандиола, 2,3-бутандиола, сукцината, изопреноидов, жирных кислот, биополимеров и их смесей.

В одном варианте реализации изобретения, субстрат, содержащий CO, представляет собой газообразный субстрат, содержащий СО. В одном варианте реализации изобретения, субстрат обычно содержит основную часть CO, такую как от около 20 до около 100% CO по объему, от 20 до 70% CO по объему, от 30 до 60% CO по объему или из 40-55% CO по объему. В конкретных вариантах реализации изобретения, подложка содержит около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50% CO, около 55% CO или около 60% CO по объему.

Хотя нет необходимости для субстрата содержать какой-либо водород, присутствие водорода не должно быть вредным для образования продукта в соответствии со способами по изобретению. В конкретных вариантах реализации изобретения, присутствие водорода приводит к повышению общей эффективности производства спирта. Например, в конкретных вариантах реализации изобретения, субстрат может содержать прим. 2:1 или 1:1 или 1:2 соотношения Н₂:СО. В одном варианте реализации изобретения, субстрат содержит около 30% или менее H₂ по объему, 20% или менее Н₂ по объему, около 15% или менее Н2 по объему или около 10% или менее Н2 по объему. В других вариантах реализации изобретения, поток субстрата содержит низкие концентрации Н2, например, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1% Н₂. В других вариантах реализации изобретения, поток субстрата по существу не содержит водорода. Субстрат может также содержать некоторое количество СО2, например, от около 1 до 80% СО₂ по объему или от около 1% до около 30% СО₂ по объему. В одном варианте реализации изобретения, субстрат содержит менее чем или равен около 20% СО2 по объему. В конкретных вариантах реализации изобретения, субстрат содержит менее чем или равен около 15% СО₂ по объему, менее чем или равен около 10% СО₂ по объему, менее чем или равен около 5% СО₂ по объему

- 10 035950 или, по существу, не содержит СО2.

Варианты реализации изобретения описаны в терминах доставки и ферментации газообразного субстрата, содержащего СО. Однако следует понимать, что газообразный субстрат может быть представлен в альтернативных формах. Например, газообразный субстрат, содержащий CO, можно предоставить растворенным в жидкости. По существу, жидкость насыщена газом, содержащим монооксид углерода, и затем эту жидкость добавляют в биореактор. Это может быть достигнуто с использованием стандартной методологии. В качестве примера, можно использовать генератор микропузырьковой дисперсии (Hensirisak, Appl Biochem Biotechnol, 101: 211-227, 2002). В качестве дополнительного примера, газообразный субстрат, содержащий CO, может адсорбироваться на твердом носителе. Такие альтернативные способы охватываются термином субстрат, содержащий СО и тому подобное.

Газообразный субстрат может быть СО-содержащим отходящим газом, полученным в качестве побочного продукта промышленного процесса или из какого-либо другого источника, такого как автомобильные выхлопные газы или газификация биомассы. В некоторых вариантах реализации изобретения, промышленный процесс выбирают из группы, состоящей из производства изделий из черных металлов, таких как сталелитейное производство, производство цветных изделий, процессы переработки нефти, газификация угля, производство электроэнергии, производство чистого углерода, производство аммиака, производство метанола и производство кокса. В этих вариантах реализации изобретения, СОсодержащий газ может быть захвачен из промышленного процесса до его выброса в атмосферу любым удобным способом. CO может быть компонентом сингаза (газ, содержащий монооксид углерода и водород). CO, получаемый из промышленных процессов, обычно сжигается для производства СО₂, и поэтому изобретение имеет особую полезность для снижения выбросов парниковых газов СО2 и в производстве биотоплива. В зависимости от состава газообразного СО-субстрата может быть также желательно обработать его для удаления любых нежелательных примесей, таких как частицы пыли, перед их введением в ферментацию. Например, газообразный субстрат может быть отфильтрован или промыт с использованием известных способов.

Как правило, ферментацию проводят в биореакторе. Термин биореактор включает в себя ферментационное устройство, состоящее из одного или более сосудов и/или вышек или трубопроводов, таких как непрерывный реактор с мешалкой (CSTR), реактор с иммобилизированными клетками (ICR), реактор с орошаемым слоем (TBR), барботажная колонна, газлифтный ферментер, статический смеситель или другой сосуд или другое устройство, подходящее для газожидкостного контакта. В некоторых вариантах реализации изобретения, биореактор может содержать первый реактор роста и второй ферментационный реактор. Как таковое, когда речь идет о добавлении субстрата в биореактор или реакции ферментации, следует понимать, что оно включает добавление к любому из этих реакторов или к обоим из них, если это необходимо. Используемые в данном документе, термины ферментация, процесс ферментации, реакция ферментации и тому подобное охватывают фазу роста и биосинтеза продукта процесса ферментации.

В некоторых вариантах реализации изобретения, культура бактерии по изобретению поддерживается в водной культуральной среде, которая содержит питательные вещества, витамины и/или минералы, достаточные для обеспечения роста микроорганизма. Предпочтительно, водная культуральная среда является минимальной анаэробной средой для микробиологического роста. Подходящие среды известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США 5173429, патенте США 5593886 и WO 2002/008438.

Ферментацию целесообразно проводить в соответствующих условиях ферментации для получения продукта ферментации. Условия реакции, которые следует учитывать, включают давление, температуру, расход газа, скорость потока жидкости, pH среды, окислительно-восстановительный потенциал среды, скорость перемешивания (при использовании непрерывного реактора с мешалкой), уровень инокулированного материала, максимальные концентрации газового субстрата для обеспечения того, чтобы CO в жидкой фазе не становился ограничивающим, и максимальные концентрации продукта, чтобы избежать ингибирования продукта.

Кроме того, часто желательно увеличить концентрацию CO потока субстрата (или парциального давления CO в газообразном субстрате) и, таким образом, повысить эффективность реакций ферментации, в которых CO является субстратом. Работа при повышенных давлениях позволяет значительно увеличить скорость переноса CO из газовой фазы в жидкую фазу, где она может быть поглощена микроорганизмом в качестве источника углерода для осуществления ферментации. Это, в свою очередь, означает, что время удерживания (определяемое как объем жидкости в биореакторе, деленный на скорость потока входного газа) может быть уменьшено, если биореакторы поддерживаются при повышенном давлении, а не при атмосферном давлении. Оптимальные условия реакции будут частично зависеть от конкретного используемого микроорганизма по изобретению. Однако, как правило, предпочтительно, чтобы ферментацию проводили при давлении выше атмосферного. Кроме того, поскольку заданная скорость конверсии CO частично зависит от времени удержания субстрата и достижение требуемого времени удерживания, в свою очередь, диктует требуемый объем биореактора, использование систем под давлением может значительно уменьшить объем требуемого биореактора, и, следовательно, денежные затраты

- 11 035950 на оборудование для ферментации. В соответствии с примерами, приведенными в патенте США 5593886, объем реактора может быть уменьшен в линейной пропорции к увеличению рабочего давления реактора, то есть биореакторы, работающие при давлении 10 атмосфер, должны составлять лишь одну десятую объема тех, которые работают при давлении в 1 атмосферу.

В качестве примера, были описаны преимущества проведения ферментации газ-этанол при повышенных давлениях. Например, в WO 2002/008438 описаны ферментации газ-этанол, проводимые при давлениях 30 фунтов/кв.дюйм изб. давления и 75 фунтов/кв.дюйм изб. давления, что дает производительность этанола 150 г/л/день и 369 г/л/день соответственно. Однако, в примерах ферментации, проводимых с использованием аналогичных сред и композиций входного газа при атмосферном давлении, было обнаружено, что продукция между 10 и 20 раз меньше этанола на литр в день.

Также желательно, чтобы скорость введения СО-содержащего газообразного субстрата контролировалась для обеспечения того, чтобы концентрация CO в жидкой фазе не становилась ограничивающей, поскольку продукты могут потребляться культурой в условиях ограниченного СО.

Состав газовых потоков, используемых для подачи в реакции ферментации, может оказать существенное влияние на эффективность и/или стоимость реакции. Например, O₂ может снизить эффективность анаэробного процесса ферментации. Обработка нежелательных или ненужных газов на стадиях ферментации до или после ферментации может увеличить нагрузку на такие стадии. Например, когда газовый поток сжимается перед поступлением в биореактор, ненужную энергию можно использовать для сжатия газов, которые не нужны в процессе ферментации. Соответственно, может оказаться желательным обрабатывать потоки субстрата, в частности потоки субстрата, полученные из промышленных источников, для удаления нежелательных компонентов и увеличения концентрации желаемых компонентов.

Примеры

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но разумеется их не следует толковать как ограничение его объема.

Пример 1.

Этот пример описывает анализ путей ферментации карбоксидотрофных бактерий, таких как С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei, для узких мест в производстве этанола и 2,3-бутандиола.

Для определения их активности анализировали стадии фермента оксидоредуктазы пути ВудЛьюнгдаля и пути ферментации этанола и 2,3-бутандиола. Реакции оксидоредуктазы являются особенно подходящими, поскольку они связаны с одним или более кофакторами, восстановление или окисление которых можно измерить. С этой целью также можно использовать синтетический окислительновосстановительный краситель, такой как метилвиологен или бензилвиологен. Ферменты в этих путях участвуют в аутотрофном росте, включая поглощение и использование газов CO, СО₂ и H₂, а также образование продукта.

Анализ ферментов и их активность подробно описаны на фиг. 1. Все анализы проводили с использованием синтетического окислительно-восстановительного красителя в качестве контроля, метилвиологена (MV), или бензилвиологена (BV). Затем тестировали кофакторы ферредоксин (Fd), НАДН и НАДФН или их комбинацию. Ферментные анализы проводили с использованием неочищенных экстрактов из ферментации, растущей автотрофно на CO и водороде.

Ферментации с С. autoethanogenum проводили в 1,5 л биореакторах при 37°С с использованием СОсодержащего сталелитейного газа в качестве единственной энергии и источника углерода. Ферментные среды содержали, на литр, MgCl, CaCl₂ (0,5 мМ), KCl (2 мМ), Н₃РО₄ (5 мМ), Fe (100 мкМ), Ni, Zn (5 мкМ), Mn, В, W, Мо, и Se (2 мкМ). Среду переносили в биореактор и автоклавировали при 121°С в течение 45 мин. После автоклавирования в среду добавляли тиамин, пантотенат (0,05 мг) и биотин (0,02 мг) и восстанавливали с 3 мМ цистеин-HCl. Для достижения анаэробных условий, реакционный сосуд барботировали азотом через фильтр 0,2 мкм. Перед инокуляцией газ переключали на CO-содержащий газ сталелитейного завода, непрерывно подаваемый в реактор. Состав исходного газа был 2 % Н₂, 42 % CO, 20 % CO2 и 36 % N2. Величину pH культуры поддерживали между 5 и 5,2.

Во время сбора клеток (биомасса 3,9 г клеток/л ферментационного бульона) расход газа составлял 5 моль CO л^-1-день^-1 и 10 миллимолей Н2 л^-1-день^-1 при этом получали следующие метаболиты: 14 г ацетата л^-1-день^-1 и 19,5 г этанола л^-1-день^-1. РН культуры доводили до pH 6 с помощью K2CO₃, и реактор охлаждали на бане со льдом и водой. Приблизительно 1,2 л культуры собирали на льду. Культуру делили между двумя 1-литровыми центрифужными бутылками (эта и все последующие стадии проводились в анаэробной камере для обеспечения бескислородных условий, чтобы избежать инактивации ферментов) и клетки осаждались при 5000 об/мин в течение 10 мин. Надосадок декантировали и удаляли остаточную жидкость. Каждый осадок ресуспендировали приблизительно в 30 мл 50 мМ KPO4, pH 7,0, с 10 мМ DTT. Ресуспендирования переносили на предварительно взвешенные пробирки 50 мл-Falcon и клетки отгоняли с максимальной скоростью (5000 г) в течение 15 мин. Пробирки удаляли из анаэробной камеры и сразу замораживали на жидком N2 перед анализом.

Клетки собирали из непрерывного реактора в бескислородных условиях. Они были разрушены тремя продавливаниями через французский пресс. Не разрушенные клетки и клеточный мусор удаляли цен

- 12 035950 трифугированием при 20000xg и 4°С в течение 30 мин. Надосадок использовали для анализа ферментов. За исключением указанных случаев, все анализы проводили при 37°С в 1,5-мл анаэробных кюветах, закрытых резиновой пробкой, заполненной 0,8 мл реакционной смеси и 0,7 мл N₂ или Н₂ или CO при 1,2х10⁵ Па. Ферменты анализировали, как описано ниже, или описано Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012. После начала реакции с ферментом, восстановление НАД(Ф)⁺ или НАД' контролировали спектрофотометрически при 340 нм (ε = 6,2 мМ^-1-см^-1) или при 380 нм (ε = 1,2 мМ^-1-см^-1), восстановление ферредоксина С. pasteurianum при 430 нм (i:A-red~13.1 мМ^-1-см^-1), восстановление метилвиологена при 578 нм (ε = 9,8 мМ^-1-см^-1) и восстановление бензилвиологена при 578 нм (ε = 8,6 мМ^-1-см^-1).

СО-дегидрогеназу измеряли, используя аналитическую смесь, которая содержала 100 мМ Трис/HCl (pH 7,5), 2 мМ DTT и около 30 мкМ ферредоксина и/или 1 мМ НАД' или 1 мМ НАДФ⁺. Газовая фаза представляла собой 100% СО.

Активность гидрогеназы измеряли, используя аналитическую смесь 100 мМ Трис/HCl (pH 7,5) или 100 мМ фосфата калия, 2 мМ DTT и 25 мкМ ферредоксина и/или 1 мМ НАДФ⁺ и/или 10 мМ метилвиологена. Газовая фаза представляла собой 100% Н₂.

Форматно-водородную активность лиазы для восстановления СО₂ с Н₂ до формиата измеряли с помощью аналитической смеси, содержащей 100 мМ фосфата калия, 2 мМ DTT и 30 мМ [¹⁴С] K2CO3 (24000 dpm/μмоль). Газовая фаза представляла собой 100% Н2. Бутылки сыворотки непрерывно встряхивали со скоростью 200 об/мин, чтобы обеспечить уравновешивание газовой фазы с жидкой фазой. После начала реакции с ферментом, 100 мкл жидких образцов отбирали каждые 1,5 мин и добавляли в микробиологическую пробирку емкостью 1,5 мл, содержащую 100 мкл 150 мМ уксусной кислоты, для прекращения реакции подкислением. 200 мкл смеси затем инкубировали при 40°С в течение 10 мин при встряхивании при 1400 об/мин в термомиксере, чтобы удалить весь ¹⁴СО2, оставляя образовавшийся ¹⁴С-формиат. Затем 100 мкл смеси добавляли к 5 мл сцинтилляционной жидкости Quicksave A (Zinsser Analytic, Франкфурт, Германия) и анализировали на радиоактивность ¹⁴С на жидком сцинтилляционном счетчике Beckman LS6500 (Фуллертон, Калифорния).

Измерение формиатдегидрогеназы проводили в аналитических смесях, содержащих 100 мМ Трис/HCl (pH 7,5) или 100 мМ фосфата калия, 2 мМ DTT, 20 мМ формиата и, где указано 25 мкМ ферредоксина, 1 мМ НАДФ⁺, 1 мМ НАД' и/или 10 мМ метилвиологена. Газовая фаза представляла собой 100% N2.

Метилен-ИфЕ-дегидрогеназу измеряли, используя аналитическую смесь, содержащую 100 мМ MOPS/KOH (pH 6,5), 50 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,4 мМ тетрагидрофолата, 10 мМ формальдегида и 0,5 мМ НАДФ⁺ или 0,5 мМ НАД'. Газовая фаза представляла собой 100% N2.

Метилен-ЩЕ-редуктазу анализировали в следующих условиях. Аналитические смеси содержали 100 мМ Трис/HCl (pH 7,5), 20 мМ аскорбата, 10 мкМ ФАД. 20 мМ бензилвиологена и 1 мМ метил-H₄F. Перед началом реакции с ферментом, бензилвиологен восстанавливали до ΔА555, равным 0,3 с дитионитом натрия.

Альдегид:ферредоксин-оксидоредуктазу анализировали, используя смесь, содержащую 100 мМ Трис/HCl (pH 7,5), 2 мМ DTT, 1,1 мМ ацетальдегида и около 25 мкМ ферредоксина. Газовая фаза представляла собой 100 % N₂.

КоА-ацетилирование ацетальдегид дегидрогеназы измеряли, используя смесь, содержащую 100 мМ Трис/HCl (pH 7,5), 2 мМ DTT, 1,1 мМ ацетальдегида, 1 мМ кофермента А и 1 мМ НАДФ⁺ или 1 мМ НАД'. Газовая фаза представляла собой 100% N₂.

Алкоголь и бутандиол дегидрогеназу измеряли в анализе с использованием 100 мМ фосфата калия (pH 6), 2 мМ DTT, 1,1 мМ ацетальдегида или ацетоина, соответственно, и 1 мМ НАДФН или 1 мМ НАДН. Газовая фаза представляла собой 100% N2.

Ферредоксин очищали из С. pasteurianum, как описано Schonheit, FEBS Lett, 89: 219-222, 1978.

Все анализы оксидоредуктазы на пути этанола и 2,3-бутандиола карбоксидотрофной бактерии С. autoethanogenum были проанализированы и успешно обнаружены, за исключением метилен-ТГФредуктазы, которая, по мнению авторов изобретения, требует еще неизвестного места связывания (Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010; Poehlein, PLoS One, 7: e33439, 2012). Активность этого фермента ранее не могла быть обнаружена в других организмах. Результаты приведены на фиг. 1 и фиг. 2. Эти данные были использованы для анализа и определения узких мест в этих путях, которые обычно возникают во время процесса ферментации.

Пример 2.

Этот пример демонстрирует усиление потока через ферментационный путь.

Общие способы, описанные в примере 3 PCT/US 2014/041188, также могут быть использованы для введения гена пируват: ферредоксин-оксидоредуктазы, ацетолактатсинтазы и/или ацетолактат декарбоксилазы в рекомбинантный микроорганизм Clostridium по изобретению.

Пример 3.

Этот пример идентифицирует превращение ацетил-КоА в пируват с помощью пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы в качестве узкого места в производстве 2,3-бутандиола.

- 13 035950

Как видно из Фиг. 2 узким местом для получения 2,3-бутандиола является реакция ацетил-КоА на пируват, катализируемый пируват:ферредоксин-оксидоредуктазой. В то время как все другие измеренные реакции проявляли по меньшей мере активность 1,1 ед./мг, эта реакция с ограничением скорости проявляла ферментативную активность только 0,11 ед./мг (10%) в присутствии ферредоксина. Это на 90 % меньше, чем все другие реакции на пути. Чтобы хоть как-то преодолеть это узкое место и увеличить выход продукта от ферментации, эндогенный фермент пируват: ферредоксин-оксидоредуктаза может быть сверхэкспрессирован или может быть введен и экспрессирован экзогенный фермент пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу.

Пример 4.

Этот пример демонстрирует усиление потока через путь продукции 2,3-бутандиола с помощью удаления узких мест.

Реакция, катализирующая превращение ацетил-КоА в пируват, изображенная на фиг. 2, является стадией, ограничивающей скорость образования 2,3-бутандиола в С. autoethanogenum, С. ljungdahlii или С. ragsdalei.

Это может быть преодолено сверхэкспрессией гена, кодирующего пируват:ферредоксиноксидоредуктазу в С. autoethanogenum.

Г ен является оптимизированным кодоном для минимизации проблем с экспрессией и предназначен для снижения гомологии с нативным геном для предотвращения нежелательных событий интеграции. Ген фланкирован сайтами рестриктазы, Xbal (3'-конец) и NheI (5'-конец) для субклонирования в pMTL83155. Синтезированный конструкт и pMTL83155 расщепляют с Xbal и NheI (Fermentas), и ген PFOR лигируют в pMTL83155 с ДНК-лигазой Т4 (Fermentas). Лигирующую смесь используют для трансформации Е. coliTOP10 (Invitrogen, LifeTechnologies), а колонии, содержащие желаемую плазмиду, идентифицируют с помощью плазмиды miniprep (Zymo Research) и рестрикционного расщепления (Fermentas). Желаемая плазмида метилируется и трансформируется в С. autoethanogenum. Успешные трансформанты идентифицируют по устойчивости к тиамфениколу и анализу ПЦР с праймерами repHF и CatR, которые будут давать продукт с 1584 парами, когда присутствует плазмида.

Трансформанты, идентифицированные как содержащие желаемую плазмиду, выращивают в сывороточных флаконах, содержащих среду РЕТС-MES, в присутствии фабричного газа, и их продуцирование метаболитов, измеренное методом ВЭЖХ, сравнивают с продуцированием родительского микроорганизма, не содержащего плазмиду. Активность пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы в трансформированном штамме также измеряется в неочищенных экстрактах, для подтверждения, что наблюдаемое узкое место в родительском штамме сглажено. Сверхэкспрессия пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы увеличивает общую активность в клетке, сглаживает узкое место на пути и ведет к увеличению потока через пируват и увеличению продукции 2,3-бутандиола.

Пример 5.

Этот пример демонстрирует увеличение потока от пирувата к 2-гидрокси-2-метил-3-кетобутират (ацетолактат) посредством сверхэкспрессии нативной катаболической ацетолактатсинтазы.

Нативный катаболический ацетолактатсинтазный ген (alsS) С. autoethanogenum клонируют в сайты NdeI и NheI pMTL83155 (WO 2013/185123) для получения сверхэкспрессирующей плазмиды, экспрессирующей alsS под контролем промоторного участка оперона фосфотрансацетилаза-ацетаткиназы.

Сверхэкспрессирующая плазмида может быть аналогичным образом получена с использованием катаболической ацетолактатсинтазы из другого микроорганизма, нативной анаболической ацетолактатсинтазы или анаболической ацетолактатсинтазы из другого микроорганизма.

Использование катаболической ацетолактатсинтазы из другого микроорганизма или анаболической ацетолактатсинтазы из другого микроорганизма может иметь более высокое сродство к пирувату и более быструю кинетику реакции. Анаболическая ацетолактатсинтаза из другого микроорганизма может быть ферментом, который идентифицирован как нечувствительный к ингибированию обратной связи. Малая субъединица анаболического ацетолактатсинтазного мутанта, который нечувствителен к ингибированию обратной связи, также может быть сверхэкспрессирована.

Плазмиду сверхэкспрессии вводят в С. autoethanogenum. Это приводит к штамму С. autoethanogenum, адаптированному для увеличения потока от пирувата до ацетолактата.

Пример 6.

Этот пример описывает метаболический инженерный подход к сверхэкспрессии пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы, ацетолактатсинтазы и/или ацетолактат декарбоксилазы.

Для увеличения продукции 2,3-бутандиола пул пирувата, молекулы предшественника 2,3бутандиола, был увеличен. Первой мишенью был ген PFOR, который кодирует фермент PFOR, который катализирует превращение ацетил-КоА в пируват. В геноме С. autoethanogenum есть две копии гена PFOR. Известно, что ген PFOR (CAETHG 0928) конститутивно экспрессируется на высоком уровне, тогда как другой ген (CAETHG 3029) активируется только в конце роста в периодической культуре (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011). Таким образом, высоко экспрессированный ген PFOR был выбран для сверхэкспрессии.

Предполагается, что ацетолактатсинтаза, связывающая две молекулы пирувата с образованием α

- 14 035950 ацетолактата, существует в трех формах, кодируемых тремя различными генами у С. autoethanogenum и в близкородственных микроорганизмах (Kopke, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010; Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011): одна катаболическая ацетолактатсинтаза и две формы анаболической ацетолактатсинтазы.

Предполагается, что ген alsS (CAETHG 1740) кодирует катаболическую ацетолактатсинтазу и участвует в образовании 2,3-бутандиола. Предполагается, что два гена ilvBN (CAETHG 0406) и ilvH (CAETHG 0124) кодируют анаболические ацетолактатсинтазы, которые, вероятно, будут участвовать в образовании аминокислот с разветвленной цепью.

α-ацетолактат декарбоксилируют до ацетоина посредством активности ацетолактат декарбоксилазы, кодируемой геном alsD (CAETHG 2932). Было обнаружено, что в других микроорганизмах уровни транскриптов гена alsD и активность ферментов регулируются концентрацией аминокислот с разветвленной цепью, присутствующих в клетке. Пока неизвестно, вызывает ли аминокислота с разветвленной цепью в С. autoethanogenum какое-либо ингибирование обратной транскрипции гена alsD или активность соответствующего фермента.

Стадия восстановления из ацетоина до 2,3-бутандиола под действием 2,3-бутандиолдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.4) не является ступенью, ограничивающей скорость. Это было продемонстрировано в периодических и непрерывных культурах С. autoethanogenum путем добавления ацетоина к ферментационным средам. В периодических культурах добавляли до 40 г/л ацетоина и он количественно превращался в 2,3бутандиол через 24 ч инкубации. Фактически, предполагаемый ген 2,3-бутандиолдегидрогеназы был экспрессирован конститутивно во время роста и в стационарной фазе в периодической культуре (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011). Кроме того, было показано, что С. autoethanogenum содержит строго НАДФН-зависимую первично-вторичную алкогольдегидрогеназу, которая также гидрирует ацетоин и другие кетоны до 2,3-бутандиола и других вторичных спиртов (Kopke, Catalyst Rev, 27: 7-12, 2014).

Три нативных гена, PFOR, alsS и alsD, были сверхэкспрессированы индивидуально и в комбинации alsS-alsD и в комбинации всех трех генов. Чтобы ввести гены в С. autoethanogenum, гены были клонированы в рекомбинантную плазмиду, которая несет ген устойчивости к антибиотикам в качестве селективного маркера. По этой причине контрольный штамм для этого набора экспериментов переносил плазмиду с геном устойчивости к антибиотику, но без какой-либо активной инсерции гена 2,3-бутандиола, поэтому он мог подвергаться воздействию стресса антибиотика и сравнен с характеристиками сверхэкспрессирующих штаммов. Важным аспектом сверхэкспрессии является выбор промотора для регуляции экспрессии вставленных генов. В этом исследовании был выбран промотор гена ферредоксина (P_fdx), так как он известен как один из самых сильных промоторов в Clostridia. Кроме того, чтобы избежать гомологичной рекомбинации между нативным геном в геноме и геном, присутствующим в плазмиде, последовательность ДНК добавленных генов была изменена в соответствии с патентованном процессом оптимизации (GeneOptimizer) ДНК-синтезирующей компании (GeneArt).

Четыре гетерологичных гена также были нацелены. Показано, что ген PFOR, выделенный из Desulfovibrio africanus, продуцирует фермент PFOR, который является высокостабильным в присутствии кислорода, который может быть выгодным при коммерческом анаэробном брожении (Pieulle, J Bacteriol, 179: 5684-5692, 1997). Также тестировали ген alsS, выделенный из Bacillus substilis, и два гетерологичных гена alsD, выделенных из Leuconostoc lactis и из Aeromonas hydrophila. Ген alsS, выделенный из Bacillus substilis, был использован для конструирования пути 2,3-бутандиола в ряде гетерологичных хозяев (Ng, Microb Cell Factories, 11: 68, 2012; Oliver, PNAS, 110: 1249-1254, 2013). Показано, что alsD, выделенный из Aeromonas hydrophila, обладает самой высокой ферментативной активностью среди нескольких других гетерологичных alsD, выделенных из других микроорганизмов в недавнем исследовании (Oliver, PNAS, 110: 1249-1254, 2013). Эти свойства делают эти гены идеальными кандидатами для генетических манипуляционных экспериментов.

Пример 7.

Этот пример описывает клонирование, конъюгацию и характеристику штаммов, сверхэкспрессирующих пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу, ацетолактатсинтазу и/или ацетолактат декарбоксилазу.

В этом исследовании использовался штамм С. autoethanogenum LZ1561 (DSM23693). В качестве инструмента для генетической манипуляции использовались два штамма-донора Е. coli; для клонирования плазмиды использовали штамм ТОР 10 (Invitrogen), а штамм СА434 использовали для конъюгации с С. autoethanogenum.

Для избыточной экспрессии генов PFOR, alsS и alsD была выбрана челночная плазмида ClostridiumE.coli серии pMTL83159 (4600 пар оснований) (Heap, J Microbiol Meth, 78: 79-85, 2009). Плазмида была сконструирована так, чтобы содержать грамположительный репликон, грамотрицательный репликон, ген traJ, устойчивый к антибиотику ген, множественные сайты клонирования, расположенные в кодирующей последовательности lacZ альфа, и промотор гена ферредоксина (P_fdx). Грамположительный репликон (ген repH) происходит от плазмиды С. butylicum рСВ102. Для клонирования плазмиды в Е. coli грамотрицательный репликон ColE1 выбирали из-за большого количества копий продуцируемых плазмид. Ген traJ или ген переноса позволяет переносить генетический материал между клеткой-донором и клеткой

- 15 035950 реципиентом. Ген catP, кодирующий устойчивость к хлорамфениколу/тиамфениколу, был маркером выбора.

Три гена, PFOR, alsS и alsD, были синтезированы ДНК-синтезирующей компанией (GeneArt). Чтобы клонировать их в плазмиду pMTL83159, пару последовательностей распознавания рестрикционных ферментов и последовательности сайта связывания рибосомы добавляли к каждой последовательности гена и синтезировали вместе с этим геном. Исходные плазмиды, несущие ген, сначала трансформировали в штамм E.coli TOP 10. Для извлечения плазмид использовали плазмидный набор ZYPPY™ miniprep (Zymo Research). Для переноса целевого гена из его исходной плазмиды на плазмиду pMTL83159 обе плазмиды разрезали с той же парой рестрикционных ферментов. Расщепленную ДНК разделяли с помощью гель-электрофореза на 0,6% агарозном геле, который работал при 75 вольтах в течение одного часа. После извлечения из геля плазмиды pMTL83159 (вектор) и последовательности ДНК (вставки) каждого гена их лигировали вместе с использованием ДНК-лигазы Т4 (Invitrogen). Лигированные плазмиды затем трансформировали в культуру Е. coli Top10. Для обеспечения уверенности в том, что извлеченные плазмиды содержат вставку, 1 мкл плазмиды расщепляли подходящими рестрикционными ферментами, а расщепленную плазмиду затем разделяли гель-электрофорезом на 0,8% агарозном геле.

Плазмиды трансформировали в клетки-доноры Е. coli CA434 и затем конъюгировали с С. autoethanogenum. Для подтверждения присутствия целевой плазмиды в трансформантах С. autoethanogenum, ПЦР проводили, используя образцы, взятые из культур в бутылях сыворотки.

Первоначальную характеристику всех штаммов сверхэкспрессии генов и разрушения генов сначала проводили в бутылках 1.i-Schott для скрининга того, какой штамм продуцировал самую высокую концентрацию 2,3-бутандиола. Эти штаммы затем дополнительно тестировались в непрерывных культурах CSTR, что позволяет точно контролировать параметры ферментации, чтобы можно было рассчитать селективность метаболитов и биомассы.

Цели сверхэкспрессионных экспериментов заключались в сверхэкспрессии трех природных генов в пути 2,3-бутандиола индивидуально и в комбинациях двух и трех генов.___________________

Сверхэкспрессирующий штамм	Доступность штамма	Доступность бутылок Schott	данных
Контроль плазмиды	+	+
Нативный PFOR	+	+
Нативный AlsS	+	+
Нативный AlsD	+	+
Нативный AlsS-AlsD	+	+
Нативный PFOR-AlsS-AlsD	+	-

В экспериментах с бутылками Schott контролировали ОП, концентрации метаболитов в средах, pH сред и давление в свободном пространстве в течение восьми дней, анализируя ежедневные образцы. В этот момент не наблюдалось никакого дальнейшего роста или значительной метаболической активности, pH всех культур упал до между 3,8 и 4 и не было измерено никакого дальнейшего потребления газа. Графическое представление профилей роста и метаболитов в зависимости от времени пяти штаммов показано на фиг. 5. В течение первых двух дней инкубации все пять штаммов с наличием данных по бутылкам Schott быстро росли. После этого скорость роста значительно снизилась, а затем прекратилась на 4-й день. Максимальные значения оптической плотности были приблизительно 0,75. Аналогично биомассе, концентрации уксусной кислоты резко возрастали в течение первых двух дней во всех культурах. Между 3-м днем и 4-м днем контрольная плазмида и alsS сверхэкспрессирующий штамм, по-видимому, остановил всю метаболическую активность, поскольку никаких дальнейших изменений концентраций метаболитов не наблюдалось. Остальные три штамма демонстрировали активность до конца экспериментов.

Превращение ацетата в этанол (активность AOR) все еще можно было наблюдать у трех штаммов после замедления роста. Наиболее заметное падение содержания ацетата наблюдалось в сверхэкспрессирующем штамме alsD, и в результате этот штамм достиг наивысшей концентрации этанола, составляющей около 7 г/л. Два штамма, alsD и комбинированные alsS-alsD сверхэкспрессионные штаммы, продуцировали более высокие количества 2,3-бутандиола, чем другие штаммы, продуцируя большую часть его в течение фазы активного роста. После этого во время стационарной фазы с 4-го дня они продолжали производить 2,3-бутандиол медленными темпами до конца эксперимента на 8-й день. Сверхэкспрессионный PFOR штамм был другим штаммом, который продуцировал 2,3-бутандиол до более высокой концентрации, чем штамм контрольный плазмиды. В отличие от первых двух штаммов, сверхэкспрессионный PFOR штамм начал производить большую часть 2,3-бутандиола в начале стационарной фазы. Скорость производства была близка к скоростям двух других штаммов во время стационарной фазы.

Сверхэкспрессия только гена alsS, по-видимому, не увеличивала количество 2,3-бутандиола. Эти результаты показывают, что наблюдаемое увеличение количества 2,3-бутандиола связано в первую оче

- 16 035950 редь со сверхэкспрессией гена alsD. Сверхэкспрессия генов alsS и alsD привела к несколько более высокой концентрации 2,3-бутандиола, чем только избыточная экспрессия одного гена alsD. Положительный дополнительный эффект alsS может быть возможен. Сверхэкспрессия гена PFOR, по-видимому, способствовала более высокому продуцированию 2,3-бутандиола в течение стационарной фазы, где не наблюдалось никакого роста. Из-за всех этих положительных результатов и того факта, что никакого отрицательного эффекта не наблюдалось в этих штаммах, сверхэкспрессирующий штамм, несущий все три гена, был дополнительно испытан в непрерывной культуре в CSTR.

Чтобы исследовать весь потенциал микроба с использованием СО-содержащего газового субстрата, сверхэкспрессирующий штамм, несущий все три нативных гена и контрольный штамм плазмиды, был дополнительно охарактеризован на непрерывных культурах на основе CSTR. pH среды контролировали в течение всей ферментации, добавляя основание (5 М раствор NH₄OH) для компенсации образования кислоты и пополнения уровней азота в средах. Субстрат непрерывно подавали барботированием СОсодержащей газовой смеси через перемешиваемый ферментационный бульон. Газовый состав свежего входящего газа и использованного выходящего газа контролировался ежечасно с помощью газовой хроматографии. На основании различий в составе газа между втекающими и вытекающими газами, скоростью потока поступающего газа и объемом жидкости в процессе ферментации; рассчитывали использование газа и скорость синтеза продукта во время отбора проб. Значения выражены в моль/л/день.

ОП и концентрацию метаболитов измеряли три раза в день, и скорость разбавления и удельную скорость роста измеряли и подсчитывали ежедневно для определения продуктивности каждого метаболита. Селективность продукта для каждого метаболита рассчитывалась с использованием потребления CO, продукции CO₂ и продуктивности метаболитов. Для определения того, зависит ли селективность продукта от объемной производительности, были установлены скорости поглощения CO 4 моль/л/день и 8 моль/л/день. При поглощении CO 4 моль/л/день скорость разбавления системы поддерживалась на уровне 1 д^-1 и удельной скорости роста при 0,5 д^-1. При более высоком поглощении CO 8 моль/л/день и, соответственно, более высоких скоростях образования метаболитов, скорость разбавления культуры повышалась до 1,7 д^-1, чтобы снизить концентрации метаболитов до того же диапазона, что и в экспериментах с 4 моль/л/день. Удельная скорость роста также была увеличена до 0,75 д^-1.

Метаболит и профиль газа комбинированного сверхэкспрессионного штамма PFOR, alsS и alsD и контрольного штамма плазмиды контролировали при поглощении CO 4 моль/л/день в течение 20 дней (фиг. 6). Хотя приготовление инокулята каждого штамма проходило через несколько циклов субкультивирования флакона сыворотки в регулярные промежутки времени, в культурах CSTR наблюдалась необычная, почти идентичная длинная лаг-фаза в пять дней. Примерно в день 5,5 обе культуры CSTR начали нормальный экспоненциальный рост (в течение нескольких часов друг от друга).

Несмотря на длительную лаг-фазу в обеих культурах и колебания в характере роста сверхэкспрессирующего штамма между днями 8 и 10, обе культуры поддерживались при стабильном поглощении газа 4 моль/л/день в течение 10 дней. При скорости разбавления 1 д^-1 и удельной скорости роста 0,5 д^-1 требуется около шести дней для замены 95% бактериальной нагрузки в ферментерах. При постоянном поглощении газа, измеренного в течение этого периода, для анализа были использованы самые последние значения. Окончательные результаты показали, что сверхэкспрессирующий штамм последовательно продуцировал более высокие уровни 2,3-бутандиола по сравнению с контрольным штаммом плазмиды.

Профили метаболита и газовые профили сверхэкспрессиирующей культуры контролировались при поглощении CO 8 моль/л/день в течение 11 дней (фиг. 7). Культуру инокулировали из культуры поглощения 4 моль/л/день СО. В этой культуре не наблюдалась лаг-фаза, и при экспоненциальном росте применялись соответствующий удельный расход CO и скорость разбавления, чтобы поддерживать культуру в оптимальных условиях выращивания. Поэтому стабильное продуцирование уксусной кислоты было достигнуто после третьего дня инкубации, в то время как другие метаболиты продолжали накапливаться. Мишень поглощения CO удваивалась с 4 моль/л/день до 8 моль/л/день.

Чтобы избежать ингибирования продукта, общая скорость разбавления культуры была увеличена с 1 д^-1 до 1,7 д^-1 и удельный темп роста был увеличен пропорционально. Концентрации метаболита медленно увеличивались и достигали стабильного уровня производства через семь дней. Как поглощение водорода, так и поглощение CO, поддерживались стабильным образом в течение шести дней, указывая на то, что ферментация сверхэкспрессирующего штамма потенциально может стабильно работать в течение продолжительных периодов времени.

Среди жидких продуктов этанол был получен с самой высокой скоростью, за которой следовал ацетат. Конкретная стратегия подачи CO была направлена на поддержание определенного соотношения ацетата и этанола, что позволяет ферментации стабильно происходить в течение длительного периода времени. Штамм LZ1561 и контрольная плазмида демонстрировали аналогичные профили 2,3-бутандиола и биомассы. Коэффициенты скорости продукции 2,3-бутандиола и биомассы в этих культурах составляли между 1,26 до 1,47. Однако, в сверхэкспрессирующем штамме это отношение составляло 2,45 при поглощении CO 4 моль/л/день и 2,24 при 8 моль/л/день поглощения CO культуры.

- 17 035950

Штамм	LZ1561	Контроль	Сверхэкспрессия	LZ1561 Сверхэкспрессия
	Скорость поглощения газа (моль/л/день)
потребление СО	4	4	4	8	8
продукция СО2	2,45	2,53	2,43	4,53	4,34
Продукт		Скорость продукции (10’'	! моль/л/день)
2,3бутандиол	52	57	81	122	168
Биомасса	37	44	33	83	75
Этанол	447	450	367	798	823
Уксусная кислота	128	133	125	258	214

Селективность продукта для 2,3-бутандиола, биомассы, этанола и ацетата для сверхэкспрессии, контроля и штаммов LZ1561 была измерена при поглощении газа 4 моль/л/день и 8 моль/л/день. С оптимизированными параметрами ферментации более чем 50% углерода было направлено на образование этанола. Полученные данные показывают, что селективность 2,3-бутандиола в отношении сверхэкспрессирующего штамма увеличивалась от 15% в среднем в LZ1561 и в культурах контрольной плазмиды до 22,5%. Повышенная селективность 2,3-бутандиола в отношении сверхэкспрессирующего штамма, повидимому, поддерживалась при различных скоростях поглощения СО. Повышение селективности 2,3бутандиола способствует снижению селективности в отношении этанола при 4 моль/л/день или уменьшению селективности ацетата при 8 моль/л/день. Точный вклад этанола и ацетата не могут быть отделены, так как на их селективность легко влияют специфические подачи газа, которые, в свою очередь, легко зависят от небольших различий между параметрами работы. Например, pH, положение рабочего колеса, расположение зонда и другие могут повлиять на эти результаты.

Пример 8.

Этот пример демонстрирует экспрессию экзогенной ацетолактат декарбоксилазы для увеличения потока к 2,3-бутандиолу.

Ацетолактат декарбоксилазные гены из A. hydrophila и L. lactis синтезировали с кодонами, выбранными для экспрессии в С. autoethanogenum (GeneArt) и клонировали в pMTL83159, как описано выше. Полученные плазмиды и pMTL83159 в качестве контроля, трансформировали в С. autoethanogenum штамм LZ1561, как описано выше.

Штаммы выращивали в 1-литровых бутылках Schott, содержащих 40 мл среды PETC-MES, без дрожжевого экстракта, и объем воздушной камеры заменяли 1,5 бар (избыточное давление) синтетического фабричного газа (50% CO, 29% N2, 18% СО2 и 3% Н₂) в качестве источника углерода и энергии. Для поддержания плазмиды добавляли 15 мг л^-1 тиамфеникола. Биомасса и концентрация метаболитов регистрировались за счет роста культур.

Экспрессия любой экзогенной ацетолактат декарбоксилазы приводила к увеличению продуцирования 2,3-бутандиола во время роста на синтетическом фабричном газе по сравнению со штаммом, несущим пустую плазмиду в качестве контроля. Экспрессия alsD из A. hydrophila и L. lactis привела к продуцированию соответственно 2,3±0,08 и 1,6±0,16 г л^-1 2,3-бутандиола по сравнению с продуцированием 0,3±0,12 г л^-1 путём пустой-плазмиды-контрольного-штамма (фиг. 8).

Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитируемые в данном документе, включены в данное описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и конкретно указана для включения посредством ссылки и была полностью изложена в данном документе. Ссылка на любой предшествующий уровень техники в этом описании не является и не должна восприниматься как подтверждение того, что этот уровень техники является частью общих знаний в области науки в любой стране.

Использование терминов в единственном числе и аналогичных референтов в контексте описания изобретения (особенно в контексте нижеследующей формулы изобретения) следует толковать как охватывающее единственное и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно противоречит контексту. Термины содержащий, имеющий, включающий и содержащий должны толковаться как открытые термины (т. е. означать включая, но не ограничиваясь ими), если не указано иное.

Перечисление диапазонов величин в данном документе предназначено только для использования в качестве краткого способа для индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, если не указано иное в данном документе, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было индивидуально описано в данном документе. Все описанные в данном документе способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если не указано иное или это

- 18 035950 явно противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, таких как), предусмотренных в данном документе, предназначено только для лучшего освещения изобретения и не представляет собой ограничение объема изобретения, если не заявлено иное. Никакой язык в описании не должен толковаться как указывающий на любой незаявленный элемент как существенный для практики изобретения.

Предпочтительные варианты реализации данного изобретения описаны в данном документе, включая лучший способ, известный изобретателям для осуществления изобретения. Варианты этих предпочтительных вариантов реализации изобретения могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения вышеприведенного описания. Изобретатели ожидают, что квалифицированные специалисты используют такие вариации, когда это необходимо, и изобретатели намереваются применять изобретение иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета, приведенного в формуле изобретения, прилагаемой к данному документу, как это допускается применимым законодательством. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных его вариантах охватывает изобретение, если не указано иное в данном документе или это явно не противоречит контексту.

Перечень последовательностей <110> LanzaTech New Zealand Limited

ЛАНЦАТЕК НЬЮ ЗИЛЭНД ЛИМИТЕД <120> РЕКОМБИНАНТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ПОВЫШЕННЫЙ ПОТОК ПРИ ФЕРМЕНТАЦИОННОМ ПУТИ <130> LT113WO1 <150> 62/168,969 <151> 2015-06-01 <150> 62/089,053 <151> 2014-12-08 <160> 28 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 3513 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400> 1

atgcgtaaaa 60	tgaaaactat	ggatggaaat	actgctgctg	cttatatttc	ctatgcattt
actgatgtag 120	cagctattta	tccaataact	ccatcatcac	caatggcaga	acatgtagat
gaatgggtag 180	ctaagggaaa	gaaaaatatt	tttggacaac	aagtaaaagt	tatggagatg
caatcagagg 240	ctggagcatc	aggagccgta	catggttcac	tacaagcagg	agcattgact
agtacatata 300	ctgcatctca	aggcttatta	cttatgatac	ctaacatgta	taagattgct
ggtgaattat 360	taccaggagt	attccatgta	tcagctagag	cagtagctgc	aaattcactt
aacatatttg 420	gtgatcacca	agatgttatg	gcaacaagac	aaactggatt	tgctttattt
gcagaaagtt 480	cagtacaaca	ggttatggat	ctttcagcag	tagcccattt	atcagcaata
aaaggaagag 540	ttccatttgt	aaacttcttt	gatggattca	gaacttctca	tgaaattcaa
aaaatcgaat 600	tattagagta	tgaagaatta	gcaaaattag	ttgatcagaa	agctttgaat
gattttagaa 660	gaagagcttt	aaatccagat	catccagtaa	ctcgtggtac	agctcaaaat
cctgatatat	acttccagga	aagagaagtt	tcaaatacgt	attacgaagc	acttccagag

720

- 19 035950

atagttgaag 780	gatatatgca	agaaatgact	aaacttacag	gaagagaata	tcatctattc
aattactatg 840	gagcaaaaga	tgcagagaga	attataatag	ctatgggttc	tgtctgtgaa
actgtagaag 900	aagtaattga	ttacttaacc	acaaaaggtg	aaaaagttgg	attacttaca
gttcatttat 960	atagaccatt	ctcaataaaa	cactttatga	aatacatacc	aaagactgtt
aagaaaattg 1020	cagtccttga	tagaacaaaa	gaaccaggat	caattggaga	acctctttat
ttagatgtta 1080	agaatgcttt	ctatggacaa	gaagtacaac	cagttatagt	tggtggaaga
tatggacttg 1140	gttcaaaaga	tgtattacca	tcacatattc	taccagtatt	tgaaaactta
aaatcagata 1200	aacctaagga	tagatttaca	ttaagtatag	ttgatgatgt	tacaaatact
tcattacctg 1260	taggagaaga	tataaataca	acaccagaag	gaactacagc	ttgtaagttc
tggggactag 1320	gatcagatgg	tactgttgga	gcaaacaaga	gtgctataaa	gatcattgga
gaccatacag 1380	atatgtatgc	tcaaggatac	tttgcatatg	attcaaagaa	atccggtggt
ataacagttt 1440	ctcatttaag	atttggtaaa	tcaccaataa	aatcaccata	tcttatagat
aaggctgatt 1500	ttgttgcagt	tcataaccaa	tcttatgttc	ataagtatga	tgtacttgca
ggacttaaaa 1560	aaggcggtaa	cttcttatta	aatacagttt	ggactcaaga	agaattggaa
aaagagttac 1620	cagcttctat	gaagaaatat	atagcaaaca	atgatataaa	attctataca
ttaaatgctg 1680	ttaaaatagc	tcaagaaatt	ggacttggtg	gaagaataaa	tatgatatgt
caatcagcat 1740	tctttaagat	tgcaaatatc	attccaatag	atgatgctgt	taagtactta
aaagaagcag 1800	ttgtaacttc	ttatggtaag	aagggacaaa	aagttgtaga	tatgaataac
gctgctatag 1860	acaagggcgt	aaatgcagta	gttaaaatag	atgttccagc	ttcatggaaa
gatgcagaag	atgaagcagc	agctacaaag	gaacttccta	aatttataga	aaaaatagtt

1920

- 20 035950 aatcctatga atagacaaga aggagacaaa cttccagtaa gtgcatttgt aggaatggaa 1980 gatggtacat tcccagcagg aactgcagct tatgaaaaga gaggaatagc tataaatgtt 2040 ccagaatggc aagtagacaa atgtatacaa tgtaaccaat gttcatttgt atgtccacat 2100 gcagctataa gaccagttct tacaactgaa gaagaattag ctaaagcacc tcaaggattt 2160 gaagctaaag atgcaaatgg agcaaaagga cttaaattta caatggctat ttcaccactt 2220 gattgttcag gatgtggaaa ctgtgaagat gtatgtccag caaaagaaaa ggctcttgtt 2280 atgaagccag tagatactca gctgtcaaag acagaagctt gggattatgc tgttaatgct 2340 gtagctcata aggataaccc aatgaaggac aaatacagtg taaaagcaag tcagttcgaa 2400 caaccattac ttgagttctc aggagcttgt gcaggatgcg gagaaactcc ttatgttaaa 2460 cttgtaactc aattgtttgg tgatagaatg atgatagcaa atgctacagg atgttcatca 2520 atttggggag catcagcacc agcaactcca tacacaacta actatagagg acatggtcca 2580 tcttgggcta actcattatt tgaagacaat gctgaatatg gattaggtat gttccttgga 2640 gttaaacaga caagagaaag acttcaggat aaaattgaag aagctttaaa gggtagttta 2700 agtgcagaac ttaaagctgc ttttgaagac tggattaaaa actttgctga aggtgaagga 2760 acaagagaaa gagctgataa aataacagct ttacttgaaa aagaaaaggg aagcaatgat 2820 ttattaaatg atatttatga aaacagagac ttcctagtaa agagatccca ctggataatt 2880 ggtggagacg gttggggcta tgatattgga tatggtggag tagatcatgt tttagcttca 2940 aatgaagatg taaatattct tgtacttgat acagaagtat attcaaatac aggtggacaa 3000 tcttcaaaat caactccaac agctgctgta gctaaatttg ctgcaagtgg taagaagact 3060 aagaagaaag atcttggaat gatggctatg agttatggat atgtttatgt agctcagatt 3120

- 21 035950 tcaatgggtg ctgataagaa tcaggcatta aaggcaattc atgaagcaga agcttatcat 3180 ggaccatcac ttataatagc ttatgctcca tgtatcaatc atggcttaag agttggaatg 3240 ggtaagagcc agagagaagc taagagagct gttgattgtg gatattgggc actttacaga 3300 tacaatccag aattaaaaga agaaggaaag aaatcattta gcttggattc aaaagaacca 3360 actacagatt tcaaggaatt cttaatggga gaagtaagat actcttcact tgctaaacaa 3420 ttcccagatc aggcagatgc attatttgaa aagactaaga aagatgctct tcaaagaatt 3480 gcaggatata aaaagcttga taatgaacag taa

3513 <210>2 <211>1170 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>2

Met Arg Lys Met Lys Thr Met Asp Gly Asn Thr Ala Ala Ala Tyr lie

Ser Tyr Ala Phe Thr Asp Vai Ala Ala lie Tyr Pro lie Thr Pro Ser

Ser Pro Met Ala Glu His Vai Asp Glu Trp Vai Ala Lys Gly Lys Lys

Asn lie Phe Gly Gin Gin Vai Lys Vai Met Glu Met Gin Ser Glu Ala

Gly Ala Ser Gly Ala Vai His Gly Ser Leu Gin Ala Gly Ala Leu Thr

Ser Thr Tyr Thr Ala Ser Gin Gly Leu Leu Leu Met lie Pro Asn Met

Tyr Lys lie Ala Gly Glu Leu Leu Pro Gly Vai Phe His Vai Ser Ala

100

105

110

Arg Ala Vai Ala Ala Asn Ser Leu Asn lie Phe Gly Asp His Gin Asp

115

120

125

- 22 035950

Vai Met Ala Thr Arg Gin Thr Gly Phe Ala Leu Phe Ala Glu Ser Ser

130 135140

Vai Gin Gin Vai Met Asp Leu Ser Ala Vai Ala His Leu Ser Ala lie

145 150 155160

Lys Gly Arg Vai Pro Phe Vai Asn Phe Phe Asp Gly Phe Arg Thr Ser

165 170175

His Glu lie Gin Lys lie Glu Leu Leu Glu Tyr Glu Glu Leu Ala Lys

180 185190

Leu Vai Asp Gin Lys Ala Leu Asn Asp Phe Arg Arg Arg Ala Leu Asn

195 200205

Pro Asp His Pro Vai Thr Arg Gly Thr Ala Gin Asn Pro Asp lie Tyr

210 215220

Phe Gin Glu Arg Glu Vai Ser Asn Thr Tyr Tyr Glu Ala Leu Pro Glu

225 230 235240 lie Vai Glu Gly Tyr Met Gin Glu Met Thr Lys Leu Thr Gly Arg Glu

245 250255

Tyr His Leu Phe Asn Tyr Tyr Gly Ala Lys Asp Ala Glu Arg lie lie

260 265270 lie Ala Met Gly Ser Vai Cys Glu Thr Vai Glu Glu Vai lie Asp Tyr

275 280285

Leu Thr Thr Lys Gly Glu Lys Vai Gly Leu Leu Thr Vai His Leu Tyr

290 295300

Arg Pro Phe Ser lie Lys His Phe Met Lys Tyr lie Pro Lys Thr Vai

305 310 315320

Lys Lys lie Ala Vai Leu Asp Arg Thr Lys Glu Pro Gly Ser lie Gly

325 330335

Glu Pro Leu Tyr Leu Asp Vai Lys Asn Ala Phe Tyr Gly Gin Glu Vai

340 345350

Gin Pro Vai lie Vai Gly Gly Arg Tyr Gly Leu Gly Ser Lys Asp Vai

355 360365

Leu Pro Ser His lie Leu Pro Vai Phe Glu Asn Leu Lys Ser Asp Lys

- 23 035950

370 375380

Pro Lys Asp Arg Phe Thr Leu Ser lie Vai Asp Asp Vai Thr Asn Thr

385 390 395400

Ser Leu Pro Vai Gly Glu Asp lie Asn Thr Thr Pro Glu Gly Thr Thr

405 410415

Ala Cys Lys Phe Trp Gly Leu Gly Ser Asp Gly Thr Vai Gly Ala Asn

420 425430

Lys Ser Ala lie Lys lie lie Gly Asp His Thr Asp Met Tyr Ala Gln

435 440445

Gly Tyr Phe Ala Tyr Asp Ser Lys Lys Ser Gly Gly lie Thr Vai Ser

450 455460

His Leu Arg Phe Gly Lys Ser Pro lie Lys Ser Pro Tyr Leu lie Asp

465 470 475480

Lys Ala Asp Phe Vai Ala Vai His Asn Gln Ser Tyr Vai His Lys Tyr

485 490495

Asp Vai Leu Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gly Asn Phe Leu Leu Asn Thr

500 505510

Vai Trp Thr Gln Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Pro Ala Ser Met Lys

515 520525

Lys Tyr lie Ala Asn Asn Asp lie Lys Phe Tyr Thr Leu Asn Ala Vai

530 535540

Lys lie Ala Gln Glu lie Gly Leu Gly Gly Arg lie Asn Met lie Cys

545 550 555560

Gln Ser Ala Phe Phe Lys lie Ala Asn lie lie Pro lie Asp Asp Ala

565 570575

Vai Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Vai Vai Thr Ser Tyr Gly Lys Lys Gly

580 585590

Gln Lys Vai Vai Asp Met Asn Asn Ala Ala lie Asp Lys Gly Vai Asn

595 600605

Ala Vai Vai Lys lie Asp Vai Pro Ala Ser Trp Lys Asp Ala Glu Asp

610 615620

- 24 035950

Glu Ala Ala Ala Thr Lys Glu Leu Pro Lys Phe lie Glu Lys lie Vai

625 630 635640

Asn Pro Met Asn Arg Gin Glu Gly Asp Lys Leu Pro Vai Ser Ala Phe

645 650655

Vai Gly Met Glu Asp Gly Thr Phe Pro Ala Gly Thr Ala Ala Tyr Glu

660 665670

Lys Arg Gly lie Ala lie Asn Vai Pro Glu Trp Gin Vai Asp Lys Cys

675 680685 lie Gin Cys Asn Gin Cys Ser Phe Vai Cys Pro His Ala Ala lie Arg

690 695700

Pro Vai Leu Thr Thr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ala Pro Gin Gly Phe

705 710 715720

Glu Ala Lys Asp Ala Asn Gly Ala Lys Gly Leu Lys Phe Thr Met Ala

725 730735 lie Ser Pro Leu Asp Cys Ser Gly Cys Gly Asn Cys Glu Asp Vai Cys

740 745750

Pro Ala Lys Glu Lys Ala Leu Vai Met Lys Pro Vai Asp Thr Gin Leu

755 760765

Ser Lys Thr Glu Ala Trp Asp Tyr Ala Vai Asn Ala Vai Ala His Lys

770 775780

Asp Asn Pro Met Lys Asp Lys Tyr Ser Vai Lys Ala Ser Gin Phe Glu

785 790 795800

Gin Pro Leu Leu Glu Phe Ser Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Glu Thr

805 810815

Pro Tyr Vai Lys Leu Vai Thr Gin Leu Phe Gly Asp Arg Met Met lie

820 825830

Ala Asn Ala Thr Gly Cys Ser Ser lie Trp Gly Ala Ser Ala Pro Ala

835 840845

Thr Pro Tyr Thr Thr Asn Tyr Arg Gly His Gly Pro Ser Trp Ala Asn

850 855860

- 25 035950

Ser

865

Leu

Phe

Glu

Asp

Asn

870

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

875

Gly

Met

Phe

Leu

Gly 880

Vai

Lys

Gin

Thr

Arg

885

Glu

Arg

Leu

Gin

Asp

890

Lys lie

Glu

Glu

Ala

895

Leu

Lys

Gly

Ser

Leu

900

Ala

Glu

Leu

Lys

905

Ala

Ala

Phe

Glu

Asp

910

Trp lie

Lys

Asn

Phe

915

Ala

Glu

Gly

Glu

Gly 920

Thr

Arg

Glu

Arg

Ala

925

Asp

Lys lie

Thr

Ala

930

Leu

Leu

Glu

Lys

Glu

935

Lys

Gly

Ser

Asn

Asp

940

Leu

Leu

Asn

Asp lie

945

Tyr

Glu

Asn

Arg

Asp

950

Phe

Leu

Vai

Lys

Arg

955

Ser

His

Trp lie lie

960

Gly

Gly

Asp

Gly

Trp

965

Gly

Tyr

Asp lie

Gly 970

Tyr

Gly

Gly

Vai

Asp

975

His

Vai

Leu

Ala

Ser

980

Asn

Glu

Asp

Vai

Asn

985 lie

Leu

Vai

Leu

Asp

990

Thr

Glu

Vai Tyr Ser Asn Thr Gly Gly Gin Ser Ser Lys Ser Thr Pro Thr Ala 995 10001005

Ala Vai Ala Lys Phe Ala Ala Ser Gly Lys Lys Thr Lys Lys Lys

1010 10151020

Asp Leu Gly Met Met Ala Met Ser Tyr Gly Tyr Vai Tyr Vai Ala

1025 10301035

Gin lie Ser Met Gly Ala Asp Lys Asn Gin Ala Leu Lys Ala lie

1040 10451050

His Glu Ala Glu Ala Tyr His Gly Pro Ser Leu lie lie Ala Tyr

1055 10601065

Ala Pro Cys lie Asn His Gly Leu Arg Vai Gly Met Gly Lys Ser

1070 10751080

Gin Arg Glu Ala Lys Arg Ala Vai Asp Cys Gly Tyr Trp Ala Leu

1085 10901095

- 26 035950

Туг Arg Туг Asn Pro

1100

Glu Leu Lys Glu Glu 1105

Gly Lys Lys Ser Phe 1110

Ser Leu Asp Ser Lys 1115

Glu Pro Thr Thr Asp 1120

Phe Lys Glu Phe Leu 1125

Met Gly Glu Vai Arg 1130

Tyr Ser Ser Leu Ala 1135

Lys Gin Phe Pro Asp 1140

Gin Ala Asp Ala Leu 1145

Phe Glu Lys Thr Lys 1150

Lys Asp Ala Leu Gin 1155

Arg lie Ala Gly Tyr 1160

Lys Lys Leu Asp Asn

1165

Glu Gin

1170 <210> 3 <211> 3538 <212> DNA <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Оптимизированная по кодону пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза,

Clostridium autoethanogenum LZ1561
<400> 3 tctagaagga 60	ggtaactaaa	tgagaaaaat	gaaaactatg	gatggaaata	ctgcagcagc
atatataagt 120	tatgcattta	ctgatgtagc	agcaatatat	cctataactc	ctagtagtcc
tatggcagaa 180	catgtagatg	aatgggtagc	aaaaggaaaa	aaaaatatat	ttggacaaca
agtaaaagta 240	atggaaatgc	aaagtgaagc	tggagcaagt	ggagcagtac	atggaagttt
acaagctgga 300	gcattaacta	gtacttatac	tgcaagtcaa	ggattattat	taatgatacc
taatatgtat 360	aaaatagctg	gagaattatt	acctggagta	tttcatgtaa	gtgcaagagc
agtagcagca 420	aatagtttaa	atatatttgg	agatcatcaa	gatgtaatgg	caactagaca
aactggattt 480	gcattatttg	cagaaagtag	tgtacaacaa	gtaatggatt	taagtgcagt
agcacattta 540	agtgcaataa	aaggaagagt	accttttgta	aatttttttg	atggatttag
aactagtcat	gaaatacaaa	aaatagaatt	attagaatat	gaagaattag	caaaattagt

600

- 27 035950 agatcaaaaa gcattaaatg attttagaag aagagcatta aatcctgatc atcctgtaac 660 tagaggaact gcacaaaatc ctgatatata ttttcaagaa agagaagtaa gtaatactta 720 ttatgaagca ttacctgaaa tagtagaagg atatatgcaa gaaatgacta aattaactgg 780 aagagaatat catttattta attattatgg agcaaaagat gcagaaagaa taataatagc 840 aatgggaagt gtatgtgaaa ctgtagaaga agtaatagat tatttaacta ctaaaggaga 900 aaaagtagga ttattaactg tacatttata tagacctttt agtataaaac attttatgaa 960 atatatacct aaaactgtaa aaaaaatagc agtattagat agaactaaag aacctggaag 1020 tataggagaa cctttatatt tagatgtaaa aaatgctttt tatggacaag aagtacaacc 1080 tgtaatagtt ggaggaagat atggattagg atctaaagat gtattaccta gtcatatatt 1140 acctgtattt gaaaatttaa aaagtgataa acctaaagat agatttactt taagtatagt 1200 agatgatgta actaatacta gtttacctgt tggagaagat ataaatacta ctcctgaagg 1260 aactactgca tgtaaatttt ggggattagg aagtgatgga actgttggag caaataaatc 1320 tgcaataaaa ataataggag atcatactga tatgtatgca caaggatatt ttgcttatga 1380 tagtaaaaaa agtggaggaa taactgtaag tcatttaaga tttggaaaaa gtcctataaa 1440 aagtccttat ttaatagata aagcagattt tgtagcagta cataatcaaa gttatgttca 1500 taaatatgat gtattagcag gattaaaaaa aggaggaaat tttttattaa atactgtatg 1560 gactcaagaa gaattagaaa aagaattacc tgcaagtatg aaaaagtata tagcaaataa 1620 tgatataaag ttttatactt taaatgcagt aaaaatagca caagaaatag gattaggagg 1680 aagaataaat atgatatgtc aaagtgcatt ttttaaaata gcaaatataa tacctataga 1740 tgatgcagta aaatatttaa aagaagcagt agtaactagt tatggaaaaa aaggacaaaa 1800

- 28 035950

agttgtagat 1860	atgaataatg	cagcaataga	taaaggagta	aatgcagtag	taaaaataga
tgtacctgca 1920	agttggaaag	atgctgaaga	tgaagcagca	gcaactaaag	aattacctaa
atttatagaa 1980	aaaatagtaa	atcctatgaa	tagacaagaa	ggagataaat	tacctgtaag
tgcatttgta 2040	ggaatggaag	atggaacttt	tcctgctgga	actgcagctt	atgaaaaaag
aggaatagca 2100	ataaatgtac	ctgaatggca	agtagataaa	tgtatacaat	gtaatcaatg
tagttttgta 2160	tgtcctcatg	cagcaataag	acctgtatta	actactgaag	aagaattagc
taaagcacct 2220	caaggatttg	aagctaaaga	tgcaaatgga	gctaaaggat	taaaatttac
tatggcaata 2280	agtcctttag	attgtagtgg	atgtggaaat	tgtgaagatg	tatgtcctgc
aaaagaaaaa 2340	gcattagtaa	tgaaacctgt	agatactcaa	ttaagtaaaa	ctgaagcatg
ggattatgca 2400	gtaaatgctg	tagcacataa	agataatcct	atgaaagata	aatatagtgt
aaaagcaagt 2460	caatttgaac	aacctttatt	agaatttagt	ggagcatgtg	caggatgtgg
agaaactcct 2520	tatgtaaaat	tagtaactca	attatttgga	gatagaatga	tgatagcaaa
tgcaactgga 2580	tgtagtagta	tatggggagc	aagtgctcct	gcaactcctt	atactactaa
ttatagagga 2640	catggaccta	gttgggcaaa	ttctttattt	gaagataatg	cagaatatgg
attaggaatg 2700	tttttaggag	taaaacaaac	tagagaaaga	ttacaagata	aaatagaaga
agcattaaaa 2760	ggatctttaa	gtgcagaatt	aaaagcagca	tttgaagatt	ggataaaaaa
ttttgcagaa 2820	ggagaaggaa	caagagaaag	agcagataaa	ataactgcat	tattagaaaa
agaaaaagga 2880	tctaatgatt	tattaaatga	tatatatgaa	aatagagatt	ttttagtaaa
aagaagtcat 2940	tggataatag	gaggagatgg	atggggatat	gatataggat	atggaggagt
agatcatgta	ttagcaagta	atgaagatgt	aaatatatta	gtattagata	ctgaagtata

3000

- 29 035950 tagtaatact ggaggacaaa gtagtaaaag tactcctact gcagcagtag caaaatttgc 3060 agcaagtgga aaaaaaacta aaaaaaaaga tttaggaatg atggcaatga gttatggata 3120 tgtatatgta gcacaaataa gtatgggagc tgataaaaat caagctttaa aagcaataca 3180 tgaagctgaa gcatatcatg gaccaagttt aataatagct tatgcacctt gtataaatca 3240 tggattaaga gtaggaatgg gaaaaagtca aagagaagca aaaagagcag tagattgtgg 3300 atattgggca ttatatagat ataatcctga attaaaagaa gaaggaaaaa aatcttttag 3360 tttagatagt aaagaaccta ctactgattt taaagaattt ttaatgggag aagtaagata 3420 tagtagttta gcaaaacaat ttcctgatca agcagatgct ttatttgaaa aaacaaaaaa 3480 agatgcatta caaagaatag ctggatataa aaaattagat aatgaacaat aagctagc 3538 <210> 4 <211> 1170 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Оптимизированная по кодону пируват :ферредоксин-оксидоредуктаза Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>4

Met Arg Lys Met Lys Thr Met Asp Gly Asn Thr Ala Ala Ala Tyr lie

1015

Ser Tyr Ala Phe Thr Asp Vai Ala Ala lie Tyr Pro lie Thr Pro Ser 20 2530

Ser Pro Met Ala Glu His Vai Asp Glu Trp Vai Ala Lys Gly Lys Lys 35 4045

Asn lie Phe Gly Gin Gin Vai Lys Vai Met Glu Met Gin Ser Glu Ala

5560

Gly Ala Ser Gly Ala Vai His Gly Ser Leu Gin Ala Gly Ala Leu Thr 65 70 7580

Ser Thr Tyr Thr Ala Ser Gin Gly Leu Leu Leu Met lie Pro Asn Met

9095

- 30 035950

Туг Lys lie Ala Gly Glu Leu Leu Pro Gly Vai Phe His Vai Ser Ala

100 105110

Arg Ala Vai Ala Ala Asn Ser Leu Asn lie Phe Gly Asp His Gin Asp

115 120125

Vai Met Ala Thr Arg Gin Thr Gly Phe Ala Leu Phe Ala Glu Ser Ser

130 135140

Vai Gin Gin Vai Met Asp Leu Ser Ala Vai Ala His Leu Ser Ala lie

145 150 155160

Lys Gly Arg Vai Pro Phe Vai Asn Phe Phe Asp Gly Phe Arg Thr Ser

165 170175

His Glu lie Gin Lys lie Glu Leu Leu Glu Tyr Glu Glu Leu Ala Lys

180 185190

Leu Vai Asp Gin Lys Ala Leu Asn Asp Phe Arg Arg Arg Ala Leu Asn

195 200205

Pro Asp His Pro Vai Thr Arg Gly Thr Ala Gin Asn Pro Asp lie Tyr

210 215220

Phe Gin Glu Arg Glu Vai Ser Asn Thr Tyr Tyr Glu Ala Leu Pro Glu

225 230 235240 lie Vai Glu Gly Tyr Met Gin Glu Met Thr Lys Leu Thr Gly Arg Glu

245 250255

Tyr His Leu Phe Asn Tyr Tyr Gly Ala Lys Asp Ala Glu Arg lie lie

260 265270 lie Ala Met Gly Ser Vai Cys Glu Thr Vai Glu Glu Vai lie Asp Tyr

275 280285

Leu Thr Thr Lys Gly Glu Lys Vai Gly Leu Leu Thr Vai His Leu Tyr

290 295300

Arg Pro Phe Ser lie Lys His Phe Met Lys Tyr lie Pro Lys Thr Vai

305 310 315320

Lys Lys lie Ala Vai Leu Asp Arg Thr Lys Glu Pro Gly Ser lie Gly

325 330335

- 31 035950

Glu Pro

Leu Tyr

340

Leu Asp

Vai Lys

Gin Pro

Vai lie 355

Vai Gly

Gly Arg

360

Leu Pro

370

Ser His lie Leu

Pro Vai

375

Pro Lys 385

Asp Arg

Phe Thr

390

Leu Ser

Ser Leu

Pro Vai

Gly Glu 405

Asp lie

Ala Cys

Lys Phe

420

Trp Gly

Leu Gly

Lys Ser

Ala lie 435

Lys lie

He Gly

440

Gly Tyr

450

Phe Ala

Tyr Asp

Ser Lys 455

His Leu 465

Arg Phe

Gly Lys

470

Ser Pro

Lys Ala

Asp Phe

Vai Ala 485

Vai His

Asp Vai

Leu Ala

500

Gly Leu

Lys Lys

Vai Trp

Thr Gin 515

Glu Glu

Leu Glu

520

Lys Tyr

530 lie Ala

Asn Asn

Asp He 535

Lys lie 545

Ala Gin

Glu lie

550

Gly Leu

Gin Ser

Ala Phe

Phe Lys 565 lie Ala

Asn Ala 345

Tyr Gly

Phe Glu lie Vai

Asn Thr 410

Ser Asp 425

Asp His

Lys Ser

He Lys

Asn Gin 490

Gly Gly 505

Lys Glu

Lys Phe

Gly Gly

Asn lie 570

Phe Tyr

Leu Gly

Asn Leu 380

Asp Asp 395

Thr Pro

Gly Thr

Thr Asp

Gly Gly 460

Ser Pro 475

Ser Tyr

Asn Phe

Leu Pro

Tyr Thr 540

Arg lie 555 lie Pro

Gly Gin

350

Ser Lys 365

Lys Ser

Vai Thr

Glu Gly

Vai Gly

430

Met Tyr 445 lie Thr

Tyr Leu

Vai His

Leu Leu

510

Ala Ser 525

Leu Asn

Asn Met

He Asp

Glu Vai

Asp Vai

Asp Lys

Asn Thr 400

Thr Thr 415

Ala Asn

Ala Gin

Vai Ser

He Asp

480

Lys Tyr 495

Asn Thr

Met Lys

Ala Vai

He Cys

560

Asp Ala 575

- 32 035950

Vai Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Vai Vai Thr Ser Tyr Gly Lys Lys Gly

580 585590

Gin Lys Vai Vai Asp Met Asn Asn Ala Ala lie Asp Lys Gly Vai Asn

595 600605

Ala Vai Vai Lys lie Asp Vai Pro Ala Ser Trp Lys Asp Ala Glu Asp

610 615620

Glu Ala Ala Ala Thr Lys Glu Leu Pro Lys Phe lie Glu Lys lie Vai

625 630 635640

Asn Pro Met Asn Arg Gin Glu Gly Asp Lys Leu Pro Vai Ser Ala Phe

645 650655

Vai Gly Met Glu Asp Gly Thr Phe Pro Ala Gly Thr Ala Ala Tyr Glu

660 665670

Lys Arg Gly lie Ala lie Asn Vai Pro Glu Trp Gin Vai Asp Lys Cys

675 680685 lie Gin Cys Asn Gin Cys Ser Phe Vai Cys Pro His Ala Ala lie Arg

690 695700

Pro Vai Leu Thr Thr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ala Pro Gin Gly Phe

705 710 715720

Glu Ala Lys Asp Ala Asn Gly Ala Lys Gly Leu Lys Phe Thr Met Ala

725 730735 lie Ser Pro Leu Asp Cys Ser Gly Cys Gly Asn Cys Glu Asp Vai Cys

740 745750

Pro Ala Lys Glu Lys Ala Leu Vai Met Lys Pro Vai Asp Thr Gin Leu

755 760765

Ser Lys Thr Glu Ala Trp Asp Tyr Ala Vai Asn Ala Vai Ala His Lys

770 775780

Asp Asn Pro Met Lys Asp Lys Tyr Ser Vai Lys Ala Ser Gin Phe Glu

785 790 795800

Gin Pro Leu Leu Glu Phe Ser Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Glu Thr

805 810815

Pro Tyr Vai Lys Leu Vai Thr Gin Leu Phe Gly Asp Arg Met Met lie

- 33 035950

820 825830

Ala Asn Ala Thr Gly Cys Ser Ser lie Trp Gly Ala Ser Ala Pro Ala

835 840845

Thr Pro Tyr Thr Thr Asn Tyr Arg Gly His Gly Pro Ser Trp Ala Asn

850 855860

Ser Leu Phe Glu Asp Asn Ala Glu Tyr Gly Leu Gly Met Phe Leu Gly

865 870 875880

Vai Lys Gin Thr Arg Glu Arg Leu Gin Asp Lys lie Glu Glu Ala Leu

885 890895

Lys Gly Ser Leu Ser Ala Glu Leu Lys Ala Ala Phe Glu Asp Trp lie

900 905910

Lys Asn Phe Ala Glu Gly Glu Gly Thr Arg Glu Arg Ala Asp Lys lie

915 920925

Thr Ala Leu Leu Glu Lys Glu Lys Gly Ser Asn Asp Leu Leu Asn Asp

930 935940 lie Tyr Glu Asn Arg Asp Phe Leu Vai Lys Arg Ser His Trp lie lie

945 950 955960

Gly Gly Asp Gly Trp Gly Tyr Asp lie Gly Tyr Gly Gly Vai Asp His

965 970975

Vai Leu Ala Ser Asn Glu Asp Vai Asn lie Leu Vai Leu Asp Thr Glu

980 985990

Vai Tyr Ser Asn Thr Gly Gly Gin Ser Ser Lys Ser Thr Pro Thr Ala 995 10001005

Ala Vai Ala Lys Phe Ala Ala Ser Gly Lys Lys Thr Lys Lys Lys

1010 10151020

Asp Leu Gly Met Met Ala Met Ser Tyr Gly Tyr Vai Tyr Vai Ala

1025 10301035

Gin lie Ser Met Gly Ala Asp Lys Asn Gin Ala Leu Lys Ala lie

1040 10451050

His Glu Ala Glu Ala Tyr His Gly Pro Ser Leu lie lie Ala Tyr

1055 10601065

- 34 035950

Ala

Pro 1070

Cys

lie

Asn

His

Gly 1075

Leu

Arg

Vai

Gly

Met 1080

Gly

Lys

Ser

Gin

Arg 1085

Glu

Ala

Lys

Arg

Ala 1090

Vai

Asp

Cys

Gly

Tyr 1095

Trp

Ala

Leu

Tyr

Arg 1100

Tyr

Asn

Pro

Glu

Leu 1105

Lys

Glu

Glu

Gly

Lys 1110

Lys

Ser

Phe

Ser

Leu 1115

Asp

Ser

Lys

Glu

Pro 1120

Thr

Thr

Asp

Phe

Lys 1125

Glu

Phe

Leu

Met

Gly 1130

Glu

Vai

Arg

Tyr

Ser 1135

Ser

Leu

Ala

Lys

Gin 1140

Phe

Pro

Asp

Gin

Ala 1145

Asp

Ala

Leu

Phe

Glu 1150

Lys

Thr

Lys

Lys

Asp 1155

Ala

Leu

Gin

Arg

lie 1160

Ala

Gly

Tyr

Lys

Lys 1165

Leu

Asp

Asn

Glu

Gin 1170

<210> 5 <211> 3725 <212> DNA <213> Desulfovibrio africanus

<400> 5 tctagataag 60	gaggtcggac	atgggaaaaa	aaatgatgac	tactgatgga	aatactgcaa
ctgcacatgt 120	agcttatgca	atgagtgaag	tagcagcaat	atatcctata	actcctagta
gtactatggg 180	agaagaagca	gacgattggg	cagcacaggg	aagaaaaaat	atatttggac
aaactttaac 240	tataagagaa	atgcaaagtg	aagctggtgc	tgctggtgca	gtacatggtg
cattagcagc 300	tggtgcatta	actactactt	ttactgcaag	tcagggatta	ttacttatga
tacctaatat 360	gtacaaaata	agtggtgaat	tattacctgg	tgtatttcat	gtaactgcaa
gagcaatagc 420	agcacatgca	cttagtatat	ttggagatca	tcaagatata	tatgcagcaa
gacagactgg	atttgcaatg	ttagcaagta	gtagtgtaca	agaggcacat	gatatggcac

480

- 35 035950 ttgtagcaca tttagcagca atagaaagta atgtaccttt tatgcatttt tttgatggat 540 ttagaactag tcatgaaata caaaaaatag aagtattaga ttatgcagat atggcaagtt 600 tagtaaatca aaaagcatta gcagaattta gagcaaaaag tatgaatcct gaacatcctc 660 atgtaagagg aactgcacaa aatcctgata tatattttca gggaagagaa gcagcaaatc 720 cttattatct taaagtacct ggaatagtag ctgaatatat gcaaaaagta gcaagtttaa 780 ctggaagaag ttataaactt tttgattatg ttggagcacc tgatgcagaa agggtaatag 840 taagtatggg aagtagttgt gaaactatag aagaagtaat aaatcatctt gcagcaaaag 900 gtgaaaaaat aggacttata aaagtaagac tttatagacc ttttgtaagt gaagcatttt 960 ttgcagcatt acctgcaagt gcaaaagtaa taactgtatt agatagaact aaagaacctg 1020 gtgcacctgg tgatccttta tatcttgatg tatgtagtgc atttgtagaa aggggtgaag 1080 caatgcctaa aatacttgct ggaagatatg gattaggaag taaagaattt agtcctgcaa 1140 tggtaaaaag tgtatatgat aatatgagtg gtgcaaaaaa aaatcatttc actgtaggaa 1200 tagaagatga tgtaactgga actagtttac ctgtagataa tgcatttgca gatactactc 1260 ctaaaggtac tatacaatgt caattttggg gacttggagc agatggaact gttggagcaa 1320 ataaacaagc aataaaaata attggagata atactgattt atttgcacaa ggatatttta 1380 gttatgatag taaaaaaagt ggtggaataa ctataagtca tttaagattt ggagaaaaac 1440 ctatacaaag tacttattta gtaaatagag cagattatgt agcatgtcat aatcctgctt 1500 atgtaggaat atatgatata ttagaaggta taaaagatgg tggaactttt gtacttaata 1560 gtccttggag tagtttagaa gatatggata aacatttacc tagtggaata aaaagaacta 1620 tagcaaataa gaaattaaaa ttttataata tagatgcagt aaaaatagca actgatgtag 1680

- 36 035950

gattaggtgg 1740	aagaataaat	atgataatgc	aaactgcatt	ttttaaatta	gctggtgtat
taccttttga 1800	aaaagcagta	gatttattaa	aaaaaagtat	acataaagct	tatggaaaaa
aaggtgaaaa 1860	aattgtaaaa	atgaatactg	atgcagtaga	tcaagcagta	actagtttac
aagaatttaa 1920	atatcctgat	agttggaaag	atgcaccagc	agaaactaaa	gcagaaccta
tgactaatga 1980	attttttaaa	aatgtagtaa	aacctatatt	aactcaacaa	ggtgataaat
tacctgtatc 2040	tgcatttgaa	gcagatggaa	gatttcctct	tggaactagt	caatttgaaa
aaagaggtgt 2100	agctataaac	gtacctcagt	gggttcctga	aaattgtata	cagtgtaatc
aatgtgcatt 2160	tgtatgtcct	catagtgcaa	tacttccagt	attagcaaaa	gaagaagaat
tagttggagc 2220	accagcaaat	tttactgcac	ttgaagcaaa	gggaaaagaa	cttaaaggat
ataaatttag 2280	aatacagata	aatactttag	attgtatggg	atgtggaaat	tgtgcagata
tatgtcctcc 2340	taaagaaaaa	gcacttgtaa	tgcagcctct	tgatactcaa	agagatgcac
aagtacctaa 2400	tttagaatat	gcagctagaa	tacctgtaaa	aagtgaagta	ttacctagag
atagtttaaa 2460	aggatctcaa	tttcaagaac	ctttaatgga	atttagtggt	gcatgtagtg
gatgtggtga 2520	aactccttat	gtaagagtaa	taactcaatt	atttggagaa	agaatgttta
tagcaaatgc 2580	aactggatgt	agtagtatat	ggggagcaag	tgcacctagt	atgccttata
aaactaatag 2640	acttggacaa	ggacctgcat	ggggaaatag	tttatttgaa	gatgcagcag
aatatggatt 2700	tggaatgaat	atgagtatgt	ttgcaagaag	aactcattta	gcagatttag
ctgcaaaagc 2760	attagaaagt	gatgcaagtg	gtgatgtaaa	agaagcatta	caaggttggt
tagctggaaa 2820	aaatgatcct	ataaaaagta	aagaatatgg	tgataaactt	aaaaaacttt
tagcaggaca	aaaagatgga	ttattaggac	aaatagcagc	aatgagtgat	ctttatacta

2880

- 37 035950

aaaaaagtgt 2940	atggatattt ggaggtgatg	gatgggctta tgatatagga	tatggtggac
ttgatcatgt 3000	acttgcatct ggtgaagatg	taaatgtatt tgtaatggat	actgaagtat
atagtaatac 3060	tggtggacaa agtagtaaag	caactcctac tggtgcagta	gcaaaatttg
cagcagctgg 3120	aaaaagaact ggaaaaaaag	atttagcaag aatggtaatg	acttatggat
atgtatatgt 3180	agcaactgta tctatgggat	atagtaaaca acaatttctt	aaagtattaa
aagaagcaga 3240	aagttttcct ggacctagtt	tagtaatagc ttatgctact	tgtataaatc
aaggattaag 3300	aaaaggtatg ggaaaaagtc	aagatgtaat gaatactgca	gtaaaaagtg
gatattggcc 3360	tttatttaga tatgatccta	gacttgcagc tcagggaaaa	aatccttttc
aattagatag 3420	taaagcacct gatggaagtg	tagaagaatt tcttatggca	caaaatagat
ttgcagtact 3480	tgatagaagt tttcctgaag	atgcaaaaag attaagagca	caagtagcac
atgaattaga 3540	tgtaagattt aaagaattag	aacacatggc agcaactaat	atatttgaaa
gttttgcacc 3600	agccggtggt aaagcagatg	gatctgtaga ttttggagaa	ggtgcagaat
tttgtactag 3660	agatgatact cctatgatgg	caagacctga tagtggtgaa	gcatgtgatc
aaaatagagc tggaactagt gaacaacagg 3720 ctagc 3725 <210> 6 <211> 1232 <212> PRT <213> Desulfovibrio africanus <400> 6	gtgatcttag taaaagaact	aaaaaataag
Met Gly Lys 1	: Lys Met Met Thr Thr 1 5	isp Gly Asn Thr Ala Thi 10	: Ala His 15
Vai Ala Tyi	? Ala Met Ser Glu Vai 1	ila Ala lie Tyr Pro lie Thr Pro

25 30

- 38 035950

Ser Ser Thr Met Gly Glu Glu Ala Asp Asp Trp Ala Ala Gin Gly Arg 35 4045

Lys Asn lie Phe Gly Gin Thr Leu Thr lie Arg Glu Met Gin Ser Glu 50 5560

Ala Gly Ala Ala Gly Ala Vai His Gly Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu 65 70 7580

Thr Thr Thr Phe Thr Ala Ser Gin Gly Leu Leu Leu Met lie Pro Asn 85 9095

Met Tyr Lys lie Ser Gly Glu Leu Leu Pro Gly Vai Phe His Vai Thr

100 105110

Ala Arg Ala lie Ala Ala His Ala Leu Ser lie Phe Gly Asp His Gin

115 120125

Asp lie Tyr Ala Ala Arg Gin Thr Gly Phe Ala Met Leu Ala Ser Ser

130 135140

Ser Vai Gin Glu Ala His Asp Met Ala Leu Vai Ala His Leu Ala Ala

145 150 155160 lie Glu Ser Asn Vai Pro Phe Met His Phe Phe Asp Gly Phe Arg Thr

165 170175

Ser His Glu lie Gin Lys lie Glu Vai Leu Asp Tyr Ala Asp Met Ala

180 185190

Ser Leu Vai Asn Gin Lys Ala Leu Ala Glu Phe Arg Ala Lys Ser Met

195 200205

Asn Pro Glu His Pro His Vai Arg Gly Thr Ala Gin Asn Pro Asp lie

210 215220

Tyr Phe Gin Gly Arg Glu Ala Ala Asn Pro Tyr Tyr Leu Lys Vai Pro

225 230 235240

Gly lie Vai Ala

Ser Tyr Lys Leu

260 lie Vai Ser Met

Glu Tyr Met Gin 245

Phe Asp Tyr Vai

Gly Ser Ser Cys

Lys Vai Ala Ser 250

Gly Ala Pro Asp 265

Glu Thr lie Glu

Leu Thr Gly Arg 255

Ala Glu Arg Vai 270

Glu Vai lie Asn

- 39 035950

275

280

285

His

Leu

290

Ala

Ala

Lys

Gly

Glu

295

Lys lie

Gly

Leu lie

300

Lys

Vai

Arg

Leu

Tyr

305

Arg

Pro

Phe

Vai

Ser

310

Glu

Ala

Phe

Phe

Ala

315

Ala

Leu

Pro

Ala

Ser

320

Ala

Lys

Vai lie

Thr

325

Vai

Leu

Asp

Arg

Thr

330

Lys

Glu

Pro

Gly

Ala

335

Pro

Gly

Asp

Pro

Leu

340

Tyr

Leu

Asp

Vai

Cys 345

Ser

Ala

Phe

Vai

Glu

350

Arg

Gly

Glu

Ala

Met

355

Pro

Lys lie

Leu

Ala

360

Gly

Arg

Tyr

Gly

Leu

365

Gly

Ser

Lys

Glu

Phe

370

Ser

Pro

Ala

Met

Vai

375

Lys

Ser

Vai

Tyr

Asp

380

Asn

Met

Ser

Gly

Ala

385

Lys

Lys

Asn

His

Phe

390

Thr

Vai

Gly lie

Glu

395

Asp

Asp

Vai

Thr

Gly 400

Thr

Ser

Leu

Pro

Vai

405

Asp

Asn

Ala

Phe

Ala

410

Asp

Thr

Thr

Pro

Lys

415

Gly

Thr lie

Gln

Cys 420

Gln

Phe

Trp

Gly

Leu

425

Gly

Ala

Asp

Gly

Thr

430

Vai

Gly

Ala

Asn

Lys

435

Gln

Ala lie

Lys lie

440 lie

Gly

Asp

Asn

Thr

445

Asp

Leu

Phe

Ala

Gln

450

Gly

Tyr

Phe

Ser

Tyr 455

Asp

Ser

Lys

Lys

Ser

460

Gly

Gly lie

Thr lie

465

Ser

His

Leu

Arg

Phe

470

Gly

Glu

Lys

Pro lie

475

Gln

Ser

Thr

Tyr

Leu

480

Vai

Asn

Arg

Ala

Asp

485

Tyr

Vai

Ala

Cys

His

490

Asn

Pro

Ala

Tyr

Vai

495

Gly lie

Tyr

Asp lie

500

Leu

Glu

Gly lie

Lys

505

Asp

Gly

Gly

Thr

Phe

510

Vai

Leu

Asn

Ser

Pro

515

Trp

Ser

Ser

Leu

Glu

520

Asp

Met

Asp

Lys

His

525

Leu

Pro

Ser

- 40 035950

Gly lie Lys Arg Thr lie Ala Asn Lys Lys Leu Lys Phe Tyr Asn lie

530 535540

Asp Ala Vai Lys lie Ala Thr Asp Vai Gly Leu Gly Gly Arg lie Asn

545 550 555560

Met lie Met Gin Thr Ala Phe Phe Lys Leu Ala Gly Vai Leu Pro Phe

565 570575

Glu Lys Ala Vai Asp Leu Leu Lys Lys Ser lie His Lys Ala Tyr Gly

580 585590

Lys Lys Gly Glu Lys lie Vai Lys Met Asn Thr Asp Ala Vai Asp Gin

595 600605

Ala Vai Thr Ser Leu Gin Glu Phe Lys Tyr Pro Asp Ser Trp Lys Asp

610 615620

Ala Pro Ala Glu Thr Lys Ala Glu Pro Met Thr Asn Glu Phe Phe Lys

625 630 635640

Asn Vai Vai Lys Pro lie Leu Thr Gin Gin Gly Asp Lys Leu Pro Vai

645 650655

Ser Ala Phe Glu Ala Asp Gly Arg Phe Pro Leu Gly Thr Ser Gin Phe

660 665670

Glu Lys Arg Gly Vai Ala lie Asn Vai Pro Gin Trp Vai Pro Glu Asn

675 680685

Cys lie Gin Cys Asn Gin Cys Ala Phe Vai Cys Pro His Ser Ala lie

690 695700

Leu Pro Vai Leu Ala Lys Glu Glu Glu Leu Vai Gly Ala Pro Ala Asn

705 710 715720

Phe Thr Ala Leu Glu Ala Lys Gly Lys Glu Leu Lys Gly Tyr Lys Phe

725 730735

Arg lie Gin lie Asn Thr Leu Asp Cys Met Gly Cys Gly Asn Cys Ala

740 745750

Asp lie Cys Pro Pro Lys Glu Lys Ala Leu Vai Met Gin Pro Leu Asp

755 760765

- 41 035950

Thr Gin Arg Asp Ala Gin Vai Pro

770 775

Asn Leu Glu Tyr Ala Ala Arg lie 780

Pro Vai Lys Ser Glu Vai Leu Pro

785 790

Arg Asp Ser Leu Lys Gly Ser Gin

795 800

Phe Gin Glu Pro Leu Met Glu Phe

805

Ser Gly Ala Cys Ser Gly Cys Gly

810 815

Glu Thr Pro Tyr Vai Arg Vai lie

820

Thr Gin Leu Phe Gly Glu Arg Met

825 830

Phe lie Ala Asn Ala Thr Gly Cys

835 840

Ser Ser lie Trp Gly Ala Ser Ala

845

Pro Ser Met Pro Tyr Lys Thr Asn

850 855

Arg Leu Gly Gin Gly Pro Ala Trp

860

Gly Asn Ser Leu Phe Glu Asp Ala

865 870

Ala Glu Tyr Gly Phe Gly Met Asn

875 880

Met Ser Met Phe Ala Arg Arg Thr

885

His Leu Ala Asp Leu Ala Ala Lys

890 895

Ala Leu Glu Ser Asp Ala Ser Gly

900

Asp Vai Lys Glu Ala Leu Gin Gly

905 910

Trp Leu Ala Gly Lys Asn Asp Pro

915 920 lie Lys Ser Lys Glu Tyr Gly Asp 925

Lys Leu Lys Lys Leu Leu Ala Gly

930 935

Gin Lys Asp Gly Leu Leu Gly Gin

940 lie Ala Ala Met Ser Asp Leu Tyr

945 950

Thr Lys Lys Ser Vai Trp lie Phe

955 960

Gly Gly Asp Gly Trp Ala Tyr Asp

965 lie Gly Tyr Gly Gly Leu Asp His

970 975

Vai Leu Ala Ser Gly Glu Asp Vai

980

Asn Vai Phe Vai Met Asp Thr Glu

985 990

Vai Tyr Ser Asn Thr Gly Gly Gin

995 1000

Ser Ser Lys Ala Thr Pro Thr Gly

1005

- 42 035950

Ala

Vai 1010

Ala

Lys

Phe

Ala

Ala 1015

Ala

Gly

Lys

Arg

Thr 1020

Gly

Lys

Lys

Asp

Leu 1025

Ala

Arg

Met

Vai

Met 1030

Thr

Tyr

Gly

Tyr

Vai 1035

Tyr

Vai

Ala

Thr

Vai 1040

Ser

Met

Gly

Tyr

Ser 1045

Lys

Gin

Gin

Phe

Leu 1050

Lys

Vai

Leu

Lys

Glu 1055

Ala

Glu

Ser

Phe

Pro 1060

Gly

Pro

Ser

Leu

Vai 1065

lie

Ala

Tyr

Ala

Thr 1070

Cys

lie

Asn

Gin

Gly 1075

Leu

Arg

Lys

Gly

Met 1080

Gly

Lys

Ser

Gin

Asp 1085

Vai

Met

Asn

Thr

Ala 1090

Vai

Lys

Ser

Gly

Tyr 1095

Trp

Pro

Leu

Phe

Arg 1100

Tyr

Asp

Pro

Arg

Leu 1105

Ala

Ala

Gin

Gly

Lys 1110

Asn

Pro

Phe

Gin

Leu 1115

Asp

Ser

Lys

Ala

Pro 1120

Asp

Gly

Ser

Vai

Glu 1125

Glu

Phe

Leu

Met

Ala 1130

Gin

Asn

Arg

Phe

Ala 1135

Vai

Leu

Asp

Arg

Ser 1140

Phe

Pro

Glu

Asp

Ala 1145

Lys

Arg

Leu

Arg

Ala 1150

Gin

Vai

Ala

His

Glu 1155

Leu

Asp

Vai

Arg

Phe 1160

Lys

Glu

Leu

Glu

His 1165

Met

Ala

Ala

Thr

Asn 1170

lie

Phe

Glu

Ser

Phe 1175

Ala

Pro

Ala

Gly

Gly 1180

Lys

Ala

Asp

Gly

Ser 1185

Vai

Asp

Phe

Gly

Glu 1190

Gly

Ala

Glu

Phe

Cys 1195

Thr

Arg

Asp

Asp

Thr 1200

Pro

Met

Met

Ala

Arg 1205

Pro

Asp

Ser

Gly

Glu 1210

Ala

Cys

Asp

Gin

Asn 1215

Arg

Ala

Gly

Thr

Ser 1220

Glu

Gin

Gin

Gly

Asp 1225

Leu

Ser

Lys

Arg

Thr 1230

Lys

Lys

<210> 7

- 43 035950 <211> 1617 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561

<400> 7 atggttatga 60	aagctgctga	agcagttatc	caatgtttaa	aaaaagaaaa	tgtaaatatg
gtatttgggt 120	atcctggtgc	tgcagtggtt	cctatatatg	aagctttgag	aaaatcagat
gtgaagcata 180	tattagtaag	acaggaacaa	gctgcaggac	actctgctag	tggatatgct
aggtcaactg 240	gagaagttgg	agtctgtata	gttacatcag	gacctggcgc	aactaatcta
attactgcca 300	ttgctgctgc	atatatggat	tccattcctc	ttgttgttat	tacgggtcag
gttaagtcta 360	cattaatcgg	aagggatgta	ttccaagaat	tagatatcac	aggtgctaca
gaatctttta 420	caaaatataa	ttttcttgta	agagatgcta	aatctatacc	taagactata
aaggaagcat 480	tttatatagc	tgaaactggt	agaaaaggcc	ctgtgcttgt	agatatacct
atggatataa 540	tggaagaaga	tattgatttt	gaatatcctg	aaagtgtaaa	tataagagga
tacaaaccta 600	ctgttaaagg	acactctggg	caaataaaga	aaataataga	tagaatcaaa
gttagcaaga 660	gacctcttat	ttgtgcaggt	ggcggagtta	tactggcaaa	tgcacaaaaa
gaactggagc 720	aatttgttaa	aaaatcacat	atacctgttg	ttcatactct	tatgggaaaa
ggatgtataa 780	atgaaaatag	tgattattat	gtaggtttaa	taggtactca	tggctttgct
tatgccaata 840	aagttgtaca	aaatgcagat	gtactaatac	ttattggagc	tagagcttca
gatagaactg 900	tcagtggagt	aaaaagtttt	gcaaaggatg	cagatataat	tcatatagat
atcgatcctg 960	ctgaaatagg	taaaattctg	aacacttata	ttccagtggt	tggtgattgt
ggaagtgttt 1020	tatcggattt	aaataaagaa	atagtagctc	cacagacaga	aaaatggatg
gaagaaatta 1080	aaaattggaa	aaaagatttg	tatatagaaa	gaaagcctac	agataaagtt
aatcccaaat 1140	atgtgttaaa	aactgtttct	gatacattag	gagaagaggt	tattttgaca

- 44 035950 gcagatgtag gacaaaatca gttgtggtgt gcccgtaatt ttaggatgac agggaataga 1200 aagtttttaa cttctggagg cctcggaact atgggatatt ctctcccagc agctattggt 1260 gctaaaattg catgtcctga taagcaagtt atagcttttg caggtgatgg tggatttcaa 1320 atgagtcttt ttgaacttgg aactattgcc gaaaataatc taaacattat tatagttttg 1380 tttaacaact caggactggg tatggttagg gagatacaag acaataaata ttctggtgaa 1440 tttggagtaa attttaggac caatccagat tttgtaaaac ttgcagaagc ctatggatta 1500 aaagctaaga gagtagaaaa tgattctgaa tttaacggag tttttagaga agcattagat 1560 tcaagcaagg catttttaat agagtgcatt gtagatcctc atgagagaac tttttag 1617 <210>8 <211>538 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>8

Met Vai Met Lys Ala Ala Glu Ala Vai lie Gin Cys Leu Lys Lys Glu 15 1015

Asn Vai Asn Met Vai Phe Gly Tyr Pro Gly Ala Ala Vai Vai Pro lie 20 2530

Tyr Glu Ala Leu Arg Lys Ser Asp Vai Lys His lie Leu Vai Arg Gin 35 4045

Glu Gin Ala Ala Gly His Ser Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ser Thr Gly 50 5560

Glu Vai Gly Vai Cys lie Vai Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu 65 70 7580 lie Thr Ala lie Ala Ala Ala Tyr Met Asp Ser lie Pro Leu Vai Vai

9095 lie Thr Gly Gin Vai Lys Ser Thr Leu lie Gly Arg Asp Vai Phe Gin

100 105110

- 45 035950

Glu Leu Asp lie Thr Gly Ala Thr Glu Ser Phe Thr Lys Tyr Asn Phe

115 120125

Leu Vai Arg Asp Ala Lys Ser lie Pro Lys Thr lie Lys Glu Ala Phe

130 135140

Tyr lie Ala Glu Thr Gly Arg Lys Gly Pro Vai Leu Vai Asp lie Pro

145 150 155160

Met Asp lie Met Glu Glu Asp lie Asp Phe Glu Tyr Pro Glu Ser Vai

165 170175

Asn lie Arg Gly Tyr Lys Pro Thr Vai Lys Gly His Ser Gly Gin lie

180 185190

Lys Lys lie lie Asp Arg lie Lys Vai Ser Lys Arg Pro Leu lie Cys

195 200205

Ala Gly Gly Gly Vai lie Leu Ala Asn Ala Gin Lys Glu Leu Glu Gin

210 215220

Phe Vai Lys Lys Ser His lie Pro Vai Vai His Thr Leu Met Gly Lys

225 230 235240

Gly Cys lie Asn Glu Asn Ser Asp Tyr Tyr Vai Gly Leu lie Gly Thr

245 250255

His Gly Phe Ala Tyr Ala Asn Lys Vai Vai Gin Asn Ala Asp Vai Leu

260 265270 lie Leu lie Gly Ala Arg Ala Ser Asp Arg Thr Vai Ser Gly Vai Lys

275 280285

Ser Phe Ala Lys Asp Ala Asp lie lie His lie Asp lie Asp Pro Ala

290 295300

Glu lie Gly Lys lie Leu Asn Thr Tyr lie Pro Vai Vai Gly Asp Cys

305 310 315320

Gly Ser Vai Leu Ser Asp Leu Asn Lys Glu lie Vai Ala Pro Gin Thr

325 330335

Glu Lys Trp Met Glu Glu lie Lys Asn Trp Lys Lys Asp Leu Tyr lie

340 345350

Glu Arg Lys Pro Thr Asp Lys Vai Asn Pro Lys Tyr Vai Leu Lys Thr

- 46 035950

355 360365

Vai Ser Asp Thr Leu Gly Glu Glu Vai lie Leu Thr Ala Asp Vai Gly

370 375380

Gin Asn Gin Leu Trp Cys Ala Arg Asn Phe Arg Met Thr Gly Asn Arg

385 390 395400

Lys Phe Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ser Leu Pro

405 410415

Ala Ala lie Gly Ala Lys lie Ala Cys Pro Asp Lys Gin Vai lie Ala

420 425430

Phe Ala Gly Asp Gly Gly Phe Gin Met Ser Leu Phe Glu Leu Gly Thr

435 440445 lie Ala Glu Asn Asn Leu Asn lie lie lie Vai Leu Phe Asn Asn Ser

450 455460

Gly Leu Gly Met Vai Arg Glu lie Gin Asp Asn Lys Tyr Ser Gly Glu

465 470 475480

Phe Gly Vai Asn Phe Arg Thr Asn Pro Asp Phe Vai Lys Leu Ala Glu

485 490495

Ala Tyr Gly Leu Lys Ala Lys Arg Vai Glu Asn Asp Ser Glu Phe Asn

500 505510

Gly Vai Phe Arg Glu Ala Leu Asp Ser Ser Lys Ala Phe Leu lie Glu

515 520525

Cys lie Vai Asp Pro His Glu Arg Thr Phe

530535 <210>9 <211>1677 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>9 atgaaaataa agggagctga agtactatta aaatgtatga tggagcaagg tgtagatact 60 gtattcggat atccgggagg agctgtttta cctatttatg atgcactata tgctgctaag 120 ggaaagataa ctcacatatc gacttcacat gaacaagggg ctgctcatgc tgcagatgga 180

- 47 035950

tatgcaagat 240	ctacaggaaa	ggtaggagtt	gtaattgcaa	catcagggcc	gggagctact
aatacggtta 300	cagcaattgc	tacagcttat	atggattccg	tacctattgt	agtatttaca
ggacaggttg 360	cgagaagtct	tcttggaaag	gattcttttc	aagaagtaaa	tattaaagat
attactgcat 420	ccataactaa	gaaaagttgc	attgtagaaa	aggtagagga	tttagctgat
actgtaagag 480	aggcatttca	aattgcagtt	agtggaagac	caggacctgt	agtagtagat
atacctaaag 540	acgtacaatc	agctgaagta	gaatatgagc	cttttagaag	taagctttct
gaaattaaag 600	aaaagaaata	ttttaattta	aatgagtatg	gagacagttt	aaataaggca
atagatatga 660	taaataggag	tgagagacct	gtaatttatt	caggtggagg	aactgtcaca
tcaggagctc 720	aaaatgaatt	gatggaactt	gtagaaaaaa	tagattcacc	aattacctgt
tcacttatgg 780	gaataggagc	tttcccggga	aacaatgaat	attatatggg	tatggttgga
atgcatggaa 840	gccgttgctc	aaattatgca	gtaagtaatt	gtgacttatt	aatagctata
ggagctaggt 900	ttagtgatag	ggttataagc	aaggtaagtg	cctttgctcc	aaaagcaaga
ataatacaca 960	tagacattga	ccctaaggag	tttggcaaaa	acgtggatat	agatgtagca
ataaaaggag 1020	atgtaaaaga	ggtacttcaa	aagattaatt	gcaagttaga	aaaggccgac
cacagggatt 1080	ggatggagaa	aataaaacag	tggaaaagtg	aacagtgtga	accttttaaa
gaatgtaaat 1140	taagtcctaa	gtttataatg	gataccttgt	ataatcttac	aggaggagaa
tgcataatta 1200	ctacagaagt	tggccaaaat	caaatttgga	ctgcacaata	ttttaaattc
ttaaagccaa 1260	gaacatttgt	atcttcaggc	ggacttggaa	ctatgggctt	cggacttgga
gcttctatag 1320	gagcatctat	gggtaatcca	gggaaaaagg	taataaatgt	agcaggggat
gggagcttta	aaatgaattc	tacagagctt	gctactgttg	ccaaatataa	gctccctatt

1380

- 48 035950 gtacaattgc ttttaaataa tcgtgcatta ggcatggtat atcaatggca ggatatgttc 1440 tatggaaaga ggttttcaaa tacagaactt ggaccagatg ttgatttcat gaaacttgga 1500 gaagcgtatg gtataaagac ttttaagata gaagacaata gccaggtaga gaaatgctta 1560 aaggaagctc ttgacttaaa tgaacctgta attatagaat gtgatataga taggaaagaa 1620 aaggtatttc ctattgtacc tccgggagcg gctatatcag atttagtaga agagtaa 1677 <210>10 <211>558 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>10

Met Lys lie Lys Gly Ala Glu Vai Leu Leu Lys Cys Met Met Glu Gin

1015

Gly Vai Asp Thr Vai Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala Vai Leu Pro lie 20 2530

Tyr Asp Ala Leu Tyr Ala Ala Lys Gly Lys lie Thr His lie Ser Thr 35 4045

Ser His Glu Gin Gly Ala Ala His Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ser 50 5560

Thr Gly Lys Vai Gly Vai Vai lie Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr 65 70 7580

Asn Thr Vai Thr Ala lie Ala Thr Ala Tyr Met Asp Ser Vai Pro lie 85 9095

Vai Vai Phe Thr Gly Gin Vai Ala Arg Ser Leu Leu Gly Lys Asp Ser

100 105110

Phe Gin Glu Vai Asn lie Lys Asp lie Thr Ala Ser lie Thr Lys Lys

115 120125

Ser Cys lie Vai Glu Lys Vai Glu Asp Leu Ala Asp Thr Vai Arg Glu

130 135140

Ala Phe Gin lie Ala Vai Ser Gly Arg Pro Gly Pro Vai Vai Vai Asp

145 150 155160

- 49 035950 lie Pro Lys Asp Vai Gin Ser Ala Glu Vai Glu Tyr Glu Pro Phe Arg

165 170175

Ser Lys Leu Ser Glu lie Lys Glu Lys Lys Tyr Phe Asn Leu Asn Glu

180 185190

Tyr Gly Asp Ser Leu Asn Lys Ala lie Asp Met lie Asn Arg Ser Glu

195 200205

Arg Pro Vai lie Tyr Ser Gly Gly Gly Thr Vai Thr Ser Gly Ala Gin

210 215220

Asn Glu Leu Met Glu Leu Vai Glu Lys lie Asp Ser Pro lie Thr Cys

225 230 235240

Ser Leu Met Gly lie Gly Ala Phe Pro Gly Asn Asn Glu Tyr Tyr Met

245 250255

Gly Met Vai Gly Met His Gly Ser Arg Cys Ser Asn Tyr Ala Vai Ser

260 265270

Asn Cys Asp Leu Leu lie Ala lie Gly Ala Arg Phe Ser Asp Arg Vai

275 280285 lie Ser Lys Vai Ser Ala Phe Ala Pro Lys Ala Arg lie lie His lie

290 295300

Asp lie Asp Pro Lys Glu Phe Gly Lys Asn Vai Asp lie Asp Vai Ala

305 310 315320 lie Lys Gly Asp Vai Lys Glu Vai Leu Gin Lys lie Asn Cys Lys Leu

325 330335

Glu Lys Ala Asp His Arg Asp Trp Met Glu Lys lie Lys Gin Trp Lys

340 345350

Ser Glu Gin Cys Glu Pro Phe Lys Glu Cys Lys Leu Ser Pro Lys Phe

355 360365 lie Met Asp Thr Leu Tyr Asn Leu Thr Gly Gly Glu Cys lie lie Thr

370 375380

Thr Glu Vai Gly Gin Asn Gin lie Trp Thr Ala Gin Tyr Phe Lys Phe

385 390 395400

- 50 035950

Leu Lys Pro Arg Thr Phe Vai Ser Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly

405 410415

Phe Gly Leu Gly Ala Ser lie Gly Ala Ser Met Gly Asn Pro Gly Lys

420 425430

Lys Vai lie Asn Vai Ala Gly Asp Gly Ser Phe Lys Met Asn Ser Thr

435 440445

Glu Leu Ala Thr Vai Ala Lys Tyr Lys Leu Pro lie Vai Gin Leu Leu

450 455460

Leu Asn Asn Arg Ala Leu Gly Met Vai Tyr Gin Trp Gin Asp Met Phe

465 470 475480

Tyr Gly Lys Arg Phe Ser Asn Thr Glu Leu Gly Pro Asp Vai Asp Phe

485 490495

Met Lys Leu Gly Glu Ala Tyr Gly lie Lys Thr Phe Lys lie Glu Asp

500 505510

Asn Ser Gin Vai Glu Lys Cys Leu Lys Glu Ala Leu Asp Leu Asn Glu

515 520525

Pro Vai lie lie Glu Cys Asp lie Asp Arg Lys Glu Lys Vai Phe Pro

530 535540 lie Vai Pro Pro Gly Ala Ala lie Ser Asp Leu Vai Glu Glu

545 550555 <210>11 <211>486 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>11 catatgagtg tacttgtaga aaatcatagt ggtgtattaa gtaaagtagc aggattattt 60 agtagaagag gatataacat tcatagttta actgttggag taactggtga tcctgaaata 120 agtagaatga ctatagtaag tattggagat gattatatgt ttgaacaaat atctaaacag 180 cttaataaat tgatagaagt aataaaagta atagaattaa atcctgatgc aagtgtatat 240 agagaattaa gtcttataaa agtaagtgca gaaagtaata acaaacttct tataatggaa 300

- 51 035950 agtgtaaata cttttagagg taaaatagta gatatgaatg aaaaaagtat gataatagaa 360 ataactggaa atgaaaaaaa aataagtgca tttatagaat taatgaaacc ttatggaata 420 aaagaaataa taagaactgg attaactgca ttacaaagag gatcaaaatt agaagattaa 480 gagctc

486 <210>12 <211>158 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>12

Met Ser Vai Leu Vai Glu Asn His Ser Gly Vai Leu Ser Lys Vai Ala

1015

Gly Leu Phe Ser Arg Arg Gly Tyr Asn lie His Ser Leu Thr Vai Gly 20 2530

Vai Thr Gly Asp Pro Glu lie Ser Arg Met Thr lie Vai Ser lie Gly 35 4045

Asp Asp Tyr Met Phe Glu Gin lie Ser Lys Gin Leu Asn Lys Leu lie 50 5560

Glu Vai lie Lys Vai lie Glu Leu Asn Pro Asp Ala Ser Vai Tyr Arg 65 70 7580

Glu Leu Ser Leu lie Lys Vai Ser Ala Glu Ser Asn Asn Lys Leu Leu 85 9095 lie Met Glu Ser Vai Asn Thr Phe Arg Gly Lys lie Vai Asp Met Asn

100 105110

Glu Lys Ser Met lie lie Glu lie Thr Gly Asn Glu Lys Lys lie Ser

115 120125

Ala Phe lie Glu Leu Met Lys Pro Tyr Gly lie Lys Glu lie lie Arg

130 135140

Thr Gly Leu Thr Ala Leu Gin Arg Gly Ser Lys Leu Glu Asp 145 150155

- 52 035950 <210> 13 <211> 486 <212> DNA <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутантная IlvN (G-10-D) ацетолактатсинтаза Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400> 13

catatgagtg 60	tacttgtaga	aaatcatagt	gatgtattaa	gtaaagtagc	aggattattt
agtagaagag 120	gatataacat	tcatagttta	actgttggag	taactggtga	tcctgaaata
agtagaatga 180	ctatagtaag	tattggagat	gattatatgt	ttgaacaaat	atctaaacag
cttaataaat 240	tgatagaagt	aataaaagta	atagaattaa	atcctgatgc	aagtgtatat
agagaattaa 300	gtcttataaa	agtaagtgca	gaaagtaata	acaaacttct	tataatggaa
agtgtaaata 360	cttttagagg	taaaatagta	gatatgaatg	aaaaaagtat	gataatagaa
ataactggaa 420	atgaaaaaaa	aataagtgca	tttatagaat	taatgaaacc	ttatggaata
aaagaaataa	taagaactgg	attaactgca	ttacaaagag	gatcaaaatt	agaagattaa

480 gagctc

486 <210> 14 <211> 158 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Мутантная IlvN (G-10-D) ацетолактатсинтаза, Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>14

Met Ser Vai Leu Vai Glu Asn His Ser Asp Vai Leu Ser Lys Vai Ala 15 1015

Gly Leu Phe Ser Arg Arg Gly Tyr Asn lie His Ser Leu Thr Vai Gly 20 2530

Vai Thr Gly Asp Pro Glu lie Ser Arg Met Thr lie Vai Ser lie Gly 35 4045

- 53 035950

Asp Asp Туг Met Phe Glu Gin lie Ser Lys Gin Leu Asn Lys Leu lie 50 5560

Glu Vai lie Lys Vai lie Glu Leu Asn Pro Asp Ala Ser Vai Tyr Arg 65 70 7580

Glu Leu Ser Leu lie Lys Vai Ser Ala Glu Ser Asn Asn Lys Leu Leu 85 9095 lie Met Glu Ser Vai Asn Thr Phe Arg Gly Lys lie Vai Asp Met Asn

100 105110

Glu Lys Ser Met lie lie Glu lie Thr Gly Asn Glu Lys Lys lie Ser

115 120125

Ala Phe lie Glu Leu Met Lys Pro Tyr Gly lie Lys Glu lie lie Arg

130 135140

Thr Gly Leu Thr Ala Leu Gin Arg Gly Ser Lys Leu Glu Asp 145 150155 <210>15 <211>1671 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561

<400> 15 atgaatagag 60	atataaaaaa	agaagtccaa	ctaaatacag	ctcaaatgct	agtaaaatgt
ttagaagccg 120	aaggagtaaa	gtacatcttt	ggtattcctg	gtgaagaaaa	cctagaaata
atgaatgcaa 180	tttcagattc	aactattgaa	tttatcacaa	cccgtcatga	gcaaggtgct
gcatttatgg 240	ccgacgttta	tggacgttta	acaggaaaag	caggtgtttg	cctatcaaca
ctaggaccag 300	gtgccactaa	cttagtaact	ggtgtagcag	atgctgatag	tgatggtgct
ccggttgttg 360	ctattacagg	tcaagtaggt	actgaaagaa	tgcatataac	atcgcaccaa
tttttagacc 420	tttgcaaaat	gttcgaacca	atcacaaaga	gaagtaaaca	aatcgttcgt
cctgatactg 480	taagtgagat	tataagactt	gtttttaagt	atgctgaaag	tgaaaagcct
ggagcatgcc	acattgattt	acctgtaaat	attgcaaaaa	tgcccgtagg	tgctttagaa

540

- 54 035950 aagcctttgg aaaagaagat tccaccaaag gaacatgcag atttatcaac aattgaggaa 600 gctgcaagtg aaatcttcaa agcaaaaaat cctattatct tagctggaag cggtgctata 660 agaggaaatt cttcaaaagc tgttacggaa tttgcaacta aattgaaaat tccagtaatt 720 aatacgatga tggcaaaagg tattattcca atggataaca agtattcaat gtggacaata 780 ggtattccac aaaaagatta tgtaaataaa attattgaag aggctgattt agtaattaca 840 attggatatg atattgtaga atatgcccca tccaaatgga atataaatgg ggacattaaa 900 attgtgcata tcgatgcaag accatcacac atcaataaac tttatcagcc catagtagaa 960 gtagttggtg atatttcaga tgctctatac aatatattga gaagaacttc tagcaaagat 1020 gaaccagtaa aagctttgga aattaaatca gaaatgctag ctgaacatga aagctatgca 1080 aatgacaatg cttttccaat gaaaccccaa agaattttaa atgatgttag aaaggtcatg 1140 ggaccacatg acattgtcat atcagatgta ggtgcccata aaatgtggat tgccagacat 1200 tataactgct atgagcccaa tacatgtatt atttcaaacg gttttgctac aatgggtatt 1260 ggtgttccag gtgcaattgc agccaaatta attaatccag ataaaaaagt attggctatt 1320 gttggtgatg gcggtttcat gatgaataat caagaattag aaacagccct acgtattaaa 1380 actccaattg tagttttaat atttaatgac agtaactacg gtttaataaa gtggaaacaa 1440 gaagaacact atggtaaaag ctgttatgta gattttacta atccagactt tgtaaagctt 1500 gcagaaagta tgtatgcaaa aggatatcga gtagaaaaag cagaagattt aattccaact 1560 ttagaagaag ctttcaaaca aaatgtacct gcagttattg attgtcaagt tgactatggt 1620 gaaaatataa agcttacaaa gcatttaaaa gaagtttatg aaaatatgta a 1671 <210> 16 <211> 556 <212> PRT

- 55 035950 <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>16

Met Asn Arg Asp lie Lys Lys Glu Vai Gin Leu Asn Thr Ala Gin Met

1015

Leu Vai Lys Cys Leu Glu Ala Glu Gly Vai Lys Tyr lie Phe Gly lie 20 2530

Pro Gly Glu Glu Asn Leu Glu lie Met Asn Ala lie Ser Asp Ser Thr 35 4045 lie Glu Phe lie Thr Thr Arg His Glu Gin Gly Ala Ala Phe Met Ala 50 5560

Asp Vai Tyr Gly Arg Leu Thr Gly Lys Ala Gly Vai Cys Leu Ser Thr 65 70 7580

Leu Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Vai Thr Gly Vai Ala Asp Ala Asp 85 9095

Ser Asp Gly Ala Pro Vai Vai Ala lie Thr Gly Gin Vai Gly Thr Glu

100 105110

Arg Met His lie Thr Ser His Gin Phe Leu Asp Leu Cys Lys Met Phe

115 120125

Glu Pro lie Thr Lys Arg Ser Lys Gin lie Vai Arg Pro Asp Thr Vai

130 135140

Ser Glu lie lie Arg Leu Vai Phe Lys Tyr Ala Glu Ser Glu Lys Pro

145 150 155160

Gly Ala Cys His lie Asp Leu Pro Vai Asn lie Ala Lys Met Pro Vai

165 170175

Gly Ala Leu Glu Lys Pro Leu Glu Lys Lys lie Pro Pro Lys Glu His

180 185190

Ala Asp Leu Ser Thr lie Glu Glu Ala Ala Ser Glu lie Phe Lys Ala

195 200205

Lys Asn Pro lie lie Leu Ala Gly Ser Gly Ala lie Arg Gly Asn Ser

210 215220

Ser Lys Ala Vai Thr Glu Phe Ala Thr Lys Leu Lys lie Pro Vai lie

- 56 035950

225 230 235240

Asn Thr Met Met Ala Lys Gly lie lie Pro Met Asp Asn Lys Tyr Ser

245 250255

Met Trp Thr lie Gly lie Pro Gin Lys Asp Tyr Vai Asn Lys lie lie

260 265270

Glu Glu Ala Asp Leu Vai lie Thr lie Gly Tyr Asp lie Vai Glu Tyr

275 280285

Ala Pro Ser Lys Trp Asn lie Asn Gly Asp lie Lys lie Vai His lie

290 295300

Asp Ala Arg Pro Ser His lie Asn Lys Leu Tyr Gin Pro lie Vai Glu

305 310 315320

Vai Vai Gly Asp lie Ser Asp Ala Leu Tyr Asn lie Leu Arg Arg Thr

325 330335

Ser Ser Lys Asp Glu Pro Vai Lys Ala Leu Glu lie Lys Ser Glu Met

340 345350

Leu Ala Glu His Glu Ser Tyr Ala Asn Asp Asn Ala Phe Pro Met Lys

355 360365

Pro Gin Arg lie Leu Asn Asp Vai Arg Lys Vai Met Gly Pro His Asp

370 375380 lie Vai lie Ser Asp Vai Gly Ala His Lys Met Trp lie Ala Arg His

385 390 395400

Tyr Asn Cys Tyr Glu Pro Asn Thr Cys lie lie Ser Asn Gly Phe Ala

405 410415

Thr Met Gly lie Gly Vai Pro Gly Ala lie Ala Ala Lys Leu lie Asn

420 425430

Pro Asp Lys Lys Vai Leu Ala lie Vai Gly Asp Gly Gly Phe Met Met

435 440445

Asn Asn Gin Glu Leu Glu Thr Ala Leu Arg lie Lys Thr Pro lie Vai

450 455460

Vai Leu lie Phe Asn Asp Ser Asn Tyr Gly Leu lie Lys Trp Lys Gin

465 470 475480

- 57 035950

Glu Glu His Tyr Gly Lys Ser Cys

485

Tyr Vai Asp Phe Thr Asn Pro Asp

490 495

Phe Vai Lys Leu Ala Glu Ser Met

500

Tyr Ala Lys Gly Tyr Arg Vai Glu 505 510

Lys Ala Glu Asp Leu He Pro Thr

515 520

Leu Glu Glu Ala Phe Lys Gin Asn 525

Vai Pro Ala Vai He Asp Cys Gin

530 535

Vai Asp Tyr Gly Glu Asn lie Lys

540

Leu Thr Lys His Leu Lys Glu Vai

545550 <210>17 <211>1680 <212> DNA <213> Искусственная последов

Tyr Glu Asn Met

555 ьность <220>

<223> Оптимизированная по кодону AlsS-ацетолактатсинтаза, Clostridium autoethanogenum LZ1561

<400> 17 catatgaata 60	gagatataaa	aaaagaagta	caattaaata	ctgcacaaat	gttagtaaaa
tgtttagaag 120	cagaaggagt	aaaatatata	tttggaatac	ctggagaaga	aaatttagaa
ataatgaatg 180	caatatctga	tagtactata	gaatttataa	ctactagaca	tgaacaagga
gcagcattta 240	tggcagatgt	atatggaaga	ttaactggaa	aagctggagt	ttgtttaagt
actttaggac 300	ctggagcaac	taatttagta	actggagtag	cagatgcaga	tagtgatgga
gcacctgtag 360	tagcaataac	tggacaagta	ggaactgaaa	gaatgcatat	aactagtcat
caatttttag 420	atttatgtaa	aatgtttgaa	cctataacta	aaagaagtaa	acaaatagta
agacctgata 480	ctgtaagtga	aataataaga	ttagtattta	aatatgcaga	aagtgaaaaa
cctggagcat 540	gtcatataga	tttacctgta	aatatagcaa	aaatgcctgt	tggagcatta
gaaaaacctt 600	tagaaaaaaa	aatacctcct	aaagaacatg	cagatttaag	tacaatagaa

- 58 035950

gaagcagcat 660	ctgaaatatt	taaagcaaaa	aatcctataa	tattagctgg	aagtggagca
ataagaggaa 720	atagtagtaa	agcagtaact	gaatttgcaa	ctaaattaaa	aatacctgta
ataaatacta 780	tgatggcaaa	aggaataata	cctatggata	ataaatatag	tatgtggact
ataggaatac 840	ctcaaaaaga	ttatgtaaat	aaaataatag	aagaagctga	tttagtaata
actataggat 900	atgatatagt	agaatatgca	cctagtaaat	ggaatataaa	tggagatata
aaaatagtac 960	atatagatgc	aagacctagt	catataaata	aattatatca	acctatagta
gaagtagttg 1020	gagatataag	tgatgcatta	tataatatat	taagaagaac	tagttcaaaa
gatgaacctg 1080	taaaagcatt	agaaataaaa	agtgaaatgt	tagcagaaca	tgaaagttat
gcaaatgata 1140	atgcatttcc	tatgaaacct	caaagaatat	taaatgatgt	aagaaaagta
atgggacctc 1200	atgatatagt	aataagtgat	gttggagcac	ataaaatgtg	gatagcaaga
cattataatt 1260	gttatgaacc	taatacttgt	ataataagta	atggatttgc	aacaatggga
ataggagtac 1320	ctggagcaat	agcagcaaaa	ttaataaatc	ctgataaaaa	agtattagca
atagttggag 1380	atggaggatt	tatgatgaat	aatcaagaat	tagaaactgc	attaagaata
aaaactccta 1440	tagtagtatt	aatatttaat	gatagtaatt	atggattaat	aaaatggaaa
caagaagaac 1500	attatggaaa	aagttgttat	gtagatttta	ctaatcctga	ttttgtaaaa
ttagcagaaa 1560	gtatgtatgc	aaaaggatat	agagtagaaa	aagcagaaga	tttaatacct
actttagaag 1620	aagcatttaa	acaaaatgta	cctgcagtaa	tagattgtca	agtagattat
ggagaaaata	taaaattaac	taaacattta	aaagaagtat	atgaaaatat	gtaagagctc

1680 <210> 18 <211> 556 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 59 035950 <220>

<223> Оптимизированная по кодону AlsS-ацетолактатсинтаза, Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>18

Met Asn Arg Asp lie Lys Lys Glu Vai Gin Leu Asn Thr Ala Gin Met 15 1015

Leu Vai Lys Cys Leu Glu Ala Glu Gly Vai Lys Tyr lie Phe Gly lie 20 2530

Pro Gly Glu Glu Asn Leu Glu lie Met Asn Ala lie Ser Asp Ser Thr 35 4045 lie Glu Phe lie Thr Thr Arg His Glu Gin Gly Ala Ala Phe Met Ala 50 5560

Asp Vai Tyr Gly Arg Leu Thr Gly Lys Ala Gly Vai Cys Leu Ser Thr 65 70 7580

Leu Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Vai Thr Gly Vai Ala Asp Ala Asp 85 9095

Ser Asp Gly Ala Pro Vai Vai Ala lie Thr Gly Gin Vai Gly Thr Glu

100 105110

Arg Met His lie Thr Ser His Gin Phe Leu Asp Leu Cys Lys Met Phe

115 120125

Glu Pro lie Thr Lys Arg Ser Lys Gin lie Vai Arg Pro Asp Thr Vai

130 135140

Ser Glu lie lie Arg Leu Vai Phe Lys Tyr Ala Glu Ser Glu Lys Pro

145 150 155160

Gly Ala Cys His lie Asp Leu Pro Vai Asn lie Ala Lys Met Pro Vai

165 170175

Gly Ala Leu Glu Lys Pro Leu Glu Lys Lys lie Pro Pro Lys Glu His

180 185190

Ala Asp Leu Ser Thr lie Glu Glu Ala Ala Ser Glu lie Phe Lys Ala

195 200205

Lys Asn Pro lie lie Leu Ala Gly Ser Gly Ala lie Arg Gly Asn Ser

210 215220

- 60 035950

Ser Lys 225

Asn Thr

Met Trp

Glu Glu

Ala Vai

Met Met

Thr lie

260

Ala Asp 275

Ala Pro

290

Ser Lys

Thr Glu

230

Ala Lys 245

Gly He

Leu Vai

Trp Asn

Phe Ala

Gly He

Pro Gin lie Thr

280 lie Asn

295

Thr Lys lie Pro

250

Lys Asp 265

He Gly

Gly Asp

Asp Ala 305

Arg Pro

Ser His

310 lie Asn

Lys Leu

Vai Vai

Gly Asp

He Ser 325

Asp Ala

Leu Tyr

330

Ser Ser

Lys Asp

340

Glu Pro

Vai Lys

Ala Leu 345

Leu Ala

Glu His 355

Glu Ser

Tyr Ala

360

Asn Asp

Pro Gin

370

Arg lie

Leu Asn

Asp Vai 375

Arg Lys lie Vai

385 lie Ser

Asp Vai 390

Gly Ala

His Lys

Tyr Asn

Cys Tyr

Glu Pro 405

Asn Thr

Cys He

410

Thr Met

Gly He

420

Gly Vai

Pro Gly

Ala He 425

Pro Asp

Lys Lys 435

Vai Leu

Ala He

440

Vai Gly

Asn Asn

450

Gin Glu

Leu Glu

Thr Ala 455

Leu Arg

Leu Lys 235

Met Asp

Tyr Vai

Tyr Asp

He Lys

300

Tyr Gin 315

Asn lie

Glu He

Asn Ala

Vai Met

380

Met Trp 395

He Ser

Ala Ala

Asp Gly

He Lys

460 lie Pro

Asn Lys

Asn Lys

270 lie Vai

285 lie Vai

Pro He

Leu Arg

Lys Ser

350

Phe Pro

365

Gly Pro lie Ala

Asn Gly

Lys Leu

430

Gly Phe 445

Thr Pro

Vai He

240

Tyr Ser 255

He He

Glu Tyr

His He

Vai Glu

320

Arg Thr 335

Glu Met

Met Lys

His Asp

Arg His 400

Phe Ala 415

He Asn

Met Met lie Vai

- 61 035950

Vai Leu lie Phe Asn Asp Ser Asn Tyr Gly Leu lie Lys Trp Lys Gin

465 470 475480

Glu Glu His Tyr Gly Lys Ser Cys Tyr Vai Asp Phe Thr Asn Pro Asp

485 490495

Phe Vai Lys Leu Ala Glu Ser Met Tyr Ala Lys Gly Tyr Arg Vai Glu

500 505510

Lys Ala Glu Asp Leu lie Pro Thr Leu Glu Glu Ala Phe Lys Gin Asn

515 520525

Vai Pro Ala Vai lie Asp Cys Gin Vai Asp Tyr Gly Glu Asn lie Lys

530 535540

Leu Thr Lys His Leu Lys Glu Vai Tyr Glu Asn Met

545 550555 <210>19 <211>1722 <212> DNA <213> Bacillus subtilis

<400> 19 catatgacta 60	aagcaactaa	agaacaaaaa	agtttagtaa	aaaatagagg	tgcagaatta
gtagtagatt 120	gtttagtaga	acaaggtgta	actcatgtat	ttggaatacc	tggtgcaaaa
atagatgcag 180	tatttgatgc	attacaagat	aaaggacctg	aaataatagt	agcaagacat
gaacaaaatg 240	cagcatttat	ggcacaagca	gtaggaagat	taactggaaa	acctggtgta
gtacttgtaa 300	ctagtggacc	tggtgcatca	aatttagcaa	ctggattatt	aactgcaaat
actgaaggtg 360	atcctgtagt	agcattagct	ggaaatgtaa	taagagcaga	tagattaaaa
agaactcatc 420	aaagtttaga	taatgcagca	ttatttcaac	ctataactaa	atattctgta
gaagtacaag 480	atgtaaaaaa	tatacctgaa	gcagtaacta	atgcatttag	aatagcaagt
gcaggacaag 540	ctggtgcagc	ttttgtaagt	tttcctcagg	atgtagtaaa	tgaagtaact
aatactaaaa 600	atgtaagagc	agtagcagca	cctaaattag	gacctgcagc	agatgatgca

- 62 035950 ataagtgcag caatagcaaa aatacaaact gcaaaattac ctgtagtatt agtaggaatg 660 aaaggtggta gacctgaagc aataaaagca gtaagaaaat tacttaaaaa agtacaatta 720 ccttttgtag aaacttatca agcagctgga actttaagta gagatttaga agatcaatat 780 tttggaagaa taggattatt tagaaatcaa cctggtgatt tattacttga acaagcagat 840 gtagtattaa ctataggata tgatccaata gaatatgatc ctaaattttg gaatataaat 900 ggtgatagaa ctataataca tttagatgaa ataatagcag atatagatca tgcatatcaa 960 cctgatttag aattaattgg agatatacct agtactataa atcacataga acatgatgca 1020 gtaaaagtag aatttgcaga aagagaacaa aaaatactta gtgatttaaa acaatatatg 1080

catgaaggtg 1140	aacaagtacc	tgcagattgg	aaaagtgata	gagcacatcc	tttagaaata
gtaaaagaat 1200	taagaaatgc	agtagatgat	catgtaactg	taacttgtga	tataggatct
catgcaatat 1260	ggatgagtag	atattttaga	agttatgaac	ctttaacttt	aatgataagt
aatggaatgc 1320	aaactcttgg	agtagcatta	ccttgggcaa	ttggagcatc	tttagtaaaa
cctggtgaaa 1380	aagtagtaag	tgtaagtggt	gatggtggat	ttctttttag	tgcaatggaa
ttagaaactg	cagtaagatt	aaaagcacct	atagtacata	tagtatggaa	tgatagtact

1440 tatgatatgg tagcatttca acaattaaaa aaatataata gaactagtgc agtagatttt 1500 ggaaatatag atatagtaaa atatgcagaa agttttggag caacaggatt aagagtagaa 1560 agtcctgatc aattagcaga tgtacttaga cagggaatga atgcagaagg accagtaata 1620 attgatgtac ctgtagatta tagtgataat ataaatttag caagtgataa attacctaaa 1680 gaatttggag aattaatgaa aactaaagca ttataagagc tc

1722 <210> 20 <211> 570 <212> PRT

- 63 035950 <213> Bacillus subtilis <400>20

Met Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gin Lys Ser Leu Vai Lys Asn Arg Gly

1015

Ala Glu Leu Vai Vai Asp Cys Leu Vai Glu Gin Gly Vai Thr His Vai 20 2530

Phe Gly lie Pro Gly Ala Lys lie Asp Ala Vai Phe Asp Ala Leu Gin 35 4045

Asp Lys Gly Pro Glu lie lie Vai Ala Arg His Glu Gin Asn Ala Ala 50 5560

Phe Met Ala Gin Ala Vai Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Vai Vai 65 70 7580

Leu Vai Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu Leu 85 9095

Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Vai Vai Ala Leu Ala Gly Asn Vai

100 105110 lie Arg Ala Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gin Ser Leu Asp Asn Ala

115 120125

Ala Leu Phe Gin Pro lie Thr Lys Tyr Ser Vai Glu Vai Gin Asp Vai

130 135140

Lys Asn lie Pro Glu Ala Vai Thr Asn Ala Phe Arg lie Ala Ser Ala

145 150 155160

Gly Gin Ala Gly Ala Ala Phe Vai Ser Phe Pro Gin Asp Vai Vai Asn

165 170175

Glu Vai Thr Asn Thr Lys Asn Vai Arg Ala Vai Ala Ala Pro Lys Leu

180 185190

Gly Pro Ala Ala Asp Asp Ala lie Ser Ala Ala lie Ala Lys lie Gin

195 200205

Thr Ala Lys Leu Pro Vai Vai Leu Vai Gly Met Lys Gly Gly Arg Pro

210 215220

Glu Ala lie Lys Ala Vai Arg Lys Leu Leu Lys Lys Vai Gin Leu Pro

- 64 035950

225 230 235240

Phe Vai Glu Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Thr Leu Ser Arg Asp Leu Glu

245 250255

Asp Gln Tyr Phe Gly Arg lie Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro Gly Asp

260 265270

Leu Leu Leu Glu Gln Ala Asp Vai Vai Leu Thr lie Gly Tyr Asp Pro

275 280285 lie Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Trp Asn lie Asn Gly Asp Arg Thr lie 290 295300 lie His Leu Asp Glu lie lie Ala Asp lie Asp His Ala Tyr Gln Pro

305 310 315320

Asp Leu Glu Leu lie Gly Asp lie Pro Ser Thr lie Asn His lie Glu

325 330335

His Asp Ala Vai Lys Vai Glu Phe Ala Glu Arg Glu Gln Lys lie Leu

340 345350

Ser Asp Leu Lys Gln Tyr Met His Glu Gly Glu Gln Vai Pro Ala Asp

355 360365

Trp Lys Ser Asp Arg Ala His Pro Leu Glu lie Vai Lys Glu Leu Arg

370 375380

Asn Ala Vai Asp Asp His Vai Thr Vai Thr Cys Asp lie Gly Ser His

385 390 395400

Ala lie Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Tyr Glu Pro Leu Thr Leu

405 410415

Met lie Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Vai Ala Leu Pro Trp Ala

420 425430 lie Gly Ala Ser Leu Vai Lys Pro Gly Glu Lys Vai Vai Ser Vai Ser

435 440445

Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr Ala Vai

450 455460

Arg Leu Lys Ala Pro lie Vai His lie Vai Trp Asn Asp Ser Thr Tyr

465 470 475480

- 65 035950

Asp Met Vai Ala Phe Gin Gin Leu Lys Lys Tyr Asn Arg Thr Ser Ala

485 490495

Vai Asp Phe Gly Asn lie Asp lie Vai Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly

500 505510

Ala Thr Gly Leu Arg Vai Glu Ser Pro Asp Gin Leu Ala Asp Vai Leu

515 520525

Arg Gin Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Vai lie lie Asp Vai Pro Vai

530 535540

Asp Tyr Ser Asp Asn lie Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro Lys Glu

545 550 555560

Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu

565570 <210>21 <211>720 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>21 atggatgatg aggtgaaagt cccaaaccat atatatcaaa tgtctacaat aaatgcactt 60 gtttcggggc tgtatgatgg ctgtgtttca ttatctaaac ttcttaaaaa aggaaacttt 120 ggtataggta cttttaaagg tctagatggt gaactaactc ttttaaatgg aactttttat 180 aggactaaac ctgatggcag cgtatacgta tgttccaaaa acgtatccgt tccttttgct 240 gtagtcactg aactggaaaa ttataatact tataatattc aaaatcgtac ttcttatgaa 300 gatataagaa aagaattgga cagctttata gaaagcaaaa atatatttta tgctttctat 360 atggaaggta aatttaatta tgtaaaaaca cgtactgttg taaaacagaa tatgccttat 420 aagcctatgg ctgaagttgt taaagatcag cctatgtttg aatataacgg tgttgatgga 480 tatgtggttg gatttaggtg tcctgattat gttgaaggcc ttaatgtccc tggatatcat 540 tttcatttca taaataaaga taagaaattt ggtggacata taagtgaatt ttccattgaa 600

- 66 035950 aatgcgaagg tttatgtaca gaactgttct tgctttagga tggaacttcc taaaaatgaa 660 agtttttata atatggaagt acaagataga aacgatgaga taacaagtgt tgaaaaataa 720 <210>22 <211>239 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>22

Met Asp Asp Glu Vai Lys Vai Pro Asn His lie Tyr Gin Met Ser Thr

1015 lie Asn Ala Leu Vai Ser Gly Leu Tyr Asp Gly Cys Vai Ser Leu Ser 20 2530

Lys Leu Leu Lys Lys Gly Asn Phe Gly lie Gly Thr Phe Lys Gly Leu 35 4045

Asp Gly Glu Leu Thr Leu Leu Asn Gly Thr Phe Tyr Arg Thr Lys Pro 50 5560

Asp Gly Ser Vai Tyr Vai Cys Ser Lys Asn Vai Ser Vai Pro Phe Ala 65 70 7580

Vai Vai Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Tyr Asn lie Gin Asn Arg

9095

Thr Ser Tyr Glu Asp lie Arg Lys Glu Leu Asp Ser Phe lie Glu Ser

100 105110

Lys Asn lie Phe Tyr Ala Phe Tyr Met Glu Gly Lys Phe Asn Tyr Vai

115 120125

Lys Thr Arg Thr Vai Vai Lys Gin Asn Met Pro Tyr Lys Pro Met Ala

130 135140

Glu Vai Vai Lys Asp Gin Pro Met Phe Glu Tyr Asn Gly Vai Asp Gly

145 150 155160

Tyr Vai Vai Gly Phe Arg Cys Pro Asp Tyr Vai Glu Gly Leu Asn Vai

165 170175

Pro Gly Tyr His Phe His Phe lie Asn Lys Asp Lys Lys Phe Gly Gly

180 185190

- 67 035950

His lie Ser Glu Phe Ser lie Glu

195 200

Asn Ala Lys Vai Tyr Vai Gin Asn

205

Cys Ser Cys Phe Arg Met Glu Leu

210 215

Pro Lys Asn Glu Ser Phe Tyr Asn

220

Met Glu Vai Gin Asp Arg Asn Asp

225 230

Glu lie Thr Ser Vai Glu Lys 235 <210> 23 <211> 745 <212> DNA <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Оптимизированная по кодону ацетолактат декарбоксилаза, Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400> 23 gagctcagga ggtaactaaa tggatgatga agtaaaagta cctaatcata tatatcaaat 60 gagtactata aatgcattag taagtggatt atatgatgga tgtgtaagtt tatctaaatt 120 attaaaaaaa ggaaattttg gaataggaac ttttaaagga ttagatggag aattaacttt 180 attaaatgga actttttata gaactaaacc tgatggaagt gtatatgtat gtagtaaaaa 240 tgtaagtgta ccttttgcag tagtaactga attagaaaat tataatactt ataatataca 300 aaatagaact tcttatgaag atataagaaa agaattagat agttttatag aaagtaaaaa 360 tatattttat gcattttata tggaaggaaa atttaattat gtaaaaacta gaactgtagt 420 aaaacaaaat atgccttata aacctatggc agaagtagta aaagatcaac ctatgtttga 480 atataatgga gtagatggat atgtagtagg atttagatgt cctgattatg tagaaggatt 540 aaatgtacct ggatatcatt ttcattttat aaataaagat aaaaaatttg gaggacatat 600 aagtgaattt agtatagaaa atgcaaaagt atatgtacaa aattgtagtt gttttagaat 660 ggaattacct aaaaatgaaa gtttttataa tatggaagta caagatagaa atgatgaaat 720

- 68 035950 aactagtgta gaaaaataag gtacc 745 <210> 24 <211> 239 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Оптимизированная по кодону ацетолактат декарбоксилаза, Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400>24

Met Asp Asp Glu Vai Lys Vai Pro Asn His lie Tyr Gin Met Ser Thr

1015 lie Asn Ala Leu Vai Ser Gly Leu Tyr Asp Gly Cys Vai Ser Leu Ser 20 2530

Lys Leu Leu Lys Lys Gly Asn Phe Gly lie Gly Thr Phe Lys Gly Leu 35 4045

Asp Gly Glu Leu Thr Leu Leu Asn Gly Thr Phe Tyr Arg Thr Lys Pro 50 5560

Asp Gly Ser Vai Tyr Vai Cys Ser Lys Asn Vai Ser Vai Pro Phe Ala 65 70 7580

Vai Vai Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Tyr Asn lie Gin Asn Arg

9095

Thr Ser Tyr Glu Asp lie Arg Lys Glu Leu Asp Ser Phe lie Glu Ser

100 105110

Lys Asn lie Phe Tyr Ala Phe Tyr Met Glu Gly Lys Phe Asn Tyr Vai

115 120125

Lys Thr Arg Thr Vai Vai Lys Gin Asn Met Pro Tyr Lys Pro Met Ala

130 135140

Glu Vai Vai Lys Asp Gin Pro Met Phe Glu Tyr Asn Gly Vai Asp Gly

145 150 155160

Tyr Vai Vai Gly Phe Arg Cys Pro Asp Tyr Vai Glu Gly Leu Asn Vai

165 170175

Pro Gly Tyr His Phe His Phe lie Asn Lys Asp Lys Lys Phe Gly Gly

180 185190

- 69 035950

His lie Ser Glu Phe Ser lie Glu Asn Ala Lys Vai Tyr Vai Gin Asn

195 200205

Cys Ser Cys Phe Arg Met Glu Leu Pro Lys Asn Glu Ser Phe Tyr Asn

210 215220

Met Glu Vai Gin Asp Arg Asn Asp Glu lie Thr Ser Vai Glu Lys

225 230235 <210>25 <211>806 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <400>25 gagctctaag gaggtcggac atggaaacta atagtagttg tgattgtgca atagaaataa 60 gtcaacaatt tgcaagatgg caggcaagac aaggtggtgg tgaagtatat caaagtagtc 120 ttatgagtgc attattagct ggtgtatatg aaggtgaaac tactatggca gatttactta 180 gacatggtga ttttggatta ggaactttta atagattaga tggtgaatta atagcatttg 240 aaagacaaat acatcaatta aaagcagatg gaagtgcaag acctgcaaga gcagaacaaa 300 aaactccttt tgcagtaatg actcatttta gaccttgttt acaaagaaga tttgcacatc 360 ctttaagtag agaagaaata catcagtggg tagatagatt agtaggaact gataatgtat 420 ttgtagcatt tagacttgat ggattatttg aacaagcaca agtaagaact gtaccttgtc 480 aaagtcctcc ttataaacct atgttagaag caatagaagc acaaccttta tttagtttta 540 gtttaagaag aggaacttta gtaggattta gatgtcctcc ttttgtacag ggaataaatg 600 tagcaggata tcatgaacat tttataactg aagatagaag aggtggtgga catatattag 660 attatgcaat gggacatgga caattacaat taagtgtagt acaacatctt aatatagaat 720 tacctagaaa tcctgcattt caacaagcag atcttaatcc tgcagattta gatagagcaa 780 taagagcagc agaaggataa ggtacc

806

- 70 035950 <210>26 <211>259 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophila <400>26

Met Glu Thr Asn Ser Ser Cys Asp Cys Ala lie Glu lie Ser Gin Gin

1015

Phe Ala Arg Trp Gin Ala Arg Gin Gly Gly Gly Glu Vai Tyr Gin Ser 20 2530

Ser Leu Met Ser Ala Leu Leu Ala Gly Vai Tyr Glu Gly Glu Thr Thr 35 4045

Met Ala Asp Leu Leu Arg His Gly Asp Phe Gly Leu Gly Thr Phe Asn 50 5560

Arg Leu Asp Gly Glu Leu lie Ala Phe Glu Arg Gin lie His Gin Leu 65 70 7580

Lys Ala Asp Gly Ser Ala Arg Pro Ala Arg Ala Glu Gin Lys Thr Pro

9095

Phe Ala Vai Met Thr His Phe Arg Pro Cys Leu Gin Arg Arg Phe Ala

100 105110

His Pro Leu Ser Arg Glu Glu lie His Gin Trp Vai Asp Arg Leu Vai

115 120125

Gly Thr Asp Asn Vai Phe Vai Ala Phe Arg Leu Asp Gly Leu Phe Glu

130 135140

Gin Ala Gin Vai Arg Thr Vai Pro Cys Gin Ser Pro Pro Tyr Lys Pro

145 150 155160

Met Leu Glu Ala lie Glu Ala Gin Pro Leu Phe Ser Phe Ser Leu Arg

165 170175

Arg Gly Thr Leu Vai Gly Phe Arg Cys Pro Pro Phe Vai Gin Gly lie

180 185190

Asn Vai Ala Gly Tyr His Glu His Phe lie Thr Glu Asp Arg Arg Gly

195 200205

- 71 035950

Gly Gly His lie Leu Asp Tyr Ala Met Gly His Gly Gin Leu Gin Leu

210 215220

Ser Vai Vai Gin His Leu Asn lie Glu Leu Pro Arg Asn Pro Ala Phe

225 230 235240

Gin Gin Ala Asp Leu Asn Pro Ala Asp Leu Asp Arg Ala lie Arg Ala

245 250255

Ala Glu Gly <210>27 <211>761 <212> DNA <213> Leuconostoc lactis <400>27 gagctctaag gaggtcggac atgactcatc aatataataa aatgagtaga ttatatcaac 60 atggaacttt agcaatgtta atgggaaaac aaatgcaggg aactataact gtagcagaac 120 ttagacaaca tggtgatact ggaataggaa ctcttactgg attagatggt gaagtaatac 180 ttcttgatgg tgaagtttat caagcacaga gtgatggaca agtaaatcat ataactaatc 240 ctgatacttt aatgcctttt gcaagtgtac attttgatgc acctactcag cagttacctt 300 ttagtcaggt agattttagt actttaagtg caaaacttaa agcagaacaa ttacaaaatg 360 tatttgcagc agtgaaattt catggtgaat ttagtagagt acatgtaaga atagctccta 420 aacaagtacc tccttatcct tcattacttg cagtagcaga aaatcaacct gaatttgaaa 480 gagaacacgt aactggaact gtagtaggat actttgcacc tcaaatattt aatggaccta 540 ctgcagcagg atggcatgta cattttctta gtgatgatct tcaatttgca ggacatatat 600 tagattttag tgcaagtcaa ataagtggaa ctttacaaat atttgatgaa tttgtacaac 660 atttacctat acatgatcct gcatatagag aaatgacttt agattttgat ggattattag 720 ctggaataga agcaagtgaa ggtggacaac aataaggtac c 761

- 72 035950 > 28 > 244 > PRT > Leuconostoc lactis <210 <211 <212 <213 <400>28

Met Thr His Gin Tyr Asn Lys Met Ser Arg Leu Tyr Gin His Gly Thr 15 1015

Leu Ala Met Leu Met Gly Lys Gin Met Gin Gly Thr He Thr Vai Ala 20 2530

Glu Leu Arg Gin His Gly Asp Thr Gly He Gly Thr Leu Thr Gly Leu 35 4045

Asp Gly Glu Vai He Leu Leu Asp Gly Glu Vai Tyr Gin Ala Gin Ser

5560

Asp Gly Gin Vai Asn His He Thr Asn Pro Asp Thr Leu Met Pro Phe 65 70 7580

Ala Ser Vai His Phe Asp Ala Pro Thr Gin Gin Leu Pro Phe Ser Gin 85 9095

Vai Asp Phe Ser Thr Leu Ser Ala Lys Leu Lys Ala Glu Gin Leu Gin

100 105110

Asn Vai Phe Ala Ala Vai Lys Phe His Gly Glu Phe Ser Arg Vai His

115 120125

Vai Arg lie Ala Pro Lys Gin Vai Pro Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ala

130 135140

Vai Ala Glu Asn Gin Pro Glu Phe Glu Arg Glu His Vai Thr Gly Thr

145 150 155160

Vai Vai Gly Tyr Phe Ala Pro Gin lie Phe Asn Gly Pro Thr Ala Ala

165 170175

Gly Trp His Vai His Phe Leu Ser Asp Asp Leu Gin Phe Ala Gly His

180 185190

He Leu Asp Phe Ser Ala Ser Gin lie Ser Gly Thr Leu Gin lie Phe

195 200205

Asp Glu Phe Vai Gin His Leu Pro He His Asp Pro Ala Tyr Arg Glu

210 215220

Met Thr Leu Asp Phe Asp Gly Leu Leu Ala Gly lie Glu Ala Ser Glu

225 230 235240

Gly Gly Gin Gin

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантная, карбоксидотрофная бактерия Clostridium, содержащая один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы (ЕС 1.2.7.1), ацетолактатсинтазы (ЕС 2.2.1.6) и ацетолактат декарбоксилазы (ЕС 4.1.1.5), причем каждый фермент представляет собой сверхэкспрессируемый эндогенный фермент или экзогенный фермент, при этом бактерия получена из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdalei, и при этом бактерия продуцирует 2,3-бутандиол и ацетат.
2. 2. Бактерия по п.1, содержащая пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу и ацетолактатсинтазу.
3. 3. Бактерия по п.1, содержащая пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу и ацетолактат декарбоксилазу.
4. 4. Бактерия по п.1, содержащая ацетолактатсинтазу и ацетолактат декарбоксилазу.
5. 5. Бактерия по п.1, содержащая пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу, ацетолактатсинтазу и ацетолактат декарбоксилазу.
6. 6. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что фермент представляет собой сверхэкспрессируемую эндогенную пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу.
7. 7. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что фермент представляет собой экзогенную пируват:ферредоксин-оксидоредуктазу Desulfovibrio africanus.
8. 8. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что фермент представляет собой сверхэкспрессируемую эндогенную IlvB ацетолактатсинтазу, имеющую последовательность SEQ ID NO: 8, сверхэкспрессируемую эндогенную IlvB ацетолактатсинтазу, имеющую последовательность SEQ ID NO: 10, сверхэкспрессируемую эндогенную IlvN ацетолактатсинтазу или сверхэкспрессируемую эндогенную AlsS ацетолактат синтазу.
9. 9. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что фермент представляет собой экзогенную ацетолактатсинтазу Bacillus subtilis.
10. 10. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что фермент является сверхэкспрессируемой эндогенной AlsD ацетолактат декарбоксилазой или сверхэкспрессируемой эндогенной BudA ацетолактат декарбоксилазой.
11. 11. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что фермент представляет собой экзогенную ацетолактат декарбоксилазу Aeromonas hydrophila.
12. 12. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что фермент представляет собой экзогенную ацетолактат декарбоксилазу Leuconostoc lactis.
13. 13. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что бактерия получена из Clostridium autoethanogenum.
14. 14. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что бактерия получена из Clostridium autoethanogenum, сохраненной под номером доступа DSMZ DSM23693.
15. 15. Способ получения 2,3-бутандиола, включающий ферментацию бактерии по п.1 в присутствии газообразного субстрата, содержащего СО.
16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что бактерия дополнительно продуцирует этанол, бутанол, изопропанол, изобутанол, высшие спирты, бутандиол, сукцинат, изопреноиды, жирные кислоты и/или их смеси.