KR102493197B1 - 발효 경로를 통해 플럭스 증가를 나타내는 재조합 미생물 - Google Patents

발효 경로를 통해 플럭스 증가를 나타내는 재조합 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피루베이트:페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.1), 아세토락테이트 합성효소(EC 2.2.1.6), 및 아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5) 중 1종 이상을 발현하는 재조합 일산화탄소영양 클로스트리듐 박테리아를 제공한다. 본 발명은 CO를 포함하는 기체 기질의 존재 하에 재조합 박테리아를 발효시킴으로써 에탄올, 뷰탄올, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 고급 알코올, 뷰탄다이올, 2,3-뷰탄다이올, 석시네이트, 아이소프레노이드, 지방산, 생체고분자, 및 이들의 혼합물 중 1종 이상을 생성하는 발효 생성물의 제조 방법을 추가로 제공한다.

Description

발효 경로를 통해 플럭스 증가를 나타내는 재조합 미생물{RECOMBINANT MICROORGANISMS EXHIBITING INCREASED FLUX THROUGH A FERMENTATION PATHWAY}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 12월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/089,053호 및 2015년 6월 1일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/168,969호의 이익을 주장하며, 이들 출원의 전문은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.
일산화탄소영양(carboxydotrophic) 미생물은 기체 기질의 발효를 통해 연료 및 화학 물질과 같은 생성물을 생성하도록 조작될 수 있다. 생성물 농도 및 기질 이용률을 개선시키기 위한 노력은 역사적으로 균주 선택 및 발효 조건의 최적화에 초점을 맞추어 왔다(Abubackar, Bioresour Technol, 114: 518-522, 2012). 그러나, 천연 미생물의 물질대사는 높은 수율, 속도 및 역가의 상업적 목적을 달성하도록 진화하지 않았으므로, 특정 상업적 목적은 단지 균주 선택 및 발효 조건의 최적화를 통해서는 달성될 수 없다. 따라서, 유용한 생성물, 예컨대 연료 및 화학 물질의 생성을 위한 개선된 미생물 및 방법에 대한 수요가 여전히 존재한다.
본 발명은 피루베이트:페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.1), 아세토락테이트 합성효소(EC 2.2.1.6), 및 아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 포함하는 재조합 일산화탄소영양 클로스트리듐(Clostridium) 박테리아를 제공하되, 각각의 효소는 과발현된 내인성 효소, 돌연변이된 내인성 효소, 또는 외인성 효소이다. 재조합 박테리아는 이들 효소 중 1종, 2종, 또는 3종 모두를 발현할 수 있다.
재조합 박테리아는 임의의 클로스트리듐 미생물로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 재조합 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리이(C. ljungdahlii), 또는 클로스트리듐 라그스달레이(C. ragsdalei)로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, 재조합 박테리아는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561)으로부터 유래된다.
본 발명은, CO를 포함하는 기체 기질의 존재 하에서 재조합 박테리아를 발효시켜 에탄올, 뷰탄올, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 고급 알코올, 뷰탄다이올, 2,3-뷰탄다이올, 석시네이트, 아이소프레노이드, 지방산, 생체고분자, 및 이들의 혼합물 중 1종 이상을 생성하는 단계를 포함하는, 발효 생성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
도 1은 측정된 효소 활성 및 아세틸-CoA를 통하여 에탄올 형성을 위한 일산화탄소영양 미생물을 통한 플럭스를 상세히 나타내는 에탄올 생합성 경로의 플럭스 맵으로서, 이는 속도 제한 경로 반응의 확인을 가능하게 한다. 화살표의 두께는 특정 경로 반응의 활성에 비례한다.
도 2는 측정된 효소 활성 및 피루베이트를 통하여 2,3-뷰탄다이올 형성을 위한 일산화탄소영양 미생물을 통한 플럭스를 상세히 나타내는 플럭스 맵으로서, 이는 속도 제한 경로 반응의 확인을 가능하게 한다.
도 3은 2,3-뷰탄다이올 경로 및 연관된 분지쇄 아미노산 생합성 경로를 나타내는 다이어그램. 피루베이트는, 2,3-뷰탄다이올 및 분지쇄 아미노산 생합성 경로 둘 다에 대한 중간체인 α-아세토락테이트로 전환된다. 실험은 PFOR, alsS 및 alsD를 과발현시키도록 실행되었다.
도 4는 pMTL83159 플라스미드의 개략도. 플라스미드는 복제 (ColE1) 유전자의 그람 음성 개시점, 복제 (repH) 유전자의 그람 양성 기점, 전달 유전자 traJ, 클로람페니콜/티암페니콜 저항성을 암호화하는 catP 유전자, lacZ 알파 암호화 서열 내에 위치하는 다중 클로닝 부위, 및 페레독신 유전자 프로모터(P fdx )를 함유한다.
도 5는 쇼트 보틀(Schott bottle)에서 성장된 5가지 균주의성장 및 대사산물 프로파일(바이오매스, 2,3-뷰탄다이올(BDO), 아세트산, 및 에탄올) 대 시간을 나타내는 그래프 세트.
도 6은 20일 동안 4 ㏖/ℓ/d CO 흡수에서 합한 PFOR, alsS 및 alsD 과발현 균주 및 플라스미드 대조군 균주의 대사산물 프로파일(상부 그래프) 및 가스 프로파일(하부 그래프)을 나타내는 그래프 세트.
도 7은 11일 동안 8 ㏖/ℓ/d CO 흡수에서 과발현 배양물의 대사산물 및 가스 프로파일을 나타내는 그래프의 그래프 세트.
도 8은 아에로모나스 하이드로필라(A. hydrophila) alsD(개방 사각형), 류코노스톡 락티스(L. lactis) alsD(폐쇄 사각형), 및 빈 플라스미드 대조군(삼각형)을 발현하는 배양물의 바이오매스 및 뷰탄다이올 생성을 나타내는 그래프의 세트. 수치는 3회 반복의 평균이고, 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
발효 경로는, 이에 의해 기질, 바람직하게는 기체 기질이 발효 생성물로 전환되는, 생화학적 반응(경로 반응)의 캐스케이드이다. 경로 반응은 전형적으로 경로 반응의 속도를 촉진시키거나 증가시키는 효소를 수반한다.
"플럭스"는 발효 경로에서 하나 이상의 반응을 통한 대사산물의 흐름을 말한다. 개별적인 경로 반응을 통한 플럭스는 상한과 하한을 갖는다. 그러므로, 플럭스는 효소 활성에 영향을 미치는 조건 또는 인자를 조정함으로써 변화될 수 있다. 하나의 경로 반응을 통한 플럭스의 조정은 발효 경로의 전반적인 플럭스를 변경시킬 수 있다. 플럭스는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라서 측정될 수 있다. 예로서, 플럭스는 플럭스-균형 분석(flux-balance analysis; FBA)을 사용하여 측정될 수 있다(Gianchandani, Systems Biol Medicine, 2: 372-382, 2010). 경로를 통한 플럭스는 또한 대사산물과 생성물의 수준(대사체학)(Patti, Nat Rev Molec Cell Biol, 13: 263-269, 2012) 및/또는 C13으로서의 라벨링 실험(플럭소믹스(fluxomics))(Niittylae, Methods Mol Biol, 553: 355-372, 2009; Tang, Mass Spectrom Rev, 28:362-375, 2009)에 의해 측정될 수 있다.
발효 경로의 효율은 경로를 통한 반응 플럭스를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 플럭스 증가는, 발효를 실행하는 미생물의 성장 속도의 증가, 상승된 생성물 농도에서 성장 속도 및/또는 생성물 생성 속도의 증가, 발효 브로쓰에서 발효 생성물 농도의 증가, 소비된 기질의 부피 당 생성된 발효 생성물 부피의 증가, 발효 생성물의 생성 속도 또는 생성 수준의 증가 중 하나 이상을 초래한다. 바람직하게, 효율의 증가는 발효 생성물 생성 속도의 증가를 초래한다.
속도 제한 반응(병목 현상)을 확인하는 한 가지 방법은 기질로부터 생성물까지 발효 경로에 수반되는 모든 반응에 대한 효소 활성을 측정하는 것이다. 이는 공정 조건 하에서 성장하는 세포에서 반응의 효소 활성을 분석하여 가장 낮은 속도에 의한 반응을 확인함으로써 수행될 수 있다. 그 다음, 이는 속도 제한이 없도록 조정되어, 따라서 시스템 전반에 걸쳐 플럭스를 증가시킬 수 있다. 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 문헌[Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명자들은 발효 경로에 관여되는 효소의 활성을 분석하였고, 일부 경로 반응이 동일한 경로에서의 다른 반응보다 실질적으로 더 낮은 효소 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 본 명세서에 기재된 재조합 미생물 및 방법은 모 미생물에서 생성물 수율이 실행가능한 상업적 목표가 될 생성물 수율을 갖지 않을 수 있는 경로에 특정한 유용성을 가진다.
효소 활성의 분석에 적용할 수 있는 발효 경로의 예는 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로, 에탄올, 2,3-뷰탄다이올 또는 이의 전구체, 예컨대 아세틸-CoA 및 피루베이트를 생성하느 발효 경로, 및 발효 경로에서 필요할 수 있는 보조인자 테트라하이드로폴레이트 및 코발라민(B12)에 대한 생합성 경로를 포함한다. 우드-융달 경로는 도 1 및 도 2에 기재된 바와 같이, 효소에 의해 촉진되는 다수의 반응으로 구성된다. 바람직한 발효 생성물의 생성을 초래하는 우드-융달 경로에 후속적인 단계는 또한 발효 경로의 일부인 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 발효 경로는 에탄올, 뷰탄올, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 고급 알코올, 뷰탄다이올, 2,3-뷰탄다이올, 석시네이트, 아이소프레노이드, 지방산, 생체고분자, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 발효 생성물의 생성을 초래한다.
본 발명은 피루베이트:페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.1), 아세토락테이트 합성효소(EC 2.2.1.6), 및 아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 포함하는 재조합 일산화탄소영양 클로스트리듐 박테리아를 제공하되, 각각의 효소는 과발현된 내인성 효소, 돌연변이된 내인성 효소, 또는 외인성 효소이다.
"모 미생물"은 본 발명의 재조합 미생물을 생성하기 위해 사용되는 미생물이다. 모 미생물은 자연적으로 발생하는 것(즉, 야생형 미생물) 또는 이전에 변형된 것(즉, 재조합 미생물)일 수 있다. 본 발명의 재조합 미생물은 변형되어 모 미생물에서 발현되었거나 발현되지 않았거나 과발현되었거나 과발현되지 않은 1종 이상의 효소를 발현 또는 과발현할 수 있거나, 또는 변형되어 1종 이상의 보조인자의 이용가능성 증가를 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서, 모 유기체는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이일 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 모 유기체는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561이다.
"재조합 미생물"은 모 미생물과 비교할 때 유전자 변형을 거친 미생물이다. 유전적 변형은 예를 들어 핵산의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다.
일반적으로, 용어 "로부터 유래된"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 각각 상이한(즉, 모 또는 야생형) 핵산, 단백질, 또는 미생물로부터 변형되거나 적합화되어, 새로운 재조합 미생물을 생성하는 것을 나타낸다.
모 미생물의 유전자 변형의 방법은, 이종 유전자 발현, 게놈 삽입 또는 결실, 변경된 유전자 발현 또는 유전자 불활성화, 또는 효소 공학 방법과 같은 분자 방법을 포함한다. 이와 같은 기법은, 예를 들어 문헌[Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]; [Pleiss, Curr Opin Biotechnol, 22: 611-617, 2011]; [Park, Protein Engineering and Design, CRC Press, 2010]에 기재되어 있다. 발현 구조물/벡터는, 예를 들어 1종 이상의 프로모터 또는 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산 및 구조물/벡터 서열은 또한 리보솜 결합 부위 및/또는 제한 부위에 필요한 것과 같은 표준 링커 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
본 발명의 발현 구조물/벡터를 포함하여, 핵산 및 핵산 구조물은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 화학적 합성 또는 재조합 기법이 사용될 수 있다. 이와 같은 기법은, 예를 들어 문헌[Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다. 본질적으로, 개별적인 유전자 및 조절 요소는, 유전자가 발현되어 원하는 단백질을 형성할 수 있도록, 서로 작동 가능하게 연결될 수 있다. 적합한 벡터는 당업자에 의해 인식될 것이다. 그러나, 예로서, 다음의 벡터가 적합할 수 있다: pMTL80000 벡터, pIMP1, pJIR750, 및 기타 플라스미드.
핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 미생물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 원래 상태의 핵산으로서 미생물에 전달될 수 있거나, 미생물에의 형질전환 공정을 용이하게 하는 1종 이상의 제제(예를 들어, 리포좀)과 함께 제형화될 수 있다. 핵산은 적절하다면, DNA, RNA, cDNA, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 특정 실시형태에서 제한 억제제가 사용될 수 있다(Murray, Microbiol Molec Biol Rev, 64: 412-434, 2000). 추가적인 벡터는 플라스미드, 바이러스(박테리오파지를 포함함), 코스미드, 및 인공 염색체를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 플라스미드를 사용하여 미생물에 전달된다. 단지 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공법, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 반응능, 프로토플라스트 형질전환, 프로파지 도입 또는 컨쥬게이션에 의해 달성될 수 있다. 적합한 형질전환 기법은, 예를 들어 문헌[Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다.
전기천공법의 사용이 클로스트리듐 륭달리이(Koepke, PNAS, 107:13087-13092, 2010; WO/2012/053905), 클로스트리듐 오토에타노게눔(WO/2012/053905), 클로스트리듐 아세티쿰(Schiel-Bengelsdorf, Synthetic Biol, 15: 2191-2198, 2012), 및 아세토박테리움 우디(
Figure 112017053297895-pct00001
, Appl Environ Microbiol, 60: 1033-1037, 1994)를 포함하여, 몇몇 일산화탄소영양 아세토젠에 대하여 보고된 바 있다. 전기천공법의 사용은 또한 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)(Mermelstein, Biotechnol, 10: 190-195, 1992), 및 클로스트리듐 셀룰로라이티쿰(C. cellulolyticum)(Jennert, Microbiol, 146: 3071-3080, 2000)을 포함하여 클로스트리디아에서 보고된 바 있다. 추가적으로, 프로파지 유도는 클로스트리듐 스카톨로게네스(C. scatologenes)(Parthasarathy, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project, Western Kentucky University, 2010)를 포함하여 일산화탄소영양 아세토젠에 대하여 설명된 바 있고, 컨쥬게이션은 클로스트리듐 디피실(C. difficile )(Herbert, FEMS Microbiol Lett, 229: 103-110, 2003) 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826, 1990)을 포함하여 다수의 클로스트리디아에 대하여 기재된 바 있다. 유사한 방법이 일산화탄소영양 아세토젠에서 사용될 수 있었다.
본 발명은 모 미생물에 비하여 발효 경로를 통한 플럭스 증가를 나타내도록 적합화된 재조합 일산화탄소영양 클로스트리듐 박테리아를 제공한다. 본 발명의 일 특정 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스(C. carboxidivorans), 클로스트리듐 드라케이(C. drakei), 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰(C. aceticum), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(C. formicoaceticum), 클로스트리듐 마그눔(C. magnum)을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 군으로부터 선택된다.
재조합 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 라그스달레이의 종 및 관련 단리물을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 클러스터로부터 유래될 수 있다. 이들은 균주 클로스트리듐 오토에타노게눔 JAI-1T(DSM10061)(Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), 클로스트리듐 오토에타노게눔 LBS1560(DSM19630)(WO　2009/064200), 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561(DSM23693), 클로스트리듐 륭달리이 PETCT(DSM13528 = ATCC 55383)(Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), 클로스트리듐 륭달리이 ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 제5,593,886호), 클로스트리듐 륭달리이 C-01(ATCC 55988)(미국 특허 제6,368,819호), 클로스트리듐 륭달리이 O-52(ATCC 55989)(미국 특허 제6,368,819호), 클로스트리듐 라그스달레이 P11T(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055), 관련 단리물, 예컨대 "클로스트리듐 코스카티(C.　coskatii)"(미국 출원 공개 2011/0229947), 또는 돌연변이된 균주, 예컨대 클로스트리듐 륭달리이 OTA-1(Tirado-Acevedo, Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 균주는 클로스트리디아 rRNA 클러스터 I 내에서 하위클러스터를 형성하고, 이들의 16S rRNA 유전자는 약 30%의 유사한 낮은 GC 함량을 가지면서 99% 초과로 동일하다. 그러나, DNA-DNA 재회합 및 DNA 핑거프린팅 실험은, 이들 균주가 별개의 종에 속한다는 것을 나타내었다(WO　2008/028055). 이 클러스터의 균주는 유사한 유전자형 및 표현형 둘 다를 갖는 공통 특징에 의해 정의되고, 이들은 모두 에너지 보전 및 발효 대사의 동일한 방식을 공유한다. 이 클러스터의 균주는 시토크롬이 결여되어 있고, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보전한다.
상기 언급한 클러스터의 모든 종은 유사한 형태 및 크기를 가지고(대수 성장 세포는 0.5-0.7 x 3-5 μm임), 중온성이며(최적 성장 온도가 30 내지 37℃임), 엄격하게 혐기성이다(문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994]; [Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993]; 및 WO 2008/028055). 게다가, 이들은 모두, 동일한 pH 범위(pH 4 내지 7.5, 최적의 초기 pH는 5.5 내지 6임), 유사한 성장 속도로 CO-함유 기체 상에서 강한 독립영양 성장, 및 주 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산과 유사한 대사 프로파일, 및 특정 조건 하에서 형성된 소량의 2,3-뷰탄다이올 및 락트산과 같은 동일한 주요 계통발생적 특질을 공유한다(문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994]; [
Figure 112017053297895-pct00002
, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011]; [Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993]; 및 WO　2008/028055). 인돌 생성 또한 3가지 종 모두에서 관찰되었다. 그러나, 상기 종들은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘), 또는 다른 기질(예를 들어, 베타인, 뷰탄올)의 기질 이용에서 구별된다. 게다가 상기 종들 중 일부는 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대해 영양요구성지만, 다른 것들은 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 기체 흡수에 관여하는 우드-륭달 경로 유전자의 조직과 수는 핵산과 아미노산 서열의 차이에도 불구하고, 모든 종에서 동일한 것으로 밝혀졌다(
Figure 112017053297895-pct00003
, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011). 또한, 상응하는 알코올로의 카복실산의 환원이 다양한 이들 미생물에서 나타났다(Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). 그러므로, 이들 특질은 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 륭달리이와 같은 하나의 유기체에 특이적인 것이 아니고, 오히려 일산화탄소영양, 에탄올-합성 클로스트리디아에 대한 일반적인 특질이며, 성능에서 차이가 있을 수 있지만, 메커니즘은 이들 균주에 걸쳐 유사하게 작용하는 것으로 예상될 수 있다.
일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이이다. 바람직하게, 모 미생물은 야생형 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 DSMZ 수탁 번호 DSM10061 또는 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561)이다. 일 실시형태에서, 재조합 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이로부터 유래된다. 바람직하게, 재조합 박테리아는 야생형 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561)이다.
본 발명의 효소 및 유전자는 과발현된 내인성 효소 및 유전자, 돌연변이된 내인성 효소 및 유전자, 또는 외인성 효소 및 유전자일 수 있다.
"내인성"은 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아에 존재하는 핵산 또는 단백질을 말한다. 일 실시형태에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 조절 요소, 예컨대 외인성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
"외인성"은 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 말한다. 일 실시형태에서, 외인성 유전자 또는 효소는 이종 균주 또는 종으로부터 유래되어 재조합 박테리아로 도입되거나 재조합 박테리아에서 발현될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 외인성 유전자 또는 효소는 인위적으로 또는 재조합으로 형성될 수 있다. 외인성 핵산은 적합화되어 박테리아의 게놈 내로 통합되거나, 박테리아에서 염색체외 상태로, 예를 들어 플라스미드로 남아있을 수 있다.
"효소 활성"은 효소의 활성, 효소의 양, 또는 반응을 촉진시키는 효소의 이용가능성을 포함하는 효소의 활성을 광범위하게 말하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 효소 활성을 "증가시키는 것"은 효소 활성의 증가, 효소 양의 증가, 또는 반응을 촉진시키는 효소 이용가능성의 증가를 포함한다.
본 발명의 유전자 및 효소는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어 유도 진화, 지식 기반 설계, 무작위 돌연변이유발 방법, 유전자 셔플링, 코돈 최적화, 부위 특이적 라이브러리의 사용, 및 부위 평가 라이브러리의 사용으로 개발되거나 조작될 수 있다.
"돌연변이된"은 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 변형된 핵산 또는 단백질을 말한다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 효소를 암호화하는 유전자에서의 결실, 삽입, 또는 치환일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 효소 내 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입, 또는 치환일 수 있다.
"코돈 최적화"는 특정 균주 또는 종에서 핵산의 최적화 또는 개선된 번역을 위한, 핵산, 예컨대 유전자의 돌연변이를 말한다. 코돈 최적화는 번역 속도를 더 빠르게 하거나 번역 정확성을 더 높일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 효소를 암호화하는 유전자는 클로스트리듐, 특히 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 및/또는 클로스트리듐 라그스달레이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 효소를 암호화하는 유전자는 클로스트리듐 오토에타노게눔 LZ1561에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다.
"과발현된"은 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 핵산 또는 단백질의 발현의 임의의 증가를 말한다. 과발현은 유전자 복제 수, 유전자 전사율, 유전자 번역율, 또는 효소 분해율을 변형시키는 것을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
"과발현된 내인성 효소"는 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 더 높은 수준으로 존재하는 내인성 효소를 말한다. 과발현된 내인성 효소는 마찬가지로, 예를 들어 강한 또는 구성 프로모터에 의해 제어되도록 변형될 수 있는 내인성 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 유사하게, "과발현된 내인성 유전자"는 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 더 높은 비율 또는 수준으로 존재하거나 전사되는 내인성 유전자를 말한다.
"돌연변이된 내인성 효소"는 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 돌연변이 또는 변형된 내인성 효소를 말한다. 유사하게, "돌연변이된 내인성 유전자"는 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 돌연변이 또는 변형된 내인성 유전자를 말한다.
"외인성 효소"는 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아에 존재하지 않는 효소를 말한다. 유사하게, "외인성 유전자"는 본 발명의 재조합 박테리아가 유래된 모 박테리아 또는 야생형 박테리아에 존재하지 않는 유전자를 말한다. 전형적으로, 외인성 효소 또는 유전자는 이종 균주 또는 종으로부터 유래되어 재조합 박테리아로 도입되거나 재조합 박테리아에서 발현된다.
본 발명은, 변이체 핵산 또는 단백질이 실질적으로 동일한 기능을 실행한다면, 서열이 본 명세서에 구체적으로 예시된 서열과 상이한 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 있어서, 이는 암호화된 단백질 또는 펩타이드가 실질적으로 동일한 기능을 가진다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열에 있어서, 변이체 서열은 1종 이상의 유전자의 발현을 촉진시키는 유사한 능력을 가질 것이다. 이와 같은 핵산 또는 단백질은 본 명세서에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로서, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자의 단편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오타이드 치환 등)를 포함하는 유전자 및/또는 다형성 등을 포함한다. 다른 미생물 유래의 상동성 유전자는 또한 본 명세서에 구체적으로 예시된 서열의 기능적으로 동등한 변이체의 예로 간주될 수 있다. 이들은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 베이예린키(C. beijerinckii), 또는 클로스트리듐 륭달리이와 같은 같은 종에서의 상동성 유전자를 포함하며, 상기 종의 상세한 내용은 진뱅크(Genbank) 또는 NCBI와 같은 웹사이트에서 공중이 이용가능하다. 기능적으로 동등한 변이체는 또한 특정 유기체에 있어서 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변하는 핵산을 포함한다. 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 명시된 핵산과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98%, 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다. 단백질의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 명시된 단백질과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98%, 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가질 것이다. 이와 같은 변이체는 단편이 단백질 또는 펩타이드의 절두 형태를 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 단편을 포함하며, 여기서 결실은 1 내지 5개, 내지 10개, 내지 15개, 내지 20개, 내지 25개의 아미노산 일 수 있으며, 폴리펩타이드의 어느 하나의 말단에서 1 내지 25개의 잔기로 연장될 수 있고, 결실은 구역 내에서 임의의 길이를 가질 수 있거나 내부 위치에 있을 수 있다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적으로 동등성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 그러나, 예로서, 특정 효소의 활성에 대하여 시험하는 분석은 문헌[Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012]에 기재되어 있다.
활성 제한 효소 시스템을 갖는 특정 실시형태에서, 핵산을 미생물에 도입하기 전에 핵산을 메틸화시키는 것이 필요할 수 있다.
일반적으로, 메틸화는 발현 구조물/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 용이하게 하는 셔틀 미생물, 바람직하게는 제한 음성 셔틀 미생물, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(B. subtillis), 또는 류코노스톡 락티스(L. lactis)를 사용하여 실행된다. 메틸화 구조물/벡터는 메틸전달효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일단 발현 구조물/벡터 및 메틸화 구조물/벡터가 셔틀 미생물로 도입되면, 메틸화 구조물/벡터 상에 존재하는 메틸전달효소 유전자가 유도된다. 본 발명의 일 특정 실시형태에서는 메틸화 구조물/벡터가 유도성 lac 프로모터를 포함하고, 락토스 또는 이의 유사체, 더 바람직하게는 아이소프로필-β-D-싸이오-갈락토사이드(IPTG)에 의해 유도되지만, 유도는 임의의 적합한 프로모터 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 ara, tet, 또는 T7 시스템을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 메틸화 구조물/벡터 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정 실시형태에서, 메틸화 구조물/벡터는 메틸화 구조물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자가 셔틀 미생물에서 발현되도록 셔틀 미생물의 정체에 특이적인 복제 기점을 가진다. 바람직하게 발현 구조물/벡터는 발현 구조물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자가 목적 미생물에서 발현되도록 목적 미생물의 정체에 특이적인 복제 기점을 가진다.
메틸전달효소의 발현은 발현 구조물/벡터 상에 존재하는 유전자를 메틸화시킨다. 그 다음, 발현 구조물/벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라서 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 구조물/벡터 둘 다 동시에 단리된다. 발현 구조물/벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 목적 미생물로 도입될 수 있다. 발현 구조물/벡터가 메틸화되므로, 발현 구조물/벡터 상에 존재하는 핵산 서열은 목적 미생물로 혼입되고 성공적으로 발현될 수 있다.
메틸전달효소 유전자는 셔틀 미생물로 도입되어 과발현될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 생성된 메틸전달효소는 공지된 방법을 사용하여 수집될 수 있고, 발현 플라스미드를 메틸화하기 위해 시험관 내에서 사용될 수 있다. 그 다음, 발현 구조물/벡터는 발현을 위하여 목적 미생물로 도입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 메틸전달효소 유전자는 셔틀 미생물의 게놈으로 도입된 다음, 발현 구조물/벡터가 셔틀 미생물로 도입되고, 셔틀 미생물로부터 1종 이상의 구조물/벡터가 단리된 후, 발현 구조물/벡터가 목적 미생물로 도입된다.
발현 구조물/벡터 및 메틸화 구조물/벡터는 조합되어 물질의 조성물을 제공할 수 있다. 이와 같은 조성물은 본 발명의 재조합 미생물을 생성하기 위한 제한 장벽 메커니즘을 회피하는 것에 있어서 특정 유용성을 가진다. 일 특정 실시형태에서, 발현 구조물/벡터 및/또는 메틸화 구조물/벡터는 플라스미드이다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 파지 ΦT1 메틸전달효소 또는 WO 2012/053905에 기재된 메틸전달효소를 포함하여, 다수의 적합한 메틸전달효소가 사용될 수 있다. 유사하게, 메틸전달효소 유전자의 발현을 가능하게 하도록 적합화된 다수의 구조물/벡터가 메틸화 구조물/벡터를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
예로서, 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 (a) 셔틀 미생물로 (i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 발현 구조물/벡터 및 (ii) 메틸전달효소 유전자를 포함하는 메틸화 구조물/벡터의 도입; 및 (b) 메틸전달효소 유전자의 발현; 셔틀 미생물로부터 1종 이상의 구조물/벡터의 단리; 및 목적 미생물로 1종 이상의 구조물/벡터의 도입을 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 (b)의 메틸전달효소 유전자는 구성적으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, 단계 (b)의 메틸전달효소 유전자의 발현이 유도된다.
본 발명의 재조합 박테리아는 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및 아세토락테이트 탈카복실화효소 중 1종 이상을 포함한다.
피루베이트:페레독신 산화환원효소(PFOR 또는 POR)(EC 1.2.7.1)는 하나의 분자(환원제, 또는 전자 공여체)로부터 다른 분자(산화제, 또는 전자 수용체)로의 전자의 전달을 촉진시키는 산화환원효소의 패밀리에 속하는 효소이다. 구체적으로, 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 피루베이트 및 아세틸-CoA:피루베이트 + CoA + 2 산화된 페레독신 ↔ 아세틸-CoA + CO2 + 2 환원된 페레독신 + 2 H+의 상호전환을 촉진시킨다. 아세틸-CoA의 피루베이트로의 전환은 독립영양체 CO(2) 고정의 우드-융달 경로를 환원적 트라이카복실산 회로에 연결시키며, 상기 환원적 트라이카복실산 회로는 독립영양 혐기성생물에서 모든 세포 거대분자의 생합성을 위한 단계이다(Furdi, J Biol Chem, 15: 28494-28499, 2000). 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 또한 피루베이트:페레독신 2-산화환원효소(CoA-아세틸화), 피루베이트 산화환원효소, 피루베이트 생성효소, 피루베이트 합성효소, 또는 피루브산-페레독신 산화환원효소로 알려져 있을 수 있다.
본 발명의 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 과발현된 내인성 효소, 돌연변이된 내인성 효소, 또는 외인성 효소일 수 있다. 유사하게, 본 발명의 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 과발현을 위하여 조작된 내인성 피루베이트:페레독신 산화환원효소 유전자에 의해 암호화될 수 있거나, 돌연변이된 내인성 피루베이트:페레독신 산화환원효소 유전자에 의해 암호화될 수 있거나, 또는 외인성 피루베이트:페레독신 산화환원효소 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 과발현된 내인성 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 예컨대 과발현된 내인성 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이 피루베이트:페레독신 산화환원효소이다. 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 종종 산소의 존재 하에서 불안정적이다. 바람직한 실시형태에서, 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 산소에 안정적이거나 또는 적어도 어느 정도 산소 무감성을 나타낸다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 외인성 데설포비브리오 아프리카누스(Desulfovibrio africanus) 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 또는 이로부터 유래된 효소이다. 데설포비브리오 아프리카누스 피루베이트:페레독신 산화환원효소의 발현은 이. 콜라이에서 입증된 바 있지만(Pieulle, J Bacteriol, 179: 5684-5692, 1997), 클로스트리듐 미생물에서는 입증되지 않았다.
아세토락테이트 합성효소(Als)(EC 2.2.1.6)는 분지쇄 아미노산, 예컨대 발린, 류신, 및 아이소류신의 합성에서 첫 번째 단계를 촉진시키는 효소이다. 특히, 아세토락테이트 합성효소는 이화성과 동화성 형태를 둘 다 가지는 케톤전달효소이며, 2개의 피루베이트 분자의 아세토락테이트 분자와 이산화탄소로의 전환을 촉진시킨다: 2 CH3COCOO- ↔ CH3COCOHCH3COO- + CO2. 아세토락테이트 합성효소는 또한 아세토하이드록시산 생성효소로 알려져 있을 수 있다.
본 발명의 아세토락테이트 합성효소는 과발현된 내인성 효소, 돌연변이된 내인성 효소, 또는 외인성 효소일 수 있다. 유사하게, 본 발명의 아세토락테이트 합성효소는 과발현을 위하여 조작된 내인성 아세토락테이트 합성효소 유전자에 의해 암호화될 수 있거나, 돌연변이된 내인성 아세토락테이트 합성효소 유전자에 의해 암호화될 수 있거나, 또는 외인성 아세토락테이트 합성효소 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 아세토락테이트 합성효소는 동화성 또는 이화성일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 아세토락테이트 합성효소는 과발현된 내인성 아세토락테이트 합성효소, 예컨대 과발현된 내인성 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이 아세토락테이트 합성효소이다. 특히, 아세토락테이트 합성효소는 과발현된 내인성 IlvB, ILvB ORF2059, IlvB ORF2336, IlvC, IlvN, IlvBN, 또는 AlsS 아세토락테이트 합성효소일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 아세토락테이트 합성효소는 돌연변이된 내인성 아세토락테이트 합성효소, 예컨대 임의의 내인성 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이 아세토락테이트 합성효소로부터 유래된 돌연변이된 아세토락테이트 합성효소이다. 특히, 돌연변이된 내인성 아세토락테이트 합성효소는 피드백-무감성 IlvN 아세토락테이트 합성효소일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 아세토락테이트 합성효소는 외인성 아세토락테이트 합성효소, 예컨대 바실러스 서브틸리스 아세토락테이트 합성, 특히 피드백-무감성 바실러스 서브틸리스 AlsS 아세토락테이트 합성효소이다. 바실러스 서브틸리스 AlsS의 발현은 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 종 균주 PCC 7942(Oliver, Metabol Eng, 22: 76-82, 2014)에서 나타났지만, 클로스트리듐 미생물에서는 나타나지 않았다.
아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5)는 탄소-탄소 결합을 절단하는, 분해효소, 구체적으로 카복시-분해효소의 패밀리에 속하는 효소이다. 아세토락테이트 탈카복실화효소는 (S)-2-하이드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트의 (R)-2-아세토인 및 CO2로의 반응, 즉 (S)-2-하이드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트 ↔ (R)-2-아세토인 + CO2를 촉진한다. 아세토락테이트 탈카복실화효소는 또한 알파-아세토락테이트 탈카복실화효소 또는 (S)-2-하이드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트 카복시-분해효소로 알려져 있을 수 있다.
본 발명의 아세토락테이트 탈카복실화효소 효소는 과발현된 내인성 효소, 돌연변이된 내인성 효소, 또는 외인성 효소일 수 있다. 유사하게, 본 발명의 아세토락테이트 탈카복실화효소는 과발현을 위하여 조작된 내인성 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자에 의해 암호화될 수 있거나, 돌연변이된 내인성 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자에 의해 암호화될 수 있거나, 또는 외인성 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 아세토락테이트 탈카복실화효소는 과발현된 내인성 아세토락테이트 탈카복실화효소, 예컨대 과발현된 내인성 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이 아세토락테이트 탈카복실화효소이다. 과발현된 내인성 아세토락테이트 탈카복실화효소는 BudA 아세토락테이트 탈카복실화효소 또는 AlsD 아세토락테이트 탈카복실화효소일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 아세토락테이트 탈카복실화효소는 외인성 아세토락테이트 탈카복실화효소, 예컨대 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 아세토락테이트 탈카복실화효소 또는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 아세토락테이트 탈카복실화효소이다. 바실러스 서브틸리스 AlsD의 발현은 시네코코커스 일롱게투스 종 균주 PCC 7942(Oliver, Metabol Eng, 22: 76-82, 2014)에서 나타났지만, 클로스트리듐 미생물에서는 나타나지 않았다.
피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및 아세토락테이트 탈수소효소는 하기 표의 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 유사하게, 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및 아세토락테이트 탈수소효소를 암호화하는 유전자는 하기 표의 핵산 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 게다가, 임의의 효소 또는 유전자는 하기 표의 서열의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 효소 또는 유전자는 하기 표의 서열과 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
Figure 112017053297895-pct00004
Figure 112017053297895-pct00005
본 발명의 재조합 박테리아는 또한 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및 아세토락테이트 탈카복실화효소의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 박테리아는 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 아세토락테이트 합성효소를 포함할 수 있지만, 아세토락테이트 탈카복실화효소를 포함할 수 없다. 박테리아는 피루베이트:페레독신 산화환원효소 및 아세토락테이트 탈카복실화효소를 포함할 수 있지만, 아세토락테이트 합성효소를 포함할 수 없다. 박테리아는 아세토락테이트 합성효소 및 아세토락테이트 탈카복실화효소를 포함할 수 있지만, 피루베이트:페레독신 산화환원효소를 포함할 수 없다. 마지막으로, 박테리아는 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및 아세토락테이트 탈카복실화효소 각각을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 박테리아는 알코올 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 알데하이드 탈수소효소(아실화)(EC 1.2.1.10), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), 알데하이드 페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.5), 인산아세틸기전달효소(EC 2.3.1.8), 아세트산키나제(EC 2.7.2.1), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2), 수소화효소(EC 1.12.7.2), 피루베이트:폼에이트 분해효소(EC 2.3.1.54), 2,3-뷰탄다이올 탈수소효소(EC 1.1.1.4), 일차:이차 알코올 탈수소효소(EC 1.1.1.1), 폼에이트 탈수소효소(EC 1.2.1.2), 폼일-THF 합성효소(EC 6.3.2.17), 메틸렌-THF 탈수소효소/폼일-THF 사이클로가수분해효소(EC:6.3.4.3), 메틸렌-THF 환원효소(EC 1.1,1.58), CO 탈수소효소/아세틸-CoA 생성효소(EC 2.3.1.169), CO 탈수소효소(EC 1.2.99.2), 및 수소화효소(EC 1.12.7.2) 중 1종 이상을 추가로 발현할 수 있거나 발현 또는 과발현하도록 조작될 수 있다.
"효소 보조인자" 또는 단순히 "보조인자"는 효소의 생물학적 기능을 촉진시키고 따라서 반응의 촉매작용을 촉진시키기 위해 효소에 결합하는 비단백질 화합물이다. 보조인자의 비제한적인 예는 NAD+, NADP+, 코발라민, 테트라하이드로폴레이트 및 페레독신을 포함한다. "니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드"(NADH)는 NAD+(산화된 형태), NADH + H+(환원된 형태) 또는 NAD+ 및 NADH + H+ 둘 다의 산화환원 쌍 중 어느 하나를 말한다. "니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산"(NADPH)은 NADP+(산화된 형태), NADPH + H+(환원된 형태) 또는 NADP+ 및 NADPH + H+ 둘 다의 산화환원 쌍 중 어느 하나를 말한다. 보조인자의 전반적인 이용가능성의 증가는 경로 반응의 속도를 증가시킬 수 있다. 보조인자의 생성에 영향을 미칠 수 있는 인자는 보조인자의 이용가능성의 증가를 달성하도록 변경될 수 있는 보조인자 생합성 유전자의 발현을 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 인자는 또한 보조인자의 이용가능성의 증가를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 보조인자의 이용가능성의 결여는 경로 반응에 대하여 속도 제한 효과를 가질 수 있다. 보조인자의 이용가능성의 결정 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 재조합 박테리아는 보조인자의 생합성에 관여되는 효소를 추가로 발현할 수 있거나 발현 또는 과발현하도록 조작될 수 있다. 특정 실시형태에서, 보조인자는 테트라하이드로폴레이트를 포함한다. 테트라하이드로폴레이트의 생합성에 관여되는 효소는 하기에 상세히 기술되어 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 재조합 미생물은 GTP 사이클로가수분해효소 I(EC 3.5.4.16), 알칼리포스파타제(EC 3.1.3.1), 다이하이드로네오프테린 알도라제(EC 4.1.2.25), 2-아미노-4-하이드록시-6-하이드록시메틸다이하이드로프테리딘 다이포스포키나제(EC 2.7.6.3), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(2.5.1.15), 다이하이드로프테로에이트 생성효소(EC 2.5.1.15), 다이하이드로폴레이트 생성효소(EC 6.3.2.12), 폴릴폴리글루타메이트 생성효소(6.3.2.17), 다이하이드로폴레이트 환원효소(EC 1.5.1.3), 티미딜레이트 생성효소(EC 2.1.1.45), 다이하이드로모나프테린 환원효소(EC 1.5.1.-)의 발현 증가를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 보조인자는 코발라민(B12)을 포함한다. 코발라민의 생합성에 관여되는 효소는 하기에 상세히 기술되어 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 재조합 미생물은 5-아미노레불리네이트 생성효소(EC 2.3.1.37), 5-아미노레불리네이트:피루베이트 아미노기전이효소(EC　2.6.1.43), 아데노실코빈아마이드 키나제/아데노실코빈아마이드-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제(EC 2.7.1.156/2.7.7.62), 아데노실코빈아마이드-GDP 리바졸레트랜스퍼라제(EC 2.7.8.26), 아데노실코빈아마이드-포스페이트 생성효소(EC 6.3.1.10), 아데노실코비릭산 생성효소(EC 6.3.5.10), 알파-리바졸 포스포타제(EC 3.1.3.73), 콥(I)알라민 아데노실트랜스퍼라제(EC 2.5.1.17), 콥(II)이리닉산 a,c-다이아마이드 환원효소(EC 1.16.8.1), 코발트-프레코린 5A 가수분해효소(EC 3.7.1.12), 코발트-프레코린-5B (C1)-메틸전달효소(EC 2.1.1.195), 코발트-프레코린-7 (C15)-메틸전달효소(EC 2.1.1.196), 코발토첼라타제 CobN(EC 6.6.1.2), 코비리닉산 a,c-다이아마이드 생성효소(EC 6.3.5.9/6.3.5.11), 페리틴(EC 1.16.3.1), 글루타메이트-1-세미알데하이드 2,1-아미노뮤타제(EC 5.4.3.8), 글루타밀-tRNA 환원효소(EC 1.2.1.70), 글루타밀-tRNA 합성효소(EC 6.1.1.17), 하이드록시메틸비란 생성효소(EC 2.5.1.61), 니코티네이트-뉴클레오타이드-다이메틸벤즈이미다졸 포스포리보실트랜스퍼라제(EC 2.4.2.21), 산소-독립성 코프로포르피리노겐 III 옥시다제(EC 1.3.99.22), 포르포빌리노겐 생성효소(EC 4.2.1.24), 프레코린-2 탈수소효소/시로하이드로클로린 페로첼라타제(EC 1.3.1.76/4.99.1.4), 프레코린-2/코발트-인자-2 C20-메틸전달효소(EC 2.1.1.130/2.1.1.151), 프레코린-3B 생성효소(EC 1.14.13.83), 프레코린-3B C17-메틸전달효소(EC 2.1.1.131), 프레코린-4 C11-메틸전달효소(EC 2.1.1.133), 프레코린-6X 환원효소(EC 1.3.1.54), 프레코린-6Y C5,15-메틸전달효소(EC 2.1.1.132), 프레코린-8W 탈카복실화효소(EC 1.-.-.-), 프레코린-8X 메틸뮤타제(EC 5.4.1.2), 시로하이드로클로린 코발토첼라타제(EC 4.99.1.3), 트레오닌-포스페이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.81), 우로포르피리노겐 탈카복실화효소(EC 4.1.1.37), 우로포르피리노겐 III 메틸전달효소/생성효소(EC 2.1.1.107/ 4.2.1.75)의 발현 증가를 나타낸다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 보조인자의 이용가능성의 증가는 상기 보조인자의 생합성 경로에 관여되는 효소 또는 유전자의 과발현을 통해 달성된다고 여겨진다. 결과적으로, 이러한 보조인자에 의존하는 반응은 더 이상 제한적이지 않다.
본 발명은 또한 CO를 포함하는 기질의 발효에 의한 1종 이상의 생성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 생성물은 에탄올, 뷰탄올, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 고급 알코올, 뷰탄다이올, 2,3-뷰탄다이올, 석시네이트, 아이소프레노이드, 지방산, 생체고분자, 및 이들의 혼합물 중 1종 이상이다.
일 실시형태에서, CO를 포함하는 기질은 CO를 포함하는 기체 기질이다. 일 실시형태에서, 기질은 전형적으로 대부분 CO, 예컨대 약 20 부피% 내지 약 100 부피% CO, 20 부피% 내지 70 부피%, 30 부피% 내지 60 부피%, 또는 40 부피% 내지 55 부피%를 함유할 것이다. 특정 실시형태에서, 기질은 약 25 부피%, 약 30 부피%, 약 35 부피%, 약 40 부피%, 약 45 부피%, 약 50 부피% CO, 약 55 부피% CO, 또는 약 60 부피% CO를 포함한다.
기질이 임의의 수소를 함유할 필요는 없지만, 수소의 존재는 본 발명의 방법에 따른 생성물 형성에 유해하지 않아야 한다. 특정 실시형태에서, 수소의 존재는 알코올 생성의 전반적인 효율의 개선을 초래한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 기질은 H2:CO를 대략 2:1, 또는 1:1, 또는 1:2의 비율로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 기질은 약 30 부피% 이하의 H2, 20 부피% 이하의 H2, 약 15 부피% 이하의 H2 또는 약 10 부피% 이하의 H2를 포함한다. 다른 실시형태에서, 기질 스트림은 낮은 농도의 H2, 예를 들어 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 H2를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 기질 스트림에는 실질적으로 수소가 없다. 기질은 또한 일부 CO2, 예를 들어 약 1 부피% 내지 약 80 부피% CO2, 또는 1 부피% 내지 약 30 부피% CO2를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 기질은 약 20 부피% 이하의 CO2를 포함한다. 특정 실시형태에서, 기질은 약 15 부피% 이하의 CO2, 약 10 부피% 이하의 CO2, 약 5 부피% 이하의 CO2를 포함하거나, 실질적으로 CO2를 포함하지 않는다.
본 발명의 실시형태는 "CO를 함유하는 기체 기질"을 전달 및 발효시키는 관점에서 기재된다. 그러나, 기체 기질은 대안적인 형태로 제공될 수 있음을 인식하여야 한다. 예를 들어, CO를 함유하는 기체 기질은 액체 중에 용해된 상태로 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 일산화탄소 함유 기체로 포화되고, 그 다음 상기 액체는 생물반응기에 첨가된다. 이는 표준 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예로서, 마이크로버블 분산액 생성기(microbubble dispersion generator)(Hensirisak, Appl Biochem Biotechnol, 101: 211-227, 2002)가 사용될 수 있었다. 추가의 예로서, CO를 함유하는 기체 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다. 이와 같은 대안적인 방법은 용어 "CO를 포함하는 기질" 등에 의해 포함된다.
기체 기질은 산업 공정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원으로부터, 예컨대 자동차 배기 가스 또는 바이오매스 가스화로부터 얻어지는 CO-함유 폐가스일 수 있다. 특정 실시형태에서, 산업 공정은 철 금속 제품 제조, 예컨대 제강 공장 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제 공정, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산, 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, CO-함유 기체는 임의의 편리한 방법을 사용하여, 대기로 방출되기 전에 산업 공정으로부터 포획될 수 있다. CO는 합성가스(일산화탄소 및 수소를 포함하는 기체)의 성분일 수 있다. 산업 공정으로부터 생성된 CO는 보통 연소되어 CO2를 생성하고, 따라서 본 발명은 CO2 온실 가스 배출을 감소시키고 바이오연료를 생성하는 데 있어서 특히 유용성을 가진다. 기체 CO-함유 기질의 조성에 따라서, 또한 이를 발효에 도입하기 전에 이를 처리하여 먼지 입자와 같은 임의의 원치 않는 불순물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 기체 기질은 공지된 방법을 사용하여 여과되거나 스크러빙될 수 있다.
전형적으로, 발효는 생물반응기에서 실행된다. 용어 "생물반응기"는 하나 이상의 용기 및/또는 탑(tower) 또는 배관 배열, 예컨대 연속 교반 탱크 반응기(continuous stirred tank reactor; CSTR), 고정화 세포 반응기(immobilized cell reactor; ICR), 삼상층 반응기(trickle bed reactor; TBR), 버블 칼럼, 기체 리프트 발효기, 정적 혼합기, 또는 기체-액체 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치로 이루어지는 발효 장치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 생물반응기 또는 발효 반응에 기질의 첨가를 언급할 때, 이는 적절한 경우 이들 반응기 중 하나 또는 둘 다에 대한 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발효", "발효 공정", "발효 반응" 등은 발효 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계를 둘 다 포괄한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 박테리아의 배양물은 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 영양소, 비타민, 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게, 수성 배양 배지는 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,173,429호, 미국 특허 제5,593,886호 및 WO 2002/008438에 기재되어 있다.
발효는 바람직하게 발효 생성물의 생성이 일어나기에 적절한 발효 조건 하에서 수행되어야 한다. 고려되어야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 기체 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종물 수준, 액체상 중 CO가 제한이 되지 않는 것을 보장하기 위한 최대 기체 기질 농도, 및 생성물 억제를 피하기 위한 최대 생성물 농도를 포함한다.
추가적으로, 기질 스트림의 CO 농도(또는 기체 기질 중 CO 분압)를 증가시키고 따라서 CO가 기질인 발효 반응의 효율을 증가시키는 것이 종종 바람직하다. 증가된 압력에서의 작동은 기체상으로부터 액체상(여기서, CO는 발효물의 생성을 위한 탄소 공급원으로서 미생물에 의해 사용될 수 있음)으로의 CO 전달 속도를 현저하게 증가시킬 수 있다. 이는 결국, 생물반응기가 대기압보다 고압에서 유지될 때, 체류 시간(생물반응기 중 액체 부피를 유입 기체 유속으로 나눈 값으로 정의됨)이 감소될 수 있음을 의미한다. 최적 반응 조건은 사용되는 본 발명의 특정 미생물에 부분적으로 의존할 것이다. 그러나, 일반적으로 발효는 주위 압력보다 더 높은 압력에서 실행되는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 CO 전환 속도가 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이고, 원하는 체류 시간을 달성하는 것은 결국 생물반응기의 필요한 부피를 나타내기 때문에, 가압 시스템의 사용은 필요한 생물반응기의 부피를 크게 감소시킬 수 있고, 결과적으로 발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. 미국 특허 제5,593,886호에 제공된 예에 따르면, 반응기 부피는 반응기 작동 압력의 증가에 비례하여 감소될 수 있으며, 즉 10 대기압에서 작동되는 생물반응기는 1 대기압에서 작동되는 생물반응기의 부피의 1/10만을 필요로 한다.
예로서, 고압에서 에탄올 발효로의 기체의 발효를 수행하는 것의 이점이 기재된 바 있다. 예를 들어, WO 2002/008438은 30 psig 및 75 psig의 압력 하에서 에탄올로의 기체 발효를 실행하여, 각각 150 g/ℓ/일 및 369 g/ℓ/일의 에탄올 생산성을 제공하는 것을 기재한다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지 및 유입 기체 조성물을 사용하여 실행한 예시적인 발효는 1일 1 리터 당 10 내지 20배 더 적은 에탄올을 생성하는 것으로 밝혀졌다.
또한, 생성물이 CO-제한 조건 하의 배양물에 의해 소비될 수 있으므로, CO-함유 기체 기질의 도입 속도는 액체상 중 CO의 농도가 제한되지 않는 것을 보장하기 위하여 제어되는 것이 바람직하다.
발효 반응을 공급하기 위해 사용되는 기체 스트림의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, O2는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전 또는 후에 발효 공정의 단계에서 원치않는 또는 불필요한 기체의 처리는 이와 같은 단계에 대한 부담을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 기체 스트림이 생물반응기에 들어가기 전에 압축되는 경우, 발효에서 필요하지 않은 기체를 압축하기 위해 불필요한 에너지가 사용될 수 있다. 따라서, 원치않는 성분을 제거하고 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위하여, 기질 스트림, 특히 산업 공급원으로부터 유래된 기질 스트림을 처리하는 것이 바람직할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하지만, 물론 어떠한 방법으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
본 실시예는 에탄올 및 2,3-뷰탄다이올의 생성에서 병목 현상에 대한 일산화탄소 영양 박테리아, 예컨대 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이의 발효 경로의 분석을 기재한다.
우드-륭달 경로와 에탄올 및 2,3-뷰탄다이올로의 발효 경로의 산화환원효소 단계를 분석하여 이들의 활성을 결정하였다. 산화환원효소 반응은 환원 또는 산화가 측정될 수 있는 1종 이상의 보조인자와 결합하기 때문에 특히 적합하다. 메틸비올로겐 또는 벤질비올로겐과 같은 합성 산화환원 염료가 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 이들 경로에 있어서 효소는 CO, CO2, 및 H2 기체의 흡수 및 이용을 포함한 독립영양 성장뿐만 아니라, 생성물 형성에도 관여한다.
분석된 효소와 이들 효소의 활성은 도 1에 상세히 나타내어져 있다. 모든 분석은 대조군으로서 합성 산화환원 염료인 메틸 비올로겐(MV) 또는 벤질 비올로겐(BV) 중 하나를 사용하여 실행하였다. 그 다음, 보조인자인 페레독신(Fd), NADH, 및 NADPH 또는 이들의 조합물을 시험하였다. 효소 분석은 CO 및 수소 상에서 독립영양으로 성장하는 발효물로부터의 조추출물을 사용하여 실행하였다.
클로스트리듐 오토에타노게눔을 이용한 발효를 37℃에서 유일한 에너지 및 탄소 공급원으로서 CO-함유 제강 공장 기체를 사용하여 1.5ℓ 생물반응기에서 수행하였다. 발효 배지는 리터 당 MgCl, CaCl2(0.5mM), KCl(2mM), H3PO4(5mM), Fe(100μM), Ni, Zn(5μM), Mn, B, W, Mo, 및 Se(2μM)를 함유하였다. 배지를 생물반응기로 옮기고 121℃에서 45분 동안 고압살균하였다. 고압살균 후, 배지에 티아민, 판토테네이트(0.05㎎) 및 바이오틴(0.02㎎)을 보충하고, 3　mM 시스테인-HCl을 이용하여 환원시켰다. 혐기성 조건을 달성하기 위하여, 0.2 ㎛ 필터를 통하여 반응기 용기에 질소를 살포하였다. 접종 전, 기체를 CO-함유 제강 공장 기체로 전환하고, 반응기에 연속적으로 공급하였다. 공급 기체 조성은 2% H2, 42% CO, 20% CO2, 및 36% N2이었다. 배양물의 pH는 5 내지 5.2로 유지하였다.
세포 수확시(발효 브로쓰 1ℓ 당 3.9 g 세포의 바이오매스), 기체 소비는 5 몰 CO L-1 일-1 및 10 밀리몰 H2 L-1 일-1이었으며, 이 때 다음과 같은 대사산물이 생성되었다: 14 g L-1 일-1 아세테이트 및 19.5 g L-1 일-1 에탄올. 배양물의 pH를 K2CO3를 이용하여 pH 6으로 조정하고, 반응기를 얼음물 조(bath)에서 냉각시켰다. 대략 1.2ℓ의 배양물을 얼음 상에서 수집하였다. 배양물을 2개의 1ℓ 원심분리기 병으로 나누고(이 단계와 모든 후속 단계는 혐기성 챔버에서 수행하여 산소결핍 조건을 보장함으로써 효소의 불활성화를 피함), 5000 rpm에서 10분 동안 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 따라 내고, 잔여 액체를 제거하였다. 각각의 펠릿을 10mM DTT를 포함하는 대략 30㎖의 50mM KPO4(pH 7.0) 중에 재현탁하였다. 재현탁액을 미리 칭량한 50㎖의 팔콘(Falcon) 튜브로 옮기고, 최대 속도(5000 g)에서 15분 동안 세포를 재펠릿화하였다. 튜브를 혐기성 챔버에서 꺼내고 분석 전에 즉시 액체 N2 상에서 동결시켰다.
산소결핍 조건 하에서 연속 반응기로부터 세포를 수확하였다. 프렌치프레스를 3회 통과시킴으로써 세포를 파쇄하였다. 파괴되지 않은 세포 및 세포 파편을 20,000 × g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액을 효소 분석에 사용하였다. 지시된 경우를 제외하고, 모든 분석은 1.2 x 105 Pa에서 0.8㎖의 반응 혼합물과 0.7㎖의 N2 또는 H2 또는 CO로 채워진, 고무 마개로 밀봉된 1.5㎖의 혐기성 큐벳에서 37℃에서 수행하였다. 하기 기재한 바와 같이 또는 문헌[Huang, J Bacteriol, 194: 3689-3699, 2012]에 의해 효소를 분석하였다. 효소와의 반응이 시작된 후, NAD(P)+ 또는 NAD+의 환원을 340㎚(ε = 6.2 mM-1 ㎝-1)에서 또는 380㎚(ε = 1.2 mM-1 ㎝-1)에서, 클로스트리듐 파스테우리아눔(C. pasteurianum) 페레독신 환원을 430㎚(εΔ산화-환원 13.1 mM-1 ㎝-1)에서, 메틸 비올로겐 환원을 578㎚(ε = 9.8 mM-1 ㎝-1)에서, 그리고 벤질 비올로겐 환원을 578㎚(ε = 8.6 mM-1 ㎝-1)에서 분광광도법으로 모니터링하였다.
CO 탈수소효소를 100mM 트리스(Tris)/HCl(pH 7.5), 2mM DTT 및 약 30μM 페레독신 및/또는 1mM NAD+ 또는 1mM NADP+를 함유하는 분석 혼합물을 사용하여 측정하였다. 기체상은 100% CO였다.
수소화효소 활성을 100mM 트리스/HCl(pH 7.5) 또는 100mM 인산칼륨, 2mM DTT, 및 25μM 페레독신 및/또는 1mM NADP+ 및/또는 10mM 메틸 비올로겐의 분석 혼합물을 사용하여 측정하였다. 기체상은 100% H2였다.
H2를 이용한 CO2의 폼에이트로의 환원에 대한 폼에이트-수소 분해효소 활성을 100mM 인산칼륨, 2mM DTT, 및 30mM[14C]K2CO3(24,000 dpm/μ㏖)을 함유하는 분석 혼합물을 이용하여 측정하였다. 기체상은 100% H2였다. 혈청 병을 200 rpm에서 연속적으로 진탕하여 기체상과 액체상의 평형을 보장하였다. 효소와의 반응 시작 후, 100㎕의 액체 샘플을 1.5분 간격으로 꺼내어 100㎕의 150mM 아세트산이 들어있는 1.5㎖의 세이프씨일 마이크로튜브에 첨가하여 반응을 산성화에 의해 중지시켰다. 그 다음, 200㎕의 혼합물을 써모믹서(Thermomixer)에서 1,400 rpm으로 진탕하면서 40℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 14C-폼에이트가 형성된 이후 남은 14CO2를 전부 제거하였다. 후속적으로, 100㎕의 혼합물을 5㎖의 퀵세이브(Quicksave) A 신틸레이션 유체(진저 어낼리틱(Zinsser Analytic), 독일 프랑크푸르트 소재)에 첨가하고, 베크만(Beckman) LS6500 액체 신틸레이션 계수기(미국 캘리포니아주 풀러턴 소재)에서 14C 방사능에 대하여 분석하였다.
폼에이트 탈수소효소 측정은 100mM 트리스/HCl(pH 7.5) 또는 100mM 인산칼륨, 2mM DTT, 20mM 폼에이트, 및 지시된 경우 25μM 페레독신, 1mM NADP+, 1mM NAD+ 및/또는 10mM 메틸 비올로겐을 함유하는 분석 혼합물을 이용하여 수행하였다. 기체상은 100% N2였다.
메틸렌-H4F 탈수소효소는 100mM MOPS/KOH(pH 6.5), 50mM 2-머캅토에탄올, 0.4mM 테트라하이드로폴레이트, 10mM 폼알데하이드 및 0.5mM NADP+ 또는 0.5mM NAD+를 함유하는 분석 혼합물을 사용하여 측정하였다. 기체상은 100% N2였다.
메틸렌-H4F 환원효소는 하기 조건 하에서 분석하였다. 분석 혼합물은 100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 20mM 아스코베이트, 10μM FAD, 20mM 벤질 비올로겐 및 1mM 메틸-H4F를 함유하였다. 효소와의 반응이 시작되기 전, 벤질 비올로겐은 다이싸이온산나트륨을 이용하여 △A555이 0.3이 되도록 환원시켰다.
알데하이드:페레독신 산화환원효소는 100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 2mM DTT, 1.1mM 아세트알데하이드, 및 약 25μM 페레독신을 함유하는 혼합물을 사용하여 분석하였다. 기체상은 100% N2였다.
CoA 아세틸화 아세트알데하이드 탈수소효소는 100mM 트리스/HCl(pH 7.5), 2mM DTT, 1.1mM 아세트알데하이드, 1mM 조효소 A, 및 1mM NADP+ 또는 1mM NAD+를 함유하는 혼합물을 사용하여 측정하였다. 기체상은 100% N2였다.
알코올 및 뷰탄다이올 탈수소효소는 100mM 인산칼륨(pH 6), 2mM DTT, 각각 1.1mM 아세트알데하이드 또는 아세토인, 및 1mM NADPH 또는 1mM NADH를 이용하는 분석법으로 측정하였다. 기체상은 100% N2였다.
페레독신은 문헌[
Figure 112017053297895-pct00006
, FEBS Lett, 89: 219-222, 1978]에 기재된 바와 같이 클로스트리듐 파스테우리아눔으로부터 정제하였다.
본 발명자들이 아직 알려지지 않은 결합 부위를 필요로 하는 것으로 여기는 메틸렌-THF 환원효소를 제외하고, 일산화탄소영양 박테리아 클로스트리듐 오토에타노게눔의 에탄올 및 2,3-뷰탄올로의 경로에서 모든 산화환원효소 반응을 분석하고 성공적으로 검출하였다(
Figure 112017053297895-pct00007
, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010; Poehlein, PLoS One, 7: e33439, 2012). 이 효소의 활성은 이전에 다른 유기체에서 검출될 수 없었다. 결과는 도 1 및 도 2에 제공되어 있다. 이 데이터는 발효 공정 동안 전형적으로 일어날 이들 경로에서 병목 현상을 분석하고 결정하기 위해 사용되었다.
실시예 2
본 실시예는 발효 경로를 통한 플럭스 증가를 설명한다.
PCT/US2014/041188의 실시예 3에 기재된 일반적인 방법이 또한 본 발명의 재조합 클로스트리듐 미생물로 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및/또는 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 3
본 실시예는 2,3-뷰탄다이올의 생성에서 병목 현상으로서 피루베이트:페레독신 산화환원효소에 의한 아세틸 CoA의 피루베이트로의 전환을 확인한다.
도 2에 보여진 바와 같이, 2,3-뷰탄다이올에 대한 병목 현상은 피루베이트:페레독신 산화환원효소에 의해 촉진되는 아세틸 CoA로부터 피루베이트로의 반응이다. 다른 측정된 모든 반응은 적어도 1.1 U/㎎의 활성을 나타내었지만, 이 속도 제한 반응은 페레독신의 존재 하에서 단지 0.11 U/㎎(10%)의 효소 활성을 나타내었다. 이는 경로에서 다른 모든 반응보다 90% 작다. 이러한 병목 현상을 극복하기 위해 적어도 어떤 방법으로든 진행하고 발효로부터 생성 수율을 증가시키기 위하여, 내인성 피루베이트:페레독신 산화환원효소가 과발현될 수 있거나 외인성 피루베이트:페레독신 산화환원효소가 도입되어 발현될 수 있다.
실시예 4
본 실시예는 병목 현상을 제거함으로써 2,3-뷰탄다이올 생성 경로를 통한 플럭스 증가를 설명한다.
아세틸-CoA의 피루베이트로의 전환을 촉진하는 반응은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이, 또는 클로스트리듐 라그스달레이에서의 2,3-뷰탄다이올 형성에 있어서 속도 제한 반응인 것으로 도 2에서 확인되었다. 이는 클로스트리듐 오토에타노게눔에서 피루베이트:페레독신 산화환원효소를 암호화하는 유전자를 과발현시킴으로써 극복될 수 있다.
상기 유전자는 발현에 의한 문제를 최소화하고 원치않는 통합 현상을 방지하기 위해 천연 유전자에 대한 상동성을 감소시키도록 설계되었다. 상기 유전자에는 pMTL83155로의 서브클로닝을 위한 제한 효소 절단 부위, 즉 XbaI(3'-말단) 및 NheI(5'-말단)이 측접한다. 합성된 구조물과 pMTL83155는 XbaI 및 NheI(퍼멘타스(Fermentas))로 분해하고, PFOR 유전자는 T4 DNA 연결효소(퍼멘타스)를 이용하여 pMTL83155로 결찰시킨다. 결찰 혼합물을 이. 콜라이 톱10(TOP10)(인비트로겐(Invitrogen), 라이프테크놀로지스(LifeTechnologies))을 형질전환시키기 위해 사용하고, 원하는 플라스미드를 포함하는 콜로니를 플라스미드 미니프렙(자이모 리서치(Zymo Research)) 및 제한 효소 분해(퍼멘타스)에 의해 확인한다. 원하는 플라스미드는 클로스트리듐 오토에타노게눔에서 메틸화되고 형질전환된다. 성공적인 형질전환체는 티암페니콜 내성, 및 플라스미드가 존재할 경우 1584개의 염기쌍 생성물을 생성할 프라이머 repHF 및 CatR을 이용한 PCR 분석에 의해 확인된다.
원하는 플라스미드를 포함하는 것으로 확인된 형질전환체를 공장 기체의 존재 하에서 PETC-MES 배지가 들어있는 혈청 병에서 성장시키고, HPLC 분석에 의해 측정한 이들 형질전환체의 대사산물 생성을 플라스미드를 포함하지 않는 모 미생물의 대사산물 생성과 비교한다. 형질전환된 균주에서 피루베이트:페레독신 산화환원효소 활성을 또한 조 추출물에서 측정하여 모 균주에서 관찰된 병목 현상이 완화되었음을 확인한다. 피루베이트:페레독신 산화환원효소의 과발현은 세포 내에서 전반적인 활성을 증가시켜, 경로에서의 병목 현상을 완화시키며, 피루베이트를 통한 플럭스의 증가 및 2,3-뷰탄다이올 생성에서의 증가를 초래한다.
실시예 5
본 실시예는 천연 이화성 아세토락테이트 합성효소의 과발현을 통한 피루베이트로부터 2-하이드록시-2-메틸-3-케토부티레이트(아세토락테이트)로의 플럭스 증가를 설명한다.
클로스트리듐 오토에타노게눔의 천연 이화성 아세토락테이트 합성효소 유전자(alsS)를 pMTL83155의 NdeI 및 NheI 부위로 클로닝하여(WO 2013/185123) 과발현 플라스미드를 생성하고, 인산아세틸기전달효소-아세트산키나제 오페론의 프로모터 영역의 제어 하에서 alsS를 발현시킨다.
과발현 플라스미드는 또 다른 미생물 유래의 이화성 아세토락테이트 합성효소, 천연 동화성 아세토락테이트 합성효소, 또는 또 다른 미생물 유래의 동화성 아세토락테이트 합성효소를 사용하여 유사하게 생성될 수 있다.
또 다른 미생물 유래의 이화성 아세토락테이트 합성효소 또는 또 다른 미생물 유래의 동화성 아세토락테이트 합성효소 중 하나의 사용은 피루베이트에 대하여 더 높은 친화성 및 더 빠른 반응 속도를 가질 수 있다. 또 다른 미생물 유래의 동화성 아세토락테이트 합성효소는 피드백 억제에 무감각한 것으로 확인된 효소일 수 있다. 피드백 억제에 무감각한 동화성 아세토락테이트 합성효소 돌연변이체의 작은 서브유닛이 또한 과발현될 수 있다.
과발현 플라스미드를 클로스트리듐 오토에타노게눔에 도입한다. 이는 피루베이트로부터 아세토락테이트로의 플럭스를 증가시키도록 적합화된 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주를 초래한다.
실시예 6
본 실시예는 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및/또는 아세토락테이트 탈카복실화효소의 과발현에 대한 대사 공학 접근법을 기재한다.
2,3-뷰탄다이올 생성을 증대시키기 위하여, 2,3-뷰탄다이올의 전구체 분자인 피루베이트의 풀을 증가시켰다. 첫 번째 표적은, 아세틸-CoA에서 피루베이트로의 전환을 촉진시키는 PFOR 효소를 암호화하는 PFOR 유전자이다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 게놈에서, PFOR 유전자의 2개의 복사체가 존재한다. PFOR 유전자(CAETHG 0928)는 구성적으로 높은 수준으로 발현되는 반면, 다른 유전자(CAETHG 3029)는 배치 배양물에서 성장 종료시에만 상향 조절되는 것으로 알려져 있다(
Figure 112017053297895-pct00008
, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011). 따라서, 고도로 발현되는 PFOR 유전자를 과발현되도록 선택하였다.
2개의 피루베이트 분자를 연결하여 α-아세토락테이트를 형성하는 아세토락테이트 합성효소는 클로스트리듐 오토에타노게눔 및 밀접하게 관련된 미생물에서 3가지 상이한 유전자에 의해 암호화된 3가지 형태, 즉 1가지 이화성 아세토락테이트 합성효소 및 2가지 형태의 동화성 아세토락테이트 합성효소로 존재하는 것으로 제안된다(
Figure 112022089822399-pct00009
, PNAS USA, 107: 13087-13092, 2010;
Figure 112022089822399-pct00010
, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011). alsS 유전자(CAETHG 1740)는 이화성 아세토락테이트 합성효소를 암호화하고 2,3-뷰탄다이올의 형성에 관여하는 것으로 예측된다. 2가지 유전자 ilvBN(CAETHG 0406) 및 ilvH(CAETHG 0124)는 분지쇄 아미노산의 형성에 관여할 가능성이 있는 동화성 아세토락테이트 합성효소를 암호화하는 것으로 예측된다.
α-아세토락테이트는 alsD 유전자(CAETHG 2932)에 의해 암호화된 아세토락테이트 탈카복실화효소의 활성을 통해 아세토인으로 탈카복실화된다. 다른 미생물에서, alsD 유전자 전사체 수준 및 효소 활성은 세포에 존재하는 분지쇄 아미노산의 농도에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다. 클로스트리듐 오토에타노게눔의 분지쇄 아미노산이 alsD 유전자 또는 상응하는 효소의 활성의 어떠한 피드백 억제를 생성하는지는 아직 알려져 있지 않다.
2,3-뷰탄다이올 탈수소효소(EC 1.1.1.4)의 작용에 의한 아세토인으로부터 2,3-뷰탄다이올로의 환원 단계는 속도 제한 단계가 아니다. 이는 클로스트리듐 오토에타노게눔의 배치 및 연속적 배양물에서 발효 배지에 아세토인의 첨가에 의해 입증되었다. 배치 배양물에서, 40 g/ℓ 이하의 아세토인을 첨가하고 24시간 인큐베이션 후 정량적으로 2,3-뷰탄다이올로 전환시켰다. 실제로, 추정된 2,3-뷰탄다이올 탈수소효소 유전자는 배치 배양물에서 성장 및 정지상 둘 다 동안 구성적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다(
Figure 112017053297895-pct00011
, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011). 또한, 클로스트리듐 오토에타노게눔은, 또한 아세토인 및 다른 케톤을 2,3-뷰탄다이올 및 다른 이차 알코올로 환원시키는 염격하게 NADPH-의존성인 일차-이차 알코올 탈수소효소를 포함하는 것으로 나타났다(
Figure 112017053297895-pct00012
, Catalyst Rev, 27: 7-12, 2014).
3가지 천연 유전자, 즉 PFOR, alsS, 및 alsD는 개별적으로 그리고 alsS-alsD의 조합으로 그리고 3가지 모든 유전자의 조합으로 과발현되었다. 클로스트리듐 오토에타노게눔으로 유전자를 도입하기 위해, 선택 마커로서 항생제 내성 유전자를 보유하는 재조합 플라스미드에 상기 유전자를 클로닝하였다. 이러한 이유로, 실험의 이러한 세트에 대한 대조군 균주는 항생제 내성 유전자는 가지지만 어떠한 활성 2,3-뷰탄다이올 유전자 삽입은 없는 플라스미드를 보유하여서, 항생제 스트레스에 노출시키고 과발현 균주 성능과 비교할 수 있었다. 과발현의 중요한 양태는 삽입된 유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 선택이다. 이 연구에서, 페레독신 유전자 프로모터(Pfdx)가 클로스트리디아에서 가장 강력한 프로모터 중 하나로 알려져 있기 때문에, 페레독신 유전자 프로모터(Pfdx)를 선택하였다. 또한, 게놈의 천연 유전자와 플라스미드에 존재하는 유전자 사이의 상동성 재조합을 피하기 위하여, DNA 합성 회사(진아트(GeneArt))의 독점 최적화 공정(진옵티마이저(GeneOptimizer))에 따라서 추가된 유전자의 DNA 서열을 변경하였다.
4가지 이종 유전자를 또한 표적으로 삼았다. 데설포비브리오 아프리카누스로부터 단리된 PFOR 유전자는 상업적 혐기성 미생물 발효에서 유리할 수 있는 산소의 존재 하에 매우 안정적인 PFOR 효소를 생성하는 것으로 나타났다(Pieulle, J Bacteriol, 179: 5684-5692, 1997). 바실러스 서브틸리스로부터 단리된 alsS 유전자 및 류코노스톡 락티스 및 아에로모나스 하이드로필라로부터 단리된 2가지 이종성 alsD 유전자도 또한 시험하였다. 다수의 이종성 숙주에서 2,3-뷰탄다이올 경로를 구성하기 위해 바실러스 서브틸리스로부터 단리된 alsS 유전자를 사용하였다(Ng, Microb Cell Factories, 11: 68, 2012; Oliver, PNAS, 110: 1249-1254, 2013). 아에로모나스 하이드로필라로부터 단리된 alsD은 최근 연구에서 다른 미생물로부터 단리된 몇몇 다른 이종성 alsD 중에서 가장 높은 효소 활성을 갖는 것으로 나타났다(Oliver, PNAS, 110: 1249-1254, 2013). 이러한 특성은 유전자 조작 실험에 대하여 이들 유전자를 이상적인 후보자로 만든다.
실시예 7
본 실시예는 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 아세토락테이트 합성효소, 및/또는 아세토락테이트 탈카복실화효소를 과발현하는 균주의 클로닝, 컨쥬게이션, 및 특성 규명을 기재한다.
클로스트리듐 오토에타노게눔 균주 LZ1561(DSM23693)을 본 연구에서 사용하였다. 2가지의 이. 콜라이 공여 균주를 유전자 조작을 위한 도구로서 사용하였는데; 톱 10(인비트로겐) 균주를 플라스미드 클로닝에 사용하였고 CA434 균주를 클로스트리듐 오토에타노게눔과의 컨쥬게이션에 사용하였다.
클로스트리듐-이. 콜라이 셔틀 플라스미드 시리즈 pMTL83159(4600개 염기쌍)를 선택하여 PFOR, alsS, 및 alsD 유전자를 과발현하였다(Heap, J Microbiol Meth, 78: 79-85, 2009). 그람-양성 레플리콘, 그람 음성 레플리콘, traJ 유전자, 항생제 내성 유전자, lacZ 알파 암호화 서열 내에 위치한 다중 클로닝 부위, 및 페레독신 유전자 프로모터(Pfdx)를 포함하도록 플라스미드를 설계하였다. 그람-양성 레플리콘(repH 유전자)은 클로스트리듐 부틸리쿰(C. butylicum) pCB102 플라스미드로부터 유래하였다. 이. 콜라이에서 플라스미드를 클로닝하기 위하여, 그람-음성 레플리콘 ColE1이 선택되었는데 그가 생성하는 플라스미드의 높은 복제 수 때문이다. traJ 또는 전달 유전자는 유전자 물질이 공여균과 수용균 사이에서 전달될 수 있게 한다. 클로람페니콜/티암페니콜 내성을 암호화하는 catP 유전자는 선택 마커였다.
3가지 유전자, 즉 PFOR, alsS, 및 alsD를 DNA 합성 회사(진아트)에 의해 합성하였다. pMTL83159 플라스미드로 이들을 클로닝하기 위하여, 제한 효소 인식 서열 및 리보솜 결합 부위 서열의 쌍을 각각의 유전자 서열에 추가하고 유전자와 함께 합성하였다. 상기 유전자를 보유하는 원래의 플라스미드를 이. 콜라이 톱 10 균주로 먼저 형질전환시켰다. 지피(ZYPPY)(상표명) 플라스미드 미니프렙 키트(자이모 리서치)를 플라스미드를 추출하기 위해 사용하였다. 원래의 플라스미드로부터 pMTL83159 플라스미드로 표적화된 유전자를 전달하기 위해, 플라스미드 둘 다를 동일한 쌍의 제한 효소로 절단하였다. 분해된 DNA를 75 볼트에서 1 시간 동안 실행한 0.6% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 플라스미드 pMTL83159(벡터) 및 각각의 유전자의 DNA 서열(삽입물)을 겔로부터 회수한 다음, 이들을 T4 DNA 연결효소(인비트로겐)를 사용함으로써 함께 결찰하였다. 그 다음, 결찰된 플라스미드를 이. 콜라이 톱10 배양물로 형질전환시켰다. 추출된 플라스미드가 삽입물을 포함하는 것을 보장하기 위하여, 1㎕의 플라스미드를 적절한 제한 효소를 이용하여 분해한 다음, 분해된 플라스미드를 0.8% 아가로스 겔 상에서 겔 전기용동에 의해 분리하였다.
플라스미드를 이. 콜라이 CA434 공여균으로 형질전환시킨 다음, 클로스트리듐 오토에타노게눔과 컨쥬게이션시켰다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 형질전환체에서 표적화된 플라스미드의 존재를 확인하기 위하여, 혈청 병에서의 배양물로부터 취한 샘플을 사용하여 PCR을 실행하였다.
모든 유전자 과발현 및 유전자 파쇄 균주의 초기 특성 규명은 1ℓ의 쇼트 보틀에서 우선 실행하여 어떤 균주가 가장 높은 농도의 2,3-뷰탄다이올을 생성하는지를 스크리닝하였다. 그 다음, 이들 균주를 CSTR 연속 배양물에서 추가로 시험하였으며, 이는 발효 매개변수의 정확한 제어가 가능하게 하여 대사산물 및 바이오매스 선택성을 계산할 수 있다.
과발현 실험의 목적은 2,3-뷰탄다이올 경로에서 개별적으로 그리고 2가지 및 3가지 유전자의 조합으로 3가지 천연 유전자를 과발현시키는 것이었다.
Figure 112017053297895-pct00013
쇼트 보틀 실험에서, OD, 배지 중 대사산물 농도, 배지의 pH 및 헤드스페이스 압력을 매일 샘플을 분석함으로써 8일 동안 모니터링하였다. 이 시점에서 더 이상의 성장 또는 상당한 대사 활성은 관찰되지 않았으며, 모든 배양물의 pH는 3.8 내지 4로 떨어졌고, 더 이상의 기체 소비도 측정되지 않았다. 5가지 균주의 성장 및 대사산물 프로파일 대 시간의 그래프 표현은 도 5에 나타내어져 있다. 쇼트 보틀 데이터 이용가능성을 가지는 5가지 모든 균주는 인큐베이션의 처음 2일 동안 빠르게 성장하였다. 그 후, 성장률은 현저하게 감소하였고, 그 다음 4일 째에 중단되었다. 최대 광학 밀도 값은 대략 0.75였다. 바이오매스와 유사하게, 아세트산 농도는 모든 배양물에서 처음 2일 동안 가파르게 증가하였다. 제3일에서 제4일 사이에, 대사산물 농도에서 더 이상의 변화가 관찰되지 않았기 때문에, 플라스미드 대조군 및 alsS 과발현 균주는 모든 대사산물 활성을 중단시킨 것으로 보였다. 다른 3가지 균주는 실험이 끝날 때까지 활성을 나타내었다.
아세테이트에서 에탄올로의 전환(AOR 활성)은 성장이 둔화된 후 3가지 균주에서 여전히 관찰될 수 있었다. 아세테이트에서 가장 주목할만한 하락이 alsD 과발현 균주에서 관찰되었으며, 결과적으로 약 7 g/ℓ의 가장 높은 에탄올 농도가 이 균주에 의해 도달되었다. 2가지 균주, 즉 alsD 및 조합한 alsS - alsD 과발현 균주는 다른 균주보다 더 많은 양의 2,3-뷰탄다이올을 생성하여, 활성 성장 단계 동안 대부분의 2,3-뷰탄다이올을 생성하였다. 그 후, 제4일로부터 정지상 동안 제8일에 실험 종료시까지 더 느린 속도로 2,3-뷰탄다이올을 계속 생성하였다. PFOR 과발현 균주는 플라스미드 대조군 균주보다 더 높은 농도까지 2,3-뷰탄다이올을 생성한 다른 균주였다. 처음 2가지 균주와 대조적으로, PFOR 과발현 균주는 정지상의 개시 동안 대부분의 2,3-뷰탄다이올을 생성하기 시작했다. 생성 속도는 정지상 동안 다른 2가지 균주의 속도와 유사하였다.
alsS 유전자의 과발현만으로는 2,3-뷰탄다이올의 양을 증가시키지 않는 것으로 보였다. 이 결과는, 관찰된 2,3-뷰탄다이올 증가가 주로 alsD 유전자의 과발현과 연관된 것임을 시사한다. alsS 및 alsD 유전자 둘 다의 과발현은 단지 alsD 유전자만을 과발현시키는 것보다 약간 더 높은 2,3-뷰탄다이올 농도를 초래하였다. alsS의 긍정적인 추가 효과가 있을 수 있었다. PFOR 유전자의 과발현은 더 이상의 성장이 관찰되지 않는 정지상 동안 더 높은 2,3-뷰탄다이올 생성에 기여한 것으로 보였다. 이러한 모든 긍정적인 결과 및 해로운 효과가 이들 균주에서 관찰되지 않았다는 사실로 인하여, 3가지 모든 유전자를 보유하는 과발현 균주를 CSTR의 연속 배양으로 추가로 시험하였다.
CO-함유 기체 기질을 사용하여 미생물의 모든 잠재력을 탐구하기 위해, 3가지 모든 천연 유전자 및 플라스미드 대조군 균주를 보유하는 과발현 균주는 CSTR-기반 연속 배양물에서 추가로 특성 규명되었다. 염기(5 M NH4OH-용액)를 첨가함으로써 전체 발효 동안 배지 pH를 제어하여 산 생성을 보상하고 배지 질소 수준을 보충하였다. 교반된 발효 브로쓰를 통해 CO-함유 기체 혼합물을 살포함으로써 기질을 연속적으로 공급하였다. 신선한 유입 기체 및 사용된 유출 기체의 기체 조성은 기체 크로마토그래피에 의해 매시간 모니터링하였다. 유입 및 유출 기체 사이의 기체 조성의 차이, 유입 기체의 유속, 및 발효물의 액체 부피를 기반으로; 샘플링시 기체 이용률 및 생성물 합성 속도를 계산하였다. 값은 ㏖/ℓ/d로 표현된다.
OD 및 대사산물 농도를 하루 3회 측정하고 희석율 및 비성장률을 매일 측정하고 계산하여 각각의 대사산물의 생산성을 결정하였다. CO 소비, CO2 생성, 및 대사산물 생산성을 사용하여 각각의 대사산물의 생성물 선택성을 계산하였다. 4 ㏖/ℓ/d 및 8 ㏖/ℓ/d의 CO 흡수율을 확립하여 생성물 선택성이 부피 생산성에 의존하는 여부를 결정하였다. 4 ㏖/ℓ/d의 CO 흡수율에서, 시스템의 희석율을 1 d-1에서 그리고 비성장률을 0.5 d-1로 유지하였다. 8 ㏖/ℓ/d의 더 높은 CO 흡수율 및 상응하는 더 높은 대사산물 생성율에서, 배양물의 희석율을 1.7 d-1로 증가시켜 4 ㏖/ℓ/d 실험에서와 유사한 범위로 대사산물 농도를 낮추었다. 비성장률을 또한 0.75 d-1로 증가시켰다.
조합된 PFOR, alsS, 및 alsD 과발현 균주 및 플라스미드 대조군 균주의 대사산물 및 기체 프로파일을 20일 동안 4 ㏖/ℓ/d CO 흡수에서 모니터링하였다(도 6). 각각의 균주의 접종물의 준비가 규칙적인 간격으로 몇 차례 혈청 병 하위배양을 통해 잘 진행되었지만, CSTR 배양물은 5일의 비정상적이고 거의 동일한 긴 유도기를 나타내었다. 약 제5.5일에, CSTR 배양물 둘 다 정상적인 기하급수적 성장을 시작하였다(서로 몇 시간 내).
배양물 둘 다에서 긴 유도기 및 제8일 내지 제10일 사이의 과발현 균주의 성장 패턴의 변동에도 불구하고, 배양물 둘 다 10일 동안 4 ㏖/ℓ/d의 안정적인 기체 흡수로 유지되었다. 1 d-1의 희석율과 0.5 d-1의 비성장률로, 발효조에서 95%의 박테리아 부하율을 대체하는 데 약 6일이 걸린다. 이 기간 동안 측정된 일정한 기체 흡수율에 의해, 가장 나중의 값을 분석에 사용하였다. 최종 결과는 과발현 균주가 플라스미드 대조군 균주에 비하여 더 높은 2,3-뷰탄다이올 수준을 지속적으로 생성하였다는 것을 나타내었다.
과발현 배양물의 대사산물과 기체 프로파일은 11일 동안 8 ㏖/ℓ/d CO 흡수율로 모니터링하였다(도 7). 배양물을 4 ㏖/ℓ/d CO 흡수 배양물로부터 접종하였다. 이 배양물에서 어떠한 유도기도 관찰되지 않았고, 기하급수적 성장 동안 적절한 특이적 CO 공급 및 희석율을 적용하여 최적의 성장 조건 하에서 배양물을 유지하였다. 그러므로, 아세트산의 안정적인 생성이 인큐베이션 3일 후에 도달한 한편, 다른 대사산물은 계속 축적되었다. CO 흡수의 목표는 4 ㏖/ℓ/d로부터 8 ㏖/ℓ/d로 2배로 되었다.
생성 억제를 피하기 위하여, 배양물의 전반적인 희석률을 1 d- 1으로부터 1.7 d-1로 증가시켰고, 비성장률을 비례적으로 증가시켰다. 7일 후 대사산물 농도를 서서히 증가시키고 안정적인 생성 속도에 도달하였다. 수소 흡수 및 CO 흡수 둘 다 6일 동안 안정적인 방식으로 유지하여, 과발현 균주의 발효가 장기간 동안 안정적으로 작동될 잠재성을 가지고 있음을 나타내었다.
액체 생성물 중에서, 에탄올을 가장 높은 비율로 생성하고, 그 다음 아세테이트를 생성하였다. 특이적인 CO 공급 전략은 발효가 장기간 동안 안정적으로 작동할 수 있도록 에탄올에 대한 아세테이트의 특정 비율을 유지하는 것을 목표로 하였다. LZ1561 균주 및 플라스미드 대조군은 유사한 2,3-뷰탄다이올 및 바이오매스 프로파일을 나타내었다. 바이오매스에 대한 2,3-뷰탄다이올 생성 비율은 이들 배양물에서 1.26 내지 1.47이었다. 그러나, 과발현 균주에서, 이 비율은 4 ㏖/ℓ/d CO 흡수에서 2.45이었고, 8 ㏖/ℓ/d CO 흡수 배양물에서 2.24이었다.
Figure 112017053297895-pct00014
과발현, 대조군 및 LZ1561 균주에 있어서 2,3-뷰탄다이올, 바이오매스, 에탄올 및 아세테이트에 대한 생성물 선택성은 4 ㏖/ℓ/d 및 8 ㏖/ℓ/d의 기체 흡수에서 측정하였다. 최적화된 발효 매개변수를 이용하여 50% 초과의 탄소는 에탄올 형성으로 유도되었다. 데이터는, 과발현 균주의 2,3-뷰탄다이올 선택성은 LZ1561 및 플라스미드 대조군 발효물에서 평균 15%로부터 22.5%까지 증가한 것을 나타낸다. 과발현 균주의 상승된 2,3-뷰탄다이올 선택성은 상이한 CO 흡수율에서 유지되는 것으로 보여졌다. 2,3-뷰탄다이올 선택성의 증가는 4 ㏖/ℓ/d에서 에탄올 선택성의 감소 또는 8 ㏖/ℓ/d에서 아세테이트 선택성의 감소에 기여한다. 에탄올 및 아세테이트의 선택성이 특정 기체 공급에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있으며, 이는 결국 실행 매개변수 사이의 작은 차이에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있으므로, 에탄올 및 아세테이트의 정확한 기여는 분리될 수 없다. 예를 들어, 특히 pH, 임펠러 위치, 프로브 위치는 이러한 모든 결과에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 8
본 실시예는 2,3-뷰탄다이올로 플럭스를 증가시키는 외인성 아세토락테이트 탈카복실화효소의 발현을 설명한다.
아에로모나스 하이드로필라 및 류코노스톡 락티스 유래의 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자를 클로스트리듐 오토에타노게눔(진아트)에서의 발현을 위하여 선택된 코돈으로 합성하고, 상기 기재된 바와 같이 pMTL83159로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드, 및 대조군으로서의 pMTL83159를 상기 기재된 바와 같이 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주 LZ1561로 형질전환시켰다.
40㎖의 PETC-MES 배지를 포함하고 어떠한 효모 추출물도 없는 1ℓ의 쇼트 보틀에서 균주를 성장시키고, 헤드스페이스를 탄소 및 에너지 공급원으로서 1.5 바(게이지) 합성 공장 가스(50% CO, 29% N2, 18% CO2, 및 3% H2)로 대체하였다. 플라스미드를 유지하기 위하여, 15㎎ L-1의 티암페니콜을 첨가하였다. 배양물의 성장을 통한 바이오매스 및 대사산물 농도를 기록하였다.
외인성 아세토락테이트 탈카복실화효소 어느 하나의 발현은 합성 공장 기체 상에서의 성장 동안 대조군으로서 빈 플라스미드를 포함하는 균주에 비하여 2,3-뷰탄다이올 생성의 증가를 초래하였다. 빈 플라스미드 대조군 균주가 0.3 ± 0.12 g L-1의 생성을 초래한 것에 비하여, 아에로모나스 하이드로필라 및 류코노스톡 락티스 유래 alsD의 발현은 각각 2.3 ± 0.08 g L-1 및 1.6 ± 0.16 g L-1의 2,3-뷰탄다이올의 생성을 초래하였다(도 8).
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본 발명을 수행하기 위하여 본 발명자들에게 공지된 최선의 방식을 포함하여, 본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 기재되어 있다. 상기 바람직한 실시형태의 변형은 전술한 설명을 읽음으로써 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이와 같은 변형을 적절하게 이용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률이 허용하는 바와 같이, 본 명세서에 첨부된 청구범위에 열거된 모든 변형 및 주제의 균등물을 포함한다. 게다가, 본 명세서에 달리 지시되어 있거나 문맥에 의해 달리 명백하게 모순되지 않는 한 모든 가능한 변형으로 상기 기재된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> LanzaTech New Zealand Limited <120> RECOMBINANT MICROORGANISMS EXHIBITING INCREASED FLUX THROUGH A FERMENTATION PATHWAY <130> LT113WO1 <150> 62/168,969 <151> 2015-06-01 <150> 62/089,053 <151> 2014-12-08 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3513 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400> 1 atgcgtaaaa tgaaaactat ggatggaaat actgctgctg cttatatttc ctatgcattt 60 actgatgtag cagctattta tccaataact ccatcatcac caatggcaga acatgtagat 120 gaatgggtag ctaagggaaa gaaaaatatt tttggacaac aagtaaaagt tatggagatg 180 caatcagagg ctggagcatc aggagccgta catggttcac tacaagcagg agcattgact 240 agtacatata ctgcatctca aggcttatta cttatgatac ctaacatgta taagattgct 300 ggtgaattat taccaggagt attccatgta tcagctagag cagtagctgc aaattcactt 360 aacatatttg gtgatcacca agatgttatg gcaacaagac aaactggatt tgctttattt 420 gcagaaagtt cagtacaaca ggttatggat ctttcagcag tagcccattt atcagcaata 480 aaaggaagag ttccatttgt aaacttcttt gatggattca gaacttctca tgaaattcaa 540 aaaatcgaat tattagagta 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tttagcagca atagaaagta atgtaccttt tatgcatttt tttgatggat 540 ttagaactag tcatgaaata caaaaaatag aagtattaga ttatgcagat atggcaagtt 600 tagtaaatca aaaagcatta gcagaattta gagcaaaaag tatgaatcct gaacatcctc 660 atgtaagagg aactgcacaa aatcctgata tatattttca gggaagagaa gcagcaaatc 720 cttattatct taaagtacct ggaatagtag ctgaatatat gcaaaaagta gcaagtttaa 780 ctggaagaag ttataaactt tttgattatg ttggagcacc tgatgcagaa agggtaatag 840 taagtatggg aagtagttgt gaaactatag aagaagtaat aaatcatctt gcagcaaaag 900 gtgaaaaaat aggacttata aaagtaagac tttatagacc ttttgtaagt gaagcatttt 960 ttgcagcatt acctgcaagt gcaaaagtaa taactgtatt agatagaact aaagaacctg 1020 gtgcacctgg tgatccttta tatcttgatg tatgtagtgc atttgtagaa aggggtgaag 1080 caatgcctaa aatacttgct ggaagatatg gattaggaag taaagaattt agtcctgcaa 1140 tggtaaaaag tgtatatgat aatatgagtg gtgcaaaaaa aaatcatttc actgtaggaa 1200 tagaagatga tgtaactgga actagtttac ctgtagataa tgcatttgca gatactactc 1260 ctaaaggtac tatacaatgt caattttggg gacttggagc agatggaact gttggagcaa 1320 ataaacaagc aataaaaata 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taactggtga tcctgaaata 120 agtagaatga ctatagtaag tattggagat gattatatgt ttgaacaaat atctaaacag 180 cttaataaat tgatagaagt aataaaagta atagaattaa atcctgatgc aagtgtatat 240 agagaattaa gtcttataaa agtaagtgca gaaagtaata acaaacttct tataatggaa 300 agtgtaaata cttttagagg taaaatagta gatatgaatg aaaaaagtat gataatagaa 360 ataactggaa atgaaaaaaa aataagtgca tttatagaat taatgaaacc ttatggaata 420 aaagaaataa taagaactgg attaactgca ttacaaagag gatcaaaatt agaagattaa 480 gagctc 486 <210> 14 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutant Clostridium autoethanogenum LZ1561 IlvN (G-10-D) acetolactate synthase <400> 14 Met Ser Val Leu Val Glu Asn His Ser Asp Val Leu Ser Lys Val Ala 1 5 10 15 Gly Leu Phe Ser Arg Arg Gly Tyr Asn Ile His Ser Leu Thr Val Gly 20 25 30 Val Thr Gly Asp Pro Glu Ile Ser Arg Met Thr Ile Val Ser Ile Gly 35 40 45 Asp Asp Tyr Met Phe Glu Gln Ile Ser Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile 50 55 60 Glu Val Ile Lys Val Ile Glu Leu Asn Pro Asp Ala Ser Val Tyr Arg 65 70 75 80 Glu Leu Ser Leu Ile 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Ile Val Lys Glu Leu Arg 370 375 380 Asn Ala Val Asp Asp His Val Thr Val Thr Cys Asp Ile Gly Ser His 385 390 395 400 Ala Ile Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Tyr Glu Pro Leu Thr Leu 405 410 415 Met Ile Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala 420 425 430 Ile Gly Ala Ser Leu Val Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Ser Val Ser 435 440 445 Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr Ala Val 450 455 460 Arg Leu Lys Ala Pro Ile Val His Ile Val Trp Asn Asp Ser Thr Tyr 465 470 475 480 Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Leu Lys Lys Tyr Asn Arg Thr Ser Ala 485 490 495 Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly 500 505 510 Ala Thr Gly Leu Arg Val Glu Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Val Leu 515 520 525 Arg Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Val Pro Val 530 535 540 Asp Tyr Ser Asp Asn Ile Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro Lys Glu 545 550 555 560 Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu 565 570 <210> 21 <211> 720 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400> 21 atggatgatg aggtgaaagt cccaaaccat atatatcaaa tgtctacaat aaatgcactt 60 gtttcggggc tgtatgatgg ctgtgtttca ttatctaaac ttcttaaaaa aggaaacttt 120 ggtataggta cttttaaagg tctagatggt gaactaactc ttttaaatgg aactttttat 180 aggactaaac ctgatggcag cgtatacgta tgttccaaaa acgtatccgt tccttttgct 240 gtagtcactg aactggaaaa ttataatact tataatattc aaaatcgtac ttcttatgaa 300 gatataagaa aagaattgga cagctttata gaaagcaaaa atatatttta tgctttctat 360 atggaaggta aatttaatta tgtaaaaaca cgtactgttg taaaacagaa tatgccttat 420 aagcctatgg ctgaagttgt taaagatcag cctatgtttg aatataacgg tgttgatgga 480 tatgtggttg gatttaggtg tcctgattat gttgaaggcc ttaatgtccc tggatatcat 540 tttcatttca taaataaaga taagaaattt ggtggacata taagtgaatt ttccattgaa 600 aatgcgaagg tttatgtaca gaactgttct tgctttagga tggaacttcc taaaaatgaa 660 agtttttata atatggaagt acaagataga aacgatgaga taacaagtgt tgaaaaataa 720 <210> 22 <211> 239 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum LZ1561 <400> 22 Met Asp Asp Glu Val Lys Val Pro Asn His Ile Tyr Gln Met Ser Thr 1 5 10 15 Ile Asn Ala Leu Val Ser Gly Leu Tyr Asp Gly Cys Val Ser Leu Ser 20 25 30 Lys Leu Leu Lys Lys Gly Asn Phe Gly Ile Gly Thr Phe Lys Gly Leu 35 40 45 Asp Gly Glu Leu Thr Leu Leu Asn Gly Thr Phe Tyr Arg Thr Lys Pro 50 55 60 Asp Gly Ser Val Tyr Val Cys Ser Lys Asn Val Ser Val Pro Phe Ala 65 70 75 80 Val Val Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Tyr Asn Ile Gln Asn Arg 85 90 95 Thr Ser Tyr Glu Asp Ile Arg Lys Glu Leu Asp Ser Phe Ile Glu Ser 100 105 110 Lys Asn Ile Phe Tyr Ala Phe Tyr Met Glu Gly Lys Phe Asn Tyr Val 115 120 125 Lys Thr Arg Thr Val Val Lys Gln Asn Met Pro Tyr Lys Pro Met Ala 130 135 140 Glu Val Val Lys Asp Gln Pro Met Phe Glu Tyr Asn Gly Val Asp Gly 145 150 155 160 Tyr Val Val Gly Phe Arg Cys Pro Asp Tyr Val Glu Gly Leu Asn Val 165 170 175 Pro Gly Tyr His Phe His Phe Ile Asn Lys Asp Lys Lys Phe Gly Gly 180 185 190 His Ile Ser Glu Phe Ser Ile Glu Asn Ala Lys Val Tyr Val Gln Asn 195 200 205 Cys Ser Cys Phe Arg Met Glu Leu Pro Lys Asn Glu Ser Phe Tyr Asn 210 215 220 Met Glu Val Gln Asp Arg Asn Asp Glu Ile Thr Ser Val Glu Lys 225 230 235 <210> 23 <211> 745 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Codon-optimized Clostridium autoethanogenum LZ1561 acetolactate decarboxylase <400> 23 gagctcagga ggtaactaaa tggatgatga agtaaaagta cctaatcata tatatcaaat 60 gagtactata aatgcattag taagtggatt atatgatgga tgtgtaagtt tatctaaatt 120 attaaaaaaa ggaaattttg gaataggaac ttttaaagga ttagatggag aattaacttt 180 attaaatgga actttttata gaactaaacc tgatggaagt gtatatgtat gtagtaaaaa 240 tgtaagtgta ccttttgcag tagtaactga attagaaaat tataatactt ataatataca 300 aaatagaact tcttatgaag atataagaaa agaattagat agttttatag aaagtaaaaa 360 tatattttat gcattttata tggaaggaaa atttaattat gtaaaaacta gaactgtagt 420 aaaacaaaat atgccttata aacctatggc agaagtagta aaagatcaac ctatgtttga 480 atataatgga gtagatggat atgtagtagg atttagatgt cctgattatg tagaaggatt 540 aaatgtacct ggatatcatt ttcattttat aaataaagat aaaaaatttg gaggacatat 600 aagtgaattt agtatagaaa atgcaaaagt atatgtacaa aattgtagtt gttttagaat 660 ggaattacct aaaaatgaaa gtttttataa tatggaagta caagatagaa atgatgaaat 720 aactagtgta gaaaaataag gtacc 745 <210> 24 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Codon-optimized Clostridium autoethanogenum LZ1561 acetolactate decarboxylase <400> 24 Met Asp Asp Glu Val Lys Val Pro Asn His Ile Tyr Gln Met Ser Thr 1 5 10 15 Ile Asn Ala Leu Val Ser Gly Leu Tyr Asp Gly Cys Val Ser Leu Ser 20 25 30 Lys Leu Leu Lys Lys Gly Asn Phe Gly Ile Gly Thr Phe Lys Gly Leu 35 40 45 Asp Gly Glu Leu Thr Leu Leu Asn Gly Thr Phe Tyr Arg Thr Lys Pro 50 55 60 Asp Gly Ser Val Tyr Val Cys Ser Lys Asn Val Ser Val Pro Phe Ala 65 70 75 80 Val Val Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Tyr Asn Ile Gln Asn Arg 85 90 95 Thr Ser Tyr Glu Asp Ile Arg Lys Glu Leu Asp Ser Phe Ile Glu Ser 100 105 110 Lys Asn Ile Phe Tyr Ala Phe Tyr Met Glu Gly Lys Phe Asn Tyr Val 115 120 125 Lys Thr Arg Thr Val Val Lys Gln Asn Met Pro Tyr Lys Pro Met Ala 130 135 140 Glu Val Val Lys Asp Gln Pro Met Phe Glu Tyr Asn Gly Val Asp Gly 145 150 155 160 Tyr Val Val Gly Phe Arg Cys Pro Asp Tyr Val Glu Gly Leu Asn Val 165 170 175 Pro Gly Tyr His Phe His Phe Ile Asn Lys Asp Lys Lys Phe Gly Gly 180 185 190 His Ile Ser Glu Phe Ser Ile Glu Asn Ala Lys Val Tyr Val Gln Asn 195 200 205 Cys Ser Cys Phe Arg Met Glu Leu Pro Lys Asn Glu Ser Phe Tyr Asn 210 215 220 Met Glu Val Gln Asp Arg Asn Asp Glu Ile Thr Ser Val Glu Lys 225 230 235 <210> 25 <211> 806 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <400> 25 gagctctaag gaggtcggac atggaaacta atagtagttg tgattgtgca atagaaataa 60 gtcaacaatt tgcaagatgg caggcaagac aaggtggtgg tgaagtatat caaagtagtc 120 ttatgagtgc attattagct ggtgtatatg aaggtgaaac tactatggca gatttactta 180 gacatggtga ttttggatta ggaactttta atagattaga tggtgaatta atagcatttg 240 aaagacaaat acatcaatta aaagcagatg gaagtgcaag acctgcaaga gcagaacaaa 300 aaactccttt tgcagtaatg actcatttta gaccttgttt acaaagaaga tttgcacatc 360 ctttaagtag agaagaaata catcagtggg tagatagatt agtaggaact gataatgtat 420 ttgtagcatt tagacttgat ggattatttg aacaagcaca agtaagaact gtaccttgtc 480 aaagtcctcc ttataaacct atgttagaag caatagaagc acaaccttta tttagtttta 540 gtttaagaag aggaacttta gtaggattta gatgtcctcc ttttgtacag ggaataaatg 600 tagcaggata tcatgaacat tttataactg aagatagaag aggtggtgga catatattag 660 attatgcaat gggacatgga caattacaat taagtgtagt acaacatctt aatatagaat 720 tacctagaaa tcctgcattt caacaagcag atcttaatcc tgcagattta gatagagcaa 780 taagagcagc agaaggataa ggtacc 806 <210> 26 <211> 259 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophila <400> 26 Met Glu Thr Asn Ser Ser Cys Asp Cys Ala Ile Glu Ile Ser Gln Gln 1 5 10 15 Phe Ala Arg Trp Gln Ala Arg Gln Gly Gly Gly Glu Val Tyr Gln Ser 20 25 30 Ser Leu Met Ser Ala Leu Leu Ala Gly Val Tyr Glu Gly Glu Thr Thr 35 40 45 Met Ala Asp Leu Leu Arg His Gly Asp Phe Gly Leu Gly Thr Phe Asn 50 55 60 Arg Leu Asp Gly Glu Leu Ile Ala Phe Glu Arg Gln Ile His Gln Leu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Gly Ser Ala Arg Pro Ala Arg Ala Glu Gln Lys Thr Pro 85 90 95 Phe Ala Val Met Thr His Phe Arg Pro Cys Leu Gln Arg Arg Phe Ala 100 105 110 His Pro Leu Ser Arg Glu Glu Ile His Gln Trp Val Asp Arg Leu Val 115 120 125 Gly Thr Asp Asn Val Phe Val Ala Phe Arg Leu Asp Gly Leu Phe Glu 130 135 140 Gln Ala Gln Val Arg Thr Val Pro Cys Gln Ser Pro Pro Tyr Lys Pro 145 150 155 160 Met Leu Glu Ala Ile Glu Ala Gln Pro Leu Phe Ser Phe Ser Leu Arg 165 170 175 Arg Gly Thr Leu Val Gly Phe Arg Cys Pro Pro Phe Val Gln Gly Ile 180 185 190 Asn Val Ala Gly Tyr His Glu His Phe Ile Thr Glu Asp Arg Arg Gly 195 200 205 Gly Gly His Ile Leu Asp Tyr Ala Met Gly His Gly Gln Leu Gln Leu 210 215 220 Ser Val Val Gln His Leu Asn Ile Glu Leu Pro Arg Asn Pro Ala Phe 225 230 235 240 Gln Gln Ala Asp Leu Asn Pro Ala Asp Leu Asp Arg Ala Ile Arg Ala 245 250 255 Ala Glu Gly <210> 27 <211> 761 <212> DNA <213> Leuconostoc lactis <400> 27 gagctctaag gaggtcggac atgactcatc aatataataa aatgagtaga ttatatcaac 60 atggaacttt agcaatgtta atgggaaaac aaatgcaggg aactataact gtagcagaac 120 ttagacaaca tggtgatact ggaataggaa ctcttactgg attagatggt gaagtaatac 180 ttcttgatgg tgaagtttat caagcacaga gtgatggaca agtaaatcat ataactaatc 240 ctgatacttt aatgcctttt gcaagtgtac attttgatgc acctactcag cagttacctt 300 ttagtcaggt agattttagt actttaagtg caaaacttaa agcagaacaa ttacaaaatg 360 tatttgcagc agtgaaattt catggtgaat ttagtagagt acatgtaaga atagctccta 420 aacaagtacc tccttatcct tcattacttg cagtagcaga aaatcaacct gaatttgaaa 480 gagaacacgt aactggaact gtagtaggat actttgcacc tcaaatattt aatggaccta 540 ctgcagcagg atggcatgta cattttctta gtgatgatct tcaatttgca ggacatatat 600 tagattttag tgcaagtcaa ataagtggaa ctttacaaat atttgatgaa tttgtacaac 660 atttacctat acatgatcct gcatatagag aaatgacttt agattttgat ggattattag 720 ctggaataga agcaagtgaa ggtggacaac aataaggtac c 761 <210> 28 <211> 244 <212> PRT <213> Leuconostoc lactis <400> 28 Met Thr His Gln Tyr Asn Lys Met Ser Arg Leu Tyr Gln His Gly Thr 1 5 10 15 Leu Ala Met Leu Met Gly Lys Gln Met Gln Gly Thr Ile Thr Val Ala 20 25 30 Glu Leu Arg Gln His Gly Asp Thr Gly Ile Gly Thr Leu Thr Gly Leu 35 40 45 Asp Gly Glu Val Ile Leu Leu Asp Gly Glu Val Tyr Gln Ala Gln Ser 50 55 60 Asp Gly Gln Val Asn His Ile Thr Asn Pro Asp Thr Leu Met Pro Phe 65 70 75 80 Ala Ser Val His Phe Asp Ala Pro Thr Gln Gln Leu Pro Phe Ser Gln 85 90 95 Val Asp Phe Ser Thr Leu Ser Ala Lys Leu Lys Ala Glu Gln Leu Gln 100 105 110 Asn Val Phe Ala Ala Val Lys Phe His Gly Glu Phe Ser Arg Val His 115 120 125 Val Arg Ile Ala Pro Lys Gln Val Pro Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ala 130 135 140 Val Ala Glu Asn Gln Pro Glu Phe Glu Arg Glu His Val Thr Gly Thr 145 150 155 160 Val Val Gly Tyr Phe Ala Pro Gln Ile Phe Asn Gly Pro Thr Ala Ala 165 170 175 Gly Trp His Val His Phe Leu Ser Asp Asp Leu Gln Phe Ala Gly His 180 185 190 Ile Leu Asp Phe Ser Ala Ser Gln Ile Ser Gly Thr Leu Gln Ile Phe 195 200 205 Asp Glu Phe Val Gln His Leu Pro Ile His Asp Pro Ala Tyr Arg Glu 210 215 220 Met Thr Leu Asp Phe Asp Gly Leu Leu Ala Gly Ile Glu Ala Ser Glu 225 230 235 240 Gly Gly Gln Gln

Claims (19)

  1. 재조합 일산화탄소영양(carboxydotrophic) 클로스트리듐(Clostridium) 박테리아로서,
    (a) 피루베이트:페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.1);
    (b) 아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5);
    (c) 피루베이트:페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.1) 및 아세토락테이트 합성효소(EC 2.2.1.6);
    (d) 피루베이트:페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.1) 및 아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5);
    (e) 아세토락테이트 합성효소(EC 2.2.1.6) 및 아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5); 또는
    (f) 피루베이트:페레독신 산화환원효소(EC 1.2.7.1), 아세토락테이트 합성효소(EC 2.2.1.6) 및 아세토락테이트 탈카복실화효소(EC 4.1.1.5)
    를 포함하고, 각각의 효소는 과발현된 내인성 효소 또는 외인성 효소이며,
    박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 및 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 과발현된 내인성 피루베이트:페레독신 산화환원효소인 박테리아.
  3. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트:페레독신 산화환원효소는 외인성 데설포비브리오 아프리카누스(Desulfovibrio africanus) 피루베이트:페레독신 산화환원효소인 박테리아.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아세토락테이트 합성효소는 과발현된 내인성 IlvB ORF2059 아세토락테이트 합성효소, 과발현된 내인성 IlvB ORF2336 아세토락테이트 합성효소, 과발현된 내인성 IlvN 아세토락테이트 합성효소, 또는 과발현된 내인성 AlsS 아세토락테이트 합성효소인 박테리아.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아세토락테이트 합성효소는 외인성 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 아세토락테이트 합성효소인 박테리아.
  6. 제1항에 있어서, 상기 아세토락테이트 탈카복실화효소는 과발현된 내인성 AlsD 아세토락테이트 탈카복실화효소 또는 과발현된 내인성 BudA 아세토락테이트 탈카복실화효소인 박테리아.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아세토락테이트 탈카복실화효소는 외인성 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 아세토락테이트 탈카복실화효소인 박테리아.
  8. 제1항에 있어서, 상기 아세토락테이트 탈카복실화효소는 외인성 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 아세토락테이트 탈카복실화효소인 박테리아.
  9. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 DSMZ 수탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔으로부터 유래된 클로스트리듐 오토에타노게눔인 박테리아.
  10. 제1항의 박테리아를 사용한 CO의 발효에 의해 2,3-뷰탄다이올을 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 박테리아가 에탄올, 뷰탄올, 아이소프로판올, 아이소뷰탄올, 고급 알코올, 석시네이트, 아이소프레노이드, 지방산, 생체고분자, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 발효 생성물을 더 생성하는 것인 제조 방법.
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