CN103320335B - 一种丙酮丁醇梭菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种丙酮丁醇梭菌及其应用。本发明提供的丙酮丁醇梭菌的保藏编号为CGMCC No.5234。本发明提供的丙酮丁醇梭菌可以用于发酵联产丙酮、丁醇、乙醇和3-羟基丁酮，提高了丁醇发酵的经济效益。可以通过添加代谢或生长调节物实现NAD+的偶联再生，提高了产物得率，同时可以灵活调节联产产物的产量，适应市场需求。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种产3-羟基丁酮的丙酮丁醇梭菌及其应用。
背景技术
丙酮(acetone)、丁醇(butanol)和乙醇(ethanol)统称为ABE，是医药、农药、塑料、橡胶以及轻工业的重要原料，也是重要的化工溶剂，因此ABE的研究对现代工业的发展有重要作用。
丙酮又称为二甲基甲酮，无色透明液体，易挥发。丙酮既是重要的有机溶剂也是非常重要的化工原料，用于炸药、塑料、纤维、制革、喷漆等行业中，也可用于合成烯酮、醋酐、碘仿、烯橡胶、环氧树脂等。
丁醇又称为1-丁醇，无色透明液体，有强烈的酒味，稍溶于水，相对密度0.81，沸点117.7℃，属于二级易燃品。丁醇是一种重要的有机原料和化工溶剂，广泛用于各种塑料、橡胶制品、树脂制造以及皮革、造纸等轻工行业中。丁醇的另一个非常重要的作用可以作为当今极具潜力的新型生物燃料，被称为第二代生物燃料。与乙醇相比，丁醇具有较高的燃烧值，可支持汽车多走30％的路程，和烃类性质接近，无需对汽车气缸进行改造；并且低挥发性；不亲水；无腐蚀；高辛烷值-抗爆性好。因此，丁醇的研究开发在全球化石资源日益枯竭的形势下，迅速成为新的热点。
3-羟基丁酮，又名乙偶姻(acetoin)、乙酰甲基甲醇，通常为淡黄色液体或晶体，天然存在于玉米、葡萄、草莓、干酪、肉类等食品中，是一种应用广泛的香料，我国国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食用香料，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。此外，3-羟基丁酮还可以作为化学合成中的重要原料，比如可用于合成手性近晶材料和向列材料。
3-羟基丁酮的传统化工制备主要是采用化学法或者酶法转化，其原料 主要是双乙酰(丁二酮)和2，3-丁二醇。1998年，英国Witwatersrand大学的Martin Studer等应用经过改性的铂作为催化剂选择性地加氢还原双乙酰，其产率为30％。英国Hull大学的Slipszenko也开展了铂催化双乙酰加氢还原生成3-羟基丁酮的研究，产率为85％。但催化加氢非均相反应通常在高压下进行，设备要求高，并且所用催化剂昂贵。1992年，美国的Hummel等采用培养菌体的方法获得乳杆菌或者酵母菌中的双乙酰还原酶，然后在pH5、温度70℃的条件下应用该还原酶及辅酶NADPH催化双乙酰合成3-羟基丁酮，产率最高达100％。1945年美国农业部的R.H.Blom通过氧化脱氢以2，3-丁二醇合成双乙酰及3-羟基丁酮。2，3-丁二醇在140℃加热后与空气一起通过Pyrex管式反应器，反应器中装填铜刨花，反应温度315℃，得到产品双乙酰(产率33％)及3-羟基丁酮(产率25％)。法国De Poitiers大学的A.Hilmi应用电化学氧化制备3-羟基-2-丁酮，其方法是在电解槽中进行反应，隔膜为离子交换膜，反应中的电极均为可逆氢电极。阳极为Pt-Pb，多孔的Pt/Ir((10％)为对应电极，电解液为HClO4，溶剂为超纯水，反应温度为40℃，电池电压为0.8V。应用这种电解氧化法，其产物除了3-羟基丁酮外还有双乙酰和二氧化碳，产率为94％。但是，化学法存在环境污染较严重和产品质量的问题，并且原料主要来源于不可再生的化石资源，从长远来看限制了其发展。
另外，还可以采用微生物发酵法生产3-羟基丁酮。在大多数微生物中，两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶作用下合成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸经乙酰乳酸脱羧酶作用即可生成3-羟基丁酮。乙酰乳酸也可以在有氧的条件下自然氧化脱羧生成双乙酰，双乙酰再还原生成3-羟基丁酮。但是，3-羟基丁酮可以被进一步还原生成2，3-丁二醇，并且双乙酰还原生成3-羟基丁酮和3-羟基丁酮还原生成2，3-丁二醇可以由同一个酶(2，3-丁二醇脱氢酶)所催化，因此在很多微生物中3-羟基丁酮往往是作为2，3-丁二醇生产中间产物，同时伴有双乙酰的生成，影响了其产量和分离。目前人们已经发现很多可以产生3-羟基丁酮的菌种，例如：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等奶制品或者酿酒发酵菌株，但是3-羟基丁酮的产量都低于1g/L。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产气节杆菌(Enterobacter aerogenes)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等也能够发酵生产3-羟基丁酮，并且 有较高产量，但是这些菌株主要是用来生产2，3-丁二醇，3-羟基丁酮仅仅是作为其副产物。Olson和Johnson利用产气节杆菌将226g/L的葡萄糖转化为14g/L的3-羟基丁酮和97g/L的2，3-丁二醇。山东大学的马翠卿等人利用含有2，3-丁二醇脱氢酶基因和NADH氧化酶基因的重组大肠杆菌制备手性3-羟基丁酮和2，3-丁二醇，手性3-羟基丁酮的浓度达到36g/L。在中国专利申请CN101008019A中，公开了一株枯草芽孢杆菌在制备3-羟基丁酮中的应用，其中以葡萄糖为主要原料，利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SFA-H31(CGMCC1869)在50L发酵罐中发酵培养52h，转化率达到48.26％，3-羟基丁酮发酵产率达55.67g/L，并证实该菌株不产生副产物丁二酮和2，3-丁二醇。然而，枯草芽孢杆菌等通常好氧生长或发酵，并且由于每分子葡萄糖到3-羟基丁酮会产生2个NADH，专一生产3-羟基丁酮则造成NADH的浪费。同时，由于2，3-丁二醇和3-羟基丁酮处于同一支路的上下游，常规的联产很难做到两者代谢流量的单独调控和NADH的有效利用。
发明内容
本发明的目的是，提供一种用于联产丁醇和3-羟基丁酮的诱变丙酮丁醇梭菌。
本发明的另一个目的是，提供一种联产丁醇和3-羟基丁酮的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种用于发酵联产丁醇和3-羟基丁酮的丙酮丁醇梭菌，其保藏编号为CGMCC No.5234，该菌株已于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明还提供了上述丙酮丁醇梭菌在发酵联产丁醇和3-羟基丁酮中的应用。
另一方面，本发明提供一种发酵联产丁醇和3-羟基丁酮的方法，所述方法包括采用上述丙酮丁醇梭菌在液体发酵培养基中进行发酵培养，以生产丁醇和3-羟基丁酮。
本发明提供的方法包括以下步骤：1)将所述丙酮丁醇梭菌于固体平板培养基上培养12-36小时；2)将步骤1)培养的丙酮丁醇梭菌接入种子培养基中，于25-39℃培养10-20小时；3)将步骤2)培养的丙酮丁醇梭菌以5％-15％的接种量接入液体发酵培养基中，于24-40℃静止培养40-85小时。
优选地，所述液体发酵培养基中包括碳源、氮源和/或无机盐。
优选地，所述碳源选自葡萄糖、甘油、玉米粉、果糖、淀粉、木糖等中的一种或几种，浓度为20g/L-80g/L。
优选地，所述氮源选自硫酸铵、醋酸铵、玉米浆、酵母粉、酵母膏、尿素等中的一种或几种，浓度为0.1g/L-10g/L。
优选地，所述无机盐选自钠盐、钾盐、铁盐、亚铁盐、锰盐、磷酸盐、硫酸盐等中的一种或几种，浓度为0.001g/L-5g/L。
优选地，所述液体发酵培养基中还包括微量元素。
优选地，所述微量元素选自维生素B1(硫胺或其盐酸盐)、维生素H(生物素，维生素B7)、维生素Bx(对氨基苯甲酸，维生素H1)等中的一种或几种。
优选地，所述液体发酵培养基中还包括一种或多种代谢或生长调节物。
优选地，所述代谢或生长调节物选自乙酸盐、支链氨基酸、甘油中的一种或几种。
更优选地，所述乙酸盐包括乙酸钠、乙酸铵、乙酸镁、乙酸钙、乙酸钾等中的一种或几种，加入培养基后的浓度0.5g/L-8g/L，加入时间为发酵开始后的0-50小时。外加乙酸盐能作为丙酮的合成原料，直接提高丙酮的产量，因此由糖生成的丙酮减少而3-羟基丁酮在NAD+的再生要求下则增多；另外乙酸盐的加入还能加快糖耗速率，缩短发酵周期。如果在生长前期加入乙酸盐则会抑制菌体生长，但是却能提高丁醇得率。
更优选地，所述支链氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等中的一种或几种，加入培养基后的浓度0.05g/L-5g/L，加入时间为发酵开始后的0-20小时。支链氨基酸和3-羟基丁酮共享同一个前体乙酰乳酸，本发明通过加入支链氨基酸能反馈抑制乙酰乳酸的合成，可以降低3-羟基丁酮产量而进一步提高丁醇产量，但是，支链氨基酸的加入对菌体生长有一定的抑制作用。
更优选地，所述甘油加入培养基后的浓度为2-20g/L，加入时间为发 酵开始后0-60小时。甘油的还原度比葡萄糖的还原度高，甘油代谢能提供更多的NADH，本发明通过在发酵中加入甘油，能为菌体后期回用乙酸和丁酸提供NADH，因此提高了丁醇得率。
优选地，所述液体发酵培养基中还包括能吸附丁酸或丁醇或利于菌体生长的载体介质，包括活性炭、纤维、树脂、乳化剂等中的一种或几种。丁酸、丁醇是菌体生长的主要抑制因素，前期的丁酸限制菌体的浓度，后期丁醇限制菌体产醇的速率和产量，本发明通过在发酵过程中加入树脂或吸附载体等，能够强化菌体的生长，减轻产物抑制作用，增强菌体的抗逆能力，发酵速率大大提高，周期下降，3-羟基丁酮产量大幅提高。
优选地，所述发酵培养为两阶段培养方式。
优选地，所述两阶段培养方式包括分两阶段控制发酵温度、pH或发酵糖浓度。
更优选地，所述发酵温度的控制方式如下：发酵开始后的0-30小时，控制温度为24-40℃，之后控制温度为32-37℃。丙酮丁醇梭菌前期生长，消耗初糖产生大量的乙酸、丁酸，然后进入产醇期产生丙酮、丁醇等，这两个阶段菌体的生长和代谢在不同的温度下有不同的行为，本发明通过温度来协调菌体的生长与产醇以及前期代谢与后期代谢，有利于提高代谢产物产量。
更优选地，所述发酵pH的控制方式如下：发酵开始后0-30小时，控制pH为pH 4-5.5，产醇开始后不控制pH。pH在丙酮丁醇梭菌的发酵中非常重要，它能反映出并且影响到乙酸、丁酸等有机酸在发酵液中的解离形式，进而影响到菌体对酸的利用。在某些情况下，因为酸利用的问题，发酵很有可能会在产酸期延滞很长一段时间，因此，在菌体从产酸期向产醇期过渡的时段，pH表现为决定生产成败的关键因素。本发明通过控制产酸期的pH在某一合适的水平，能够保证菌体成功并且迅速地过渡到产醇期。
更优选地，所述发酵糖浓度的控制方式如下：发酵初始糖浓度为30-50g/L，待糖浓度降至10-30g/L时，补加糖碳源，使得培养基中的糖浓度维持在10-30g/L，待总糖浓度达到60-90g/L时，停止补加。上述诱变丙酮丁醇梭菌在较高的初糖浓度下有生长抑制的现象，同时在不同的糖浓度下菌体表现出不同的碳硫分配。本发明通过补加糖的策略，控制发酵过程 中的糖浓度，同时达到促进菌体生长和保持菌体处在较佳碳硫分配的状态下发酵的目的。
本发明通过将一株丙酮丁醇梭菌B3(Clostridium acetobutylicum)经紫外诱变后，筛选出一株能高产丁醇和3-羟基丁酮的丙酮丁醇梭菌。本发明获得的诱变丙酮丁醇梭菌有较强的乙酰乳酸合成酶活性和乙酰乳酸脱羧酶活性，同时缺失2，3-丁二醇脱氢酶活性和异丙醇脱氢酶活性。能高产丁醇、丙酮、乙醇(ABE)和3-羟基丁酮，并且没有2，3-丁二醇、异丙醇等副产物。此外，上述诱变丙酮丁醇梭菌，具有很强的耐氧性能，种子培养和发酵培养均无需通厌氧气体驱除残留空气，种子培养和发酵培养不通气不搅拌静止发酵即可。
本发明以此菌进行发酵生产丁醇、乙醇、丙酮和3-羟基丁酮(乙偶姻)，实现NAD+的偶联再生，同时对碳代谢流进行定向调控。具体地，本发明利用上述诱变丙酮丁醇梭菌进行ABE发酵联产3-羟基丁酮的方法包括：将上述诱变丙酮丁醇梭菌在固体平板上培养12-36h后接入种子培养基，25-39℃培养10-20h，以5％-15％的接种量接入含碳源、氮源、无机盐以及微量元素的培养基中培养，添加代谢或生长调节物，进行厌氧发酵生产丁醇和3-羟基丁酮，发酵时间40-85h。
如图1所示，丙酮丁醇梭菌进行ABE发酵的前期(产酸期)约有30％-40％的糖被转化生成乙酸和丁酸等，菌体进入产醇期后，乙酸和丁酸可以被重新还原生成乙醇和丁醇、乙酸和丁酸的回用效率决定着丁醇的生产效率。本发明中的诱变菌株生产3-羟基丁酮可以为乙酸和丁酸的回用提供NADH进而生成丁醇，实现了NAD+的偶联再生，提高了糖利用率和溶剂得率，并且不产生常见副产物2，3-丁二醇、异丙醇等。同时，由于ABE产生途径和3-羟基丁酮产生途径处于不同的分支，并且与菌体生长有不同的相关性，因此通过添加作用于各支路途径的小分子效应物或生长调节物，可以有效实现碳流在这两条途径中的流量分配，灵活调节两者产量以适应市场需求。
综上所述，本发明的有益效果在于以下几方面：
(1)通过诱变获得的生产菌种有很强的耐氧性能，大大减少了常规厌氧发酵过程中的避氧措施。静止发酵，不通气不搅拌，节能减排。
(2)发酵不产生2，3-丁二醇、异丙醇、甲酸和乳酸等副产物，提高 了产物得率和减轻了后续分离压力。
(3)3-羟基丁酮产生提供的NADH能用于乙酸、丁酸的还原生成乙醇和丁醇，实现了NAD+的偶联再生，提高了碳得率。
(4)3-羟基丁酮和ABE处于不同的代谢支路上，两者的代谢流量能够灵活调节，可以更好地适应市场需求。
生物材料保藏信息
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)B3，已于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5234。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为NAD+偶联再生联产ABE和3-羟基丁酮的示意图。
图2为在50L发酵罐中发酵30h时的取样做出的气相色谱图谱，按出峰先后顺序依次为：3.752min，丙酮；4.199min，乙醇；5.501min，丁醇；6.867min，3-羟基丁酮；8.060min，乙酸；9.705min，丁酸。
具体实施方式
根据下述实施例可以更好地理解本发明，然而实施例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及结果仅用于说明本发明，而不应当对本发明进行限制。
以下各实施例中，平板培养和种子培养的培养基成分和培养条件如下：
平板培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨3g/L，七水合硫酸镁3g/L，乙酸铵2g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，琼脂15g/L，于121℃灭菌15min。
平板培养条件：将诱变筛选得到的丙酮丁酮梭菌B3划线在平板上，置于Bugbox厌氧箱(英国Ruskinn)37℃培养24h，平板长出白色不规则菌落。
种子培养基：培养基同以上平板培养基，不加琼脂。
种子培养条件：将平板上的菌泥刮至种子培养基，以100mL蓝盖试剂瓶或者摇瓶进行发酵，装液量为50％，37℃静止培养15h，有大量泡沫浮于液面。
以下各实施例中，所采用的分析方法为气相色谱(GC)，条件如下：火焰离子检测器(FID)，Agilent HP-INNOWAX 19091N-236毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25um)，N2为载气，流速2mL/min，分流比90∶1，H2流速30ml/min，空气流速300ml/min，进样口温度180℃，检测器220℃，柱温(程序升温)：70℃保留0.5min，然后以20℃/min的速率升温到190℃，保留4min。所检测的发酵产物的代表性图谱见图2。
实施例1丙酮丁醇梭菌的诱变
将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)作为原始菌株，在平板上活化培养24h后转接一次，挑取一环菌泥于加了100颗玻璃珠的60mM的氯化锂无菌水溶液中，体积100ml，在摇瓶中200rpm摇晃10min将菌体均匀打散，然后取1mL菌悬液于无菌平板中置于254nm紫外诱变箱中照射90s后稀释100倍涂布于含有20mg/L的溴甲酚紫平板中，37℃厌氧培养3天。挑选菌落大、变色时间早且变色圈较大较亮的菌落作为初选菌株共120株，扩大培养后进行发酵，验证产量以及稳定性。最终获得一株丙酮丁醇梭菌B3(Clostridium acetobutylicum B3)，已于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.5234。该菌株丁醇平均产量11.3g/L，3-羟基丁酮平均产量2.8g/L，总溶剂量19.6g/L且传代8次后产量不低于平均产量的10％。所筛选的丙酮丁醇梭菌B3具有以下的生理特征：
(1)在平板中培养，菌落圆形，直径4-8mm，白色或灰白色，突起，边缘不规则，菌落较厚容易挑起。
(2)在液体中培养，会产生大量泡沫，除此之外还会有絮状粘膜或丝状物，发酵结束后瓶底或者罐底有白色粉末状沉淀。
(3)革兰氏染色阳性；细胞长杆状，在发酵后期出现端生孢子；厌氧，但发酵过程中无需通厌氧气体，发酵容器无需密闭。
(4)具有较高的乙酰乳酸合成酶活性，且该酶活性很容易受到支链 氨基酸的抑制。
(5)其发酵样品中无可检测到的甲酸，乳酸，柠檬酸及甘油，但可以利用这些物质。
实施例2
发酵培养基：葡萄糖60g/L，乙酸铵3g/L，玉米浆2ml/L，121℃灭菌15min。
将种子液混合后以10％的接种量接入5L发酵罐中，装液量60％，于37℃静止培养80h。
最终得到的发酵液中，丙酮3.9g/L，乙醇0.8g/L，丁醇11.9g/L，3-羟基丁酮2.4g/L。
实施例3
发酵培养基：6％的玉米粉，沸水糊化60min，121℃灭菌30min。
将种子液混合后以5％的接种量接入5L发酵罐中，装液量3L，于37℃静止培养50h。
最终得到的发酵液中，丙酮4.2g/L，乙醇1.1g/L，丁醇11.8g/L，3-羟基丁酮2.1g/L。
实施例4
发酵培养基：葡萄糖60g/L，乙酸铵2.5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，121℃灭菌30min。
将种子液以10％的接种量接入5L发酵罐中，装液量3L，于37℃静止80h培养。
最终得到的发酵液中，丙酮4.1g/L，乙醇1.1g/L，丁醇12.2g/L，3-羟基丁酮2.3g/L。
实施例5
与实施例4的方法相同，所不同的是当发酵进行到30h时，加入3g/L的乙酸钠，发酵72h。
最终得到的发酵液中，丙酮5.2g/L，乙醇1.1g/L，丁醇12.5g/L，3-羟基丁酮1.9g/L。
实施例6
与实施例4的方法相同，所不同的是发酵初期加入0.5g/L的缬氨酸和0.5g/L的亮氨酸，发酵85h。
最终得到的发酵液中，丙酮4.8g/L，乙醇1.1g/L，丁醇12g/L，3-羟基丁酮1.6g/L。
实施例7
与实施例4的方法相同，所不同的是发酵40h时加入5g/L的甘油，发酵80h。
最终得到的发酵液中，丙酮3.9g/L，乙醇1.5g/L，丁醇12.8g/L，3-羟基丁酮2.0g/L。
实施例8
与实施例4的方法相同，所不同的是在丁醇浓度达到5g/L左右时，加入树脂吸附丁醇，树脂加入量以其吸附容量为最大丁醇产生量的一半计算，每隔10h搅拌5min。发酵65h。
最终得到的发酵液中，丙酮3.0g/L，乙醇1.1g/L，丁醇11.8g/L，3-羟基丁酮3.5g/L。
实施例9
与实施例4的方法相同，所不同的是发酵初期0-15h维持温度在38℃，然后温度维持在34℃，发酵72h。
最终得到的发酵液中，丙酮3.1g/L，乙醇1.1g/L，丁醇11.4g/L，3-羟基丁酮2.5g/L。
实施例10
与实施例4的方法相同，所不同的是发酵初期0-35h维持温度在27℃，然后温度维持在34℃，发酵80h。
最终得到的发酵液中，丙酮3.2g/L，乙醇1g/L，丁醇11.8g/L，3-羟基丁酮2.5g/L。
实施例11
与实施例4的方法相同，所不同的是在发酵0-30h，以1M的氢氧化钠溶液控制培养基的pH在4.5，待产醇开始后不控制pH，发酵80h。
最终得到的发酵液中，丙酮3.0g/L，乙醇0.9g/L，丁醇11.2g/L，3-羟基丁酮2.5g/L。
实施例12
与实施例4的方法相同，所不同的是培养基初糖浓度40g/L，待初糖浓度降至15g/L时，每隔10h补加10g/L的糖，共补加3次，总糖浓度达到70g/L，发酵80h。
最终得到的发酵液中，丙酮5.0g/L，乙醇1.4g/L，丁醇13.8g/L，3-羟基丁酮3.6g/L。
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Claims (22)
1.一种用于发酵联产丁醇和3-羟基丁酮的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)B3，其保藏编号为CGMCC No.5234。
2.权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌在发酵联产丁醇和3-羟基丁酮中的应用。
3.一种发酵联产丁醇和3-羟基丁酮的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1所述丙酮丁醇梭菌在液体发酵培养基中进行发酵培养，以生产丁醇和3-羟基丁酮。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将权利要求1所述丙酮丁醇梭菌于固体平板培养基上培养12-36小时；
2)将步骤1)培养的丙酮丁醇梭菌接入种子培养基中，于25-39℃培养10-20小时；
3)将步骤2)培养的丙酮丁醇梭菌以5-15％的接种量接入液体发酵培养基中，于24-40℃静止培养40-85小时。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基中包括碳源、氮源和/或无机盐。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、甘油、玉米粉、果糖、淀粉、木糖中的一种或几种，浓度为20g/L-80g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述氮源选自硫酸铵、醋酸铵、玉米浆、酵母粉、酵母膏、尿素中的一种或几种，浓度为0.1g/L-10g/L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自钠盐、钾盐、铁盐、亚铁盐、锰盐、磷酸盐、硫酸盐中的一种或几种，浓度为0.001g/L-5g/L。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基中还包括微量元素。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微量元素选自维生素B1或其盐酸盐、维生素H、维生素Bx中的一种或几种，浓度0.0001g/L-3g/L。
11.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培 养基中还包括一种或多种代谢或生长调节物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述代谢或生长调节物选自乙酸盐、支链氨基酸、甘油中的一种或几种。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述乙酸盐包括乙酸钠、乙酸铵、乙酸镁、乙酸钙、乙酸钾中的一种或几种，加入培养基后的浓度0.5g/L-8g/L，加入时间为发酵开始后的0-50小时。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述支链氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的一种或几种，加入培养基后的浓度0.05g/L-5g/L，加入时间为发酵开始后的0-20小时。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述甘油加入培养基后的浓度为2-20g/L，加入时间为发酵开始后0-60小时。
16.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基中还包括能利于菌体生长的吸附载体。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述吸附载体为吸附丁酸或丁醇的吸附载体。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述吸附载体为树脂、活性炭、纤维、乳化剂中的一种或几种。
19.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养为两阶段培养方式。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述两阶段培养方式包括分两阶段控制发酵温度、pH和/或发酵糖浓度。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述发酵温度的控制方式如下：发酵开始后的0-30小时，控制温度为24-40℃，之后控制温度为32-37℃。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述发酵pH的控制方式如下：发酵开始后0-30小时，控制pH为pH 4-5.5，产醇开始后不控制pH。
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