JP6008858B2 - ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組込み - Google Patents

ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組込み Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１０年９月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３８０，５６３号明細書、及び２０１１年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／４６６，５５７号明細書に関連し、且つその優先権の利益を主張するものであり、これらの出願は双方とも、全体として参照により本明細書に援用される。
電子的に提出された配列表に関する記載
本願と共に提出されるＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：２０１１０９０７＿ＣＬ５１７８ＵＳＮＡ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、サイズ：６６９，９５３バイト、及び作成日：２０１１年８月３１日）において電子的に提出された配列表の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
本発明は、工業微生物学分野並びにブタノール及びその異性体の発酵生産に関する。より具体的には、本発明は、ピルベート利用生合成経路のステップ、例えばピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上の組込みポリヌクレオチドを有する組換え宿主細胞に関する。
ブタノールは重要な工業用化学品であり、燃料添加剤として、プラスチック工業における原料化学品として、並びに食品及び香料工業における食品グレードの抽出剤として有用である。毎年１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生産されており、この汎用化学品の需要は増加が見込まれる。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）とも称される２−ブタノンは、広く用いられている溶媒であり、商業的に生産されるケトンとしてアセトンに次いで最も重要である。２−ブタノンは、塗料、樹脂、及び接着剤用の溶媒、並びに選択的抽出剤、酸化反応の活性化剤として用いられ、触媒の存在下で水素と反応させると２−ブタノールに化学的に変換することができる（非特許文献１）。２，３−ブタンジオールは、現在分解油から得られている重要な工業用化学品であるブテン及びブタジエンの化学合成に用いることができ、及び２，３−ブタンジオールのエステルは可塑剤として用いることができる（非特許文献２）。
微生物は、２，３−ブタンジオール、２−ブタノン、２−ブタノール及びイソブタノールなどの生成物を生成するように、生合成経路の発現を操作することができる。特許文献１は、イソブタノール生成のための組換え微生物の操作について開示している。特許文献２及び３は、２−ブタノン又は２−ブタノールの生成のための組換え微生物の操作について開示している。イソブタノール及び２−ブタノールの生合成には複数の経路が知られており、その全てが細胞のピルベートから始まる。ブタンジオールは、特許文献３に開示される２−ブタノール経路の中間体である。
乳酸及びグリセロールの生成のために、酵母でピルベート代謝が改変されている。特許文献４は、１つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された、且つＤ−乳酸の生成に用いられるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する酵母株を開示している。非特許文献３は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が破壊された、且つ乳酸デヒドロゲナーゼを発現するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について記載している。特許文献５は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しないグルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株について記載しており、これは外来性の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有することができる。非特許文献４は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてピルビン酸デカルボキシラーゼの減少及びＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの増加がグリセロール収率に及ぼす影響について記載している。
米国特許第７，８５１，１８８号明細書 米国特許出願公開第２００７０２５９４１０号明細書 米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書 米国特許出願公開第２００７００３１９５０号明細書 米国特許出願公開第２００５／００５９１３６号明細書
Ｎｙｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６９：１１９８，１９４７ Ｖｏｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，"Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ ２，３−Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，"ｉｎ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｖｏｌ．２，Ｓｅｃｔｉｏｎ ３，ｐｐ．９３３−９４７，１９８６ Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０：１１４８−１１５３，２００６） Ｎｅｖｏｉｇｔ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，１２：１３３１−１３３７，１９９６）
アルコール又は他の化合物を工業的に発酵生産するため、ピルビン酸生合成経路用の酵母細胞によるポリヌクレオチドの安定した産生が必要とされている。さらに、酵母などの組換え宿主細胞におけるイソブタノール、２，３−ブタンジオール、２−ブタノール又は２−ブタノンの改良された生成手段が必要とされている。
本明細書には、ピルベート利用生合成経路のステップ、例えばピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上の組込みポリヌクレオチドを有する組換え宿主細胞が提供される。かかる宿主細胞は、ピルベートからアセトラクテートへの変換などの生合成経路ステップを触媒するポリペプチドをコードする組込みポリヌクレオチドを有しない宿主細胞と比較して、イソブタノール、２，３−ブタンジオール、２−ブタノール又は２−ブタノンなどの生合成経路の生成物形成を安定化及び／又は増加させる手段を提供する。
本発明の一態様は、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。別の態様では、宿主細胞は、ピルベート利用生合成経路と、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは宿主細胞にとって異種である。
本発明の態様は、イソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞に関し、前記経路は、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、及び前記経路は、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を含む。実施形態において、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較したとき、イソブタノール生成の力価が増加している。
本発明の態様は、２，３−ブタンジオール、２−ブタノール、又は２−ブタノン生合成経路を含む組換え宿主細胞に関し、前記経路は、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、及び前記経路は、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒される少なくとも１つの基質から生成物への変換を含む。実施形態において、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較したとき、２，３−ブタンジオール、２−ブタノール、又は２−ブタノン生成の力価が増加している。
別の態様では、本発明は、ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと；ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと；ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第３のポリペプチドをコードする第３の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し；第１及び第２の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれ；第３の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれず；及び第１、第２、及び第３のポリペプチドはピルベート利用生合成経路の異なるステップを触媒する。
別の態様では、本発明は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと；（ｂ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第３のポリペプチドをコードする第３の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し；第１及び第２の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ；第３の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず；及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。
別の態様では、本発明は、（ａ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと；（ｂ）（ａ）の変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し；第１の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ；第２の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず；及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。
本発明の態様では、宿主細胞は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、又は酵母である。別の態様では、宿主細胞は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーである。別の態様では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。別の態様では、宿主細胞は通性嫌気性生物である。
本発明の別の態様では、ピルベート利用生合成経路は、その経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ポリヌクレオチドの１つ以上は染色体に組み込まれる。別の態様では、ピルベート利用生合成経路は、生成物２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール又は２−ブタノンを形成する。
本発明の一態様では、ピルベート利用生合成経路はブタノール生合成経路である。別の態様では、ブタノール生合成経路は、２−ブタノール生合成経路又はイソブタノール生合成経路である。別の態様では、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；（ｉｖ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド；又は（ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）のポリヌクレオチドの１つ以上はプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；（ｉｖ）α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ；（ｖ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド；又は（ｖｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、又は（ｖｉ）のポリヌクレオチドの１つ以上はプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；（ｉｖ）α−ケトイソバレレートからバリン；（ｖ）バリンからイソブチルアミン；（ｖｉ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒド；又は（ｖｉｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、又は（ｖｉｉ）のポリヌクレオチドの１つ以上がプラスミド上にある。
本発明の別の態様では、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン；（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール；又は（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）のポリヌクレオチドの１つ以上はプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン；（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール；（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；又は（ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）のポリヌクレオチドの１つ以上がプラスミド上にある。
本発明の別の態様では、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）α−アセトラクテートからアセトイン；（ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；（ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェート；（ｖ）又は３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、又は（ｖ）のポリヌクレオチドの１つ以上がプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）α−アセトラクテートからアセトイン；（ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；（ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェート；（ｖ）３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノン；又は（ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、又は（ｖｉ）のポリヌクレオチドの１つ以上がプラスミド上にある。
別の態様では、基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つが異種である。別の実施形態では、基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの２つ以上が異種である。別の実施形態では、ピルベート利用生合成経路の基質から生成物への変換の各々に対するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全てが異種である。
本発明の一態様では、ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、アセト乳酸シンターゼである。別の態様では、アセト乳酸シンターゼは、表１に示されるアセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の態様では、アセト乳酸シンターゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の態様では、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ ２．２．１．６に対応する。
本発明の別の態様では、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ １．１．１．８６に対応する。別の態様では、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ ４．２．１．９に対応する。別の態様では、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ ４．１．１．７２又は４．１．１．１に対応する。別の態様では、イソブチルアルデヒドからイソブタノールの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ １．１．１．２６５、１．１．１．１又は１．１．１．２に対応する。
一態様では、本発明の宿主細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの発現は、低下するか、又は実質的に消失する。別の態様では、宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異及び／又は置換を含む。
本発明の別の態様では、本明細書に記載される生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上は、プラスミドにある。別の態様では、プラスミドは、配列番号１〜８９の１つ以上と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を含み、又は配列番号１２９〜１３３のいずれか一つ又はそのコード領域と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
一態様では、本発明の宿主細胞におけるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現は、低下するか、又は実質的に消失する。別の態様では、本発明の宿主細胞におけるＦＲＡ２の発現は、低下するか、又は実質的に消失する。別の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの１つ以上は、宿主細胞の染色体にＰＤＣ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域で組み込まれる。
一態様では、本発明は、本発明の宿主細胞から生合成経路の生成物を生成する方法に関する。別の態様では、本発明はブタノールの生成方法に関し、この方法は、（ａ）本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）ブタノールが生成される条件下で宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップとを含む。別の態様では、この方法は、発酵ブロスを抽出剤と接触させて二相発酵混合物を生成するステップをさらに含む。別の態様では、抽出剤は脂肪酸を含む。別の態様では、脂肪酸はトウモロコシ油又はダイズ油に由来する。別の態様では、抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アミド、又はＣ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒドなどの水不混和性有機抽出剤を含む。別の態様では、この方法は、発酵ブロスを有機酸及びその有機酸によりブタノールをエステル化する能力を有する酵素と接触させるステップをさらに含む。別の態様では、この方法は、発酵ブロスの少なくとも一部を気化させて、水とブタノールとを含む蒸気流を形成するステップをさらに含む。
一態様では、本発明の宿主細胞からのブタノール生成速度は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有しない宿主細胞と比較したとき、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍だけ大きく増加する。別の態様では、本発明の宿主細胞からのブタノール生成の力価は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有しない宿主細胞と比較したとき、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍だけ高く増加する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードする非組込み型の組換えポリヌクレオチドのコピー数又は発現を増加させる方法に関し、この方法は、生合成経路の生成物が生成される条件下で本発明の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップを含む。別の態様では、本発明は、ピルベート利用生合成経路におけるフラックスを増加させる方法に関し、この方法は、（ａ）本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）宿主細胞におけるピルベート利用生合成経路のフラックスが増加する条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップとを含む。
別の態様では、本発明は、組換え宿主細胞を生成する方法に関し、この方法は、宿主細胞を、（ｉ）ピルベート利用生合成経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するペプチドをコードするポリヌクレオチドとで形質転換するステップを含み；（ｉｉ）のポリヌクレオチドは染色体に組み込まれる。別の態様では、本発明は、ピルベート利用生合成経路の生成物の形成を増加させる方法に関し、この方法は、（ｉ）本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｉｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、染色体に組み込まれていないポリヌクレオチドを含む宿主細胞により形成される生成物の量と比べて、より多い生成物の量でピルベート利用経路の生成物が形成される条件下で、宿主細胞を成長させるステップとを含む。
別の態様では、本発明は、（ｉ）本発明の宿主細胞と；（ｉｉ）ブタノールと；（ｉｉｉ）抽出剤とを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、（ｉ）本発明の宿主細胞と；（ｉｉ）ブタノールと；（ｉｉｉ）抽出剤と；（ｉｖ）エステル化酵素とを含む組成物に関する。別の態様では、かかる組成物のブタノールはイソブタノールである。
別の態様では、本発明は、アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）を酵母宿主細胞の染色体に組み込む方法に関し、この方法は、前記宿主細胞を配列番号１３１を含む組込みベクターで形質転換するステップを含む。別の態様では、宿主細胞はイソブタノール生合成経路をさらに含む。別の態様では、宿主は少なくとも２つの染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む。
ここに援用され、且つ本明細書の一部をなす添付の図面は、本発明を例示し、さらにその説明と共に、本発明の原理を説明し、且つ関連する技術分野の当業者による本発明の作製及び使用を可能にする役割を担う。
ピルベート利用についての経路及び酵素を示す。 ３つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。 ４つの異なる２−ブタノール生合成経路を示す。 Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳの配列を用いてＢＬＡＳＴ解析により検索されたアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）コード領域の配列関係を、最も近傍の１００個に限定して示す。ａｌｓコード配列は、その由来生物ごとに特定される。 Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳの配列を用いてＢＬＡＳＴ解析により検索されたアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）コード領域の配列関係を、最も近傍の１００個に限定して示す。ａｌｓコード配列は、その由来生物ごとに特定される。 Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳの配列を用いてＢＬＡＳＴ解析により検索されたアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）コード領域の配列関係を、最も近傍の１００個に限定して示す。ａｌｓコード配列は、その由来生物ごとに特定される。 Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳの配列を用いてＢＬＡＳＴ解析により検索されたアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）コード領域の配列関係を、最も近傍の１００個に限定して示す。ａｌｓコード配列は、その由来生物ごとに特定される。 ＰＮＹ２２０４遺伝子座（ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ：：ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１）を示す。 ＰＮＹ２２１１遺伝子座（ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１）を示す。ｐｄｃ１−ｔｒｘ１遺伝子間領域におけるａｌｓＳ遺伝子の組込みは、ベクター、マーカー遺伝子及びｌｏｘＰ配列が失われるため、「スカーレスな（ｓｃａｒｌｅｓｓ）」挿入と見なされる。
本発明は、以下の詳細な説明及び本願の一部をなす添付の配列説明からより十全に理解され得る。
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１条〜第１．８２５条（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９年）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列表要件［規則第５．２条及び第４９．５条（ａの２）及び実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）第２０８条及び付録Ｃ］に則っている。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列データに用いる記号及び形式は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定められる規則に従う。
Figure 0006008858
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配列番号９０〜２２２及び２４３〜２４６は、実施例において使用及び説明される配列である。
配列番号２３８〜２４２は、本明細書で参照されるハイブリッドプロモーター配列である。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、それらの定義を含む本願に従う。文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書で言及される全て刊行物、特許及び他の参考文献が、特許又は特許公開の特定の節のみを参照によって援用することが指示されない限り、個別の各刊行物又は特許出願が参照によって援用されると具体的且つ個別的に指示されたものとして、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
材料、方法及び例は、あくまでも例示に過ぎず、限定する意図はない。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明から、及び特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。
本発明は、ブタノールを生成するための組換え微生物及び方法に関する。本発明は数多くの商業的及び工業的必要性に応える。ブタノールは、様々な用途を有する重要な工業的汎用化学品であり、燃料又は燃料添加剤としてのその可能性が特に顕著である。ブタノールは、四炭素のみのアルコールでありながらガソリンと同程度のエネルギー含量を有し、いかなる化石燃料とも混合することができる。ブタノールは、それを標準的な内燃機関で燃焼させたときＣＯ２のみが発生し、ＳＯＸ又はＮＯＸをほとんど若しくは全く生じないため、燃料又は燃料添加剤として好適である。さらにブタノールは、もう一つの燃料添加剤であるエタノールと比べて腐食性が低い。
バイオ燃料又は燃料添加剤としてのその有用性に加え、ブタノールは、新興の燃料電池産業における水素供給問題に影響を及ぼす可能性がある。現在の燃料電池は、水素の輸送及び供給に関連する安全上の懸念に悩まされている。ブタノールはその水素含量を容易に構成し直すことができ、燃料電池又は車両のいずれに必要な純度も、既存のガソリンスタンドを通じて供給することができる。
特許請求の範囲及び明細書の解釈には、以下の定義及び略記を用いるものとする。
本明細書で使用されるとき、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を備える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を備えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｓ）」、「〜を有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、又は「〜を含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又はこれらの任意の他の変形語は、非排他的又は非制限的であることが意図される。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、その他の、明示的に列挙されていない要素、若しくはかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に固有の要素を含み得る。さらに、反する旨が明記されない限り、「又は」は非排他的又はを指し、排他的又はを指すのではない。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか一つを満たす：Ａが真であり（又は存在し）且つＢが偽である（又は存在しない）、Ａが偽であり（又は存在せず）且つＢが真である（又は存在する）、及びＡ及びＢがともに真である（又は存在する）。
本明細書で使用されるとき、請求項との関連における用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の形式で書かれたクローズドクレームと、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の形式で書かれた完全なオープンクレームとの間の中間的な見地を表すことが意図される。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．第２１１１．０３条を参照のこと。
また、本発明のエレメント又は構成要素に先行する不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、インスタンスの数に関して、すなわちエレメント又は構成要素の出現に関して、非制限的なものであることが意図される。従って「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は少なくとも１つを含むものとして読まれなければならず、単数形の語形のエレメント又は構成要素はまた、数値が明らかに単数であることを意味しない限り、その複数形も含む。
本明細書で使用されるとき、用いられる本発明の成分又は反応物の量を修飾する用語「約」は、例えば、現実の世界で濃縮物の作製又は溶液の使用のために用いられる典型的な計測及び液体操作の手順；それらの手順における不注意による誤り；組成物の作製又は方法の実行のために用いられる成分の製造、供給源、又は純度の違いなどを通じて生じ得る数量のばらつきを指す。用語「約」はまた、特定の初期混合物によってもたらされる組成物の平衡条件の違いに起因して異なる量も包含する。用語「約」によって修飾されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲はそれらの量と等価な量を含む。一実施形態において、用語「約」は、報告される数値の１０％以内、好ましくは報告される数値の５％以内を意味する。
用語「発明」又は「本発明」は、本明細書で使用されるとき、非制限的な用語であり、特定の発明のいずれか単一の実施形態を参照することは意図されず、明細書及び特許請求の範囲に記載されるとおりのあらゆる可能な実施形態を包含する。
用語「ブタノール」は、本明細書で使用されるとき、２−ブタノール、イソブタノール又はそれらの混合物を指す。
用語「イソブタノール生合成経路」は、ピルベートからイソブタノールを生成する酵素経路を指す。
用語「２−ブタノール生合成経路」は、ピルベートから２−ブタノールを生成する酵素経路を指す。
用語「２−ブタノン生合成経路」は、ピルベートから２−ブタノンを生成する酵素経路を指す。
用語「抽出剤」は、本明細書で使用されるとき、発酵ブロスからブタノール及び／又は他の構成成分を抽出するために用いられる１つ以上の有機溶媒を指す。
用語「アセト乳酸シンターゼ」及び「アセト乳酸シンテターゼ」は、本明細書では、ピルベートからアセトラクテート及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指して同義的に使用される。アセト乳酸シンターゼの例は、ＥＣ番号２．２．１．６により公知である（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。これらの酵素は、数多くの供給源から利用可能であり、限定はされないが、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）［ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１５６１８及びＺ９９１２２、それぞれ、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列］、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５０７９及びＭ７３８４２）、及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ２５１６１及びＬ１６９７５）が挙げられる。さらなる例を表１にも提供する。
用語「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」は、α−アセトラクテートからアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（又は複数のポリペプチド）を指す。アセト乳酸デカルボキシラーゼの例はＥＣ ４．１．１．５として公知であり、例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号２１、タンパク質：配列番号２２）、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ＤＮＡ：配列番号２３、タンパク質：配列番号２４）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号１９、タンパク質：配列番号２０）から利用可能である。
用語「アセトインアミナーゼ」は、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（又は複数のポリペプチド）を指す。アセトインアミナーゼは、補因子ピリドキサール５’−リン酸又はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を利用し得る。得られる生成物は、３位に（Ｒ）又は（Ｓ）立体化学を有し得る。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アラニン又はグルタミン酸塩などのアミノ酸をアミノ供与体として使用し得る。ＮＡＤＨ依存性及びＮＡＤＰＨ依存性酵素は、アンモニアを第２の基質として使用し得る。アミノアルコールデヒドロゲナーゼとしても知られるＮＡＤＨ依存性アセトインアミナーゼの好適な例が、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，４３２，６８８号明細書）により記載されている。ピリドキサール依存性アセトインアミナーゼの例は、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３（２００２））により記載されるアミン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（アミン：ピルビン酸トランスアミナーゼとも称される）である。
用語「アミノブタノールキナーゼ」は、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（又は複数のポリペプチド）を指す。アミノブタノールキナーゼは、ＡＴＰをリン酸供与体として利用し得る。同様の基質エタノールアミン及び１−アミノ−２−プロパノールに対して類似の反応を触媒する酵素が報告されている（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３４：１６７−１８２）。米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書は、実施例１４において、エルウィニア・カロトボラ・サブエスピー・アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）のアミノアルコールキナーゼを記載している。
「アミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ」とも称される用語「アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ」は、３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸から２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（又は複数のポリペプチド）を指す。アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼは、補因子ピリドキサール５’−リン酸を利用し得る。同様の基質１−アミノ−２−プロパノールホスフェートに対して類似の反応を触媒する酵素が報告されている（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１３４：１６７−１８２）。米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書は、実施例１５において、新規に同定された、生物エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）由来のアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼを記載している。
「アセトインレダクターゼ」としても知られる用語「ブタンジオールデヒドロゲナーゼ」は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（又は複数のポリペプチド）を指す。ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、広範なアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの一部である。ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、アルコール生成物における（Ｒ）−又は（Ｓ）−立体化学の生成に関して特異性を有し得る。（Ｓ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ １．１．１．７６として公知であり、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号２５、タンパク質：配列番号２６）から利用可能である。（Ｒ）特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ １．１．１．４として公知であり、例えば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号２７、タンパク質：配列番号２８）、及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号２９、タンパク質：配列番号３０）から利用可能である。
用語「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」及び「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」及び「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（ＫＡＲＩ）は、本明細書では、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換を触媒する酵素を指して同義的に使用される。好適な酵素は、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はＮＡＤＰＨを電子供与体として利用する。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの例は、ＥＣ番号１．１．１．８６により公知であり、それらの配列は、限定はされないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１８２２２及びＮＣ＿０００９１３）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１３４５９及びＮＣ＿００１１４４）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ３０２１０及びＢＸ９５７２２０）、及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４７８９及びＺ９９１１８）を含む無数の微生物から利用可能である。
用語「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒する酵素を指す。アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼの例は、ＥＣ番号４．２．１．９により公知である。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４８及びＮＣ＿０００９１３）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２５５０及びＮＣ＿００１１４２）、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＦ２９８７４及びＢＸ９５７２１９）、及びＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４１０５及びＺ９９１１５）を含む無数の微生物から利用可能である。
用語「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」は、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼの例は、ＥＣ番号４．１．１．７２により公知であり、限定はされないが、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０、ＣＡＧ３４２２６、及びＡＪ７４６３６４）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４６１３４６及びＮＣ＿００３１９７）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９１８９及びＮＣ＿００１９８８）を含む数多くの供給源から利用可能である。
用語「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼの例はＥＣ番号１．１．１．２６５により公知であるが、これはまた、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ １．１．１．１又は１．１．１．２）にも分類され得る。これらの酵素はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はＮＡＤＰＨを電子供与体として利用し、限定はされないが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１０６５６、ＮＣ＿００１１３６；ＮＰ＿０１４０５１；及びＮＣ＿００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１７４８４及びＮＣ＿０００９１３）及びＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０；ＮＰ＿３４９８９１、及びＮＣ＿００３０３０）を含む数多くの供給源から利用可能である。
用語「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」は、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子受容体として使用してα−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル補酵素Ａ）への変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．２．４．４により公知である。これらの分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、４つのサブユニットから構成され、いずれのサブユニットの配列も、限定はされないが、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３５、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３４、Ｚ９９１１６、ＣＡＢ１４３３７、及びＺ９９１１６）及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ６５６１４、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１５、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１７、Ｍ５７６１３、ＡＡＡ６５６１８、及びＭ５７６１３）を含む無数の微生物から利用可能である。
用語「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのいずれかを電子供与体として使用してイソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．２．１．１０及び１．２．１．５７により公知である。これらの酵素は、限定はされないが、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＤ３１８４１及びＡＦ１５７３０６）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８、ＮＰ＿１４９１９９、及びＮＣ＿００１９８８）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＡ８９１０６及びＵ１３２３２）、及びサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿１４５４８６及びＮＣ＿００６４６１）を含む複数の供給源から利用可能である。
用語「トランスアミナーゼ」は、アラニン又はグルタミン酸塩のいずれかをアミン供与体として使用してα−ケトイソバレレートからＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。トランスアミナーゼの例は、ＥＣ番号２．６．１．４２及び２．６．１．６６により公知である。これらの酵素は数多くの供給源から利用可能である。アラニン依存性酵素の供給源の例としては、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２３１及びＮＣ＿０００９１３）及びバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０９３７４３及びＮＣ＿００６３２２）が挙げられる。グルタミン酸塩依存性酵素供給源の例としては、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿０２６２４７及びＮＣ＿０００９１３）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０１２６８２及びＮＣ＿００１１４２）及びメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿２７６５４６及びＮＣ＿０００９１６）が挙げられる。
用語「バリンデヒドロゲナーゼ」は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体として、及びアンモニアをアミン供与体として使用してα−ケトイソバレレートからＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を指す。バリンデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．４．１．８及び１．４．１．９により公知であり、限定はされないが、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿６２８２７０及びＮＣ＿００３８８８）及びＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ１４３３９及びＺ９９１１６）を含む数多くの供給源から利用可能である。
用語「バリンデカルボキシラーゼ」は、Ｌ−バリンからイソブチルアミン及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。バリンデカルボキシラーゼの例は、ＥＣ番号４．１．１．１４により公知である。これらの酵素は、例えば、ストレプトミセス・ビリジファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ１０２４２及びＡＹ１１６６４４）などのストレプトミセス類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に見られる。
用語「オメガトランスアミナーゼ」は、好適なアミノ酸をアミン供与体として使用してイソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。オメガトランスアミナーゼの例はＥＣ番号２．６．１．１８により公知であり、限定はされないが、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＰ９２６７２及びＡＹ３３０２２０）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＹＰ＿２９４４７４及びＮＣ＿００７３４７９）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿７１９０４６及びＮＣ＿００４３４７）、及びＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＮ６６２２３及びＡＥ０１６７７６）を含む数多くの供給源から利用可能である。
用語「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」は、ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を指す。この酵素は補酵素Ｂ１２を補因子として使用する。イソブチリル−ＣｏＡムターゼの例は、ＥＣ番号５．４．９９．１３により公知である。これらの酵素は、限定はされないが、ストレプトミセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＡＣ０８７１３、Ｕ６７６１２、ＣＡＢ５９６３３、及びＡＪ２４６００５）、Ｓ．セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＣＡＢ７０６４５、ＡＬ９３９１２３、ＣＡＢ９２６６３、及びＬ９３９１２１）、及びストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿８２４００８、ＮＣ＿００３１５５、ＮＰ＿８２４６３７及びＮＣ＿００３１５５）を含む数多くのストレプトミセス類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に見られる。
用語「実質的に含まない」は、本イソブタノール経路手段に匹敵する炭素経路における酵素活性（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ）の存在又は非存在を参照して用いられるとき、酵素レベルが野生型宿主における同じ酵素と比べて実質的に低いことを意味し、ここでは野生型レベルの約２０％未満が好ましく、野生型レベルの約１５％又は１０％未満がより好ましい。活性は、野生型活性の約５％、４％、３％、２％又は１％未満であってもよい。
用語「通性嫌気性生物」は、好気性及び嫌気性の双方の環境で成長することができる微生物を指す。
用語「炭素基質」又は「発酵性炭素基質」は、本発明の宿主生物により代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、及び一炭素基質又はそれらの混合物からなる群から選択される炭素源を指す。炭素基質の供給源としては、限定はされないが、トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、木材、藻類などの任意の糖又はデンプン含有バイオマス；任意の農業廃棄物又は農業残渣並びに任意のリグノセルロース系及び／又はヘミセルロース系材料を含めた、再生可能資源原料などの任意の原料を挙げることができる。
用語「遺伝子」は、特定のタンパク質として発現する能力を有する核酸断片を指し、場合によりそのコード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）及びその後続の調節配列（３’非コード配列）を含む。「天然遺伝子」は、その独自の調節配列を有して天然で見出されるとおりの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指し、天然で同時に見出されることのない調節配列及びコード配列を含む。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、天然で見出されるものとは異なる形で並んだ調節配列及びコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来遺伝子」又は「異種遺伝子」は、通常は宿主生物に見出されないが、例えば遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子、又は宿主生物に見出され、若しくは宿主生物にとって天然であるが、その機能に影響を及ぼすように何らかの形で修飾されている遺伝子を指す。本明細書に記載されるとおりの染色体に組み込まれたポリヌクレオチドは（天然ポリヌクレオチドであろうと、又は非天然ポリヌクレオチドであろうと）、異種ポリヌクレオチドと見なされる。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含む。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
本明細書で使用されるとき、用語「コード配列」及び「コード領域」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その範囲内、又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造が含まれ得る。
用語「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御する能力を有するＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは全体として天然遺伝子に由来してもよく、又は天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、又はさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。当業者は、異なるプロモーターが遺伝子の発現を、異なる組織又は細胞型で、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件若しくは生理学的条件に応答して誘導し得ることを理解する。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識される。
用語「作動可能に連結された」は、単一の核酸断片上の核酸配列が、一方の機能が他方によって影響を受けるように関係付けられていることを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現が生じることが可能な場合、当該のコード配列と作動可能に連結されている（すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結される。
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」は、核酸断片の宿主生物への導入を指し、これにより遺伝的に安定な遺伝形質がもたらされる。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換」生物と称される。
用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を運び、且つ通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。かかるエレメントは、任意の供給源に由来する、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの、線状又は環状の、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であって、多数のヌクレオチド配列がつなぎ合わされ、又は組み換えられることにより、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入する能力を有する固有の構築物となった配列であり得る。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、外来宿主における当該遺伝子の発現の亢進を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの利用において特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」を十分に理解している。従って、宿主細胞における発現を改良するために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
用語「内在性」は、本明細書で使用されるとき、生物により産生又は合成されるもの、又は生物の環境に加えられるものを指す。
用語「コドンが最適化された」は、それが様々な宿主を形質転換するための核酸分子の遺伝子又はコード領域に関連するとき、そのＤＮＡによりコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映させるための、核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンの改変を指す。かかる最適化は、コドンのうちの少なくとも１つ、又は２つ以上、又は多数を、当該生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つ又は複数のコドンに置き換えることを含む。
本明細書で使用されるとき、「単離核酸断片」又は「単離核酸分子」は同義的に使用され、一本鎖又は二本鎖であり、場合により合成の、非天然の又は改変されたヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。
核酸断片は、適切な温度及び溶液イオン強度条件下で一本鎖形態の核酸断片を他の核酸断片にアニールすることができる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にそのなかのＣｈａｐｔｅｒ １１及びＴａｂｌｅ １１．１（全体として参照により本明細書に援用される）に例示されている。温度及びイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件を調整することで、適度な類似性を有する断片（遠縁の生物由来の相同配列など）乃至高度な類似性を有する断片（近縁の生物由来の、機能的酵素を複製する遺伝子など）をスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄により、ストリンジェンシー条件が決まる。ある一組の条件では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分から開始し、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分を繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分を２回繰り返す一連の洗浄が用いられる。別の一組のストリンジェントな条件では、より高温が用いられ、ここで洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分を２回の洗浄の温度を６０℃に上げることを除いては、上記と同じである。別の一組の高度にストリンジェントな条件では、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で２回の最終洗浄が用いられる。さらなる一組のストリンジェントな条件には、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。
ハイブリダイゼーションでは２つの核酸が相補配列を含む必要があるものの、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間にミスマッチがあってもよい。核酸のハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性が高度であるほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍの値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順に低くなる：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長より大きいハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が導出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲，９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置の重要性が高くなり、その特異性はオリゴヌクレオチドの長さによって決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲，１１．７−１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。別の実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、プローブ長などの要素に従い必要に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者が配列を手作業で評価することによるか、或いはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いた、コンピュータによって自動化された配列比較及び同定より、ポリペプチド又は遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列が含まれる部分である。一般に、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタンパク質又は遺伝子と相同であると推定的に同定するには、１０個以上の連続したアミノ酸又は３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、配列依存的な遺伝子同定方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）及び単離方法（例えば、細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用され得る。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドがＰＣＲの増幅プライマーとして使用され得る。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定及び／又は単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を教示する。ここで当業者は、本明細書に報告されるとおりの配列の有益性により、開示される配列の全て又は実質的な部分を当業者に公知の目的のために使用し得る。従って、本発明は、添付の配列表に報告されるとおりの完全な配列、並びに上記に定義するとおりのそれらの配列の実質的な部分を含む。
用語「相補的な」は、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記載するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関連して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
用語「同一性パーセント」は、当該技術分野において公知のとおり、２つ以上のポリペプチド配列間又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間における、それらの配列を比較して決定されるとおりの関係である。当該技術分野では、「同一性」はまた、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間における、場合によってはかかる配列のストリング間のマッチにより決定されるとおりの、配列の関連性の程度も意味する。「同一性」及び「類似度」は、限定はされないが、（１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；（２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；（３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；（４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；及び（５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含め、公知の方法によって容易に計算することができる。
同一性の好ましい決定方法は、試験する配列間のベストマッチをもたらすように設計される。同一性及び類似度の決定方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコードとして体系化されている。配列アラインメント及び同一性パーセント計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを用いて実行されてもよい。配列の多重アラインメントは、数種類のアルゴリズムを包含する「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を用いて実行され、そのアルゴリズムには、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖという名称のアラインメント方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３，１９８９；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１，１９９２により記載される）に対応し、且つＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムに含まれるＣｌｕｓｔａｌ Ｖアラインメント法」が含まれる。多重アラインメントについて、デフォルト値はギャップペナルティ＝１０及びギャップ長ペナルティ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセント計算のためのデフォルトパラメータは、Ｋタプル＝１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５及びダイアゴナル・セーブド＝５である。核酸についてのこれらのパラメータは、Ｋタプル＝２、ギャップペナルティ＝５、ウィンドウ＝４及びダイアゴナル・セーブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの「配列距離」テーブルを見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。加えて、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法」が利用可能であり、これはＣｌｕｓｔａｌ Ｗという名称のアラインメント方法に対応し（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）により記載される）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムに含まれる。多重アラインメントのデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイディバージェント配列（Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジションウェイト＝０．５、タンパク質ウェイト行列＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡウェイト行列＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの「配列距離」テーブルを見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
当業者には、他の種からのポリペプチドの同定において多くの配列同一性レベルが有用であることが十分に理解され、ここでかかるポリペプチドは、同じ若しくは類似した機能又は活性を有する。有用な同一性パーセントの例としては、限定はされないが、２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が挙げられ、又は本発明の説明において２４％から１００％までの任意の整数の百分率、例えば、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が有用であり得る。好適な核酸断片は上記の相同性を有するのみならず、典型的には、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものであっても、又は独自に開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はされないが：（１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；（２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；（３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；（４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；及び（５）スミス−ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を挙げることができる。本願の文脈の範囲内で、分析に配列分析ソフトウェアが使用される場合、特記されない限り、分析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づき得ることは理解されるであろう。本明細書で使用されるとき「デフォルト値」は、初回の初期化時に最初にソフトウェアにロードされる任意の一組の値又はパラメータを意味する。
本明細書で用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）により；及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）により；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，刊行元Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）により記載されている。さらなる方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にある。他の分子ツール及び技法が当該技術分野において公知であり、それには、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるスプライシング（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３−９８１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子座における突然変異のポジティブ選択（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７，３４５−３４６；Ｍ Ａ Ｒｏｍａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１ Ｊａｎｕａｒｙ １１；１９（１）：１８７）、ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え系並びに突然変異体ｌｏｘ部位及びＦＬＰ基質突然変異（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：２０８７−２０９６；Ｓｅｎｅｃｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１，Ｉｓｓｕｅ ２，Ｐａｇｅｓ ４０５−４２１；Ａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｉｓｓｕｅ ４，６４９−６５９頁）、「シームレス」遺伝子欠失（Ａｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｙｅａｓｔ；２３（５）：３９９−４０５）、及びギャップ修復方法論（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５８：２０１−２１６；１９８１）が含まれる。
ピルベートからアセトラクテートへの変換による生合成経路生成
微生物細胞は糖類からピルベートを生成し、次にピルベートが、図１に示すものを含む細胞代謝の多くの経路で利用される。微生物宿主細胞は、数多くの望ましい生成物を生成するように操作することができ、最初の生合成経路ステップは内因性ピルベートからアセトラクテートへの変換である。イソブタノールを合成するように操作された生合成経路（図２）が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載されており、２−ブタノール及び２−ブタノンを合成するように操作された生合成経路（図３）が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７０２５９４１０号明細書及び同第２００７０２９２９２７号明細書に記載されている。生成物２，３−ブタンジオールは、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書に記載される生合成経路の中間体である。これらの経路の各々が、アセト乳酸シンターゼによりピルベートをアセトラクテートに変換する最初のステップを有する。従って、これらの生合成経路からの生成物収率は、一部には、ピルベートから生成され得るアセトラクテートの量及び利用可能なピルベートの量に依存し得る。
本出願者らは、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が、ピルベート利用生合成経路の生成物（例えば、イソブタノールなどのブタノール）の生成の改善を呈することを見出した。本出願者らは、本発明の宿主細胞が、ポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない細胞と比較して、生成物力価の上昇、生成速度の増加又は細胞密度の増加によって示されるとおりのブタノール生成の改善を呈することを見出した。
実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路と、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関する。実施形態において、ポリヌクレオチドは宿主細胞にとって異種である。実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、その経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。実施形態において、ポリヌクレオチドの１つ以上は宿主細胞の染色体に組み込まれる。
アセト乳酸シンターゼの発現及び組込み
本発明の実施形態において、ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、アセト乳酸シンターゼである。本発明の宿主細胞における内因性アセト乳酸シンターゼは、ミトコンドリアゲノムにおいてコードされ、ミトコンドリアで発現し得る。実施形態では、本発明の組換え宿主細胞（酵母など）を調製するため、アセト乳酸シンターゼのサイトゾル発現を提供する遺伝子修飾が作製される。かかる実施形態において、アセト乳酸シンターゼは核から発現し、ミトコンドリア標的シグナルは含まれず、従って酵素がサイトゾルに留まる（サイトゾル局在化）。アセト乳酸シンターゼのサイトゾル発現は、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書に記載されている。
アセトヒドロキシ酸シンターゼと称することもできるアセト乳酸シンターゼ酵素は、ＥＣ ２．２．１．６に属し（２００２年に４．１．３．１８から変更された）、周知されている。これらの酵素は、タンパク質を新生するアミノ酸ロイシン及びバリンの生合成経路、並びに数多くの生物における２，３−ブタンジオール及びアセトインの発酵生成経路に関与する。
当業者は、様々な供給源から単離されたアセト乳酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、配列相同性とは無関係に本発明において有用であり得ることを理解するであろう。好適なアセト乳酸シンターゼ酵素は、定義に記載されるとおりの数多くの供給源から利用可能である。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のａｌｓＳ及びクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のｂｕｄＢによりコードされるものなどの、ケトブチレートと比べてピルベートに対して基質選択性を有するアセト乳酸シンターゼ酵素活性が、特に有用である（Ｇｏｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（６）：３４４４−３４４９，１９９０；及びＨｏｌｔｚｃｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１（３）：９１７−９２２，１９７５）。
アセト乳酸シンターゼはよく知られているため、且つそのゲノム配列決定が一般的であるため、当業者はバイオインフォマティクス手法を用いた配列類似度に基づき、好適なアセト乳酸シンターゼを容易に同定し得る。典型的には、本明細書に提供されるものなどの既知のアセト乳酸シンターゼアミノ酸配列を含む公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記に記載される）検索を用いて、本株で用い得るアセト乳酸シンターゼ、及びそれらのコード配列が同定される。例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ配列の最も近傍の１００個であるアセト乳酸シンターゼを、図４の系統樹に示す。この樹には、同定された配列間の相同性関係を示す。これらの配列のなかには４０％の同一性を有するものがあるが、それらはアセト乳酸シンターゼであると確認されている。表１におけるアセト乳酸シンターゼタンパク質のいずれかと少なくとも約７０〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％又は少なくとも約９８％又は９９％の配列同一性を有するアセト乳酸シンターゼタンパク質、又は図４に示されるアセト乳酸シンターゼタンパク質のいずれかを、本株で使用することができる。同一性は、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、及びタンパク質ウェイト行列Ｇｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのデフォルトパラメータを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づく。
アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）活性のサイトゾル発現をもたらすために用い得るアセト乳酸シンターゼをコードする配列の例を、表１に掲載する。酵母サイトゾル発現に用い得るさらなるアセト乳酸シンターゼコード配列は、文献及び当業者に周知されているバイオインフォマティクスデータベースにおいて特定することができ、ａｌｓタンパク質についての一部のコード領域を、供給源生物ごとに図４に示す。ＥＣ番号２．２．１．６を有する任意のａｌｓが当業者によって同定され得るとともに、本宿主細胞において用いられ得る。
加えて、本明細書に記載される配列又は当該技術分野で挙げられる配列を使用して、天然における他の相同体を同定することができる。例えば、本明細書に記載されるアセト乳酸シンターゼコード核酸断片の各々を使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離し得る。配列依存性プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は、当該技術分野において公知である。配列依存性プロトコルの例としては、限定はされないが、（１）核酸ハイブリダイゼーション方法；（２）核酸増幅技法の様々な使用によって例示されるとおりの、ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４，１９８５；又は鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２，１９９２］；及び（３）ライブラリ構築及び相補性によるスクリーニング方法が挙げられる。
例えば、本核酸断片の全て又は一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、当業者に公知の方法を用いて任意の所望の生物由来のライブラリをスクリーニングすることにより、本明細書に記載されるアセト乳酸シンターゼコード遺伝子と同様のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を直接単離することができる。開示される核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野において公知の方法により設計及び合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前掲）。さらに、配列全体を直接使用して、当業者に公知の方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡ標識法、ニックトランスレーション又は末端標識法）によりＤＮＡプローブを合成することができ、又は利用可能なインビトロ転写系を用いてＲＮＡプローブを合成することができる。加えて、本配列の一部（又は完全長）を増幅するように特異的プライマーを設計及び使用することができる。得られる増幅産物を増幅反応中に直接標識するか、又は増幅反応後に標識し、プローブとして用いることで、適切なストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションにより完全長ＤＮＡ断片を単離することができる。
典型的に、ＰＣＲタイプの増幅技法では、プライマーは互いに異なる配列を有し、相補的ではない。所望の試験条件によっては、プライマーの配列は、効率的であるとともに忠実でもある標的核酸複製をもたらすように設計しなければならない。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、当該技術分野において公知である（Ｔｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，”ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ Ｅｄ．，１９８６，ｐｐ．３３−５０，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｅｄ．，（１９９３）Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．３１−３９，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
概して記載される配列の２つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸断片のライブラリで実施することもでき、ここで一方のプライマーの配列は記載される核酸断片に由来し、他方のプライマーの配列は、微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
或いは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８））に従い、ＰＣＲを用いて転写物の単一の点と３’末端又は５’末端との間の領域のコピーを増幅することにより、ｃＤＮＡを産生することができる。この配列から、３’方向及び５’方向の向きのプライマーを設計することができる。市販の３’ＲＡＣＥ又は５’ＲＡＣＥシステム（例えば、ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、特定の３’又は５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（Ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３，１９８９；Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７，１９８９）。
或いは、記載されるアセト乳酸シンターゼコード配列を、相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いることができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素には、プローブ、目的の遺伝子又は遺伝子断片を含むと考えられる試料、及び特定のハイブリダイゼーション方法が含まれる。プローブは、典型的には、検出しようとする核酸配列と相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出しようとする核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は５塩基から数万塩基まで様々であってよく、行われる具体的な試験に依存し得る。典型的には約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が好適である。しかしながら、検出しようとする核酸配列と相補的でなければならないのは、プローブ分子の一部のみである。加えて、プローブと標的配列との間の相補性は、完全でなくともよい。ハイブリダイゼーションは相補性が不完全な分子間でも確かに起こり、その結果、ハイブリダイズされた領域における一定の割合の塩基が適切な相補塩基と対を形成しないことになる。
ハイブリダイゼーション方法は十分に定義されている。典型的にはプローブ及び試料が、核酸ハイブリダイゼーションを許容し得る条件下で混合されなければならない。これは、適切な濃度及び温度条件下、無機塩又は有機塩の存在下でプローブと試料を接触させることを含む。プローブ及び試料核酸は、プローブと試料核酸との間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起こり得るのに十分な長い時間にわたり接触していなければならない。ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間は、混合物中のプローブ又は標的の濃度によって決まり得る。プローブ又は標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤が添加されてもよい。カオトロピック剤はヌクレアーゼ活性を阻害することにより核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック剤により、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブを高感度でストリンジェントにハイブリダイズすることが可能となる（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１，１９９１）。好適なカオトロピック剤としては、限定はされないが、特に、塩化グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム及びトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在し得る。必要であれば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）で加えることができる。
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的には、こうした溶液は、約２０〜６０体積％、好ましくは３０体積％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳ又はＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９））、約０．０５〜０．２％のデタージェント（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、又は０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）及び血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、非標識担体核酸約０．１〜５ｍｇ／ｍＬ、断片化された核ＤＮＡ（例えば、仔ウシ胸腺又はサケ精子ＤＮＡ、又は酵母ＲＮＡ）、及び場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌグリシンも含まれる。様々な極性の水溶性又は膨潤性作用剤（例えば、ポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えば、ポリアクリレート又はポリメチルアクリレート）及びアニオン性サッカリドポリマー（例えば、硫酸デキストラン）を含む体積排除剤など、他の添加剤もまた含まれ得る。
核酸ハイブリダイゼーションは、サンドイッチアッセイフォーマットなどの様々なアッセイフォーマットに適合する。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合する。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は、固体支持体である。固体支持体は、それに吸着した、又はそれに共有結合した、固定化された核酸プローブを有し、核酸プローブは標識されておらず、且つ配列のある部分と相補的である。
アセト乳酸シンターゼのサイトゾル発現は、ミトコンドリア標的シグナル配列を含まない、アセト乳酸シンターゼタンパク質をコードする配列を含む遺伝子で形質転換することにより達成され得る。酵母における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）。酵母における遺伝子の発現には典型的には、目的のコード領域に作動可能に連結されたプロモーター、及び転写ターミネーターが必要である。アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子の発現カセットの構築においては、限定はされないが、構成的プロモーターＦＢＡ、ＧＰＤ１、ＡＤＨ１、及びＧＰＭ、並びに誘導性プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、及びＣＵＰ１を含む多くの酵母プロモーターを用いることができる。他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ（配列番号２３８）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ（配列番号２３９）、ＵＡＳ（ＦＢＡ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号２４０）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号２４１）、及びＵＡＳ（ＰＧＫ）−ＯＬＥ１ｐ（配列番号２４２）が挙げられる。好適な転写ターミネーターとしては、限定はされないが、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、及びＡＤＨ１が挙げられる。
好適なプロモーター、転写ターミネーター、及びコード領域は、酵母２ミクロンプラスミドにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる（Ｌｕｄｗｉｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，１３２：３３−４０，１９９３；米国特許出願公開第２００８０２６１８６１Ａ１号明細書）。
好適なプロモーター、転写ターミネーター、及びコード領域は、実施例に記載されるとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる。このようなベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株及び酵母株のいずれにおける菌株の増殖も可能にする。
典型的には、ベクターは、選択可能なマーカーと、所望の宿主における自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列とを含む。酵母で典型的に用いられるプラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、及びｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であり、これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２μ複製起点、及び栄養選択用マーカーを含む。これらの４つのベクターの選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）及びＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。ポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を含む発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における標準的な分子クローニング技術によるか、或いは酵母におけるギャップ修復組換え法により行うことができる。
ギャップ修復クローニング手法は、酵母における高度に効率的な相同組換えを利用する。典型的には、酵母ベクターＤＮＡが消化され（例えばその多重クローニング部位において）、その配列に「ギャップ」が作り出される。目的のインサートＤＮＡが複数産生され、これらのインサートＤＮＡは、５’末端及び３’末端の両方に、互いに及びベクターＤＮＡの５’末端及び３’末端と連続的に重複する≧２１ｂｐ配列を含む。例えば、「遺伝子Ｘ」の酵母発現ベクターを構築するには、発現カセット用に酵母プロモーター及び酵母ターミネーターが選択される。このプロモーター及びターミネーターは酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、及び遺伝子Ｘは、その供給源生物からＰＣＲ増幅されるか、或いは遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られるかのいずれかである。直鎖化されたベクターの５’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、及びターミネーターと直鎖化されたベクターの３’末端との間に、少なくとも２１ｂｐの重複配列が存在する。次に「ギャップ含有（ｇａｐｐｅｄ）」ベクター及びインサートＤＮＡが酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を許容する適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。正しいインサートの組み合わせの存在は、ＰＣＲマッピングにより、選択した細胞から調製されたプラスミドＤＮＡを用いて確認することができる。次に、酵母から単離されたプラスミドＤＮＡ（通常は濃度が低い）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０に形質転換し、続いてミニプレップ及び制限マッピングによってプラスミドコンストラクトをさらに確認することができる。最後にコンストラクトを配列分析によって確認することができる。
ギャップ修復技法と同様に、酵母ゲノムへの組込みもまた、酵母の相同組換えシステムを利用する。典型的には、コード領域と、さらに制御エレメント（プロモーター及びターミネーター）及び栄養要求マーカーを含むカセットが、カセットとハイブリダイズし、且つ挿入が所望されるゲノム範囲の５’側及び３’側領域と配列相同性を有する４０〜７０塩基対を含むプライマーを使用して、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅される。次にＰＣＲ産物が酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むため、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーターコンストラクトがプラスミドＤＮＡコンストラクトからＰＣＲ増幅され、ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）ＰＣＲによるか、或いは一般的な制限消化及びクローニングによって、独立栄養マーカー（ＵＲＡ３など）とつなぎ合わされる。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含む完全なカセットが、酵母染色体上の位置「Ｙ」の５’側及び３’側領域と相同性を有する４０〜７０ｂｐを含むプライマー配列と共にＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシル不含の成長培地で選択される。形質転換体は、コロニーＰＣＲによるか、或いは染色体ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによって確認することができる。或いは、組込みベクターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で構築して増殖させてもよい。任意の好適な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングベクターに、染色体への組込みに必要なエレメント（少なくとも１つの宿主特異的な標的配列及び酵母選択可能マーカー）を加えることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主からベクターを調製した後、それを宿主特異的標的配列内での制限消化によって直鎖化し、酵母に形質転換することができる。直鎖化されたベクターと天然の標的配列との間の相同組換えにより、ベクター全体の組込みが生じ得る（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １９４，ｐｐ．２８１−３０１）。形質転換体は、栄養要求マーカーについて選択することにより得られ、ＰＣＲ法又はダイレクトシーケンシングにより確認される。
実施形態において、本発明は組換え宿主細胞を生成する方法に関し、この方法は、（ｉ）ピルベート利用生合成経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと；（ｉｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するペプチドをコードするポリヌクレオチドとで宿主細胞を形質転換するステップを含み；ここで（ｉｉ）のポリヌクレオチドは染色体に組み込まれる。
生合成経路
ブタノールの生成に好適な生合成経路は、当該技術分野において公知であり、特定の好適な経路が本明細書に記載される。一部の実施形態において、イソブタノールを含めたブタノールの生合成経路は、宿主細胞にとって異種である少なくとも１つの遺伝子を含む。一部の実施形態において、ブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種である２つ以上の遺伝子を含む。一部の実施形態において、ブタノール生合成経路は、生合成経路の全てのステップに対応するポリペプチドをコードする異種遺伝子を含む。本明細書で使用されるとき、異種とは、天然の遺伝子、及び本明細書における目的のため修飾されている非天然の遺伝子の双方を指す。
有利には、本発明の宿主細胞でピルベート利用生合成経路の生成物を産生することができる。かかる生成物のリストには、限定はされないが、２，３−ブタンジオール、２−ブタノン、２−ブタノール、及びイソブタノールが含まれる。実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、その経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれる。
一部の実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと；ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと；ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第３のポリペプチドをコードする第３の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し；ここで第１及び第２の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれ；第３の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれず；及び第１、第２、及び第３のポリペプチドはピルベート利用生合成経路の異なるステップを触媒する。
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと；（ｂ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第３のポリペプチドをコードする第３の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し；ここで第１及び第２の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ；第３の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず；及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと；（ｂ）（ａ）の変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し；ここで第１の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ；第２の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず；及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。
ピルベートからアセトラクテートに変換するステップから始まるイソブタノール合成のための生合成経路が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に開示されている。米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載されるとおり、アセトラクテートを用いる例示的なイソブタノール生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる：
−例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒されるとおりのアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（図２の経路ステップｂ）；
−例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換（図２の経路ステップｃ）；
−例えば分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりのα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換（図２の経路ステップｄ）；及び
−例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりのイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図２の経路ステップｅ）。
本明細書に記載される基質から生成物への変換に用いることのできる遺伝子及びポリペプチド、並びにかかる遺伝子及びポリペプチドを同定する方法は、本明細書及び／又は当該技術分野において、例えばイソブタノールについては本実施例及び米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載されている。ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素については、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０ Ａ１号明細書、同第２００９０１６３３７６ Ａ１号明細書、同第２０１００１９７５１９ Ａ１号明細書、及び国際公開第２０１１／０４１４１５号パンフレットに記載されている。そこで開示されるＫＡＲＩの例は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１、並びに蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５突然変異体由来のものである。ＫＡＲＩは、アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変異体「Ｋ９Ｇ９」及び「Ｋ９Ｄ３」（それぞれアミノ酸配列の配列番号２２５及び２２４）を含む。米国特許出願公開第２０１０００８１１５４ Ａ１号明細書、及び米国特許第７，８５１，１８８号明細書は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）由来のＤＨＡＤを含めた、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）について記載している。α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するのに好適なポリペプチドとしては、それぞれ配列番号２４７、４８、及び２４８を有するリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、及びマクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のものが挙げられる。米国特許出願公開第２００９０２６９８２３ Ａ１号明細書は、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のＳａｄＢ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）について記載している。アルコールデヒドロゲナーゼにはまた、ウマ肝臓ＡＤＨ及びベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ（タンパク質配列番号２３７）も含まれる。上記に参照される出願及び特許の各々は、参照により本明細書に援用される。
また、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書には、開示される生合成経路を用いたイソブタノール生成のための、キメラ遺伝子の構築、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）により例示される酵母の遺伝子操作についても記載される。
一部の実施形態において、イソブタノール生合成経路は、酵母細胞にとって異種である少なくとも１つの遺伝子、少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、又は少なくとも４つの遺伝子を含む。一部の実施形態において、組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路の基質から生成物への変換それぞれについての異種遺伝子を含む。実施形態において、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチド、及び／又はイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、ＮＡＤＨを補因子として利用する能力を有する。
ピルベートをアセトラクテートに変換するステップから始まる２−ブタノン及び２−ブタノール合成のための生合成経路が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７０２５９４１０号明細書及び同第２００７０２９２９２７号明細書に開示されている。開示されている２−ブタノン及び２−ブタノール生合成経路の図を、図３に提供する。２−ブタノンは、最後に示されている、２−ブタノンを２−ブタノールに変換するステップが省略されるときに生じる生成物である。本明細書に開示される株における２−ブタノン又は２−ブタノールの生成では、アセトラクテートの利用率を増加させることが有益である。米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書に記載されるとおり、アセトラクテートを用いる例示的な生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる：
−例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりのアセトラクテートからアセトインへの変換（図３のステップｂ）；
−例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりのアセトインから２，３−ブタンジオールへの変換（図３のステップｉ）；
−例えばジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼにより触媒されるとおりの２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換（図３のステップｊ）；及び
−例えばブタノールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの２−ブタノンから２−ブタノールへの変換（図３のステップｆ）。
これらの酵素の発現に使用することのできる遺伝子が、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書に記載されている。酵母のこの経路におけるロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のブタンジオールデヒドラターゼ、ＲｄｈｔＡ（タンパク質配列番号３２、コード領域配列番号３１）の使用が、米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書に開示されている。この酵素は、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のブタンジオールデヒドラターゼリアクティバーゼ（ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）、ＲｄｈｔＢ（タンパク質配列番号３４、コード領域配列番号３３）と併せて使用される。
米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書に記載されるとおり、アセトラクテートを用いる例示的な生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる：
−例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりのα−アセトラクテートからアセトインへの変換（図３のステップｂ）；
−例えばアセトインアミナーゼにより触媒されるとおりのアセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換（図３のステップｃ）；
−例えばアミノブタノールキナーゼにより触媒されるとおりの３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェートへの変換（図３のステップｄ）；
−例えばアミノブタノールリン酸ホスホル−リアーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｌｙａｓｅ）により触媒されるとおりの３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへの変換（図３のステップｅ）；及び
−例えばブタノールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの２−ブタノンから２−ブタノールへの変換（図３のステップｆ）。
２−ブタノンは、最後に示されている、２−ブタノンを２−ブタノールに変換するステップが省略されるときに生じる生成物である。本明細書に開示される株における２−ブタノン又は２−ブタノールの生成では、アセトラクテートの利用率を増加させることが有益である。
最後の、２−ブタノンを２−ブタノールに変換するステップには、米国特許出願公開第２００９０２６９８２３号明細書に開示されるアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）として同定される細菌の環境単離株から単離される新規ブタノールデヒドロゲナーゼ（ＤＮＡ：配列番号３５、タンパク質配列番号３６）が有用である。
また、米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書には、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７号明細書に開示される生合成経路を用いた２−ブタノール生成のためのキメラ遺伝子の構築及び酵母の遺伝子操作についても記載される。２，３−ブタンジオールは、この２−ブタノール経路の中間体であり、その合成におけるステップもまた上記に記載される。
本発明の実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール又は２−ブタノンを含む生成物を形成する。実施形態において、ピルベート利用生合成経路はブタノール生合成経路である。実施形態において、ブタノール生合成経路は、２−ブタノール生合成経路又はイソブタノール生合成経路である。実施形態において、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；（ｉｖ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド；又は（ｖ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；（ｉｖ）α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ；（ｖ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド；又は（ｖｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；（ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；（ｉｖ）α−ケトイソバレレートからバリン；（ｖ）バリンからイソブチルアミン；（ｖｉ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒド；又は（ｖｉｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
実施形態において、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン；（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール；又は（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞は、（ｉ）ピルベートからアセトラクテート；（ｉｉ）アセトラクテートからアセトイン；（ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオール；（ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；又は（ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
実施形態において、組換え宿主細胞は、（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドであって、染色体に組み込まれるポリヌクレオチドと；（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと；（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含み、ここで宿主細胞はピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まず；及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。
実施形態において、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ １．１．１．８６に対応する。実施形態において、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ ４．２．１．９に対応する。実施形態において、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ ４．１．１．７２又は４．１．１．１に対応する。他の実施形態において、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ １．１．１．２６５、１．１．１．１又は１．１．１．２に対応する。
本発明の他の実施形態において、本明細書に記載される生合成経路ステップのいずれかの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上は、プラスミド上にある。実施形態において、本明細書に記載される生合成経路ステップのいずれかの変換を触媒するポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、ＰＤＣ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域で染色体に組み込まれる。
他の実施形態において、本発明の宿主細胞は、グリセロール−３−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドの発現が低下し、又は実質的に消失していてもよい。実施形態において、グリセロール−３−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドは、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）である。実施形態において、宿主細胞は、グリセロール−３−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。実施形態において、グリセロール−３−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドは、ＥＣ番号１．１．１．８に対応する。実施形態において、グリセロール−３−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＧＰＤ１又はＧＰＤ２である。実施形態において、グリセロール−３−リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、表２のＧＰＤ配列を含む。宿主細胞に対するかかる修飾等については、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書に記載されている。
他の実施形態において、本発明の宿主細胞は、鉄調節タンパク質の発現が低下し、又は実質的に消失していてもよい。実施形態において、本発明の宿主細胞は、鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの発現が低下し、又は実質的に消失していてもよい。実施形態において、組換え宿主細胞は、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；及び（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換；及び／又は（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、ＡＦＴ１（核酸配列番号２２７、アミノ酸配列番号２２８）、ＡＦＴ２（配列番号２２９及び２３０）、ＦＲＡ２（配列番号２３１及び２３２）、ＧＲＸ３（配列番号２３３及び２３４）、又はＣＣＣ１（配列番号２３５及び２３６）によりコードされる。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、構成的突然変異体ＡＦＴ１ Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１ Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１ Ｃ２９１Ｆ、又はＡＦＴ１ Ｃ２９３Ｆである。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＰＳＥ１、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、ＭＳＮ５、又はそれらの組み合わせから選択される。実施形態において、宿主細胞は、鉄調節タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。実施形態において、宿主細胞は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、国際公開第２０１１／１０３３００号パンフレットに開示されるとおりの配列を含む。
本明細書に提供されるとおりのイソブタノール生合成経路などのブタノール生合成経路を含む宿主細胞が、１つ以上の追加的な修飾をさらに含み得ることは理解されるであろう。米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって援用される）は、アセト乳酸シンターゼがサイトゾル限局的に発現し、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が実質的に消失するように酵母を操作することによる、ピルベートからアセトラクテートへの変換の増加を開示している。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾及び／又はピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、若しくは米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節エレメントをコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、エントナー−ドゥドロフ経路を通じた炭素フラックスの増加又は還元当量の平衡をもたらす宿主細胞に対する修飾。他の修飾には、アセト乳酸レダクターゼ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換が含まれる。実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃ（配列番号２２６）又はその相同体である。さらなる修飾には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及び／又はアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、及び／又は置換が含まれる。実施形態において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＬＤ６（配列番号２２３）又はその相同体である。酵母生成宿主細胞がｐｄｃ−である、グルコース抑制を低下させる効果を有する遺伝子修飾が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載されている。加えて、宿主細胞は、参照により本明細書に援用される２０１１年６月１５日に出願された米国特許出願第１３／１６１，１６８号明細書に記載されるとおりの、ホスホケトラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド及び／又はホスホトランスアセチラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み得る。
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低下
微生物細胞における内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性はピルベートをアセトアルデヒドに変換し、次にアセトアルデヒドはエタノールに変換されるか、又はアセテートを介してアセチル−ＣｏＡに変換される（図１を参照）。微生物細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つ以上の遺伝子を有する。例えば、酵母では、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）におけるピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子が存在する一方、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＰＤＣ１、ＰＤＣ５、及びＰＤＣ６遺伝子によりコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つのアイソザイム、並びにピルビン酸デカルボキシラーゼ調節遺伝子ＰＤＣ２が存在する。ＰＤＣ６由来のピルビン酸デカルボキシラーゼの発現は最小限である。本発明の実施形態において、宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、又はピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を調節する遺伝子の破壊により低下したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し得る。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＰＤＣ１及びＰＤＣ５遺伝子、又は３つ全ての遺伝子が破壊される。加えて、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＰＤＣ２調節遺伝子を破壊することによっても低下させることができる。他の酵母では、ＰＤＣ１又はＰＤＣ５と少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、又は少なくとも約９８％の配列同一性を有するものなどの、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードする遺伝子を破壊してもよい。
ピルビン酸デカルボキシラーゼコード遺伝子の破壊によりピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下した酵母株の例は、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）についてＦｌｉｋｗｅｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６）に、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）ついてＢｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（１）：２７−３６，１９９６）に、及びＨｏｈｍａｎｎ（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．，２４１：６５７−６６６，１９９３）における調節遺伝子の破壊など、報告がなされている。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しないサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の株が、ＡＴＣＣから受託番号２０００２７及び２０００２８により入手可能である。
ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現は、同様にアセト乳酸シンターゼ発現及びアセトラクテートに由来する化合物を生成するための他の生合成経路酵素コード遺伝子で操作される任意の宿主細胞で低下させることができる。破壊の標的とし得る酵母ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の例を、表２に掲載する（配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４及び６６）。表２に掲載されるピルビン酸デカルボキシラーゼ（配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５及び６７）と少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、又は少なくとも約９８％若しくは９９％の配列同一性を有するピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするものなど、他の標的遺伝子を文献中及び当業者に周知されるバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。加えて、本明細書に記載される配列又は当該技術分野で挙げられる配列を使用して、アセト乳酸シンターゼコード遺伝子の同定について上記に記載したとおりに、他の酵母株における相同体を同定することができる。
或いは、ピルビン酸デカルボキシラーゼコード配列はよく知られているため、且つ酵母のゲノムの配列決定が一般的であるため、バイオインフォマティクス手法を用いた配列類似度に基づき、好適なピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子標的を同定することができる。以下の酵母株は、ゲノムが完全に配列決定及びアノテートされており、公的に利用可能である：アシュビア・ゴッシピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＡＴＣＣ １０８９５、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）ＣＢＳ １３８、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ Ｙ−１１４０、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＣＢＳ ６０５４、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８ｃ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）９７２ｈ−、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＬＩＢ１２２。典型的には、本明細書に提供されるものなどの、既知のピルビン酸デカルボキシラーゼコード配列又はピルビン酸デカルボキシラーゼアミノ酸配列による公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記に記載される）検索を用いて、他の酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼコード配列が同定される。
従って、本明細書に開示されるピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質（配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５及び６７）のいずれかと少なくとも約７０〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％又は少なくとも約９８％若しくは９９％の配列同一性を有するピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質を提供することは、本発明の範囲内にある。同定は、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、及びタンパク質ウェイト行列Ｇｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づく。
実施形態において、本発明の宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、及び／又は鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの発現が低下しているか、又は実質的に消失していてもよい。他の実施形態において、宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、又はＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドに、欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、又はＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする遺伝子は、任意の宿主細胞において遺伝子修飾を用いて破壊することができる。標的遺伝子を遺伝子修飾する多くの方法が当業者に公知であり、それらを本酵母株の作製に用いることができる。標的タンパク質の発現を低下又は消失させるために用いることのできる修飾は、限定はされないが、遺伝子全体又は遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現しない、又はより低いレベルで発現するように遺伝子に（プロモーター又はコード領域のいずれかにおいて）ＤＮＡ断片を挿入すること、機能タンパク質が発現しないようにコード領域に突然変異を導入して終止コドン又はフレームシフトを加えること、及び非機能性の又は酵素活性が低いタンパク質が発現するようにコード領域に１つ以上の突然変異を導入してアミノ酸を変えることを含む破壊である。加えて、アンチセンスＲＮＡ又は干渉ＲＮＡの発現により、遺伝子の発現が阻害されてもよく、及び同時抑制をもたらすコンストラクトが導入されてもよい。さらに、豊富にあるコドンがまれなコドンに置換されているために発現が低い遺伝子を合成し、内因性遺伝子をこの遺伝子に置換してもよい。かかる遺伝子は同じポリペプチドを産生するが、産生率は低くなり得る。加えて、突然変異によって転写物の合成又は安定性を低下させてもよい。同様に、タンパク質がｍＲＮＡから翻訳される効率も、突然変異により調整することができる。これらの方法は全て、既知の又は同定される遺伝子配列を利用して当業者が容易に実施できるものである。
コード配列を取り囲むＤＮＡ配列もまた一部の修飾手順において有用で、酵母について、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により整理されるＧｅｎｏｍｅ ＰｒｏｊｅｃｔｓのＧｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ ＩＤ９５１８により整理される完全ゲノム配列でＧＯＰＩＤ番号１３８３８を特定することにより、利用可能である。酵母ゲノム配列のさらなる例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の配列ＧＯＰＩＣ番号１３８３７、及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の配列（ＧＰＩＤ番号１０７７１、１０７０１及び１６３７３に含まれる）が挙げられる。他の酵母ゲノム配列を、当業者は公的に利用可能なデータベースに容易に見出し得る。
特に、遺伝子コード配列を取り囲むＤＮＡ配列は、相同組換えを用いる修飾方法に有用である。例えば、この方法では、遺伝子隣接配列が選択可能なマーカー遺伝子を囲んで置かれ、標的遺伝子をマーカー遺伝子に置き換える相同組換えが媒介される。また、部分的な遺伝子配列及び選択可能なマーカー遺伝子を囲む遺伝子隣接配列を使用して、標的遺伝子の一部をマーカー遺伝子に置き換える相同組換えを媒介することもできる。加えて、選択可能なマーカーは、部位特異的組換え部位によって囲まれてもよく、それにより対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、後に再活性化させることなく標的遺伝子座から耐性遺伝子が切り出される。部位特異的組換えの後には、タンパク質の発現を破壊する組換え部位が残る。当業者に周知のとおり、選択可能なマーカーを切り出した後に同様に標的遺伝子に欠失が残るように相同組換えベクターを構築することができる。
欠失は、Ｗａｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ，１０：１７９３−１８０８，１９９４）に記載されるとおり、有糸分裂組換えを用いて作製することができる。この方法は、２０ｂｐ程度の短さであってよい、標的ＤＮＡ配列を取り囲むゲノム領域の間に選択可能なマーカーを含むＤＮＡ断片を調製するステップを含む。このＤＮＡ断片は、マーカー遺伝子の末端とハイブリダイズし、且つ酵母ゲノムにより組み換えることのできるゲノム領域を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、選択可能なマーカー遺伝子をＰＣＲ増幅することにより調製することができる。直鎖状ＤＮＡ断片は、効率的に酵母に形質転換してゲノムに組み換えることができ、標的ＤＮＡ配列の欠失を含む遺伝子置換をもたらす（“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”ｖ１９４，ｐｐ ２８１−３０１，１９９１に記載されるとおり）。
加えて、本発明の任意の宿主細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、又はＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの活性は、ランダム突然変異誘発を用いて破壊することができ、続いてスクリーニングが行われ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下した株が同定される。この種の方法を用いれば、ピルビン酸デカルボキシラーゼコード領域、又はこれらの活性の発現に影響を及ぼす任意の他のゲノム領域のＤＮＡ配列が既知である必要はない。
遺伝子突然変異の作成方法は、当該技術分野においては一般的で周知されており、突然変異体の作成の実施に適用され得る。一般的に用いられるランダム遺伝子修飾方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに概説される）には、自発的突然変異生成、ミューテーター遺伝子により引き起こされる突然変異生成、化学的突然変異生成、紫外線又はＸ線照射、又はトランスポゾン突然変異生成が含まれる。
酵母の化学的突然変異生成は、一般的に、以下のＤＮＡ突然変異原の一つによる細胞の処理を含む：メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸、硫酸ジエチル、又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）。これらの突然変異生成方法は、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に概説されている。ＥＭＳによる化学的突然変異生成は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されるとおり行うことができる。また紫外線（ＵＶ）光又はＸ線の照射を用いて、酵母細胞にランダム突然変異誘発を生じさせることもできる。紫外線照射による突然変異生成の主要な効果は、ＤＮＡ複製の忠実度を破壊するピリミジン二量体の形成である。酵母の紫外線突然変異生成のプロトコルは、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に見ることができる。ミューテーター表現型の導入を用いてもまた、酵母にランダム染色体突然変異を生じさせ得る。一般的なミューテーター表現型は、以下の遺伝子の１つ以上を破壊することにより得られ得る：ＰＭＳ１、ＭＡＧ１、ＲＡＤ１８又はＲＡＤ５１。非ミューテーター表現型の回復は、野生型対立遺伝子を挿入することによって容易に得られ得る。これらの又は他の公知のランダム突然変異誘発法のいずれかによってもたらされる修飾された細胞の集合は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール−３−リン酸デカルボキシラーゼ、鉄調節タンパク質又はＦｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの活性の低下についてスクリーニングされ得る。
宿主細胞
本発明の宿主細胞は、遺伝子操作に適した任意の細胞であってよい。実施形態において、宿主細胞は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、又は酵母であり得る。実施形態において、宿主細胞は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーである。他の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、又はエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）である。
酵母の例としては、限定はされないが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）が挙げられる。酵母株の例としては、限定はされないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。一部の実施形態において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は当該技術分野において公知であり、限定はされないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ ＡＢ、Ｆｅｒｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍａｒｔｒｅｘ，ａｎｄ Ｌａｌｌｅｍａｎｄを含め、様々な供給源から利用可能である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、限定はされないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ バッチ Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｐｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、及びＣＢＳ７９６１が挙げられる。
実施形態において、本発明の宿主細胞は通性嫌気性生物である。実施形態において、生成宿主として使用される細胞は、好ましくは生成された化学物質に対する高い耐性を有し、及び／又は高い炭水化物利用率を有し得る。これらの特徴は、突然変異生成及び選択、遺伝子操作によって付与されてもよく、又は天然であってもよい。
発酵培地
本発明の宿主細胞は、好適な炭素基質を含有し得る発酵培地で成長させることができる。好適な基質としては、限定はされないが、グルコース及びフルクトースなどの単糖類、ラクトース若しくはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプン若しくはセルロースなどの多糖類又はそれらの混合物、並びにチーズホエー透過液、コーンスティープリカー、シュガービート廃糖蜜、及び大麦モルトなどの再生可能原料からの未精製混合物を挙げることができる。加えて、炭素基質はまた、二酸化炭素などの一炭素基質、又は主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールであってもよい。１つ及び２つの炭素基質に加え、メチロトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン及び様々な代謝活性用のアミノ酸など、多数の他の炭素含有化合物を利用し得る。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロース又はグリセロールを形成することが分かっている（Ｂｅｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２．編者：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．発行者：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニン又はオレイン酸を代謝し得る（Ｓｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。従って、本発明で利用される炭素源は、多様な炭素含有基質を包含し得ることが企図される。
炭素源に加え、発酵培地は、当業者に公知の、培養物の成長及び所望の生成物の生成に必要な酵素経路の促進に好適な、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤及び他の成分を含有し得る。
培養条件
典型的には本発明の宿主細胞は、適切な培地中、約２０℃〜約３７℃の範囲の温度で成長させる。本発明における好適な成長培地は、酵母窒素原基礎培地、硫酸アンモニウム、及びデキストロースを炭素／エネルギー源として含むブロス、又はほとんどのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株増殖に最適な比のペプトン、酵母エキス、及びデキストロースのブレンドであるＹＰＤ培地など、一般的な商業的に調製された培地である。他の限定又は合成成長培地もまた使用することができ、特定の微生物の成長に適した培地は、微生物学又は発酵科学の当業者に公知であろう。
発酵に好適なｐＨ範囲は、ｐＨ３．０〜ｐＨ７．５であり得る。初期条件では、ｐＨ４．５．０〜ｐＨ６．５のｐＨ範囲が用いられ得る。
発酵は好気性又は嫌気性条件下で行うことができ、嫌気性又は微好気性条件が好ましい。
発酵培地で生成されるブタノールの量は、当該技術分野において公知の多くの方法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて決定することができる。
工業用バッチ及び連続発酵
本発明の方法は、バッチ発酵方法を用い得る。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵開始時に設定され、発酵中に人為的な改変を受けない閉鎖系である。従って、発酵開始時、培地に所望の１つ又は複数の生物を接種し、その系に何も加えることなく発酵を生じさせる。しかしながら、典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、多くの場合にｐＨ及び酸素濃度などの要素の制御が試みられる。バッチ系では、その系の代謝産物及びバイオマス組成物が、発酵の停止時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は静止遅滞期を通じて調節され、高成長の対数期に至り、最終的に定常期に至って、そこで成長速度が低下し又は停止する。処理されない場合、定常期の細胞は最終的には死滅し得る。対数期の細胞は、概して最終生成物又は中間体の生成のバルクに関与する。
標準的なバッチ系の変種がフェドバッチ系である。フェドバッチ発酵プロセスもまた本発明に好適であり、発酵の進行に伴い基質が徐々に添加される点を除いては、典型的なバッチ系を含む。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、及び培地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の計測は困難であり、従ってｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２などの廃ガスの分圧など、計測可能な因子の変化に基づき推定される。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野において公知であり、参照により本明細書に援用されるＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、又はＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）に例を見ることができる。
加えて、本発明の方法は、連続発酵方法に適合している。連続発酵は開放系であり、ここでは限定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に等量の馴化培地が処理のため取り除かれる。概して連続発酵は培養物を、細胞が主に対数期で成長している一定の高密度に維持する。
連続発酵により、細胞成長又は最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの要因又は任意の数の要因を調節することが可能となる。例えば、一つの方法では、炭素源又は窒素レベルなどの制限栄養素が一定の率に維持され、且つ他のパラメータは全て調節可能とされる。他の系では、培地の濁度により計測される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼす多数の要因を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の成長条件の維持を図り、従って培地の抜き取りによる細胞損失が、発酵における細胞成長速度と釣り合わなければならない。連続発酵プロセスの栄養素及び成長因子を調節する方法、並びに生成物形成速度を最大化する技法は、工業微生物学の技術分野において公知であり、様々な方法が、Ｂｒｏｃｋ，前掲により詳述されている。
本発明は、バッチ、フェドバッチ又は連続プロセスのいずれを用いても実施することができ、任意の公知の発酵方式が好適であり得ることが企図される。加えて、細胞が全細胞触媒として基板上に固定化され、ブタノール生成用の発酵条件に供され得ることが企図される。
発酵培地からの生成物単離方法
本発明の生合成経路の生成物（例えば、ブタノール）は、当該技術分野において公知の方法を用いて発酵培地から単離することができる。例えば、抽出、遠心、ろ過、デカンテーションなどにより、固体を発酵培地から取り除くことができる。次に、上記に記載したとおり固体を取り除く処理がなされた発酵培地から、蒸留、液液抽出、又は膜ベースの分離などの方法を用いて生成物（例えば、ブタノール）を単離することができる。ブタノールは、低沸点の、水との共沸混合物を形成するため、蒸留を用いても、当該の混合物はその共沸組成までしか分離され得ない。蒸留を別の分離方法と組み合わせて用いると、共沸近傍の分離を達成することができる。ブタノールの単離及び精製のために蒸留と組み合わせて用いることのできる方法としては、限定はされないが、デカンテーション、液液抽出、吸着、及び膜ベースの技法が挙げられる。加えて、ブタノールは、共留剤を使用する共沸蒸留を用いて単離することができる（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）。
ブタノール−水混合物は不均一な共沸混合物を形成するため、蒸留をデカンテーションと組み合わせて用いることで、ブタノールを単離及び精製することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物が凝縮され、ブタノールがデカンテーションによって発酵培地から分離される。デカントされた水相は、還流として最初の蒸留カラムに戻されてもよい。デカントされたブタノールリッチな有機相は、第２の蒸留カラムで蒸留によりさらに精製され得る。
ブタノールなどの生成物はまた、液液抽出を蒸留との組み合わせで用いても、発酵培地から単離することができる。この方法では、ブタノールは、好適な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次にブタノール含有有機相を蒸留して、溶媒からブタノールが分離される。
また、蒸留を吸着と組み合わせて用いてもまた、発酵培地からブタノールを単離することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に分子篩などの吸着剤を使用することにより、残りの水が除去される（Ａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ ２００２）。
加えて、蒸留をパーベーパレイションと組み合わせて用いて、ブタノールなどの生成物を発酵培地から単離及び精製することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性の膜によるパーベーパレイションにより、残りの水が除去される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５：１９９−２１０，２００４）。
抽出発酵を用いたブタノールなどの生成物の生成及び発酵ブロスからの回収方法が、２００９年６月４日に出願された米国特許出願第１２／４７８，３８９号明細書、及び対応する米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書、２００９年８月６日に出願された米国仮特許出願第６１／２３１，６９９号明細書、２０１０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３６８，４２９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１００２２１８０２号明細書及び同第２０１１００９７７７３号明細書に詳細に記載されている。かかる方法には、発酵ブロスを、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アミド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、及びそれらの混合物からなる群から選択される水不混和性有機抽出剤と接触させて、水相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップを含むものが含まれる。「接触させる」は、発酵プロセスのなかの任意の時点で、発酵培地と有機抽出剤とを物理的に接触した状態にすることを意味する。
好適な抽出剤の例としては、限定はされないが、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの溶媒を含む抽出剤が挙げられる。一実施形態において、抽出剤はオレイルアルコールを含む。これらの有機抽出剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの様々な供給元から、様々なグレードで市販されており、その多くは抽出発酵で使用してブタノールを生成又は回収するのに好適である。テクニカルグレードは、所望の成分並びに高級及び低級脂肪成分を含めた、化合物の混合物を含有する。例えば、市販されている一つのテクニカルグレードのオレイルアルコールは、約６５％のオレイルアルコールと高級及び低級脂肪アルコールの混合物とを含有する。
実施形態において、本発明はブタノールを生成する方法に関し、この方法は、（ａ）本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｂ）ブタノールが生成される条件下で宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップとを含む。他の実施形態において、この方法は、発酵ブロスを抽出剤と接触させて二相発酵混合物を生成するステップをさらに含む。他の実施形態において、抽出剤は脂肪酸を含む。他の実施形態において、脂肪酸は、トウモロコシ油又はダイズ油に由来する。他の実施形態において、抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アミドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤を含む。他の実施形態において、この方法は、発酵ブロスを有機酸及びその有機酸によるブタノールのエステル化能を有する酵素と接触させるステップをさらに含む。実施形態において、この方法は、発酵ブロスの少なくとも一部を気化させて、水とブタノールとを含む蒸気流を形成するステップをさらに含む。
ブタノール力価及び生成量の測定方法は公知である。例えば、ブタノール力価及び生成量は、例に記載されるとおり、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて計測することができる。実施形態において、本発明の宿主細胞により生成されるブタノールの量は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞によって生成されるブタノールの量と比較したとき、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍だけ多く増加する。実施形態において、本発明の宿主細胞により生成されるブタノールの力価は、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較したとき、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍だけ高く増加する。
実施形態において、本発明は、本明細書に記載される生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードする非組込み型の組換えポリヌクレオチドのコピー数又は発現を増加させる方法に関し、この方法は、本明細書に記載される発酵条件などの、生合成経路の生成物が生成される条件下で、本発明の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップを含む。他の実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路のフラックスを増加させる方法に関し、この方法は、本明細書に記載される発酵条件などの、宿主細胞におけるピルベート利用生合成経路のフラックスが増加する条件下で、本発明の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップを含む。
他の実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路の生成物の形成を増加させる方法に関し、この方法は、（ｉ）本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと；（ｉｉ）ピルベート利用経路の生成物が形成される条件下で宿主細胞を成長させるステップとを含み、ここで組換え宿主細胞により形成される生成物の量は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞により形成される生成物の量より多い。他の実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール又は２−ブタノンを形成する。他の実施形態において、ピルベート利用生合成経路はブタノール生合成経路である。他の実施形態において、ブタノール生合成経路は、（ａ）２−ブタノール生合成経路；又は（ｂ）イソブタノール生合成経路である。
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）本発明の宿主細胞と；（ｉｉ）ブタノールと；（ｉｉｉ）抽出剤とを含む組成物に関する。他の実施形態において、本発明は、（ｉ）本発明の宿主細胞と；（ｉｉ）ブタノールと；（ｉｉｉ）抽出剤と；（ｉｖ）エステル化酵素とを含む組成物に関する。エステル化酵素は、酸とアルコールとの間の反応を触媒してエステルを生じさせる酵素である。最も広義には、エステル化（ｅｓｔｅｒｆｉｃａｔｉｏｎ）酵素はエステル結合に作用するヒドロラーゼであり、多くの場合にエステラーゼと称される。本明細書で使用されるとき、リパーゼは、ブロス中に存在する脂肪酸とイソブタノールとの間のエステル形成において有効であることが示されているエステラーゼのサブクラスである。かかるリパーゼは、１つ以上のエステラーゼ酵素、例えばリパーゼ酵素などのヒドロラーゼ酵素を含み得る。使用されるリパーゼ酵素は、例えば、アブシディア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボーベリア属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、ブロコトリックス属（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロモバクター属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ヒフォジマ属（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタリジウム属（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イノシシ属（Ｓｕｓ）、スポロボロミセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、サーモミセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、チアロスポレラ属（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、及び／又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の株を含めた、任意の供給源に由来することができる。好ましい態様において、リパーゼの供給源は、アブシディア・ブラケスレエナ（Ａｂｓｉｄｉａ ｂｌａｋｅｓｌｅｅｎａ）、アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アクロモバクター・イオファグス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｉｏｐｈａｇｕｓ）、アルカリゲネス・エスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、アルテルナリア・ブラッシシオラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｏｌａ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブロコトリックス・テルモソハタ（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ ｔｈｅｒｍｏｓｏｈａｔａ）、カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）（カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ））、カンジダ・パラリポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）リパーゼＢ、カンジダ・エルノビイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｅｒｎｏｂｉｉ）、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）、クロモバクター・ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｉｕｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ）、フザリウム・ロセウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ジオトリクム・ペニシラツム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｍ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）、フミコラ・ブレビスポラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｂｒｅｖｉｓｐｏｒａ）、フミコラ・ブレビス・バル・テルモイデア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｂｒｅｖｉｓ ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ラクトバチルス・クルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・シクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）、ペニシリウム・クルストスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム・エスピーＩ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．Ｉ）、ペニシリウム・エスピーＩＩ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＩＩ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）（異名バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ））、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、シュードモナス・メフィチカ・リポリティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｐｈｉｔｉｃａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プランタリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌａｎｔａｒｉ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、及びシュードモナス・ウィスコンシネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾプス・ヤポニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス・ミクロスポルス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ノドスス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｏｄｏｓｕｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロミセス・シバタヌス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、スス・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（旧フミコラ・ラヌギノセ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ））、チアロスポレラ・ファセオリナ（Ｔｈｉａｒｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。さらに好ましい態様において、リパーゼは、サーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｃｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、アスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）リパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）リパーゼ、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）リパーゼＢ、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）リパーゼ、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）リパーゼ、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ、ムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）リパーゼ、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、アルカリゲネス・エスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）リパーゼ、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）リパーゼ、カンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）リパーゼ、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）由来のリパーゼＡ及びＢ、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）リパーゼ、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）リパーゼ、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）リパーゼ、リゾプス・デレマル（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼ、及びリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）リパーゼからなる群から選択される。酵素触媒４２として好適な、好適な市販のリパーゼ配合物としては、限定はされないが、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能なＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００ Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）２０００Ｔ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＣＡＬＢ Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）ＣＡＬＡ Ｌ、及びＰａｌａｔａｓｅ ２００００Ｌ、又はＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから入手可能なシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、豚膵、カンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のものが挙げられる。
実施形態において、抽出剤は脂肪酸を含む。実施形態において、脂肪酸はトウモロコシ油又はダイズ油に由来する。他の実施形態において、抽出剤は水不混和性有機抽出剤である。他の実施形態において、抽出剤は、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、又はＣ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒドである。
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示として提供されるに過ぎないことが理解されなければならない。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を把握することができ、及びその趣旨及び精神から逸脱することなく、本発明を様々な使用及び条件に適合させるため本発明の様々な変更及び改良を行うことができる。
一般的方法
本実施例で用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｓｉｌｈａｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，発行者Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹにより記載されている。
細菌培養物の成長及び維持に好適な材料及び方法は、当該技術分野において公知である。以下の実施例で用いるのに好適な技法は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４）のなかに、又はＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９８９）により詳説されるとおり、見出すことができる。微生物細胞を成長させ、及び維持するために使用される全ての試薬、制限酵素及び材料は、特記されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。微生物株は、特に注記されない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手した。全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｓｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成された。合成完全培地については、Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
ＧＣ
ＧＣ方法には、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）からのＨＰ−ＩｎｎｏＷａｘカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ内径、０．２５μｍ膜）を利用した。キャリアガスはヘリウムで、ヘッド圧を一定として１５０℃で計測して１ｍｌ／分の流量であった；注入器スプリットは２００℃で１：１０であった；オーブン温度は、４５℃で１分間、１０℃／分で４５℃から２３０℃に、及び２３０℃で３０秒間であった。ＦＩＤ検出を、４０ｍｌ／分のヘリウムメークアップガスで２６０℃で使用した。培養ブロス試料は注入前に０．２μＭスピンフィルタでろ過した。所望の分析感度に応じて、０．１μｌ又は０．５μｌのいずれかの注入量を用いた。以下の化合物について校正標準曲線を作成した：エタノール、イソブタノール、アセトイン、メソ−２，３−ブタンジオール、及び（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール。分析標準もまた利用して、イソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）、イソ酪酸、及びイソアミルアルコールについて保持時間を特定した。
ＨＰＬＣ
発酵副産物組成の分析は当業者に公知である。例えば、一つの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法は、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−Ｇガードカラムを備えたＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラムを（双方とも、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）、屈折率（ＲＩ）検出と共に利用する。クロマトグラフ分離は、移動相として０．０１ＭのＨ２ＳＯ４を使用して、０．５ｍＬ／分の流量及び５０℃のカラム温度で達成される。イソブタノール保持時間は４７．６分である。
培養培地におけるイソブタノール濃度の決定方法
培養培地のイソブタノール濃度は、当該技術分野において公知の複数の方法により決定することができる。例えば、特定の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法では、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−Ｇガードカラムを備えたＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラム（双方ともＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入）を、屈折率（ＲＩ）検出と共に利用した。クロマトグラフ分離は、移動相として０．０１ＭのＨ２ＳＯ４を使用して、０．５ｍＬ／分の流量及び５０℃のカラム温度で達成した。イソブタノールは、使用した条件下で４６．６分の保持時間を有した。或いは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）方法が利用可能である。例えば、特定のＧＣ方法では、ＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ内径、１μｍ膜厚、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）と共に利用した。キャリアガスはヘリウムで、ヘッド圧を一定として１５０℃で計測して４．５ｍＬ／分の流量であった；注入器スプリットは２００℃で１：２５であった；オーブン温度は、４５℃で１分間、１０℃／分で４５℃から２２０℃、及び２２０℃で５分間であった；及びＦＩＤ検出は、２６ｍＬ／分のヘリウムメークアップガスにより２４０℃で用いた。イソブタノールの保持時間は４．５分であった。
略号の意味は以下のとおりである：「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」はポンド毎平方インチを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、及び「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で計測した光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロベース対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、及び「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。用語「モル選択率」は、１モルの糖基質が消費される毎に生成される生成物のモル数であり、パーセントで報告される。
実施例１
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０８３（「ＮＧＣＩ−０７０」；ＰＮＹ１５０４）の構築
株ＢＰ１０６４は、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ（ＣＢＳ ８３４０；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ
Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，オランダ）から得たもので、以下の遺伝子の欠失を含む：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、及びＧＰＤ２。ＢＰ１０６４をプラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１３４）及びｐＬＨ４６８（配列番号１３５）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３，ＰＮＹ１５０４）を作成した。
コード配列全体を完全に取り除いた欠失を、標的遺伝子の上流及び下流の相同性領域と、形質転換体選択用のＧ４１８耐性マーカー又はＵＲＡ３遺伝子のいずれかとを含むＰＣＲ断片による相同組換えによって作成した。ｌｏｘＰ部位が隣接するＧ４１８耐性マーカーは、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて取り除いた。ＵＲＡ３遺伝子は相同組換えにより取り除いてスカーレス欠失を作成するか、又はｌｏｘＰ部位が隣接する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて取り除いた。
スカーレス欠失の手順は、Ａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３：３９９，２００６から構成した。概して、オーバーラップＰＣＲによって４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることにより、各スカーレス欠失用のＰＣＲカセットを作製した。ＰＣＲカセットは、選択マーカー／カウンター選択マーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）及びターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）と共に含んだ。断片Ａ及びＣは、各々５００ｂｐ長で、標的遺伝子の直ちに上流の５００ｂｐ（断片Ａ）及び標的遺伝子の３’５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応した。断片Ａ及びＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みに使用した。断片Ｂ（５００ｂｐ長）は標的遺伝子の直ちに下流の５００ｂｐに対応し、染色体にカセットを組み込んだときに断片Ｂに対応する配列のダイレクトリピートが作成されるようにして、相同組換えによって染色体からＵＲＡ３マーカー及び断片Ｃを切り出すために使用した。ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを使用して、ＵＲＡ３マーカーを相同組換えにより初めに染色体に組み込み、次に切り出した。最初の組込みにより、３’５００ｂｐを除いて遺伝子が欠失した。切り出すと、遺伝子の３’５００ｂｐ領域もまた欠失した。この方法を用いた遺伝子の組込みについて、組み込む遺伝子は、ＰＣＲカセットの断片ＡとＢとの間に含まれた。
ＵＲＡ３欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるため、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４鋳型ＤＮＡ（配列番号１３６）からＰＣＲ増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーター及びｋａｎＭＸマーカーを含み、ｌｏｘＰ部位が隣接しているため、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換え及びマーカーの除去が可能である。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ並びにプライマーＢＫ５０５及びＢＫ５０６（配列番号１３７及び１３８）を使用して行った。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組込みによってＵＲＡ３コード領域の置換が生じるように、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域及びコード領域の下流の３’領域に由来した。ＰＣＲ産物を、標準的な遺伝学的技法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いてＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄに形質転換し、形質転換体を３０℃のＧ４１８含有ＹＰＤ（１００μｇ／ｍｌ）で選択した。プライマーＬＡ４６８及びＬＡ４９２（配列番号１３９及び１４０）を用いたＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングして組込みが正しいことを確認し、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸと命名した。
ＨＩＳ３欠失
ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、及びＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製した、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して、スカーレスＨＩＳ３欠失用のＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。ＨＩＳ３断片Ａは、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４１）及びＨＩＳ３断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１４２）により増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂは、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１４３）、及びＨＩＳ３断片Ｕの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１４４）により増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕは、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１４５）、及びＨＩＳ３断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１４６）により増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃは、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５８（配列番号１４７）、及びプライマーｏＢＰ４５９（配列番号１４８）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＨＩＳ３断片ＡとＨＩＳ３断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４１）及びｏＢＰ４５５（配列番号１４４）で増幅して、ＨＩＳ３断片ＡＢを作成した。オーバーラップＰＣＲにより、ＨＩＳ３断片ＵとＨＩＳ３断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１４５）及びｏＢＰ４５９（配列番号１４８）で増幅して、ＨＩＳ３断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＨＩＳ３断片ＡＢとＨＩＳ３断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１４１）及びｏＢＰ４５９（配列番号１４８）で増幅して、ＨＩＳ３ ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＨＩＳ３ ＡＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の２％グルコース添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。ｈｉｓ３ノックアウトを含む形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号１４９）及びｏＢＰ４６１（配列番号１５０）でのＰＣＲによりスクリーニングした。正しい形質転換体を、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。
Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカー除去及びΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカー除去
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｋａｎＭＸ Δｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号６６、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載される）で形質転換し、３０℃の２％グルコース添加ヒスチジン及びウラシル不含合成完全培地に播くことにより、ＫａｎＭＸマーカーを取り除いた。３０℃の１％ガラクトース添加ＹＰで形質転換体を６時間成長させて、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＫａｎＭＸマーカーの切り出しを誘導し、３０℃のＹＰＤ（２％グルコース）プレートに播いて回収した。単離物をＹＰＤで一晩成長させ、３０℃の５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地に播いて、ＵＲＡ３マーカーが失われた単離物を選択した。５−ＦＯＡ耐性単離物をＹＰＤで成長させてそこに播き、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを取り除いた。単離物を、ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシル不含合成完全培地プレート、及びヒスチジン不含合成完全培地プレートでの成長を評価することにより、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、及びｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの喪失について確認した。Ｇ４１８に対して感受性を有し、且つウラシル及びヒスチジン栄養要求性であった正しい単離物を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７と命名した。欠失及びマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、Δｕｒａ３用のプライマーｏＢＰ４５０（配列番号１５１）及びｏＢＰ４５１（配列番号１５２）並びにΔｈｉｓ３用のプライマーｏＢＰ４６０（配列番号１４９）及びｏＢＰ４６１（配列番号１５０）でのＰＣＲ及び配列決定により確認した。
ＰＤＣ６欠失
ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、及びＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製した、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して、スカーレスＰＤＣ６欠失用のＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。ＰＤＣ６断片Ａは、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１５３）及びＰＤＣ６断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４１（配列番号１５４）により増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂは、ＰＤＣ６断片Ａの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４２（配列番号１５５）、及びＰＤＣ６断片Ｕの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４３（配列番号１５６）により増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕは、ＰＤＣ６断片Ｂの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４４（配列番号１５７）、及びＰＤＣ６断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４５（配列番号１５８）により増幅した。ＰＤＣ６断片Ｃは、ＰＤＣ６断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４４６（配列番号１５９）、及びプライマーｏＢＰ４４７（配列番号１６０）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＰＤＣ６断片ＡとＰＤＣ６断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１５３）及びｏＢＰ４４３（配列番号１５６）で増幅して、ＰＤＣ６断片ＡＢを作成した。オーバーラップＰＣＲにより、ＰＤＣ６断片ＵとＰＤＣ６断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号１５７）及びｏＢＰ４４７（配列番号１６０）で増幅して、ＰＤＣ６断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＰＤＣ６断片ＡＢとＰＤＣ６断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号１５３）及びｏＢＰ４４７（配列番号１６０）で増幅して、ＰＤＣ６ ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ６ ＡＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の２％グルコース添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。ｐｄｃ６ノックアウトを含む形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号１６１）及びｏＢＰ４４９（配列番号１６２）でのＰＣＲによりスクリーニングした。正しい形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３をＹＰＤで一晩成長させ、３０℃の５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地に播いて、ＵＲＡ３マーカーが失われた単離物を選択した。欠失及びマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号１６１）及びｏＢＰ４４９（配列番号１６２）でのＰＣＲ及び配列決定により確認した。単離物にＰＤＣ６遺伝子が存在しないことが、ＰＤＣ６のコード配列に特異的なプライマーｏＢＰ５５４（配列番号１６３）及びｏＢＰ５５５（配列番号１６４）を使用したネガティブＰＣＲの結果により実証された。正しい単離物をＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１と命名した。
ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ番号７００６１０由来のｉｌｖＤコード領域によって置換した。ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、及びＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製した、鋳型としてのＮＹＬＡ８３（米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書に記載される）ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込み用のＰＣＲカセットの、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）由来のｉｌｖＤコード領域が後続するＡ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号１６５）は、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１６６）及びＰＤＣ１断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１５（配列番号１６７）により増幅した。ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込み用のＰＣＲカセットのＢ断片、Ｕ断片、及びＣ断片は、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、及びＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製した、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂは、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１６（配列番号１６８）、及びＰＤＣ１断片Ｕの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１７（配列番号１６９）により増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕは、ＰＤＣ１断片Ｂの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１８（配列番号１７０）、及びＰＤＣ１断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５１９（配列番号１７１）により増幅した。ＰＤＣ１断片Ｃは、ＰＤＣ１断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５２０（配列番号１７２）、及びプライマーｏＢＰ５２１（配列番号１７３）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍとＰＤＣ１断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１６６）及びｏＢＰ５１７（配列番号１６９）で増幅して、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを作成した。オーバーラップＰＣＲにより、ＰＤＣ１断片ＵとＰＤＣ１断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号１７０）及びｏＢＰ５２１（配列番号１７３）で増幅して、ＰＤＣ１断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢとＰＤＣ１断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１６６）及びｏＢＰ５２１（配列番号１７３）で増幅して、ＰＤＣ１ Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセット（配列番号１７４）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ１ Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の２％グルコース添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組込みを含む形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ
Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号１７５）及びｏＢＰ５１２（配列番号１７６）でのＰＣＲによりスクリーニングした。単離物にＰＤＣ１遺伝子が存在しないことが、ＰＤＣ１のコード配列に特異的なプライマーｏＢＰ５５０（配列番号１７７）及びｏＢＰ５５１（配列番号１７８）を使用したネガティブＰＣＲの結果により実証された。正しい形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３をＹＰＤで一晩成長させ、３０℃の５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地に播いて、ＵＲＡ３マーカーが失われた単離物を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組込み、及びマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号１７５）及びｏＢＰ５１２（配列番号１７６）でのＰＣＲ及び配列決定により確認した。正しい単離物を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７と命名した。
ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のｓａｄＢコード領域によって置換した。初めに、ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組込み用のＰＣＲカセットのセグメントをプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳはｐＵＣ１９ベースであり、多重クローニング部位（ＭＣＳ）内に位置するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＵＲＡ３遺伝子の配列を含む。ｐＵＣ１９は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における複製及び選択用のｐＭＢ１レプリコン及びβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。ＵＲＡ３のコード配列に加え、この遺伝子の上流及び下流からの配列が、酵母においてＵＲＡ３遺伝子を発現させるために含まれた。このベクターはクローニング目的で用いることができ、また、酵母組込みベクターとしても用いることができる。
ＵＲＡ３コード領域を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡ由来のＵＲＡ３コード領域の上流２５０ｂｐ及び下流１５０ｂｐと共に包含するＤＮＡを、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１７９）、及びＸｂａＩ、ＰａｃＩ、及びＮｏｔＩ制限部位を含むｏＢＰ４３９（配列番号１８０）により増幅した。ゲノムＤＮＡを、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ＰＣＲ産物及びｐＵＣ１９（配列番号１８１）を、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりライゲートして、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを作成した。このベクターを、プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１８２）及びｏＢＰ２６５（配列番号１８３）でのＰＣＲ及び配列決定により確認した。
ｓａｄＢ及びＰＤＣ５断片Ｂのコード配列をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングして、ＰＤＣ５ Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ ＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を作成した。ｓａｄＢのコード配列を、ｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号１８４）を鋳型として使用して、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５３０（配列番号１８５）、及びＰＤＣ５断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３１（配列番号１８６）で増幅した。ＰＤＣ５断片Ｂは、ｓａｄＢの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５３２（配列番号１８７）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５３３（配列番号１８８）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ｓａｄＢとＰＤＣ５断片ＢとのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号１８５）及びｏＢＰ５３３（配列番号１８８）で増幅して、ｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩ及びＰｍｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによってｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドを、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号１８９）及びＰＤＣ５断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むｏＢＰ５４６（配列番号１９０）を用いたｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ増幅用の鋳型として使用した。ＰＤＣ５断片Ｃは、ＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４７（配列番号１９１）、及びプライマーｏＢＰ５３９（配列番号１９２）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵとＰＤＣ５断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号１８９）及びｏＢＰ５３９（配列番号１９２）で増幅して、ＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＰＤＣ５ ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを、天然ＰＤＣ５コード配列の直ちに上流の５０ヌクレオチドと相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５４２（配列番号１９４）、及びｏＢＰ５３９（配列番号１９２）で増幅することにより、ＰＤＣ５ Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号１９３）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＰＤＣ５ Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の１％エタノール添加（グルコース不含）ウラシル不含合成完全培地に播いた。ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組込みを含む形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号１９５）及びｏＢＰ５４１（配列番号１９６）でのＰＣＲによりスクリーニングした。単離物にＰＤＣ５遺伝子が存在しないことが、ＰＤＣ５のコード配列に特異的なプライマーｏＢＰ５５２（配列番号１９７）及びｏＢＰ５５３（配列番号１９８）を使用したネガティブＰＣＲの結果により実証された。正しい形質転換体を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。
ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３をＹＰＥ（１％エタノール）で一晩成長させ、３０℃のエタノール添加（グルコース不含）且つ５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地に播いて、ＵＲＡ３マーカーが失われた単離物を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組込み、及びマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号１９５）及びｏＢＰ５４１（配列番号１９６）でのＰＣＲにより確認した。正しい単離物を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３と命名した。
ＧＰＤ２欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるため、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ ＰＣＲ（配列番号２００）を鋳型ＤＮＡとして使用して、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１３１）をＰＣＲ増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位が隣接する（ＡＴＣＣ番号７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーを含む。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーＬＡ５１２及びＬＡ５１３（配列番号２０１及び２０２）を使用して行った。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組込みがＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域及びそのコード領域の下流の３’領域に由来するものとした。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、１％エタノール添加（グルコース不含）ウラシル不含合成完全培地で形質転換体を選択した。プライマーｏＢＰ５８２及びＡＡ２７０（配列番号１９８及び２０３）を用いたＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングして、組込みが正しいことを確認した。
ＵＲＡ３マーカーを、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号２０４）で形質転換し、３０℃の１％エタノール添加ヒスチジン不含合成完全培地に播くことにより再利用した。形質転換体を１％エタノール添加且つ５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地にストリークし、３０℃でインキュベートして、ＵＲＡ３マーカーが失われた単離物を選択した。５−ＦＯＡ耐性単離物をＹＰＥ（１％エタノール）で成長させて、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを取り除いた。欠失及びマーカー除去を、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号１９８）及びｏＢＰ５９１（配列番号２０５）でのＰＣＲにより確認した。正しい単離物を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ Δｕｒａ３：：ｌｏｘＰ Δｈｉｓ３ Δｐｄｃ６ Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ Δｐｄｃ５：：ｓａｄＢ Δｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＢＰ１０６４（ＰＮＹ１５０３）と命名した。
ＢＰ１０６４をプラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１３４）及びｐＬＨ４６８（配列番号１３５）で形質転換して、株ＮＧＣＩ−０７０（ＢＰ１０８３；ＰＮＹ１５０４）を作成した。
ｐＹＺ０９０は、ｐＨＲ８１（ＡＴＣＣ番号８７５４１、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）骨格ベースであり、ＡＬＳを発現するための、酵母ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ ２位〜４４９位）から発現し、且つＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ ２１８１位〜２４３０位）が続くバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｌｓＳ遺伝子のコード領域（ｎｔ ４５７位〜２１７２位）を有するキメラ遺伝子と、ＫＡＲＩを発現するための、酵母ＩＬＶ５プロモーター（２４３３位〜３６２６位）から発現し、且つＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ ４６８２位〜５３０４位）が続く、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のｉｌｖＣ遺伝子のコード領域（ｎｔ ３６３４位〜４６５６位）を有するキメラ遺伝子とを含むように構築した。ｐＬＨ４６８プラスミド（配列番号２）は、酵母におけるＤＨＡＤ、ＫｉｖＤ及びＨＡＤＨの発現用に構築されたもので、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書に記載されている。
実施例２
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１１３５及びＰＮＹ１５０７の構築並びにイソブタノール生成誘導体
この実施例の目的は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１１３５及びＰＮＹ１５０７を構築することであった。これらの株はＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）に由来した。ＰＮＹ１５０３は、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ（ＣＢＳ ８３４０；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ，オランダ）に由来した。ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）の構築については上記に記載する。ＢＰ１１３５は、ＦＲＡ２遺伝子のさらなる欠失を含む。ＰＮＹ１５０７はＢＰ１１３５に由来し、ＡＤＨ１遺伝子のさらなる欠失を含み、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現にコドンが最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のｋｉｖＤ遺伝子がＡＤＨ１遺伝子座に組み込まれたものであった。
標的遺伝子の上流及び下流の相同性領域と、形質転換体選択用のＵＲＡ３遺伝子とを含むＰＣＲ断片による相同組換えにより、概してコード配列全体が取り除かれた欠失を作成した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより取り除き、スカーレス欠失を作成した。同様にして、遺伝子組込みを作成した。
スカーレス欠失の手順は、Ａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３：３９９，２００６から構成した。概して、オーバーラップＰＣＲによって４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを組み合わせることにより、各スカーレス欠失用のＰＣＲカセットを作製した。ある場合には、初めに個々の断片をプラスミドにクローニングしてから、欠失／組込み手順のためカセット全体をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲカセットは、選択マーカー／カウンター選択マーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター領域（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）及びターミネーター領域（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）と共に含んだ。断片Ａ及びＣは、各々ほぼ５００ｂｐ長で、標的遺伝子の直ちに上流の５００ｂｐ（断片Ａ）及び標的遺伝子の３’５００ｂｐ（断片Ｃ）に対応した。断片Ａ及びＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みに使用した。断片Ｂ（５００ｂｐ長）は標的遺伝子の直ちに下流の５００ｂｐに対応し、染色体にカセットを組み込んだときに断片Ｂに対応する配列のダイレクトリピートが作成されるようにして、相同組換えによって染色体からＵＲＡ３マーカー及び断片Ｃを切り出すために使用した。
ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを使用して、ＵＲＡ３マーカーを相同組換えにより初めに染色体に組み込み、次に切り出した。最初の組込みにより、３’５００ｂｐを除いて遺伝子が欠失した。切り出すと、遺伝子の３’５００ｂｐ領域もまた欠失した。この方法を用いた遺伝子の組込みについて、組み込む遺伝子は、ＰＣＲカセットの断片ＡとＢとの間に含まれた。
ＦＲＡ２欠失
ＦＲＡ２欠失は、コード配列の３’末端から２５０ヌクレオチドが欠失し、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３ヌクレオチドがインタクトなまま残るように設計した。インフレームの終止コドンが、欠失の７ヌクレオチド下流に存在した。ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、及びＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製した、鋳型としてのＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して、スカーレスＦＲＡ２欠失用のＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。ＦＲＡ２断片Ａは、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９９）及びＦＲＡ２断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９５（配列番号１００）により増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂは、ＦＲＡ２断片Ａの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９６（配列番号１０１）、及びＦＲＡ２断片Ｕの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９７（配列番号１０２）により増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕは、ＦＲＡ２断片Ｂの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９８（配列番号１０３）、及びＦＲＡ２断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９９（配列番号１０４）により増幅した。ＦＲＡ２断片Ｃは、ＦＲＡ２断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ６００（配列番号１０５）、及びプライマーｏＢＰ６０１（配列番号１０６）により増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＦＲＡ２断片ＡとＦＲＡ２断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９９）及びｏＢＰ５９７（配列番号１０２）で増幅して、ＦＲＡ２断片ＡＢを作成した。オーバーラップＰＣＲにより、ＦＲＡ２断片ＵとＦＲＡ２断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号１０３）及びｏＢＰ６０１（配列番号１０６）で増幅して、ＦＲＡ２断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＦＲＡ２断片ＡＢとＦＲＡ２断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号９９及びｏＢＰ６０１（配列番号１０６）で増幅して、ＦＲＡ２ ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
ＰＮＹ１５０３のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＦＲＡ２ ＡＢＵＣ ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の１％エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。ｆｒａ２ノックアウトを含む形質転換体を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１０７）及びｏＢＰ６０３（配列番号１０８）でのＰＣＲによりスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（酵母エキス、ペプトン、１％エタノール）で成長させ、３０℃の５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地に播いて、ＵＲＡ３マーカーが失われた単離物を選択した。欠失及びマーカー除去を、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１０７）及びｏＢＰ６０３（配列番号１０８）でのＰＣＲにより確認した。単離物にＦＲＡ２遺伝子が存在しないことが、欠失させたＦＲＡ２コード配列に特異的なプライマーｏＢＰ６０５（配列番号１０９）及びｏＢＰ６０６（配列番号１１０）を用いたネガティブＰＣＲの結果により実証された。正しい単離物を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δ ｐｄｃ６Δ ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δとして選択し、ＰＮＹ１５０５（ＢＰ１１３５）と命名した。この株をイソブタノール経路プラスミド（ｐＹＺ０９０、配列番号１３４）及びｐＬＨ４６８（２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書）で形質転換し、一つのクローンをＢＰ１１６８（ＰＮＹ１５０６）と命名した。
ＡＤＨ１欠失及びｋｉｖＤ Ｌｌ（ｙ）組込み
ＡＤＨ１遺伝子を欠失させ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現にコドンを最適化したラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のｋｉｖＤコード領域によって置換した。初めに、ＡＤＨ１欠失−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組込み用のスカーレスカセットを、参照により本明細書に援用される２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書に記載されるとおり、プラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現にコドンを最適化したラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のｋｉｖＤコード領域を、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１１）、及びＡＤＨ１断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６３（配列番号１１２）により、ｐＬＨ４６８（２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書）を鋳型として使用して増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂは、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６４（配列番号１１３）、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６５（配列番号１１４）で、上記のとおり調製したゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）とＡＤＨ１断片ＢとのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１１）及びｏＢＰ５６５（配列番号１１４）で増幅して、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＡＤＨ１断片Ａは、ＳａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０５（配列番号１１５）、及びＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０６（配列番号１１６）によりゲノムＤＮＡから増幅した。ＡＤＨ１断片ＡのＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ＡＤＨ１断片Ｃは、ＰａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０７（配列番号１１７）、及びＳａｌＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０８（配列番号１１８）によりゲノムＤＮＡから増幅した。ＡＤＨ１断片ＣのＰＣＲ産物をＰａｃＩ及びＳａｌＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１を、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７４（配列番号１１９）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７５（配列番号１２０）で、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳ（以下に記載される；配列番号２０６）から増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１のＰＣＲ産物をＡｓｃＩ及びＰｍｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドから、プライマーｏＢＰ５０５（配列番号１１５）及びｏＢＰ５０８（配列番号１１８）で組込みカセット全体を増幅し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
ＰＮＹ１５０５のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、上記で構築したＡＤＨ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の１％エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）で成長させ、３０℃の５−フルオロオロチン酸（０．１％）含有合成完全培地に播いて、ＵＲＡ３マーカーが失われた単離物を選択した。ＡＤＨ１の欠失及びｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の組込みを、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、外部プライマーｏＢＰ４９５（配列番号１２１）及びｏＢＰ４９６（配列番号１２２）、並びにｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）特異的プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１１１）及び外部プライマーｏＢＰ４９６（配列番号１２２）でのＰＣＲにより確認した。正しい単離物を、株ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δ ｐｄｃ６Δ ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δ ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔとして選択し、ＰＮＹ１５０７（ＢＰ１２０１）と命名した。ＰＮＹ１５０７をイソブタノール経路プラスミドｐＹＺ０９０（配列番号１３４）及びｐＢＰ９１５（以下に記載される）で形質転換した。これらの誘導体によるイソブタノール生成について、以下に記載する。
ｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳベクターの構築
カセットＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ（配列番号１２９）をクローニングするため、初めに６０２ｂｐのＦＢＡ１プロモーター（ＦＢＡ１ｐ）を、プライマーＴ−ＦＢＡ１（ＳａｌＩ）（配列番号１２３）及びＢ−ＦＢＡ１（ＳｐｅＩ）（配列番号１２４）でＣＥＮ．ＰＫのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、プラスミドのＳａｌＩ／ＳｐｅＩ消化によってＰＧＫ１ｐプロモーターを取り除いた後、プラスミドｐＷＳ３５８−ＰＧＫ１ｐ−ＧＵＳ（配列番号１３０）のＳａｌＩ及びＳｐｅＩ部位にクローニングして、ｐＷＳ３５８−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳを得た。ｐＷＳ３５８−ＰＧＫ１ｐ−ＧＵＳプラスミドは、ＰＧＫ１ｐ及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）ＤＮＡ断片をｐＷＳ３５８の多重クローニング部位に挿入することにより生成し、ｐＷＳ３５８はｐＲＳ４２３ベクターに由来した（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１１０：１１９−１２２，１９９２）。第二に、得られたｐＷＳ３５８−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳプラスミドをＳａｌＩ及びＳａｃＩで消化し、ＦＢＡ１ｐプロモーター、ＧＵＳ遺伝子、及びＦＢＡｔターミネーターを含むＤＮＡ断片をゲル精製し、及びｐＲＳ３１６上のＳａｌＩ／ＳａｃＩ部位にクローニングしてｐＲＳ３１６−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳを作成した。第三に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）オープンリーディングフレームの上流−５１９位と−４０２位との間に位置する上流活性化配列（ＵＡＳ）を含む１１８ｂｐのＤＮＡ断片、すなわちＵＡＳ（ＰＧＫ１）を、プライマーＴ−Ｕ／ＰＧＫ１（ＫｐｎＩ）（配列番号１２５）及びＢ−Ｕ／ＰＧＫ１（ＳａｌＩ）（配列番号１２６）でＣＥＮ．ＰＫのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化し、ｐＲＳ３１６−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳ上のＫｐｎＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングしてｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ−ＧＵＳを作成した。
実施例３
ＰＮＹ２２０４及びイソブタノール生成誘導体の構築
この実施例の目的は、染色体ＸＩＩにおけるＰＤＣ１とＴＲＸ１とのコード配列間に天然に存在する遺伝子間領域へのアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子の組込みを可能にするベクターの構築について記載することである。
組込みベクターｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１の構築
１．７ｋｂのＢｂｖＣＩ／ＰａｃＩ断片をｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ：：ａｌｓＳ：：ＣＹＣ（米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書）からｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ：：ＩＬＶ５：：ＣＹＣ（米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書、ＩＬＶ５遺伝子を遊離させるためＢｂｖＣＩ／ＰａｃＩで予め消化した）に移すことにより、ＦＢＡ−ａｌｓＳ−ＣＹＣｔカセットを構築した。ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、プライマーＮ９８ＳｅｑＦ１（配列番号９１）及びＮ９９ＳｅｑＲ２（配列番号９３）を用いたＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングした。ＦＢＡ−ａｌｓＳ−ＣＹＣｔカセットを、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩを使用してベクターから単離し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１（参照により本明細書に援用される２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書、クローン「Ｂ」に記載されるとおり；本明細書では配列番号２４３）のＡｆｌＩＩ部位（クレノウ断片を用いて末端をライゲーションに適合させた）にクローニングした。ベクターにおいて両方向のａｌｓＳカセットを含む形質転換体が得られ、ＰＣＲにより、構成「Ａ」についてはプライマーＮ９８ＳｅｑＦ４（配列番号９２）及びＮ１１１１（配列番号９７）を使用して、並びに構成「Ｂ」についてはＮ９８ＳｅｑＦ４（配列番号９２）及びＮ１１１０（配列番号９６）を使用して確認した。次に、ＵＲＡ３遺伝子（１．２ｋｂのＮｏｔＩ／ＮａｅＩ断片）を除去して、ｐＵＣ１９ベクターに保持された（ＳｍａＩ部位にクローニングした）ジェネティシンカセット（本明細書では配列番号２４４；以前に、参照により本明細書に援用される２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書に記載されている）を付加することにより、ジェネティシン選択型の「Ａ」構成ベクターを作製した。ｋａｎ遺伝子を、初めにＫｐｎＩで消化し、クレノウ断片（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ２１２）を用いて３’オーバーハングＤＮＡを除去し、ＨｉｎｃＩＩで消化して、次に１．８ｋｂの遺伝子断片をゲル精製（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット、カタログ番号Ｄ４００１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ；配列番号２４５）することにより、ｐＵＣ１９から単離した。クレノウ断片を用いて全ての末端をライゲーションに適合させ、及びプライマーＢＫ４６８（配列番号９０）及びＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号９４）を使用して、ＰＣＲにより形質転換体をスクリーニングし、先のＵＲＡ３マーカーと同じ向きのジェネティシン耐性遺伝子を有するクローンを選択した。得られたクローンは、ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１（クローンＡ）（配列番号１３１）と命名した。
ａｌｓＳ組込み株及びイソブタノール生成誘導体の構築
上記に記載されるｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ組込みベクターをＰｍｅＩで直鎖化し、ＰＮＹ１５０７（上記の実施例１に記載される）に形質転換した。ＰｍｅＩは、クローニングされたｐｄｃ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域内でベクターを切断し、従ってその位置に標的化した組込みをもたらす（Ｒｏｄｎｅｙ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ．２８１−３０１）。形質転換体をＹＰＥ＋５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８で選択した。パッチした形質転換体を、プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号９４）及びｏＢＰ５１２（配列番号９８）を使用したＰＣＲにより、組込みイベントについてスクリーニングした。２つの形質転換体を、それらの株のイソブタノール産生能力を評価することにより、アセト乳酸シンターゼ機能について間接的に試験した。このため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター（ｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５、以下に記載される）に、さらなるイソブタノール経路遺伝子を提供した。一方のクローン、株ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δ ｐｄｃ６Δ ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−ｐＵＣ１９−ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δ ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔをＰＮＹ２２０４と命名した。プラスミドを含まない親株をＰＮＹ２２０４と命名した。ＰＮＹ２２０４遺伝子座（ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ：：ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１）を図５に示す。
イソブタノール経路プラスミド（ｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５）
ｐＹＺ０９０（配列番号１３４）をＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＣＵＰ１プロモーターの大部分及びａｌｓＳコード配列の全て及びＣＹＣターミネーターを取り除いた。次に、クレノウ断片で処理した後にベクターをセルフライゲートし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換することにより、アンピシリン耐性について選択した。２つの独立したクローンについて、プライマーＮ１９１（配列番号９５）を使用したＰＣＲによるライゲーション接合点にわたるＤＮＡ配列決定により、ＤＮＡ領域が取り除かれたことが確認された。得られたプラスミドをｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号１３２）と命名した。
ｐＬＨ４６８（配列番号１２４）から、ｋｉｖＤ遺伝子及びｋｉｖＤの上流の９５７塩基対のＴＤＨ３プロモーターを欠失させることによってｐＢＰ９１５を構築した。ｐＬＨ４６８をＳｗａＩで消化し、大きい断片（１２８９６ｂｐ）をアガロースゲルと、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。単離されたＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼでセルフライゲートし、これを用いてエレクトロコンピテントＴＯＰ１０大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換した。形質転換体からのプラスミドを単離し、ＳｗａＩ制限酵素による制限解析により、欠失が正しいことを確かめた。単離物もまた、プライマーｏＢＰ５５６（配列番号１２７）及びｏＢＰ５６１（配列番号１２８）により、欠失部位にかけて配列決定した。正しい欠失を有するクローンを、ｐＢＰ９１５（ｐＬＨ４６８ΔｋｉｖＤ）（配列番号１３３）と命名した。
実施例４
ｋｉｖＤ遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成
この実施例の目的は、プラスミドに含まれるｋｉｖＤを有する株と比較した、ｋｉｖＤ遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成を示すことである。ｋｉｖＤが組み込まれていない、プラスミドｐＹＺ０９０及びｐＬＨ４６８を有する株を、プラスミドｐＹＺ０９０及びｐＢＰ９１５を有する組込み株ＰＮＹ１５０７と比較した。培地成分は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯからのものであった。株を、７６ｍｇ／Ｌ トリプトファン、３８ ０ｍｇ／Ｌ ロイシン、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、２０ｍｇ／Ｌ ニコチン酸、２０ｍｇ／Ｌ 塩酸チアミン、０．２％グルコース、及び０．２％エタノールを添加した合成培地（アミノ酸不含の酵母窒素原基礎培地、並びにウラシル、ヒスチジン、トリプトファン、及びロイシン不含の酵母合成ドロップアウト培地サプリメント）で成長させた。一晩培養物を、１２５ｍｌ通気エルレンマイヤーフラスコの中８ｍｌの培地中、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉ２４振盪機において３０℃、２５０ＲＰＭで成長させた。１２５ｍＬのしっかり蓋をしたエルレンマイヤーフラスコ中１９ｍＬの培地に一晩培養物を、ＯＤ６００が０．５になるまで接種し、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉ２４振盪機において３０℃、２５０ＲＰＭで８時間成長させた。グルコースを２％まで添加した（時間０時間）。４８時間後、培養上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルタユニット、Ｃｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して回収した）を、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載される方法のとおりにＨＰＬＣにより分析した。結果を表３に示す。ｋｉｖＤ遺伝子コピーが組み込まれた株は、プラスミドに含まれるｋｉｖＤを有する株と比較して同程度のイソブタノール力価を有する。
Figure 0006008858
実施例５
ａｌｓＳ遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成
この実施例の目的は、プラスミドからアセト乳酸シンターゼを取り除いて酵母ゲノムに組み込む場合における、イソブタノール生成の増加を示すことである。ａｌｓＳが組み込まれていない株（プラスミドｐＹＺ０９０及びｐＢＰ９１５を有するＰＮＹ１５０７）を、組込み株（プラスミドｐＹＺ０９０ＤａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５を有するＰＮＹ２２０４）と比較した。株は全て、ヒスチジン及びウラシル不含の、炭素源として０．３％グルコース及び０．３％エタノールを含有する合成完全培地（１２５ｍＬ通気エルレンマイヤーフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０）中１０ｍＬ培地）で成長させた。一晩インキュベートした後（Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０ Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍ）、培養物を、２％グルコース及び０．０５％エタノール含有合成完全培地で（１２５ｍＬのしっかり蓋をしたエルレンマイヤーフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０）中、２０ｍｌの培地）、０．２ＯＤ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒの測定）まで希釈し戻した。４８時間インキュベートした後（Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０ Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍ）、培養上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルタユニット、Ｃｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を使用して回収した）を、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載される方法のとおりにＨＰＬＣにより分析した。結果を以下の表４に示す。ａｌｓＳ遺伝子コピーが組み込まれた株のイソブタノール力価は、ａｌｓＳを組み込んでいないイソブタノール力価より大幅に高かった。
Figure 0006008858
実施例６
ａｌｓＳ遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成
この実施例の目的は、プラスミドからアセト乳酸シンターゼを取り除いて酵母ゲノムに組み込む場合における、細胞密度及びイソブタノール生成の増加を示すことである。ａｌｓＳが組み込まれていない株（２０１０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，５４６号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりのＰＮＹ１５０４、及びＰＮＹ１５０６）を、組込み株ＰＮＹ２２０５（ｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５プラスミドで形質転換された、且つａｌｓＳ組込みを有するＰＮＹ２２０４）と比較した。
接種及びバイオリアクター培地
６．７ｇのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ ０９１９−１５−３）；２．８ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ Ｙ２００１）；２０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン；４ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；０．８ｍＬのエルゴステロール及びツイーン溶液；３ｇのエタノール；及び３ｇのグルコースを含有する酵母接種培地（１Ｌ）を調製した。１０ｍＬエルゴステロール及びツイーン溶液については、１００ｍｇのエルゴステロールを５ｍＬの１００％エタノール及び５ｍＬのツイーン８０に溶解した。溶液を７０℃で１０分間加熱した。
凍結バイアルから、全バイアル培養物（約１ｍｌ）を１０ｍＬの接種培地にピペッティングすることにより、１２５ｍＬ振盪フラスコを直接接種した。このフラスコを２６０ｒｐｍ及び３０℃でインキュベートした。株を、ＯＤが約１．０になるまで一晩成長させた。ＨＥλＩＯＳ α 分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）で、λ＝６００ｎｍにおけるＯＤを決定した。この時点で、１１０ｍＬの接種培地が入った２Ｌ振盪フラスコを、一晩培養物から接種した。２Ｌフラスコにおける出発ＯＤは０．１であった。フラスコを２６０ｒｐｍ及び３０℃でインキュベートした。振盪フラスコのＯＤが約１．０に達したとき、振盪フラスコに、２０ｍＬの１Ｍ ＭＥＳ緩衝液、２０ｍＬの１０×酵母エキス及びペプトン（ＹＥＰ）、最終濃度３０ｇ／Ｌまでのグルコース及び約１６０ｍｌのオレイルアルコール（９０〜９５％、Ｃｏｇｎｉｓ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ ＯＨ，米国）を添加した。２４時間後、オレイルアルコールを除去し、バイオリアクターを接種した。
１００ｇの酵母エキス及び２００のペプトンを１Ｌの最終容量まで水に溶解することにより、１０×ＹＥＰ溶液を調整した。
以下を含有するバイオリアクター培地（１Ｌ）を調製した：
（ｉ）塩：硫酸アンモニウム５．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．８ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．９ｇ、硫酸亜鉛七水和物０．２ｇ；
（ｉｉ）ビタミン：ビオチン（Ｄ−）０．４０ｍｇ、リン酸Ｃａ Ｄ（＋）８．００ｍｇ、ミオイノシトール２００．００ｍｇ、塩酸ピリドキソール８．００ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸１．６０ｍｇ、リボフラビン１．６０ｍｇ、葉酸０．０２ｍｇ、ナイアシン３０．０ｍｇ、及びチアミン３０ｍｇ；
（ｉｉｉ）アミノ酸：ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含の酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ Ｙ２００１）２．８ｇ、１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン２０ｍＬ、及び１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン４ｍＬ；及び
（ｉｖ）微量元素：ＥＤＴＡ（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ ＩＩＩ７）９９．３８ｍｇ、硫酸亜鉛七水和物２９．８１ｍｇ、塩化マンガン二水和物（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）５．５７ｍｇ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物１．９９ｍｇ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物１．９９ｍｇ、モリブデン酸二ナトリウム二水和物（Ｄｉ−ｓｏｄｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）２．６５ｍｇ、塩化カルシウム二水和物（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）２９．８１ｍｇ、硫酸鉄七水和物１９．８８ｍｇ、ホウ酸。
バイオリアクター実験計画
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（米国）からの２ＬのＢＩＯＳＴＡＴ Ｂ−ＤＣＵ Ｔｗｅｅｎ２Ｌバイオリアクターで実験を行った。この発酵槽はＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）からの質量分析計につなぐ。８０ｍＬの接種材料を接種した直後、発酵槽の容量は約８００ｍｌであり、溶存酸素分圧（ＤＯＴ）を１０％に制御し、ｐＨを５．２５に制御し、曝気を０．５Ｌ／分に制御し、０．８Ｌのレイルアルコールを添加した。オレイルアルコールを用いて培養ブロスからイソブタノールを抽出した。
培養実験の分析方法
十分に混合したブロス試料を適切なキュベット（ＣＳ５００ ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，独国）にピペッティングすることにより、λ＝６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を分光光度計を用いて決定した。試料のバイオマス濃度が分光光度計の線吸収範囲（典型的にはＯＤ値０．０００〜０．６００）を超える場合、０．９％ＮａＣｌ溶液で試料を希釈して、線吸収範囲の値を得た。
培地中の代謝産物及び生成物を分析し、ＧＣ方法及びＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）からのＺＢ−ＷＡＸｐｌｕｓカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ内径、０．２５μｍ膜）を用いて定量化した。ヘリウムキャリアガスを２．３ｍＬ／分の定流量で用いた；２５０℃で１：２０の注入器スプリット；７０℃のオーブン温度で１分間、続いて１０℃／分で７０℃から１６０℃、及び３０℃／分で１６０℃から２４０℃。水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）を、４０ｍＬ／分のヘリウムメークアップガスにより２６０℃で使用した。培養ブロス試料は、注入前に０．２μｍスピンフィルタでろ過した。０．５μｌの注入量を用いた。イソブタノールの校正標準曲線を作成した。
当該技術分野において公知の方法を用いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりグルコース及び発酵副産物の分析を行った。ＨＰＬＣ方法では、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−Ｇガードカラムを備えたＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラム（双方ともＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）を、屈折率（ＲＩ）検出と共に利用した。クロマトグラフ分離は、０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を移動相として使用して、０．５ｍＬ／分の流量及び５０℃のカラム温度で実現した。イソブタノール保持時間は４７．６分であった。
培養上清中のイソブタノール濃度をＨＰＬＣ方法により決定した。オレイルアルコール相のイソブタノール濃度をＧＣ方法により決定した。排ガス試料中のイソブタノール濃度を、上述のとおり質量分析計により決定した。
結果
光学濃度の計測値（ＯＤ）、イソブタノール生成速度（Ｒ）、培養ブロス１リットル当たりに生成されたイソブタノール（イソブタノール力価、Ｔ）、及び発酵時間約４６時間目における消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率（Ｙ）を表５に提供する。ＰＮＹ２２０５株は、ＰＮＹ１５０４株及びＰＮＹ１５０６株と比較してより高い細胞密度に成長し、力価及び速度が増したが、収率は同程度であった。
Figure 0006008858
実施例７
同じ反応性液体抽出条件下における株ＰＮＹ１５０４及び株ＰＮＹ２２０５のパフォーマンスの比較
使用原液
プレシード培地
以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した：６．７ｇのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ ０９１９−１５−３）；２．８ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ
Ｙ２００１）；２０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン；４ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；３ｇのエタノール；３ｇのグルコース及び合計１Ｌの溶液を作るのに十分な水。
シードフラスコ培地
以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した：６．７ｇのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ ０９１９−１５−３）；２．８ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ
Ｙ２００１）；２０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン；４ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；３ｇのエタノール；３０ｇのグルコース；３８ｇのＭＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＹＸＸＸ）及び合計１Ｌの溶液を作るのに十分な水。混合後、溶液をろ過滅菌した。
エルゴステロール溶液
０．２ｇのエルゴステロールの溶液、１０ｍＬの２００プルーフエタノール及び１０ｍｌのツイーン８０を混合し、１０分間７０℃に加熱した。
Ｄｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液
０．９ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ Ｌ ４００の溶液と４９．１ｍＬのろ過滅菌した水道水とを混合した。
Ｌｉｐｏｌａｓｅ １００Ｌ原液
２．１２ｍＬのＬｉｐｏｌａｓｅ １００Ｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌ０７７７）の溶液及びｐＨ６．８のリン酸緩衝溶液４０ｇを混合してろ過滅菌した。
ビタミン原液
５ｇのニコチン酸と１ｇのチアミンとを、５００ｍＬのろ過滅菌した脱イオン水中に混合した。
トウモロコシマッシュ
トウモロコシマッシュを３０Ｌ液化タンクに加えた。次に、その３０Ｌ液化タンクに、１６９１０ｇの水道水を１２０ｒｐｍで撹拌しながら加えた。タンクには、ＤＢ／ＤＴ＝約０．２５のデュアルブレードピッチ付きブレードタービンが装備された。次に、１４０９１ｇの粉砕したトウモロコシ（ハンマーミルで１ミクロンスクリーンにより粉砕）を加え、マッシュを５５℃に加熱して、その温度に３０分間維持した。５．４ｇの１７％ＮａＯＨ水溶液を加えることにより、ｐＨを５．８に調整した。１９８６ｇの水道水と１９．５ｇのＧｅｎｅｎｃｏｒからのＳｐｅｚｙｍｅ Ｆｒｅｄ Ｌとを混合することによりα−アミラーゼ酵素溶液を調製し、得られた溶液を０．２ミクロンフィルタで滅菌ろ過した。この溶液２００４ｇを３０Ｌ液化タンクに加え、５５℃でさらに６０分間維持した。次に溶液を９５℃に加熱し、その温度に１２０分間維持した。溶液は、発酵に使用する前に３０℃に冷却した。
ＰＮＹ１５０４プロセス
プレシード成長
２５０ｍＬのバッフル付き通気振盪フラスコに、３０ｍＬのプレシード培地を加えた。次に、株ＰＮＹ１５０４の凍結シードバイアル２本、総量約１．５ｍＬを、同じフラスコに加えた。次に培養物を、インキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第１段階
１５ｍＬのプレシード培養物を、２Ｌのバッフル付き通気振盪フラスコ中の３００ｍＬのシードフラスコ培地に加えた。フラスコをインキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第２段階
次に３０ｍＬの酵母エキスペプトン及び３００ｍＬの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加えた。このフラスコを、インキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
１Ｌ生成発酵槽
水でプローブが被覆された１Ｌ発酵槽を１２１℃で３０分間滅菌した。排水し、５２０ｍＬの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った：３．８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬの１％エルゴステロール溶液、６ｍＬのニコチン酸／チアミン溶液及び４．８ｍＬのＬｉｐｌｏｌａｓｅ
１００Ｌ原液。次に、シードフラスコ第２段階の水相６０ｍＬを加え、続いて２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。そのすぐ後に、９６ｍＬのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。１２時間後、２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。接種後２４時間目にさらなる２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。次に溶液を、ｐＨ５．２、温度３０℃及びｐＯ２（溶存酸素の分圧）設定値３％でインキュベートした。空気流量は０．２ｓｌｐｍ（標準リットル毎分）に設定し、及びｐＯ２は撹拌によって制御した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨ溶液でｐＨを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。
ＰＮＹ２２０５プロセス
プレシード成長
２５０ｍＬのバッフル付き通気振盪フラスコに、３０ｍＬのプレシード培地を加えた。次に、株ＰＮＹ２２０５の凍結シードバイアル２本、総量約１．５ｍＬを、同じフラスコに加えた。次にフラスコを、インキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間維持した。
シードフラスコ第１段階
３００ｍＬのシードフラスコ培地を２Ｌのバッフル付き通気振盪フラスコに加えた。１５ｍＬのプレシード培養物をフラスコに加え、インキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第２段階
３０ｍＬの酵母エキスペプトン及び３００ｍＬの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、そのフラスコをインキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
１Ｌ生成発酵槽
水でプローブが被覆された１Ｌ発酵槽を１２１℃で３０分間滅菌した。排水し、５２０ｍＬの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った：３．８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬの１％エルゴステロール溶液、６ｍＬのニコチン酸／チアミン溶液及び４．８ｍＬのＬｉｐｌｏｌａｓｅ
１００Ｌ原液。次に、シードフラスコ第２段階の水相６０ｍＬを加え、続いて２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。そのすぐ後に、９６ｍＬのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後１２時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。接種後２４時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液をさらに加えた。溶液を、ｐＨ５．２、温度３０℃及びｐＯ２設定値３％でインキュベートした。空気流量は０．２ｓｌｐｍに設定し、ｐＯ２は撹拌によって制御した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨ溶液でｐＨを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。
培養実験の分析方法
得られた培養物の光学濃度（ＯＤ）を、分光光度計を用いてλ＝６００ｎｍで計測した。第一に、十分に混合したブロス試料を適切なキュベットにピペッティングした。試料のバイオマス濃度が分光光度計の線吸収範囲（典型的にはＯＤ値０．０００〜０．６００）を超えた場合、試料を０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈して線吸収範囲内の値を得た。予め秤量した遠心管で５ｍＬの細胞ブロスを遠心し、続いて蒸留水で洗浄し、オーブンにおいて８０℃で恒量に乾燥し、重量差を決定することにより、細胞懸濁液の乾燥重量を決定した。
培地中の代謝産物及び生成物を、ＧＣ方法により、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）からのＺＢ−ＷＡＸｐｌｕｓカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ内径、０．２５μｍ膜）を利用して分析及び定量化した。キャリアガスは２．３ｍＬ／分の定流量のヘリウムであった；注入器スプリットは２５０℃で１：２０であった；オーブン温度は、７０℃で１分間、１０℃／分で７０℃から１６０℃、及び３０℃／分で１６０℃から２４０℃である。ＦＩＤ検出は、４０ｍｌ／分ヘリウムメークアップガスにより２６０℃で用いた。培養ブロス試料は、注入前に０．２μｍスピンフィルタでろ過した。イソブタノール（ｗ−メチル−１−プロパノール）の校正標準曲線を使用した。
ＹＳＩ（酵素電極技術を用いてグルコース濃度の迅速測定値を生成するＹＳＩ ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ生化学分析器）により、グルコース分析を実施した。
結果
イソブタノール生成速度、培養ブロス１リットル当たりのイソブタノール（有効力価）、及び消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率を、表６に提供する。ＰＮＹ２２０５株はＰＮＹ１５０４株と比較して生成速度及び力価がより高かったが、収率は同程度であった。
Figure 0006008858
実施例８
同じ反応性液体抽出条件下における株ＰＮＹ１５０４及び株ＰＮＹ２２０５のパフォーマンスの比較
使用原液
プレシード培地
以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した：６．７ｇのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ ０９１９−１５−３）；２．８ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ
Ｙ２００１）；２０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン；４ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；３ｇのエタノール；３ｇのグルコース及び合計１Ｌの溶液を作るのに十分な水。
シードフラスコ培地
以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した：６．７ｇのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ ０９１９−１５−３）；２．８ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ
Ｙ２００１）；２０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン；４ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；３ｇのエタノール；３０ｇのグルコース；３８ｇのＭＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＹＸＸＸ）及び合計１Ｌの溶液を作るのに十分な水。混合後、溶液をろ過滅菌した。
エルゴステロール溶液
０．２ｇのエルゴステロールの溶液、１０ｍＬの２００プルーフエタノール及び１０ｍｌのツイーン８０を混合し、１０分間７０℃に加熱した。
Ｄｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液
０．９ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ Ｌ ４００の溶液と４９．１ｍＬのろ過滅菌した水道水とを混合した。
Ｌｉｐｏｌａｓｅ １００Ｌ原液
２．１２ｍＬのＬｉｐｏｌａｓｅ １００Ｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌ０７７７）の溶液及びｐＨ６．８のリン酸緩衝溶液４０ｇを混合してろ過滅菌した。
ビタミン原液
５ｇのニコチン酸と１ｇのチアミンとの溶液を、５００ｍＬのろ過滅菌した脱イオン水中に混合した。
トウモロコシマッシュ
トウモロコシマッシュを３０Ｌ液化タンクに加えた。次に、その３０Ｌ液化タンクに、１６９１０ｇの水道水を１２０ｒｐｍで撹拌しながら加えた。タンクには、ＤＢ／ＤＴ＝約０．２５のデュアルブレードピッチ付きブレードタービンが装備された。次に、１４０９１ｇの粉砕したトウモロコシ（ハンマーミルで１ミクロンスクリーンにより粉砕）を加え、マッシュを５５℃に加熱して３０分間インキュベートした。５．４ｇの１７％ＮａＯＨ水溶液を加えることにより、ｐＨを５．８に調整した。１９８６ｇの水道水と１９．５ｇのＧｅｎｅｎｃｏｒからのＳｐｅｚｙｍｅ Ｆｒｅｄ Ｌとを混合し、０．２ミクロンフィルタで滅菌ろ過することにより、α−アミラーゼ酵素溶液を調製した。この溶液２００４ｇを３０Ｌ液化タンクに加え、５５℃でさらに６０分間インキュベートした。次に、溶液を９５℃に加熱し、その温度に１２０分間維持した。次に、発酵に使用するまでに、溶液を３０℃に冷却した。
ＰＮＹ１５０４プロセス
プレシード成長
２５０ｍＬのバッフル付き通気振盪フラスコに、３０ｍＬのプレシード培地を加えた。次に、株ＰＮＹ１５０４の凍結シードバイアル２本、総量約１．５ｍＬを、同じフラスコに加えた。培養物をインキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第１段階
３００ｍＬのシードフラスコ培地を２Ｌのバッフル付き通気振盪フラスコに加えた。次に１５ｍＬのプレシードをフラスコに移した。次にそのフラスコをインキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第２段階
３０ｍＬの酵母エキスペプトン及び３００ｍＬの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、そのフラスコをインキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
１Ｌ生成発酵槽
水でプローブが被覆された１Ｌ発酵槽を１２１℃で３０分間滅菌した。排水し、５２０ｍＬの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った：３．８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬの１％エルゴステロール溶液、６ｍＬのニコチン酸／チアミン溶液及び４．８ｍＬのＬｉｐｌｏｌａｓｅ １００Ｌ原液。次に、シードフラスコ第２段階の水相６０ｍＬを加え、続いて２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。そのすぐ後に、１４１ｍＬのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後１２時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。接種後２４時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液をさらに加えた。次に溶液をｐＨ５．２、温度３０℃及びｐＯ２設定値３％でインキュベートした。空気流量は０．２ｓｌｐｍに設定し、ｐＯ２は撹拌によって制御した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨ溶液でｐＨを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。
ＰＮＹ２２０５プロセス
プレシード成長
２５０ｍＬのバッフル付き通気振盪フラスコに、３０ｍＬのプレシード培地を加えた。次に、株ＰＮＹ２２０５の凍結シードバイアル２本、総量約１．５ｍｌを、同じフラスコに加えた。次にフラスコをインキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第１段階
２Ｌのバッフル付き通気振盪フラスコに、３００ｍＬのシードフラスコ培地を加えた。次に１５ｍＬのプレシード成長物（ｐｒｅ−ｓｅｅｄ ｇｒｏｗｔｈ）をフラスコに加え、インキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第２段階
３０ｍＬの酵母エキスペプトン及び３００ｍＬの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、インキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
１Ｌ生成発酵槽
水でプローブが被覆された１Ｌ発酵槽を１２１℃で３０分間滅菌した。排水し、５２０ｍＬの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った：３．８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬの１％エルゴステロール溶液、６ｍＬのニコチン酸／チアミン溶液及び４．８ｍＬのＬｉｐｌｏｌａｓｅ １００Ｌ原液。次に、シードフラスコ第２段階の水相６０ｍＬを加え、続いて２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。そのすぐ後に、９６ｍＬのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後１２時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。接種後２４時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液をさらに加え、溶液を、ｐＨ５．２、温度３０℃及びｐＯ２設定値３％でインキュベートした。空気流量は０．２ｓｌｐｍに設定し、ｐＯ２は撹拌によって制御した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨ溶液でｐＨを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。
結果
イソブタノール生成速度、培養ブロス１リットル当たりのイソブタノール（有効力価）、及び消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率を表７に提供する。ＰＮＹ２２０５株は、ＰＮＹ１５０４株と比較して生成速度及び力価がより高かったが、収率は同程度であった。
Figure 0006008858
実施例９
同じ反応性液体抽出条件下における株ＰＮＹ１５０４及び株ＰＮＹ２２０５のパフォーマンスの比較
使用原液
プレシード培地
以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した：６．７ｇのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ ０９１９−１５−３）；２．８ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ Ｙ２００１）；２０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン；４ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；３ｇのエタノール；３ｇのグルコース及び合計１Ｌの溶液を作るのに十分な水。
シードフラスコ培地
以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した：６．７ｇのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ ０９１９−１５−３）；２．８ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ Ｙ２００１）；２０ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン；４ｍＬの１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；３ｇのエタノール；３０ｇのグルコース；３８ｇのＭＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＹＸＸＸ）及び合計１Ｌの溶液を作るのに十分な水。混合後、溶液をろ過滅菌した。
エルゴステロール溶液
０．２ｇのエルゴステロールの溶液、１０ｍＬの２００プルーフエタノール及び１０ｍｌのツイーン８０を混合し、１０分間７０℃に加熱した。
Ｄｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液
０．９ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ Ｌ ４００の溶液と４９．１ｍＬのろ過滅菌した水道水とを混合した。
Ｌｉｐｏｌａｓｅ １００Ｌ原液
２．１２ｍＬのＬｉｐｏｌａｓｅ １００Ｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｌ０７７７）の溶液及びｐＨ６．８のリン酸緩衝溶液４０ｇを混合してろ過滅菌した。
ビタミン原液
５ｇのニコチン酸と１ｇのチアミンとの溶液を、５００ｍＬのろ過滅菌した脱イオン水中に混合した。
トウモロコシマッシュ
トウモロコシマッシュを３０Ｌ液化タンクに加えた。次に、その３０Ｌ液化タンクに、１６９１０ｇの水道水を１２０ｒｐｍで撹拌しながら加えた。タンクには、ＤＢ／ＤＴ＝約０．２５のデュアルブレードピッチ付きブレードタービンが装備された。次に、１４０９１ｇの粉砕したトウモロコシ（ハンマーミルで１ミクロンスクリーンにより粉砕）を加え、マッシュを５５℃に加熱して３０分間インキュベートした。５．４ｇの１７％ＮａＯＨ水溶液を加えることにより、ｐＨを５．８に調整した。１９８６ｇの水道水と１９．５ｇのＧｅｎｅｎｃｏｒからのＳｐｅｚｙｍｅ Ｆｒｅｄ Ｌとを混合し、０．２ミクロンフィルタで滅菌ろ過することにより、α−アミラーゼ酵素溶液を調製した。この溶液２００４ｇを３０Ｌ液化タンクに加え、５５℃でさらに６０分間インキュベートした。次に、溶液を９５℃に加熱し、その温度に１２０分間維持した。次に、発酵に使用するまでに、溶液を３０℃に冷却した。
ＰＮＹ１５０４プロセス
プレシード成長
２５０ｍＬのバッフル付き通気振盪フラスコに、３０ｍＬのプレシード培地を加えた。次に、株ＰＮＹ１５０４の凍結シードバイアル２本、総量約１．５ｍＬを、同じフラスコに加えた。培養物をインキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第１段階
３００ｍＬのシードフラスコ培地を２Ｌのバッフル付き通気振盪フラスコに加えた。次に１５ｍＬのプレシードをフラスコに移した。次にそのフラスコをインキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第２段階
３０ｍＬの酵母エキスペプトン及び３００ｍＬの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、そのフラスコをインキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
１Ｌ生成発酵槽
水でプローブが被覆された１Ｌ発酵槽を１２１℃で３０分間滅菌した。排水し、５２０ｍＬの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った：３．８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬの１％エルゴステロール溶液、６ｍＬのニコチン酸／チアミン溶液及び４．８ｍＬのＬｉｐｌｏｌａｓｅ １００Ｌ原液。次に、シードフラスコ第２段階の水相６０ｍＬを加え、続いて２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。そのすぐ後に、１４１ｍＬのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後１２時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。接種後２４時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液をさらに加えた。次に溶液をｐＨ５．２、温度３０℃及びｐＯ２設定値３％でインキュベートした。空気流量は０．２ｓｌｐｍに設定し、ｐＯ２は撹拌によって制御した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨ溶液でｐＨを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。
ＰＮＹ２２０５プロセス
プレシード成長
２５０ｍＬのバッフル付き通気振盪フラスコに、３０ｍＬのプレシード培地を加えた。次に、株ＰＮＹ２２０５の凍結シードバイアル２本、総量約１．５ｍｌを、同じフラスコに加えた。次にフラスコをインキュベーター振盪機において３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第１段階
２Ｌのバッフル付き通気振盪フラスコに、３００ｍＬのシードフラスコ培地を加えた。次に１５ｍＬのプレシード成長物（ｐｒｅ−ｓｅｅｄ ｇｒｏｗｔｈ）をフラスコに加え、インキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
シードフラスコ第２段階
３０ｍＬの酵母エキスペプトン及び３００ｍＬの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、インキュベーター振盪機において３０℃及び２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
１Ｌ生成発酵槽
水でプローブが被覆された１Ｌ発酵槽を１２１℃で３０分間滅菌した。排水し、５２０ｍＬの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った：３．８ｍＬのエタノール、０．６ｍＬの１％エルゴステロール溶液、６ｍＬのニコチン酸／チアミン溶液及び４．８ｍＬのＬｉｐｌｏｌａｓｅ １００Ｌ原液。次に、シードフラスコ第２段階の水相６０ｍＬを加え、続いて２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。そのすぐ後に、９６ｍＬのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後１２時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液を加えた。接種後２４時間目に２ｍＬのＤｉｓｔｉｌｌａｓｅ原液をさらに加え、溶液を、ｐＨ５．２、温度３０℃及びｐＯ２設定値３％でインキュベートした。空気流量は０．２ｓｌｐｍに設定し、ｐＯ２は撹拌によって制御した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨ溶液でｐＨを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。
結果
イソブタノール生成速度、培養ブロス１リットル当たりのイソブタノール（有効力価）、及び消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率を表８に提供する。ＰＮＹ２２０５株は、ＰＮＹ１５０４株と比較して生成速度及び力価が高くなったが、収率は同程度であった。
Figure 0006008858
実施例１０
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ２２１１の構築
ＰＮＹ２２１１を、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ１５０７（実施例２）から以下の段落に記載するとおり数工程で構築した。第一に、ホスホケトラーゼ遺伝子を含むようにこの株を修飾した。ホスホケトラーゼ遺伝子カセット及び組込み株の構築については、以前に、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載されている。次に、実施例３に記載される組込みベクターを使用して、株にアセト乳酸シンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ）を付加した。最後に、相同組換えを用いてホスホケトラーゼ遺伝子及び組込みベクター配列を除去すると、ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤ（以前に記載されたＰＤＣ１ ＯＲＦの欠失／挿入、２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書；本明細書の実施例１を参照のこと）と染色体ＸＩＩの天然ＴＲＸ１遺伝子との間の遺伝子間領域におけるａｌｓＳのスカーレス挿入が得られた。ＰＮＹ２２１１の得られた遺伝子型は、ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δ ｐｄｃ６Δ ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δ ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔである。
ホスホケトラーゼ遺伝子カセットを相同組換えによりＰＮＹ１５０７に導入した。組込みコンストラクトは以下のとおり作成した。プラスミドｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡ（米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３ Ａ１号明細書に記載される）をＮｏｔＩ及びＸｍａＩで消化し、１．８ｋｂのＦＢＡ−ｂｕｄＡ配列を取り除き、クレノウ断片で処理した後、ベクターを再度ライゲートした。次に、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）からのＤＮＡ合成及びベクター構築サービスにより、ＣＵＰ１プロモーターをＴＥＦ１プロモーター変異体（Ｎｅｖｏｉｇｔ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６．７２（８）：５２６６−５２７３により記載されるＭ４変異体）で置換した。得られたプラスミドｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ａｌｓＳをＳｔｕＩ及びＭｌｕＩで切断し（ａｌｓＳ遺伝子の一部及びＣＹＣ１ターミネーターを含む１．６ｋｂ部分を除去する）、プライマーＮ１１７６（配列番号２０７）及びＮ１１７７（配列番号２０８）によりｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ−ｘｐｋ１＋ＡＤＨ−ｅｕｔＤ（２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載される；本明細書の配列番号２４６）から産生した４ｋｂのＰＣＲ産物、及びプライマーＮ８２２（配列番号２０９）及びＮ１１７８（配列番号２１０）により酵母ゲノムＤＮＡ（ＥＮＯ１プロモーター領域）から産生した０．８ｋｂのＰＣＲ産物ＤＮＡと組み合わせ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４１に形質転換した（ＡＴＣＣ ２０１３８８；ギャップ修復クローニング法、Ｍａ ａｎｄ Ｂｏｔｓｔｅｉｎを参照のこと）。ヒスチジン不含合成完全培地に細胞を播くことにより、形質転換体を得た。予想されたプラスミド（ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ、配列番号２１１）の正しい構築物を、ＰＣＲ（プライマーＮ８２１（配列番号２１２）及びＮ１１１５（配列番号２１３））により、及び制限消化（ＢｇｌＩ）により確認した。続いて２つのクローンを配列決定した。３．１ｋｂのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１遺伝子をＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化することにより単離し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１ベクター（２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載される、本明細書の配列番号２４３）クローンＡ、ＡｆｌＩＩで切断）にクローニングした。クローニング断片をクレノウ断片で処理し、ライゲーション用の平滑末端を作成した。ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１の挿入を、ＰＣＲ（プライマーＮ１１１０（配列番号２１４）及びＮ１１１４（配列番号２１５））により確認した。ベクターをＡｆｌＩＩで直鎖化し、クレノウ断片で処理した。１．８ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩジェネティシン耐性カセット（２０１０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３５６，３７９号明細書に記載される；本明細書の配列番号２４５）を、クレノウ断片処理後にライゲートすることによりクローニングした。ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。ジェネティシンカセットの挿入を、ＰＣＲ（プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号２１６）及びＢＫ４６８（配列番号２１７））により確認した。プラスミド配列は配列番号２１８（ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ｋａｎ）として提供される。
得られた組込みカセット（ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ＫａｎＭＸ：：ＴＲＸ１）を単離し（ＡｓｃＩ及びＮａｅＩ消化により、ゲル精製された５．３ｋｂバンドが生じた）、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換キット（カタログ番号Ｔ２００１）を使用してＰＮＹ１５０７（実施例２）に形質転換した。ＹＰＥ＋５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８に播くことによって形質転換体を選択した。予想された遺伝子座での組込みを、ＰＣＲ（プライマーＮ８８６（配列番号２１９）及びＮ１２１４（配列番号２２０））により確認した。次に、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−Ｃｒｅを使用して、ｌｏｘＰ隣接ＫａｎＭＸカセットを取り除いた（本明細書に記載されるベクター及び方法）。カセットが正しく取り除かれたことを、ＰＣＲ（プライマーｏＢＰ５１２（配列番号２２１）及びＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号２２２））により確認した。最後に、本明細書に記載されるａｌｓＳ組込みプラスミド（ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１、クローンＡ）を、含まれているジェネティシン選択マーカーを用いてこの株に形質転換した。２つの組み込み体を、プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５で形質転換し（本明細書に記載されるプラスミド、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”２００５．Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｈｅｒｎのプロトコル＃２を用いて形質転換した）、及びグルコース含有培地における成長及びイソブタノール生成を評価することにより（成長及びイソブタノール計測方法は、本明細書及び２００５年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／７３０，２９０号明細書、及び米国特許出願公開第２００７／００９２９５７ Ａ１号明細書に記載される）、アセト乳酸シンターゼ活性について試験した。２つのクローンのうちの一つは陽性であり、ＰＮＹ２２１８と命名した。プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５を含むＰＮＹ２２１８の単離物は、ＰＮＹ２２０９と命名した。
ＰＮＹ２２１８をＣｒｅリコンビナーゼで処理し、得られたクローンを、ＰＣＲ（プライマーＮ８８６（配列番号２１９）及びＮ１６０ＳｅｑＲ５（配列番号２２２））により、ｘｐｋ１遺伝子及びｐＵＣ１９組込みベクター配列の喪失についてスクリーニングした。これにより、ｘｐｋ１上流のＤＮＡと組込みベクターの挿入中に導入された相同ＤＮＡの組換え後、ｐｄｃ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域に組み込まれたａｌｓＳ遺伝子のみが残る（ベクター、マーカー遺伝子及びｌｏｘＰ配列が失われるため「スカーレス」挿入、図６）。この組換えはいずれの時点でも起こり得たが、ジェネティシン選択がなくともベクターの組込みは安定しているように思われ、組換えイベントはＣｒｅリコンビナーゼの導入後にのみ観察された。一つのクローンをＰＮＹ２２１１と命名した。
実施例１１
同じ反応性液体抽出条件下における株ＰＮＹ２２０５及び株ＰＮＹ２２１１のパフォーマンスの比較
イソブタノール生成をＰＮＹ２２０５と比較するため、スカーレス組込みを有する単離物（特に２つのクローン「Ｂ」及び「Ｍ」）をｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５で形質転換した。組み込み体を、１％エタノールを炭素源として含む合成完全培地（ヒスチジン及びウラシル不含）で選択した。組み込み体を同じ培地にパッチし、パッチした細胞を２％グルコース＋０．０５％エタノールを炭素源として含むプレートに再びパッチした。２日後、パッチを使用して液体培地（１０ｍＬ合成完全、ヒスチジン及びウラシル不含、２％グルコース及び０．０５％エタノール含有、１２５ｍＬ通気フラスコ中）を接種した。一晩インキュベートした後（３０℃、２５０ｒｐｍ）、培養物をＯＤ０．２に希釈し戻した（しっかり蓋をした１２５ｍＬフラスコ中、２０ｍＬの培地）。４８時間後、試料を採取してイソブタノール生成を決定した。新規の株背景は、ＰＮＹ２２０５と同程度のイソブタノール生成を支持した。さらなる操作用にクローンＭを選択し、ＰＮＹ２２１１と命名した。プラスミドｐＹＺ０９０ＤａｌｓＳ及びｐＢＰ９１５で形質転換したクローンＭ７をＰＮＹ２２１３と命名した。
株ＰＮＹ２２０５、クローンＢ及びクローンＭの培養ブロス１リットル当たりのイソブタノールの生成（ｇ／Ｌ単位での有効力価）を表９に提供する。クローンＢ株及びＭ株は、ＰＮＹ２２０５と比較して同程度のイソブタノール力価を有した。
Figure 0006008858

Claims (23)

  1. イソブタノール生合成経路を含む組換え酵母宿主細胞であって、該経路が、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、該経路が、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を含み、そしてＦｒａ２の発現が該酵母宿主細胞において低下され、及び／又は、排除され、そしてピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較して、イソブタノール生成の力価が増加している、上記組換え酵母宿主細胞。
  2. ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
  3. サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
  4. ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドが宿主細胞サイトゾルで発現する、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
  5. 基質から生成物への変換：２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド；及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
    さらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  6. 基質から生成物への変換：２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレ
    レート；α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ；イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド；及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  7. 基質から生成物への変換：２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；α−ケトイソバレレートからバリン；バリンからイソブチルアミン；イソブチルアミンからイソブチルアルデヒド；及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  8. ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドが、アセト乳酸シンターゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  9. アセト乳酸シンターゼが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項８に記載の組換え酵母宿主細胞。
  10. 宿主細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ、又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの一つ又はそれ以上の発現が低下するか、又は排除される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  11. ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、及び／又は置換を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  12. ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドに組み込まれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  13. ポリヌクレオチドが、ＰＤＣ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域で染色体に組み込まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
  14. （ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードし、染色体に組み込まれるポリヌクレオチドと；
    （ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードし、プラスミド上にあるポリヌクレオチドと；
    （ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと；
    （ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと；
    を含む組換え酵母宿主細胞であって、
    ここで酵母宿主細胞がピルビン酸デカルボキシラーゼ及びＦｒａ２活性を含まず；そして酵母宿主細胞がイソブタノールを生産する、上記組換え酵母宿主細胞。
  15. （ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと；
    （ｂ）生合成経路生成物が生成される条件下で、酵母宿主細胞を発酵性炭素基質と接触
    させて発酵ブロスを形成し、それによりイソブタノールが生産されるステップと；
    を含む方法。
  16. 発酵ブロスを抽出剤と接触させて二相発酵混合物を生産するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 抽出剤が、Ｃ12〜Ｃ22脂肪アルコール、Ｃ12〜Ｃ22脂肪酸、Ｃ12〜Ｃ22脂肪酸のエステル、Ｃ12〜Ｃ22脂肪アルデヒド、及びＣ12〜Ｃ22脂肪アミドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 方法が、発酵ブロスを有機酸、及びその有機酸によりイソブタノールをエステル化する能力を有する酵素と接触させるステップをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 方法が、発酵ブロスの少なくとも一部分を気化させて、水とイソブタノールとを含む蒸気流を形成するステップをさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. イソブタノール生成速度又は力価が、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え酵母宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍大きな差で増加する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. イソブタノールの形成を増加させる方法であって、
    （ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと；
    （ii）イソブタノールが形成される条件下で酵母宿主細胞を増殖させるステップと；
    を含み、
    該組換え酵母宿主細胞により形成されるイソブタノールの量が、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない宿主細胞により形成されるイソブタノールの量より多い、上記方法。
  22. （ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせ；
    （ii）イソブタノール；
    （iii）抽出剤；及び
    （iv）任意にエステル化酵素
    を含む組成物。
  23. 抽出剤が、Ｃ12〜Ｃ22脂肪アルコール、Ｃ12〜Ｃ22脂肪酸、Ｃ12〜Ｃ22脂肪酸のエステル、Ｃ12〜Ｃ22脂肪アルデヒド及びＣ12〜Ｃ22脂肪アルデヒドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤である、請求項２２に記載の組成物。
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