CN116024201B - α-乙酰乳酸脱羧酶突变体及其在生产乙偶姻中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了α‑乙酰乳酸脱羧酶突变体及其在生产乙偶姻中的应用，α‑乙酰乳酸脱羧酶突变体为下列之一：SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的115位赖氨酸突变为甘氨酸；SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸、第115位赖氨酸突变为甘氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸；所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为α‑乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列。本发明的α‑乙酰乳酸脱羧酶突变体比野生型α‑乙酰乳酸脱羧酶的稳定性好，半衰期长，催化生产的乙偶姻产量高。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及α-乙酰乳酸脱羧酶突变体及其在生产乙偶姻中的应用。
背景技术
乙偶姻，又名3-羟基-2-丁酮，天然存在于许多食品中，被美国联邦应急管理署第2008号文件批准是一种公认的安全物质(GRAS)，主要用于食品行业来增强产品风味。乙偶姻也应用于医药、农业和化工行业。被美国能源部列为优先开发的30种平台化合物之一。化学合成法生产乙偶姻能耗大，成本高，对环境污染严重，所以生物法生产乙偶姻是未来的趋势。生物法合成乙偶姻的生产途径中，碳源通常进入糖酵解途径产生3-磷酸甘油醛，然后生成丙酮酸，最后经过α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶催化的两步脱羧反应合成乙偶姻。
在乙偶姻的生物合成中，α-乙酰乳酸脱羧酶催化的反应通常被认为是限速反应。两个丙酮酸分子在α-乙酰乳酸合成酶的作用下聚合生成一分子α-乙酰乳酸，而α-乙酰乳酸是一种不稳定的物质，它可通过α-乙酰乳酸脱羧酶的催化生成乙偶姻。在利用体外双酶级联反应进行乙偶姻的生产时，395.6g/L丙酮酸可快速生产186.7g/L乙偶姻，平均反应速率为15.56g/L/h。但在逐渐提高丙酮酸浓度的生产过程中，乙偶姻的得率越来越低[1]，可能是由于α-乙酰乳酸的不稳定性，也可能是反应过程中pH逐渐升高，使得ALDC的活性大大降低，所以通过蛋白质工程改造提高α-乙酰乳酸脱羧酶的稳定性对乙偶姻的高效生产是有重大的意义的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供α-乙酰乳酸脱羧酶突变体。
本发明的第二个目的是提供α-乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因。
本发明的第三个目的是提供含上述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因的工程菌。
本发明的第四个目的是提供上述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体在催化制备乙偶姻中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
α-乙酰乳酸脱羧酶突变体，所述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体为下列之一：SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的115位赖氨酸突变为甘氨酸，用SEQ ID No.3所示；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸，用SEQ IDNo.5所示；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸、第115位赖氨酸突变为甘氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸，用SEQ ID No.6所示；所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列。
上述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因。
含上述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因的工程菌。
上述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体催化制备乙偶姻中的应用。
有益效果
本发明的α-乙酰乳酸脱羧酶突变体比野生型α-乙酰乳酸脱羧酶的稳定性好，半衰期长，催化生产的乙偶姻产量高。
附图说明
图1为α-乙酰乳酸脱羧酶表达载体示意图。
图2为α-乙酰乳酸脱羧酶和α-乙酰乳酸合成酶构建的双酶级联反应体系示意图。
图3为体外双酶级联反应体系生产乙偶姻(pH 7.0)。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，但对本发明不作任何限制。
原始质粒pET28a来源为biovector(http://www.biovector.net/)；
Escherichia coli BL21(DE3)感受态来源为NEB(http://www.neb-china.com/)；
原始菌株Bacillus subtilis 168来源为BGSC(Bacillus Genetic StockCenter，http://www.bgsc.org/)；
所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等、分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
所有其他生化试剂(如胰蛋白胨、酵母抽提物、NaCl、TPP、MgCl2、ATP、NADP+等)从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活测定：α-乙酰乳酸脱羧酶催化α-乙酰乳酸生成乙偶姻，其酶活的测定主要步骤如下：
首先制备α-乙酰乳酸溶液，反应体系为80mM丙酮酸钠、10mM MgCl2、0.4mM TPP、2.0U/mLα-乙酰乳酸合成酶和100mM磷酸缓冲液。配置好反应溶液，置于37℃摇床，220rpm反应20min，即可得到α-乙酰乳酸溶液。将稀释至合适浓度的α-乙酰乳酸脱羧酶粗酶液，取50μL加入等体积的α-乙酰乳酸溶液混匀，在40℃温浴反应20min，取50μL上述反应液与200μL显色液(0.5％肌酸溶液和5％萘酚溶液按体积比1：1混合所得)混合，在37℃下温浴20min。在多功能微孔板检测仪中测定反应液在530nm处的吸光值。1U ALDC定义为1min内产成1μmol乙偶姻所需的酶量。
α-乙酰乳酸脱羧酶的稳定性的测定：测定α-乙酰乳酸脱羧酶突变体在40℃下放置不同时间后吸取相应量进行α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活测定。
酶的纯化具体步骤为：
1)将E.coli BL21(DE3)工程菌接种至含5mLLB液体培养基的试管中，在37℃摇床，220rpm培养12h。按1％的接种量加入至已添加50μg/mL卡那霉素的200mLLB液体培养基中，在37℃摇床，220rpm培养。待菌体OD600达到0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为0.5mM，16℃培养12h，4℃，4200rpm离心20min收集菌体，并用20mLbuffer A悬浮。
2)收集步骤1)得到的悬浮液，在高压细胞破碎机的作用下破碎细胞，在4℃，1200bar，油压18Kg/cm3条件下处理3次，破碎后4℃，8000rpm离心40min，收集上清液得到粗酶液。
3)将步骤2)中得到的粗酶液，利用重力镍柱纯化方法，纯化蛋白。在4℃条件下，将粗酶液全部流穿装有镍填料的柱子，再用buffer A和buffer B配制的不同的咪唑浓度(20、50、100、150、200、250、500mM)的洗脱液洗脱，收集50-250mM浓度的流出液，得到高纯度的酶溶液。
4)将步骤3)得到的目的蛋白溶液，利用孔径10KD的超滤管浓缩蛋白。将收集的流出液，在4800rpm，4℃离心。最后用5mLPBS(pH＝7.0)缓冲液洗涤2次，继续离心至剩余量为2mL，分装，得到酶溶液。加入质量终浓度为10％的甘油，分装，储存于-80℃冰箱。
buffer A配方为：25mM PBS，150mM NaCl，20mM咪唑，调节PH至7.0。
buffer B配方为：25mM PBS，150mM NaCl，500mM咪唑，调节PH至7.0。
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸，简称：E248A，用SEQIDNo.2所示；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的115位赖氨酸突变为甘氨酸简称：K115G，用SEQIDNo.3所示；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的167位天冬氨酸突变为丙氨酸简称：D167A，用SEQ IDNo.4所示；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸简称：E248A-D167A，用SEQ ID No.5所示；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸、第115位赖氨酸突变为甘氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸简称：E248A-K115G-D167A，用SEQ ID No.6所示；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列。
实施例1：α-乙酰乳酸脱羧酶突变体的获得
1)定点饱和突变
首先在PDB数据库中搜索来自B.subtilis 168的α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的结构5XNE(分辨率)，并利用PyMOL将ALDC二聚体分成单体后。分别选择Glu251、Arg142、Glu62和His201四个活性位点的/>内的氨基酸，并命名为Glu251-A、Arg142-A、Glu62-A和His201-A，除去上述氨基酸的其余所有氨基酸为各位点的B组，即Glu251-B、Arg142-B、Glu62-B和His201-B。接着使用B-FITTER软件对A组和B组中的每个氨基酸的B因子进行计算，并按照大小排序，去除催化关键残基和N、C末端残基后，得到A组中B-factor较大的残基(E248，S253，K245，G252，R110，K159，R170，T160，E197，D167，E114，I163)和B组中B-factor较大的残基(S119，M120，N84，K115，N118，E111，H102，D239)作为突变靶标位点。
以α-乙酰乳酸脱羧酶基因alsD(核苷酸序列为SEQ ID NO.7)所在的质粒DNApET28a-ALDC(SEQ ID NO.13)(见图1)为模板进行PCR扩增。利用表1中的简并引物对上述20种氨基酸进行饱和突变。将上述获得的PCR产物经DpnI酶切后，采用纯化回收试剂盒进行DNA的回收。接着将回收后的突变体文库利用化学转化的方法转化至E.coli BL21(DE3)菌株中。
表1.饱和突变所用的引物
2)饱和突变库的初筛与复筛
将上述含有α-乙酰乳酸脱羧酶突变体文库的大肠杆菌，挑取单克隆接种至含有1mL LB液体培养基的96深孔板中，添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，37℃恒温振荡12h。按照1％接种量转入新的含50μg/mL卡那霉素的含有1mL LB液体培养基的96深孔板中，37℃恒温振荡培养3h，加入0.5mM IPTG，20℃诱导表达过夜。然后将上述96深孔板在4℃，2500rpm下离心30min，弃掉上清，放入-80℃冰箱反复冻融3次，破碎细胞。使用磷酸缓冲液(pH 7.0)重悬，在4℃，2500rpm下离心30min，得到的上清液即为粗酶液，用于酶活和稳定性的测定。将酶活不低于野生型酶活的20％，且稳定性提高的突变体和含突变体的菌株筛选出来，进行重新培养和复筛，具体步骤同上。
对上述复筛的突变体文库进行初筛和复筛后，将有效突变体转至250mL摇瓶中培养。含突变体的菌株先被挑取至含相应抗性的5mL LB液体培养基的试管中，过夜培养。再按1％转接至含相应抗性的装有50mL LB液体培养基的容量为250mL摇瓶中，待OD600长至0.6时，加入0.5mM IPTG，16℃诱导18h。收集菌体，利用磷酸缓冲液洗涤2次，利用高通量组织研磨仪进行菌体的破碎。之后在4℃离心机中，10000rpm离心10min，吸取上清液至新的EP管中，得到粗酶液，测定酶活及稳定性。接着将表达稳定性提高的突变体的载体送测，分析突变的核苷酸和氨基酸序列。
经过高通量筛选，从3720个突变体中筛选得到12h后剩余酶活高于野生型的突变体E248A(SEQ ID No.2，即SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸)、K115G(SEQ ID No.3，即SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的115位由赖氨酸突变为甘氨酸)、D167A(SEQ ID No.4，即SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的167位由天冬氨酸突变为丙氨酸)。
其中E248A的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，
K115G的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，
D167A的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
同时得到了分别含突变体E248A、K115G和D167A的E.coli BL21(DE3)工程菌BL-E248A、BL-K115G和BL-D167A和分别表达突变体E248A、K115G和D167A的载体pET-E248A、pET-K115G、pET-D167A。突变体E248A、K115G、D167A和野生型(WT)的12h剩余酶活分别为是初始酶活的47.56％、46.51％、51.29％和21.66％。
实施例2：有益突变点的组合突变
为了进一步探索组合突变对ALDC的稳定性的影响，将上述获得的突变位点E248A、K115G和D167A进行组合突变。采用定点突变方法，利用表2中的引物K115G-F/R(SEQIDNO.55/56)，以pET-E248A为模板，进行全质粒PCR。将获得的PCR产物经DpnI酶切后，采用纯化回收试剂盒进行DNA的回收。接着将回收后的DNA利用化学转化的方法转化至E.coliBL21(DE3)菌株中。筛选阳性菌落，并提取质粒进行测序验证，获得含突变体E248A-K115G的载体pET28a-E248A-K115G和工程菌BL-E248A-K115G。
同理获得分别含突变体E248A-D167A、K115G-D167A、E248A-K115G-D167A的载体pET28a-E248A-D167A、pET28a-K115G-D167A、pET28a-E248A-K115G-D167A和工程菌BL-E248A-D167A、BL-K115G-D167A和BL-E248A-K115G-D167A。
表2.构建组合突变体所用的引物
经过测定组合突变体的0h和12h时的酶活，得到12h后剩余酶活高于野生型的突变体E248A-D167A(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)和E248A-K115G-D167A(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)，突变体E248A-D167A、E248A-K115G-D167A和WT的12h剩余酶活分别是初始酶活的32.24％、22.64％和21.66％。
实施例3：有效突变体的基本酶学参数的测定
对上述实施例中获得的5个有效突变体E248A、K115G、D167A、E248A-D167A、E248A-K115G-D167A和WT进行半衰期的测定，通过将突变体在40℃下放置不同时间，每3h取样进行剩余酶活的测定。根据Origin的半衰期模拟曲线，计算各个酶的半衰期。如表3所示，野生型在40℃，pH 7.0的磷酸缓冲液下的半衰期为5.83h，5个突变体的半衰期都有不同程度的提高，E248A、K115G、D167A、E248A-D167A和E248A-K115G-D167A的半衰期分别为6.92h、10.6h、8.48h、8.72h和8.81h，相比于野生型分别提高了18.7％、81.81％、45.45％、49.57％、51.11％。
表3.有益突变体和WT的半衰期
实施例4：体外双酶催化法生产乙偶姻
构建有益突变体E248A、K115G、D167A、E248A-D167A或E248A-K115G-D167A与α-乙酰乳酸合成酶(ALS)组成的体外双酶级联催化反应生产乙偶姻(见图2)。反应体系包含489.89mM丙酮酸钠，0.2mM TPP(焦磷酸硫胺素)，10mM Mg2+，0.75Uα-乙酰乳酸合成酶，0.75U有益突变体或WT，缓冲液为磷酸缓冲液(pH＝7.0)，体系体积为10mL。获得α-乙酰乳酸合成酶使用的表达载体是pET28a-alsS(核苷酸序列为SEQ ID NO.14)，使用的工程菌是BL-ALS。反应条件为40℃，220rpm，每隔1h取样测定丙酮酸和乙偶姻浓度。反应3h后，E248A、K115G、D167A、E248A-D167A、E248A-K115G-D167A以及WT参与的反应中乙偶姻产量分别为148.11mM、186.58mM、165.76mM、189.03mM、208.32mM和174.23mM，如图3所示。突变体E248A-K115G-D167A在乙偶姻生产方面具有明显的优势，
进一步的将有益突变体E248A-K115G-D167A与α-乙酰乳酸合成酶构建体外双酶体系催化生产乙偶姻。反应体系组成为4.5M丙酮酸钠浓度，0.2mM TPP，10mM Mg2+，30Uα-乙酰乳酸合成酶，30U E248A-K115G-D167A，100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，总体积为10mL，反应温度为35℃。反应12h后乙偶姻的产量达到了195.6g/L，得率达到了0.493mol/mol，达到理论得率的98.7％。
参考文献：
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Claims (4)
1.α-乙酰乳酸脱羧酶突变体，其特征是所述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体为下列之一：SEQID No.1所示的氨基酸序列的115位赖氨酸突变为甘氨酸，用SEQ ID No.3所示；SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸，用SEQ IDNo.5所示；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸、第115位赖氨酸突变为甘氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸，用SEQ ID No.6所示；所述SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列为α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列。
2.权利要求1所述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因。
3.含权利要求2所述α-乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因的工程菌。
4.权利要求1的α-乙酰乳酸脱羧酶突变体催化制备乙偶姻中的应用。
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