CN116042566A - 烟酰胺核糖激酶突变体及其应用 - Google Patents

烟酰胺核糖激酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一系列烟酰胺核糖激酶突变体及其应用，所述烟酰胺核糖激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。本发明所述的烟酰胺核糖激酶突变体可高效催化底物烟酰胺核糖(NR)在ATP的作用下生成烟酰胺单核苷酸(NMN)，且能明显减少反应时间和酶的用量，降低生产成本，具有较好的工业应用前景。

Description

烟酰胺核糖激酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于微生物基因技术重组领域，具体涉及的是一种表达烟酰胺核糖激酶(NRK)的重组菌的及其制备方法和实际应用。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种天然存在于人体中的物质，它直接参与细胞内NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的合成。NAD+作为一种存在于所有活细胞中的辅酶，能控制细胞功能和存活，以应对环境的变化，如营养摄入、细胞损伤等。随着年龄的增长，人体内自身含有的NAD+水平不断下降，使细胞线粒体活性降低；同时，NAD+减少也损害了细胞产生能量的能力，导致老化及老年相关疾病的发生。因此，NMN作为NAD+的前体，具备直接从根本上抗衰老的作用。鉴于此项，NMN项目目前已成为全球各医药及食品公司竞相研发的对象。
目前，国内生产NMN的主要方法有两种：化学合成法和生物酶催化法。其中化学合成法为直接的NMN合成工艺，方法为烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，而化学法合成磷酸化杂质较多，生产效率低，产品纯度低，且使用的大量有机溶剂对环境会造成一定程度的污染。
NMN的生物酶催化法主要是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在ATP存在的条件下，由烟酰胺核糖激酶(NRK)催化生成NMN，该途径所需反应步骤少，收率高，是目前NMN生产主流方案，但是现用烟酰胺核糖激酶(NRK)酶活较低，导致其应用于生产转化率较低。因此，开发酶活更高的烟酰胺核糖激酶具有重要意义。
发明内容
针对现有NMN生物酶催化过程中，产出烟酰胺核糖激酶的菌株酶活普遍不高的问题，本发明通过构建了烟酰胺核糖激酶突变体编码基因，重组工程菌在经诱导表达后获得的菌体作为酶源，应用于烟酰胺单核苷酸(NMN)的生产，提高了生产效率。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
本发明提供一系列烟酰胺核糖激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQIDNO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
本发明所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸残基的突变位点主要为突变体1的108D缺失，突变体2：S161T，突变体3：E123L D143E，突变体4：L65F N90I。
本发明还提供本发明所述的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因，在一些实施例中，所述基因如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供包含本发明所述的编码基因的重组载体。本发明所述的重组载体，可以按照本领域的常规方法将本发明所述的编码基因与常用表达质粒进行重组获得，例如，在一种实施例中，是将质粒pET-28a用BamHI和HindIII双酶酶切，与编码基因用T4 DNAligase连接获得。
本发明还提供包含本发明所述的编码基因或重组载体的感受态细胞。具体可以采用本领域常用的感受态细胞按照本领域常规的方法将本发明所述的编码基因或重组载体转入获得，例如，以热激转化法将重组载体转入BL21(DE3)感受态细胞中获得。
本发明还提供本发明所述的烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因、重组载体或感受态细胞在烟酰胺单核苷酸制备中的应用。本发明所述的应用，是以烟酰胺核糖(NR)为底物，在ATP的作用下生成烟酰胺单核苷酸。
本发明具体应用的方式和条件可以按照本领域的常规方法，例如：
在一些实施例中，本发明所述应用的反应体系为：100～180mol/L的烟酰胺核糖、100～150mol/L的ATP-2Na、1～5g/L的氯化镁，PBS缓冲液配置，pH为6.5～7.5。
在一些实施例中，本发明所述应用，如果使用烟酰胺核糖激酶突变体，则反应浓度为10～20U/ml；如果使用菌体，则菌体用量为20～30g/L。
在一些实施例中，本发明所述应用，反应时的温度为25～30℃。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的烟酰胺核糖激酶突变体蛋白，可高效催化底物烟酰胺核糖(NR)在ATP的作用下生成烟酰胺单核苷酸(NMN)。
(2)本发明提供的烟酰胺核糖激酶突变体蛋白，能明显减少反应时间和酶的用量，降低生产成本，具有较好的工业应用前景。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
若无特别说明，以下实施例中的“NR”表示烟酰胺核糖，“NMN”表示β-烟酰胺单核苷酸。
实施例1筛选酶活高的重组菌
以野生烟酰胺核糖激酶的大肠杆菌基因组(SEQ ID NO.1)作为模板，采用易错PCR法构建基因随机突变质粒文库，具体PCR扩增体系和PCR程序如表1所示：
表1PCR扩增体系和PCR程序
将上述扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳回收DNA产物，将pET-28a空载体用BamHI和HindIII双酶酶切，上述回收的DNA产物用同样方法酶切，将酶切后的DNA片段和pET-28a载体用T4 DNA ligase连接，16℃反应过夜。
以热激转化法将质粒文库转入BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的LB平板上，挑选单克隆进行菌检，目标条带0.8kb，菌检体系如表2：
表2菌检体系
随机挑选菌检结果阳性的单克隆接种到24孔板中，每孔中含终浓度50mg/ml的卡纳霉素的4ml液体LB培养基，37℃，220rpm/min摇床培养16h，取培养液以3％体积比接种到含有50mg/ml的卡纳霉素的50ml液体TB培养基中，37℃，220rpm/min摇床培养至OD600＝0.4～0.6时，加入诱导剂：IPTG(终浓度为50umol/L)，25℃，220rpm/min摇床诱导培养16h，经过酶活、蛋白电泳检测，摇瓶小试验证，筛选出可溶性表达且酶活较高的菌种，将含有酶活较高的菌种的发酵液于高速冷冻离心机4℃条件下，6000rpm离心30min，收集湿菌体，保藏于-20℃冰箱中。通过本实施例获得了4株高活力突变型菌株，分别进行烟酰胺核糖激酶的基因的测序，4株突变株1～4中的突变的烟酰胺核糖激酶氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2～5所示。氨基酸残基的突变位点主要为突变体1的108D缺失，突变体2：S161T，突变体3：E123LD143E，突变体4：L65F N90I。
实施例2实施例1筛选的4株高活力突变型菌株和野生型烟酰胺核糖激酶菌株的酶活测定
本发明测定酶活所用的粗酶液的制备方法如下：
(1)取发酵稳定期(常规方法发酵)的发酵液4ml在4℃、转速10000r/min条件下离心5min，弃上清液，收集菌体，用4ml PBS缓冲液重悬。
(2)将重悬液用多通道超声波粉碎仪进行超声破碎。后再4℃、转速10000r/min条件下离心2min，弃沉淀，收集的上清液即为粗酶液。
对于4株高活力突变型菌株和野生型烟酰胺核糖激酶菌株，分别测定其酶活，测定方法如下：
1.检测的反应体系为0.8mL，包括0.2mL的NR溶液、0.2mL的ATP-2Na溶液、0.1mL的氯化镁溶液和0.29mL的PBS缓冲溶液；
2.加入0.01mL的粗酶液，在25℃下反应10分钟后，立即添加0.2mL稀硫酸终止反应。12000rpm离心3分钟后，去上层清液采用高效液相色谱(HPLC)测定上层清液中的烟酰胺单核苷酸的含量。
3.HPLC法采用安捷伦高效液相色谱(Agilent 1100,USA)，检测条件如下：
色谱柱：Eclipse Plus C18 5um 4.6*250mm；
柱温：30℃；
流动相：A：80mL水+0.1g庚烷磺酸钠+0.02mL三乙胺+0.1mL冰醋酸；B：乙腈；A:B＝9:1；
流速：0.8mL/min；
检测波长：265nm；
进样量：20μL；
4.烟酰胺核糖激酶酶活：在25℃条件下，1mL发酵液与2.85g烟酰胺核糖反应催化10分钟后生成的烟酰胺单核苷酸的毫摩尔数，该毫摩尔数即为总酶活力单位数U。结果见表3。
表3：酶活测定结果
菌株 酶活(U/ml)
野生型 20
突变株1 35
突变株2 48
突变株3 70
突变株4 56
实施例3:50ml反应体系摇瓶催化实验：
1.反应体系：配制反应液，NR终浓度100mM、ATP终浓度110mM、氯化镁含量1％，搅拌溶解，用30％ NaOH将反应液pH调至7.0，分装至摇瓶中，每瓶30ml反应液，置于30℃培养箱预热；
2.取出-20℃冰箱中冻存24h的4株高活力突变型菌株及NRK野生菌株菌泥1g，每管用20ml PBS缓冲液重悬，置于30℃培养箱预热30分钟，将菌液(20ml)加入对应编号的摇瓶反应液(30ml)中(菌体密度为20g/L)，温度30℃、转速220rpm，开始反应，每间隔30分钟取样，检测NMN、NR、ATP含量，直至NR基本转化完，反应结束。
3.实验结果如表4所示，结果可见相较野生型菌株，突变型菌株的反应时间和NR转化率均有一定程度的提高，尤其突变株3。
表4：摇瓶催化反应结果
实施例4：10L反应体系反应釜催化实验：
本实施例所用的酶液的制备方法如下：
(1)取发酵稳定期的发酵液(按常规方法发酵)，使用高速冷冻离心机，分装每瓶500ml发酵液，在4℃、转速4000r/min条件下离心30min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃冰柜中冻存24h；
(2)按照30g/L的比例，用PBS缓冲液将冻菌体重悬，使用均制机在高压的条件下将重悬菌液破碎处理，后再4℃、转速10000r/min条件下离心2min，弃沉淀，收集的上清液即为酶液。
配制20％ NR反应液(纯度90％)5L，加入氯化镁30g，搅拌使之溶解，配制15％ATP钠盐5L，用30％浓度的NaOH将ATP钠盐调pH至5以上，先加入1L ATP钠盐到NR中，其余4L在反应开始时流加到NR中；连接好反应罐，调节ph稳定至7.0，温度30℃，加入酶液(终浓度15U/ml)，开始反应，间隔取样，NR基本转化完后，终止反应，收集反应液，测量反应过程中NMN、NR、ATP含量，计算NR转化率。结果如表5所示，最终突变菌株较野生型烟酰胺核糖激酶菌株转化率有所提高，特别是突变株3转化率达97.09％，且缩短了反应所需的时间，提高了生产效率。
表5：10L体系催化实验结果

Claims (10)

1.烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
2.编码权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
4.包含权利要求2或3所述的基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，是将质粒pET-28a用BamHI和HindIII双酶酶切，与权利要求2或3所述基因连接获得。
6.包含权利要求2或3所述的基因或权利要求4或5所述的重组载体的感受态细胞。
7.根据权利要求6所述的感受态细胞，其特征在于，以热激转化法将权利要求4或5所述重组载体转入BL21(DE3)感受态细胞中获得。
8.权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6或7所述的感受态细胞在烟酰胺单核苷酸制备中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的反应体系为：100～180mol/L的烟酰胺核糖、100～150mol/L的ATP-2Na、1～5g/L的氯化镁，PBS缓冲液配置，pH为6.5～7.5；优选的，如果使用烟酰胺核糖激酶突变体，则反应浓度为10～20U/ml；
如果使用菌体，则菌体用量为20g～30g/L。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，反应时的温度为25～30℃。
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