CN117486983B - L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途 - Google Patents
L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117486983B CN117486983B CN202311474123.4A CN202311474123A CN117486983B CN 117486983 B CN117486983 B CN 117486983B CN 202311474123 A CN202311474123 A CN 202311474123A CN 117486983 B CN117486983 B CN 117486983B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carnosine
- yjem
- strain
- transporter
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010087806 Carnosine Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N N-beta-alanyl-L-histidine Natural products NCCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 CQOVPNPJLQNMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N carnosine Chemical compound [NH3+]CCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC=N1 CQOVPNPJLQNMDC-ZETCQYMHSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 9
- 101150003909 yjeM gene Proteins 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 230000010435 extracellular transport Effects 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 abstract description 33
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 6
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N Carnosic acid Natural products CC([C@@H]1CC2)(C)CCC[C@]1(C(O)=O)C1=C2C=C(C(C)C)C(O)=C1O QRYRORQUOLYVBU-VBKZILBWSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940044199 carnosine Drugs 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- QHFQAJHNDKBRBO-UHFFFAOYSA-L calcium chloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] QHFQAJHNDKBRBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WHIXFMOBEKBEQW-UHFFFAOYSA-L dichlorozinc tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Zn+2] WHIXFMOBEKBEQW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HRQDCDQDOPSGBR-UHFFFAOYSA-M sodium;octane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCS([O-])(=O)=O HRQDCDQDOPSGBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002337 anti-port Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 201000008525 senile cataract Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种L‑肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途,本发明属于基因工程领域。本发明还提供YjeM转运蛋白或其编码基因在生产L‑肌肽中的应用。本发明还提供了一种基因工程菌株在生产L‑肌肽中的应用。所述的L‑肌肽为过表达YjeM转运蛋白的重组菌株发酵生产的L‑肌肽。本发明发现过表达YjeM转运蛋白的重组菌株发酵生产L‑肌肽的产量和对照组比较提高了1.33倍。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体涉及L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途。
背景技术
L-肌肽是100多年前在乌克兰的Charkow大学由Gulewitsch和在分析肉类提取物时发现的[1]。它是一种天然存在的二肽,由β-丙氨酸和L-组氨酸组成,广泛分布在哺乳动物组织中,在心脏、骨骼肌以及大脑水平上发挥其生物活性并在其中高度聚集。一些无脊椎动物物种也含有肌肽。自该活性肽发现的一百多年来,已有大量的研究发现或者证明L-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性,并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗,由于其抗氧化的活性强,毒副作用低并具有多种生理活性,该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用,市场空间广阔。
L-肌肽的化学合成已被广泛报道,成为目前生产L-肌肽的商业方式。化学合成方法虽然比较多,但主要有以下两种[2]:一是利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合,然后脱掉保护基团得到L-肌肽。该路线比较复杂,收率低,肽键形成过程中易消旋,影响产品纯度,并且溶剂消耗大,易造成环境污染;二是摒弃β-丙氨酸参与的反应。主要原理为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键,再进一步转换为L-肌肽。该路线相对简单,省去对不同基团的保护和脱保护的过程,避免消旋反应的发生,但是需要无水操作,要求比较严格。以上的路线随着工艺的差异,产品得率大约在60%-80%左右。
为了避免化学合成法在合成条件上所要求的保护基团的添加与脱除、反应温度变化剧烈、pH调整频繁、反应压力高、多相反应体系复杂、溶剂易燃易爆有毒、中间产物分离过程繁琐等诸多不利因素,近年来,国内外有研究者开始致力于利用酶或者细胞在温和的条件下合成L 肌肽。然而,通过生物方法获得的L-肌肽的收率远未达到工业化生产水平。因此亟需开发一种反应温和、产量高、操作简单的L-肌肽合成方法。
YjeM是大肠杆菌中的一种转运蛋白,属于氨基酸-多胺-有机阳离子(APC)转运蛋白超家族,是GABA反向转运蛋白(GGA)家族中的一个未特化成员。目前并没有关于YjeM可以转运L-肌肽的相关现有技术的公开。
[1]Guiotto A,Calderan A,Ruzza P,et al.Carnosine and carnosine-relatedantioxidants:a review[J].Curr Med Chem.2005;12(20):2293-315.
[2]吴长增,宋晓平.L-肌肽的合成与应用[J].许昌学院学报,2009(5):4.
发明内容
针对上述不足,本发明提供了一种L-肌肽制备方法,即转运蛋白YjeM的新用途,经验证,YjeM能够显著提高过表达重组菌株发酵生产L-肌肽的产量,本发明是YjeM转运L-肌肽技术的首次公开。
本发明中YjeM转运蛋白简称为YjeM,其编码基因为yjeM。
本发明的技术方案包括:
一方面,本发明提供了一种YjeM转运蛋白或其编码基因在转运L-肌肽中的应用,所述的YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
具体地,所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运。
具体地,所述的编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
进一步具体地,所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步具体地,所述的过表达为构建过表达质粒。
优选地,所述的过表达质粒为pEZ07-yjeM。
进一步具体地,所述的表达L-肌肽的菌株为基因工程菌株。
优选地,所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株。
进一步优选地,所述菌株的保藏编号为CGMCC No.27382。
另一方面,本发明提供了YjeM转运蛋白或其编码基因在生产L-肌肽中的应用,所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
具体地,所述应用为提高L-肌肽产量。
又一方面,本发明提供了一种yjeM编码基因,所述yjeM编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
又一方面,本发明提供了一种表达质粒的构建方法,包括以下步骤:
S1扩增yjeM基因片段,获得目的基因;
S2将目的基因与酶切回收的载体片段进行克隆构建;
S3转化细胞,筛选阳性克隆,提取质粒验证,得到含有YjeM转运蛋白的表达质粒。
优选地,步骤S1以大肠杆菌W3110基因组为模板,利用引物对扩增yjeM基因片段。
优选地,步骤S1中所述的引物对为pTR166-F/pTR166-R;所述的引物pTR166-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;所述的引物pTR166-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步优选地,所述步骤S1中所述的yjeM基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述yjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地,步骤S2中所述的载体为pEZ07载体。
进一步优选地,步骤S2中所述的目的基因yjeM与pEZ07载体片段的纳摩尔比为1:2。
优选地,步骤S2中所述的酶为NcoI限制性内切酶和/或XhoI限制性内切酶。
优选地,步骤S3中所述转化细胞为加入感受态细胞,进行热击转化。
进一步优选地,步骤S3所述的感受态细胞选自TG1感受态细胞、DH5α感受态细胞、JM109感受态细胞中的一种或多种。
进一步优选地,步骤S3所述的感受态细胞为TG1感受态细胞。
优选地,步骤S3中所述的加入感受态细胞后,包括将其混匀放置42℃热击2min,冰浴2min的步骤。
优选地,步骤S3所述的壮观霉素浓度为80 150mg/L。
进一步优选地,步骤S3所述的壮观霉素浓度为100mg/mL。
又一方面,本发明提供了一种L-肌肽的生产方法,所述生产方法包括构建过表达yjeM编码基因的基因工程菌株。
具体地,所述的yjeM编码基因为SEQ ID NO:2,所述的基因工程菌株为保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株。
由此,本发明同时提供了保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株及其在生产L-肌肽中的应用,具体为提高L-肌肽产量中的应用。
所述菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为中国北京,保藏编号为CGMCC No.27382,分类命名为大肠埃希氏菌。
具体地,所述菌株为L-肌肽基因工程菌株为SHK20C/pHD641。
具体地,所述基因工程菌株的出发菌株为大肠杆菌W3110(ATCC 27325)。
进一步具体地,所述大肠杆菌W3110的基因型为F-mcrAmcrB IN(rrnD-rrnE)1lambda-。
具体地,所述菌株的制备包括以下步骤:大肠杆菌W3110为基础出发菌株,对L-肌肽的降解、摄取基因进行敲除,同时整合解除反馈抑制的L-肌肽合成操纵子,改良其反馈抑制和弱化调控等改造,获得L-肌肽基因工程菌株SHK20C/pHD641。
具体地,所述生产方法还包括构建重组菌株。
进一步具体地,所述重组菌株为上述构建得到的含有YjeM转运蛋白的表达质粒转化L-肌肽基因工程菌株SHK20C/pHD641,分别得到含YjeM转运蛋白的重组菌株。
优选地,所述重组菌株用于发酵生产L-肌肽,生产方法包括以下步骤:
(1)将重组菌株接入含相应抗生素的LB培养基进行培养,得到种子液;
(2)将步骤(1)的种子液转入发酵培养基中进行培养;
(3)加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),培养,得到含有L-肌肽的发酵液。
优选地,步骤(1)中所述的LB培养基为每1L包括:酵母粉5g,氯化钠10g,蛋白胨10g。
优选地,步骤(2)中所述的发酵培养基为每1L包括:葡萄糖30g、5N-5倍的盐溶液200mL、TM3溶液1mL、柠檬酸铁10mg、七水硫酸镁246mg、氯化钙111mg和硫胺素1μg。
具体地,所述的5N-5倍的盐溶液包括:十二水合磷酸氢二钠75.6g/L、磷酸二氢钾15g/L、氯化钠2.5g/L和氯化铵25g/L。
具体地,所述的TM3溶液为每1L包括:四水氯化锌2.0g、六水氯化钙2.0g、两水钼酸钠2.0g、五水硫酸铜1.9g、硼酸0.5g和盐酸100mL。
优选地,所述的发酵过程中,还包括对上述的发酵培养基进行高压蒸汽灭菌步骤。
进一步优选地,所述的灭菌温度为121℃,时间20-30min。
优选地,步骤(3)中所述的IPTG的终浓度为1mM。
优选地,所述L-肌肽的靠目测方法为高效液相色谱法(HPLC)
具体地,所述的检测方法包括以下步骤:发酵液用灭菌水稀释至2倍,离心(1200rpm,1min),过0.22μm滤膜,上清液用HPLC检测。
HPLC的参数如下:
采用Ultimate AQ-C18,4.6*250*5μm;
流动相A为:乙腈;
流动相B为:10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液,磷酸调pH至3.0;
流动相A:流动相B为15:85;
柱流量为1ml/min,柱温为30℃;
波长为210nm,进样量为5μL(稀释2倍后);
检测时间为13min;
利用紫外检测器检测波长210nm,初始流动相的流速为1.0mL/min,发酵液的上样量5μL,柱温30℃。
本发明的有益效果为:
(1)本发明发现过表达YjeM转运蛋白的重组菌株发酵生产的L-肌肽的产量明显高于对照组。
(2)目前并没有关于YjeM可以转运L-肌肽的相关现有技术的公开,本专利是关于YjeM转运L-肌肽的技术首次公开。
保藏说明
生物材料(菌株名称):大肠埃希氏菌;
分类命名:大肠埃希氏菌Escherichia coli;
保藏编号:CGMCC No.27382;
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;
保藏时间:2023年5月18日;
保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为HPLC测定L-肌肽的图谱。
图2为转运蛋白重复发酵的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明进行说明,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明,以使本发明技术方案更易于理解掌握。下属实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明均可从商业途径获得。
基础实验例1:摇瓶发酵验证重组菌株生产L-肌肽的方法
1、试剂:
(1)LB培养基:每升培养基中含酵母粉5g,氯化钠10g,蛋白胨10g,去离子水定容至1L。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌,灭菌温度121℃,时间20-30min。
(2)发酵培养基(每升):葡萄糖30g,5N-5倍的盐溶液200mL,TM3溶液1mL,柠檬酸铁10mg,七水硫酸镁246mg,氯化钙111mg,硫胺素1μg,以无菌去离子水定容至1L。
其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠75.6g,磷酸二氢钾15g,氯化钠2.5g,氯化铵25g,以离子水定容至1L。
TM3溶液为四水氯化锌2.0g,六水氯化钙2.0g,两水钼酸钠2.0g,五水硫酸铜1.9g,硼酸0.5g,盐酸100mL,去离子水定容至1L。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌,灭菌温度121℃,时间20-30min。同时准备空摇瓶,每瓶按照称取0.4g碳酸钙,使碳酸钙最终浓度为20g/L。
2、仪器:
恒温摇床培养箱。
3、方法:
摇瓶发酵过程:
(1)接种重组菌株至含有壮观霉素的3mL的LB培养基中,置37℃摇床250rpm培养16h后得种子液。
(2)取种子液200μL转移至2mL含有壮观霉素的LB液体培养基,于37℃摇床250rpm培养4h。
(3)将2mL二级种子全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中,置37℃摇床中,250rpm培养4h。
(4)添加IPTG使其终浓度1mM,调节摇床温度至34℃,继续培养20h左右,取0.5mL发酵液和0.5mL水混匀离心后(12000rpm,1min),取上清检测,检测方法详见基础实验例2。
基础实验例2:HPLC测定发酵液中的L-肌肽
基础实验例步骤(4)的上清离心(1200rpm,1min),过0.22μm的滤膜,用高效液相色谱(HPLC)检测。
HPLC的参数如下:
采用Ultimate AQ-C18,4.6*250*5μm;
流动相A为:乙腈;
流动相B为:10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液,磷酸调pH至3.0;
流动相A:流动相B体积比为15:85;
柱流量为1mL/min,柱温为30℃;
波长为210nm,进样量为5μL;
检测时间为13min;
利用紫外检测器检测波长210nm,初始流动相的流速为1.0mL/min。
实验结果:
HPLC测定L-肌肽的图谱如图1,从图1中可以看出,L-肌肽的出峰时间为10分钟。
实施例1转运蛋白表达库的初筛
本发明通过搜索查询和比对,筛选出167个转运蛋白,分别设计引物通过无缝克隆构建到低拷贝载体pEZ07(载体pEZ07同中国专利申请号:201510093004.3中)上,得到167个转运蛋白表达质粒pTR001-pTR167。以转运蛋白表达质粒pTR166(即pEZ07-yjeM)构建为例介绍转运蛋白表达质粒构建过程,具体步骤如下:
(1)以大肠杆菌W3110(ATCC 27325)基因组为模板,利用引物对扩增yjeM基因片段,引物对序列见表1,得到大小为1555bp的片段且电泳无杂带。
表1 pEZ07-yjeM构建引物
表1中,F和R为扩增引物,其中:F表示正向引物,R表示反向引物。
(2)步骤(1)得到的片段直接进行过柱回收纯化,使用捷瑞胶回收纯化试剂盒(购自上海捷瑞生物工程技术有限公司,货号GK2043),得到纯化片段。
(3)步骤(2)得到的纯化片段以纳摩尔比1:2与NcoI/XhoI酶切回收的pEZ07载体片段进行EZ克隆构建,使用GBclonart无缝克隆试剂盒(购自苏州神洲基因有限公司,货号GB2001-48)。
所述NcoI/XhoI酶切回收pEZ07载体片段的步骤为:
pEZ07提取质粒后,取50μL质粒加入30μL水,分别加入5μL FastDigest NcoI、5μLFastDigest XhoI的酶10X FastDigest Buffer 10μL混匀后37℃放置3h后进行载体回收。
所述的EZ克隆构建包括以下步骤:
重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min,然后转移到冰上放置5min,加入TG1化转感受态细胞,混匀放置5min,42℃热击2min,冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB,复苏培养1h后,离心(8000rpm,1min),涂布含100mg/L壮观霉素的LB平板,次日挑取克隆培养过夜,提取质粒进行酶切验证,最终构建得到质粒,编号pTR166。
酶切验证步骤为:质粒提取成功后10μL体系:取质粒5μL、水2.6μL、0.7μLFastDigest MssI与0.7μL FastDigest HindIII、10X FastDigest green Buffer 1μL混匀后37℃放置1h后进行电泳跑胶25min看条带是否正确。
(4)上述构建得到的转运蛋白库相关质粒pTR001-pTR167分别转化宿主SHK20C/pHD641(保藏号CGMCC No.27382),分别得到含不同转运蛋白的重组菌株。将含不同转运蛋白的重组菌株及对照菌SHK20C/pEZ07(SHK20C/pHD641整合空载体pEZ07)分别接种克隆到含100mg/L壮观霉素的LB试管,取培养过夜的种子200μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基,于37℃摇床250rpm培养4h后全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中,置37℃摇床中,250rpm培养4h,加IPTG诱导34℃培养过夜,继续培养20h左右,取0.5mL发酵液加0.5mL的离子水稀释2倍,12000rpm离心1min后取上清检测,检测方法详见基础实验例2。每个菌株挑取3个克隆进行平行发酵,结果取平均值,测定结果如下:
表2转运蛋白初筛发酵结果
以上数据表明,67.66%(113/167)的转运蛋白过表达后L-肌肽的产量明显降低,只有4.19%(7/167)的转运蛋白过表达后L-肌肽的产量提高20%-60%。YjeM能够显著提高L-肌肽的产率,L-肌肽的产量与对照相比提高了132.72%,具有显著提高。
实施例2转运蛋白表达库的复筛
将初筛L-肌肽产量明显提高的菌株YjeM,按照实施例1进行摇瓶发酵复筛,经过2轮摇瓶复筛发酵,验证结果如图2所示。
转运蛋白YjeM过表达L-肌肽的产量超过2.5g/L,与对照组1.91g/L相比,L-肌肽产量有明显的提高。将转运蛋白YjeM再次进行摇瓶发酵重复,结果类似,说明转运蛋白YjeM表达结果比较稳定。YjeM不仅可以稳定提高L-肌肽的产量,而且增加比例更显著,这是首次发现转运蛋白YjeM可以明显提高L-肌肽的产量。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明,该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是,凡未脱离本发明所为的等效实施或变更,均应包含于本发明技术方案的范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附要求为准。
Claims (6)
1.一种YjeM转运蛋白或其编码基因在转运L-肌肽中的应用,其特征在于,所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运;所述的转运蛋白或编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的表达L-肌肽的菌株为基因工程菌株;所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株,保藏编号为CGMCC No.27382。
4.一种YjeM转运蛋白或其编码基因在生产L-肌肽中的应用,其特征在于,所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运;所述的转运蛋白或编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
5.一种L-肌肽的生产方法,其特征在于,所述生产方法包括构建过表达yjeM编码基因的基因工程菌株,所述的yjeM编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO:2,所述的基因工程菌株为保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株(Escherichia coli)。
6.一种基因工程菌株在生产L-肌肽中的应用,其特征在于,所述的应用为在基因工程菌株中过表达yjeM编码基因,所述yjeM编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2,所述的基因工程菌株为保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311474123.4A CN117486983B (zh) | 2023-11-07 | 2023-11-07 | L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311474123.4A CN117486983B (zh) | 2023-11-07 | 2023-11-07 | L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117486983A CN117486983A (zh) | 2024-02-02 |
CN117486983B true CN117486983B (zh) | 2024-07-02 |
Family
ID=89670338
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311474123.4A Active CN117486983B (zh) | 2023-11-07 | 2023-11-07 | L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117486983B (zh) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109593805B (zh) * | 2019-01-16 | 2021-02-09 | 常熟理工学院 | 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法 |
CN109609536B (zh) * | 2019-01-16 | 2020-12-08 | 常熟理工学院 | 一种全细胞一步合成l-肌肽的方法 |
CN109652484B (zh) * | 2019-01-16 | 2020-12-29 | 常熟理工学院 | 一种全细胞高效催化合成l-肌肽的方法 |
CN113481252A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-10-08 | 苏州富士莱医药股份有限公司 | 一步法催化合成l-肌肽的方法 |
CN115838713A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-03-24 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用 |
CN116732009A (zh) * | 2023-07-28 | 2023-09-12 | 江南大学 | 一种重组二肽酶突变体及其在l-肌肽生产中的应用 |
-
2023
- 2023-11-07 CN CN202311474123.4A patent/CN117486983B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MULTISPECIES: glutamate/gamma-aminobutyrate family transporter YjeM [Enterobacteriaceae];NCBI;NCBI Reference Sequence;20201216;1 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117486983A (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109593805B (zh) | 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法 | |
JP4262206B2 (ja) | 遺伝子組換えAgrobacteriumtumefaciensによる補酵素Q10製造の発酵方法 | |
KR20000011587A (ko) | 사람성장호르몬의분비생산방법 | |
WO2019157823A1 (zh) | 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用 | |
CN114657078B (zh) | 一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用 | |
CN113684165A (zh) | 一种重组谷氨酸棒杆菌及其在生产l-谷氨酰胺中的应用 | |
CN113136377A (zh) | 一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用 | |
CN114277046B (zh) | 一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体及应用 | |
CN116515918B (zh) | MdtL的色氨酸转运应用及生产方法和菌株 | |
CN112522228B (zh) | 一种来源于氨氧化假诺卡氏单胞菌的r-转氨酶及其合成方法 | |
CN117486983B (zh) | L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途 | |
CN112608933A (zh) | 一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法 | |
CN117510598B (zh) | 转运蛋白YahN在L-肌肽生产中的应用 | |
CN117486984B (zh) | 转运蛋白KefG在提高L-肌肽产量中的应用 | |
CN116042566A (zh) | 烟酰胺核糖激酶突变体及其应用 | |
CN114525215B (zh) | 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用 | |
CN117486982B (zh) | 转运蛋白TdcC在提高L-肌肽的产量中的应用 | |
CN113151378B (zh) | 制备烟酸或其衍生物的核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸的方法、酶组合物及应用 | |
CN113201074B (zh) | 一种pkek融合蛋白及制备方法与应用 | |
WO1988005816A1 (en) | Polypeptide | |
CN111172090B (zh) | 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法 | |
CN117925744B (zh) | 非核糖体肽合成酶在生产脱羧肌肽中的应用 | |
CN114774432B (zh) | 麻疯树核糖体失活蛋白JcRIP12及其编码基因和应用 | |
CN117106680B (zh) | 一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法 | |
CN112831451B (zh) | 产丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |