CN117486983A - L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种L‑肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途，本发明属于基因工程领域。本发明还提供YjeM转运蛋白或其编码基因在生产L‑肌肽中的应用。本发明还提供了一种基因工程菌株在生产L‑肌肽中的应用。所述的L‑肌肽为过表达YjeM转运蛋白的重组菌株发酵生产的L‑肌肽。本发明发现过表达YjeM转运蛋白的重组菌株发酵生产L‑肌肽的产量和对照组比较提高了1.33倍。

Description

L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途。

背景技术

L-肌肽是100多年前在乌克兰的Charkow大学由Gulewitsch和在分析肉类提取物时发现的^[1]。它是一种天然存在的二肽，由β-丙氨酸和L-组氨酸组成，广泛分布在哺乳动物组织中，在心脏、骨骼肌以及大脑水平上发挥其生物活性并在其中高度聚集。一些无脊椎动物物种也含有肌肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明L-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗，由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性,该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。

L-肌肽的化学合成已被广泛报道，成为目前生产L-肌肽的商业方式。化学合成方法虽然比较多，但主要有以下两种^[2]：一是利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L-肌肽。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；二是摒弃β-丙氨酸参与的反应。主要原理为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为L-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求比较严格。以上的路线随着工艺的差异，产品得率大约在60％-80％左右。

为了避免化学合成法在合成条件上所要求的保护基团的添加与脱除、反应温度变化剧烈、pH调整频繁、反应压力高、多相反应体系复杂、溶剂易燃易爆有毒、中间产物分离过程繁琐等诸多不利因素，近年来，国内外有研究者开始致力于利用酶或者细胞在温和的条件下合成L 肌肽。然而，通过生物方法获得的L-肌肽的收率远未达到工业化生产水平。因此亟需开发一种反应温和、产量高、操作简单的L-肌肽合成方法。

YjeM是大肠杆菌中的一种转运蛋白，属于氨基酸-多胺-有机阳离子(APC)转运蛋白超家族，是GABA反向转运蛋白(GGA)家族中的一个未特化成员。目前并没有关于YjeM可以转运L-肌肽的相关现有技术的公开。

[1]Guiotto A,Calderan A,Ruzza P,et al.Carnosine and carnosine-relatedantioxidants:a review[J].Curr Med Chem.2005；12(20):2293-315.

[2]吴长增,宋晓平.L-肌肽的合成与应用[J].许昌学院学报,2009(5):4.

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种L-肌肽制备方法，即转运蛋白YjeM的新用途，经验证，YjeM能够显著提高过表达重组菌株发酵生产L-肌肽的产量，本发明是YjeM转运L-肌肽技术的首次公开。

本发明中YjeM转运蛋白简称为YjeM，其编码基因为yjeM。

本发明的技术方案包括：

一方面，本发明提供了一种YjeM转运蛋白或其编码基因在转运L-肌肽中的应用，所述的YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

具体地，所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运。

具体地，所述的编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。

进一步具体地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步具体地，所述的过表达为构建过表达质粒。

优选地，所述的过表达质粒为pEZ07-yjeM。

进一步具体地，所述的表达L-肌肽的菌株为基因工程菌株。

优选地，所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株。

进一步优选地，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.27382。

另一方面，本发明提供了YjeM转运蛋白或其编码基因在生产L-肌肽中的应用，所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

具体地，所述应用为提高L-肌肽产量。

又一方面，本发明提供了一种yjeM编码基因，所述yjeM编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

又一方面，本发明提供了一种表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

S1扩增yjeM基因片段，获得目的基因；

S2将目的基因与酶切回收的载体片段进行克隆构建；

S3转化细胞，筛选阳性克隆，提取质粒验证，得到含有YjeM转运蛋白的表达质粒。

优选地，步骤S1以大肠杆菌W3110基因组为模板，利用引物对扩增yjeM基因片段。

优选地，步骤S1中所述的引物对为pTR166-F/pTR166-R；所述的引物pTR166-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述的引物pTR166-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步优选地，所述步骤S1中所述的yjeM基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述yjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，步骤S2中所述的载体为pEZ07载体。

进一步优选地，步骤S2中所述的目的基因yjeM与pEZ07载体片段的纳摩尔比为1：2。

优选地，步骤S2中所述的酶为NcoI限制性内切酶和/或XhoI限制性内切酶。

优选地，步骤S3中所述转化细胞为加入感受态细胞，进行热击转化。

进一步优选地，步骤S3所述的感受态细胞选自TG1感受态细胞、DH5α感受态细胞、JM109感受态细胞中的一种或多种。

进一步优选地，步骤S3所述的感受态细胞为TG1感受态细胞。

优选地，步骤S3中所述的加入感受态细胞后，包括将其混匀放置42℃热击2min，冰浴2min的步骤。

优选地，步骤S3所述的壮观霉素浓度为80 150mg/L。

进一步优选地，步骤S3所述的壮观霉素浓度为100mg/mL。

又一方面，本发明提供了一种L-肌肽的生产方法，所述生产方法包括构建过表达yjeM编码基因的基因工程菌株。

具体地，所述的yjeM编码基因为SEQ ID NO：2，所述的基因工程菌株为保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株。

由此，本发明同时提供了保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株及其在生产L-肌肽中的应用，具体为提高L-肌肽产量中的应用。

所述菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.27382，分类命名为大肠埃希氏菌。

具体地，所述菌株为L-肌肽基因工程菌株为SHK20C/pHD641。

具体地，所述基因工程菌株的出发菌株为大肠杆菌W3110(ATCC 27325)。

进一步具体地，所述大肠杆菌W3110的基因型为F-mcrAmcrB IN(rrnD-rrnE)1lambda-。

具体地，所述菌株的制备包括以下步骤：大肠杆菌W3110为基础出发菌株，对L-肌肽的降解、摄取基因进行敲除，同时整合解除反馈抑制的L-肌肽合成操纵子，改良其反馈抑制和弱化调控等改造，获得L-肌肽基因工程菌株SHK20C/pHD641。

具体地，所述生产方法还包括构建重组菌株。

进一步具体地，所述重组菌株为上述构建得到的含有YjeM转运蛋白的表达质粒转化L-肌肽基因工程菌株SHK20C/pHD641，分别得到含YjeM转运蛋白的重组菌株。

优选地，所述重组菌株用于发酵生产L-肌肽，生产方法包括以下步骤：

(1)将重组菌株接入含相应抗生素的LB培养基进行培养，得到种子液；

(2)将步骤(1)的种子液转入发酵培养基中进行培养；

(3)加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，培养，得到含有L-肌肽的发酵液。

优选地，步骤(1)中所述的LB培养基为每1L包括：酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g。

优选地，步骤(2)中所述的发酵培养基为每1L包括：葡萄糖30g、5N-5倍的盐溶液200mL、TM3溶液1mL、柠檬酸铁10mg、七水硫酸镁246mg、氯化钙111mg和硫胺素1μg。

具体地，所述的5N-5倍的盐溶液包括：十二水合磷酸氢二钠75.6g/L、磷酸二氢钾15g/L、氯化钠2.5g/L和氯化铵25g/L。

具体地，所述的TM3溶液为每1L包括：四水氯化锌2.0g、六水氯化钙2.0g、两水钼酸钠2.0g、五水硫酸铜1.9g、硼酸0.5g和盐酸100mL。

优选地，所述的发酵过程中，还包括对上述的发酵培养基进行高压蒸汽灭菌步骤。

进一步优选地，所述的灭菌温度为121℃，时间20-30min。

优选地，步骤(3)中所述的IPTG的终浓度为1mM。

优选地，所述L-肌肽的靠目测方法为高效液相色谱法(HPLC)

具体地，所述的检测方法包括以下步骤：发酵液用灭菌水稀释至2倍，离心(1200rpm，1min)，过0.22μm滤膜，上清液用HPLC检测。

HPLC的参数如下：

采用Ultimate AQ-C18，4.6*250*5μm；

流动相A为：乙腈；

流动相B为：10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液，磷酸调pH至3.0；

流动相A：流动相B为15：85；

柱流量为1ml/min，柱温为30℃；

波长为210nm，进样量为5μL(稀释2倍后)；

检测时间为13min；

利用紫外检测器检测波长210nm，初始流动相的流速为1.0mL/min，发酵液的上样量5μL，柱温30℃。

本发明的有益效果为：

(1)本发明发现过表达YjeM转运蛋白的重组菌株发酵生产的L-肌肽的产量明显高于对照组。

(2)目前并没有关于YjeM可以转运L-肌肽的相关现有技术的公开，本专利是关于YjeM转运L-肌肽的技术首次公开。

保藏说明

生物材料(菌株名称)：大肠埃希氏菌；

分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli；

保藏编号：CGMCC No.27382；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏时间：2023年5月18日；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为HPLC测定L-肌肽的图谱。

图2为转运蛋白重复发酵的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行说明，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明，以使本发明技术方案更易于理解掌握。下属实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明均可从商业途径获得。

基础实验例1：摇瓶发酵验证重组菌株生产L-肌肽的方法

1、试剂：

(1)LB培养基：每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水定容至1L。

上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。

(2)发酵培养基(每升)：葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200mL，TM3溶液1mL，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1μg，以无菌去离子水定容至1L。

其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠75.6g，磷酸二氢钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L。

TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。

上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。同时准备空摇瓶，每瓶按照称取0.4g碳酸钙，使碳酸钙最终浓度为20g/L。

2、仪器：

恒温摇床培养箱。

3、方法：

摇瓶发酵过程：

(1)接种重组菌株至含有壮观霉素的3mL的LB培养基中，置37℃摇床250rpm培养16h后得种子液。

(2)取种子液200μL转移至2mL含有壮观霉素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h。

(3)将2mL二级种子全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养4h。

(4)添加IPTG使其终浓度1mM，调节摇床温度至34℃，继续培养20h左右，取0.5mL发酵液和0.5mL水混匀离心后(12000rpm，1min)，取上清检测，检测方法详见基础实验例2。

基础实验例2：HPLC测定发酵液中的L-肌肽

基础实验例步骤(4)的上清离心(1200rpm，1min)，过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测。

HPLC的参数如下：

采用Ultimate AQ-C18，4.6*250*5μm；

流动相A为：乙腈；

流动相B为：10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液，磷酸调pH至3.0；

流动相A：流动相B体积比为15：85；

柱流量为1mL/min，柱温为30℃；

波长为210nm，进样量为5μL；

检测时间为13min；

利用紫外检测器检测波长210nm，初始流动相的流速为1.0mL/min。

实验结果：

HPLC测定L-肌肽的图谱如图1，从图1中可以看出，L-肌肽的出峰时间为10分钟。

实施例1转运蛋白表达库的初筛

本发明通过搜索查询和比对，筛选出167个转运蛋白，分别设计引物通过无缝克隆构建到低拷贝载体pEZ07(载体pEZ07同中国专利申请号：201510093004.3中)上，得到167个转运蛋白表达质粒pTR001-pTR167。以转运蛋白表达质粒pTR166(即pEZ07-yjeM)构建为例介绍转运蛋白表达质粒构建过程，具体步骤如下：

(1)以大肠杆菌W3110(ATCC 27325)基因组为模板，利用引物对扩增yjeM基因片段，引物对序列见表1，得到大小为1555bp的片段且电泳无杂带。

表1 pEZ07-yjeM构建引物

表1中，F和R为扩增引物，其中：F表示正向引物，R表示反向引物。

(2)步骤(1)得到的片段直接进行过柱回收纯化，使用捷瑞胶回收纯化试剂盒(购自上海捷瑞生物工程技术有限公司，货号GK2043)，得到纯化片段。

(3)步骤(2)得到的纯化片段以纳摩尔比1:2与NcoI/XhoI酶切回收的pEZ07载体片段进行EZ克隆构建，使用GBclonart无缝克隆试剂盒(购自苏州神洲基因有限公司，货号GB2001-48)。

所述NcoI/XhoI酶切回收pEZ07载体片段的步骤为：

pEZ07提取质粒后，取50μL质粒加入30μL水，分别加入5μL FastDigest NcoI、5μLFastDigest XhoI的酶10X FastDigest Buffer 10μL混匀后37℃放置3h后进行载体回收。

所述的EZ克隆构建包括以下步骤：

重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，加入TG1化转感受态细胞，混匀放置5min，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB，复苏培养1h后，离心(8000rpm，1min)，涂布含100mg/L壮观霉素的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒，编号pTR166。

酶切验证步骤为：质粒提取成功后10μL体系：取质粒5μL、水2.6μL、0.7μLFastDigest MssI与0.7μL FastDigest HindIII、10X FastDigest green Buffer 1μL混匀后37℃放置1h后进行电泳跑胶25min看条带是否正确。

(4)上述构建得到的转运蛋白库相关质粒pTR001-pTR167分别转化宿主SHK20C/pHD641(保藏号CGMCC No.27382)，分别得到含不同转运蛋白的重组菌株。将含不同转运蛋白的重组菌株及对照菌SHK20C/pEZ07(SHK20C/pHD641整合空载体pEZ07)分别接种克隆到含100mg/L壮观霉素的LB试管，取培养过夜的种子200μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h后全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养4h，加IPTG诱导34℃培养过夜，继续培养20h左右，取0.5mL发酵液加0.5mL的离子水稀释2倍，12000rpm离心1min后取上清检测，检测方法详见基础实验例2。每个菌株挑取3个克隆进行平行发酵，结果取平均值，测定结果如下：

表2转运蛋白初筛发酵结果

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以上数据表明，67.66％(113/167)的转运蛋白过表达后L-肌肽的产量明显降低，只有4.19％(7/167)的转运蛋白过表达后L-肌肽的产量提高20％-60％。YjeM能够显著提高L-肌肽的产率，L-肌肽的产量与对照相比提高了132.72％，具有显著提高。

实施例2转运蛋白表达库的复筛

将初筛L-肌肽产量明显提高的菌株YjeM，按照实施例1进行摇瓶发酵复筛，经过2轮摇瓶复筛发酵，验证结果如图2所示。

转运蛋白YjeM过表达L-肌肽的产量超过2.5g/L，与对照组1.91g/L相比，L-肌肽产量有明显的提高。将转运蛋白YjeM再次进行摇瓶发酵重复，结果类似，说明转运蛋白YjeM表达结果比较稳定。YjeM不仅可以稳定提高L-肌肽的产量，而且增加比例更显著，这是首次发现转运蛋白YjeM可以明显提高L-肌肽的产量。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。

Claims (10)

1.一种YjeM转运蛋白或其编码基因在转运L-肌肽中的应用，其特征在于，所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运；所述的编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的过表达为构建过表达质粒；所述的过表达质粒为pEZ07-yjeM。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的表达L-肌肽的菌株为基因工程菌株；所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株，保藏编号为CGMCCNo.27382。

6.一种YjeM转运蛋白或其编码基因在生产L-肌肽中的应用，其特征在于，所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.一种yjeM编码基因，其特征在于，所述yjeM编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

8.一种L-肌肽的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括构建过表达yjeM编码基因的基因工程菌株，所述的yjeM编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述的基因工程菌株为保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株。

9.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCCNo.27382，分类命名为大肠埃希氏菌。

10.权利要求9所述的基因工程菌株的应用，其特征在于，所述应用为在生产L-肌肽中的应用。