CN109593805A - 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法 - Google Patents

一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109593805A
CN109593805A CN201910040733.0A CN201910040733A CN109593805A CN 109593805 A CN109593805 A CN 109593805A CN 201910040733 A CN201910040733 A CN 201910040733A CN 109593805 A CN109593805 A CN 109593805A
Authority
CN
China
Prior art keywords
beta
histidine
amino acid
alanyl
acid ligase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910040733.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109593805B (zh
Inventor
朱益波
张璐
孙安迪
包承润
邹锦涛
于志勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Bainuo Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Changshu Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changshu Institute of Technology filed Critical Changshu Institute of Technology
Priority to CN201910040733.0A priority Critical patent/CN109593805B/zh
Publication of CN109593805A publication Critical patent/CN109593805A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109593805B publication Critical patent/CN109593805B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04001—Polyphosphate kinase (2.7.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02028—L-Amino-acid alpha-ligase (6.3.2.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

本发明公开了一种利用L‑氨基酸连接酶一步法合成L‑肌肽的方法，该方法以β‑丙氨酸、L‑组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl2为激活剂，加入L‑氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，在pH值为6.5‑8.5,30‑45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成L‑肌肽；本发明的方法，由序列优化过后的L‑氨基酸连接酶基因在大肠杆菌中成功获得表达，并能一步催化β丙氨酸和L‑组氨酸合成L‑肌肽。底物无需经过甲酯化或者基团保护；催化反应中所需要的ATP由聚磷酸激酶催化ADP磷酸化不断再生，只需消耗少量的ADP即可实现ATP的循环再生；且再生原料六偏磷酸钠来源广泛，成本低廉，操作简单，易于规模化生产。

Description

一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法
技术领域
本发明涉及一种合成肌肽的方法，具体是一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，属于生物技术领域。
背景技术
L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)，是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明L-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗。由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性，该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。
目前L-肌肽的生产主要采用化学合成法。已有的化学合成方法比较多，主要可以分为两大类：(1)利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L-肌肽。该路线由于各个保护基团的差异导致合成路线较多。其中常用的方法是利用邻苯二甲酸酐与β-丙氨酸生成邻苯二甲酰-β-丙氨酸保护氨基，羧基与氯化亚砜反应生成邻苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再与保护的L-组氨酸形成肽键后脱保护基团得到产品。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；(2)无β-丙氨酸参与的反应：主要原理为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽。常用的路线是在醇钠作用下，L-组氨酸和氰乙酸乙酯发生酰化反应，得到氰基乙酰-L-组氨酸，经催化氢化还原得L-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求严格。同时，氰乙酸乙酯为环境毒害物质，易引起水体污染和毒性反应。
目前，已有采用温和环保的酶催化合成取代传统化学合成工艺的报道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸一步合成L-肌肽(申请公布号为CN107217048A的专利文献)。该方法依然需要将β丙氨酸甲酯化，并且反应液中合成的L-肌肽会被氨肽酶降解为β-丙氨酸和L-组氨酸，同时，氨肽酶会形成三肽，导致反应产物复杂、提取纯化困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，该方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点，具有较好的应用潜力。
为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：
一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，该以β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl2为激活剂，加入L-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，在pH值为6.5-8.5,30-45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成L-肌肽。
具体地，包括以下步骤：
(1)分别构建L-氨基酸连接酶的基因重组表达载体pET-ywfE和聚磷酸盐激酶的基因重组表达载体pET-PPK，其中，L-氨基酸连接酶基因来源于Bacillus subtilis BGSC3A2，GI：1094636766，该序列经密码子优化后如SEQ ID NO.1所示；聚磷酸盐激酶基因来源于E.coli K-12(MG1655)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
(2)分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程重组菌株E.coli pET-ywfE和E.coli pET-PPK。
(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达的L-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶的菌体。
重组菌株中的培养方法为:重组菌株按体积百分比的1-2％接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180-220rpm培养至OD600达到0.6-0.8时添加终浓度0.2-0.5mM IPTG，于25℃诱导培养8-10h，收集菌体。
作为优选，所述LB培养基每升包括10g氯化钠，5g酵母粉，10g蛋白胨，pH7.2-7.4。
(4)破碎步骤(3)中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；
(5)将步骤(4)中获得的混合酶液加入含有80-150mMβ-丙氨酸、80-150mM L-组氨酸、5mM MgCl2、3.0-6.0mM ATP和30-50mM六偏磷酸钠的催化液中，在pH值为6.5-8.5,温度为30-45℃条件下进行酶促反应合成肌肽。
所述催化液为50mM磷酸缓冲液中含有浓度为100mMβ-丙氨酸、100mM L-组氨酸、5mM MgCl2、5mM ATP和50mM六偏磷酸钠。
本发明方法利用大肠杆菌分别表达L-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系。L-氨基酸连接酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸合成L-肌肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生。利用上述双酶偶联体系，在合适的反应条件下反应6h可以得到31mM L-肌肽。
上述的L-肌肽制备方法所得催化体系中L-肌肽的检测方法为：取适量体积反应液于15000g离心10min后，取上清液经适当稀释后，取30μl样品混于270μl 0.2M硼酸缓冲液(pH＝9.0)，加入300μl 1.5mg/ml FMOC-Cl乙腈溶液，室温放置10分钟，再加入300μl 4mg/ml盐酸金刚烷胺的乙腈：水(1:1)溶液，混匀，0.22μm滤膜过滤，上HPLC进行测定。
色谱分析条件：Zorbax ODS C18柱，上样量20μl；流动相组成：A：乙腈；B:50mM醋酸钠缓冲液pH4.2；检测波长263nm；流动相总流量1ml/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0-3min，34％A，66％B；3-10min，45％A，55％B；10-20min，60％A，40％B；20-30min，100％A；30-40min，100％A。
本发明的方法，由序列优化过后的L-氨基酸连接酶基因在大肠杆菌中成功获得表达，并能一步催化β丙氨酸和L-组氨酸合成L-肌肽。底物无需经过甲酯化或者基团保护；催化反应中所需要的ATP由聚磷酸激酶催化ADP磷酸化不断再生，只需消耗少量的ADP即可实现ATP的循环再生；且再生原料六偏磷酸钠来源广泛，成本低廉，操作简单，易于规模化生产。
附图说明
图1为双酶偶联反应示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明利用大肠杆菌分别表达L-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系。L-氨基酸连接酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸合成L-肌肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生，如图1所示。具体步骤：
一、重组L-氨基酸连接酶菌株构建
1.1：根据GI号为GI：1094636766的L-氨基酸连接酶基因序列，经密码子优化后，在优化序列5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加XhoI酶切位点，形成如SEQ ID NO.1所示序列。该序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.2：使用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤1中的基因片段及pET-28a载体，胶回收目的片段，并用T4DNA连接酶连接两个基因片段，得到重组表达载体pET-ywfE。
1.3：将步骤2中的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)中，获得产表达的L-氨基酸连接酶菌株E.coli pET-ywfE。
二、聚磷酸激酶表达菌株构建
2.1：以E.coli K12基因组为模板，用引物对5’-GGATCCATATGGGTCAGGAAAAGCTATAC-3’、5’-CGCGGATCCGGTACCTTATTCAGGTTGTTCGAG-3’扩增ppk基因片段。所述引物分别包含酶切位点NdeI和BamHI，形成如SEQ ID NO.2所示序列。
2.2：使用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切步骤1中获得的目的片段及pET-15b载体，胶回收相应目标片段DNA。
2.3：使用T4DNA连接酶连接步骤2中的两个基因片段，得到重组载体pET-PPK。
2.4：将步骤3获得的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)中，获得表达聚磷酸激酶的E.coli PET-PPK。
三、L-氨基酸连接酶和聚磷酸激酶的制备
将步骤一和步骤二中的菌株分别按照1％-2％(v/v)接种到LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素用于E.coli pET-ywfE，100μg/mL氨苄青霉素用于E.coli pET-PPK)，于37℃，200rpm培养至OD600达到0.8左右，添加终浓度为0.4mM的IPTG，25℃诱导培养10h。
将E.coli pET-ywfE发酵液于8000rpm，4℃离心10分钟，收集菌体。使用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次后，再次用缓冲液重悬，加入1％(v/v)Triton-100，冰浴，超声波破碎4秒停2秒，维持15分钟。4℃，12000rpm离心20分钟，取上清液。
将上清液经0.45微米滤膜过滤后，以1ml/min的流速通过Ni Focurose6FF(IMAC)树脂后，用同样流速的0.5M NaCl，20mM pH7.4PBS缓冲液冲洗，再用0.5M NaCl和250mM咪唑溶液以同样流速洗脱目的蛋白。
将洗脱的蛋白用pH7.4PBS缓冲液4℃透析脱盐，获得纯化酶液。
E.coli pET-PPK的发酵液处理方法按照文献(Artificial Cells,BloodSubstitutes,and Biotechnology,34:515–521,2006,DOI:10.1080/10731190600862886)所述进行处理。
四、双酶偶联催化合成L-肌肽
4.1：配置反应体系，其中pH7.4 50mM磷酸缓冲液中含有浓度为100mMβ-丙氨酸、100mM L-组氨酸、5mM MgCl2、5mM ATP和50mM六偏磷酸钠。
4.2：向步骤1中添加纯化的L-氨基酸连接酶与聚磷酸激酶，使得终浓度分别为0.2mg/ml和0.4mg/ml。反应体系在37℃水浴振荡反应6h。
反应液中L-肌肽及底物氨基酸的检测：
取适量体积反应液于15000g离心10min后，取上清液经适当稀释后，取30μl样品混于270μl 0.2M硼酸缓冲液(pH＝9.0)，加入300μl 1.5mg/ml FMOC-Cl乙腈溶液，室温放置10分钟，再加入300μl 4mg/ml盐酸金刚烷胺的乙腈：水(1:1)溶液，混匀，0.22μm滤膜过滤，上HPLC进行测定。
色谱分析条件：Zorbax ODS C18柱，上样量20μl；流动相组成：A：乙腈；B:50mM醋酸钠缓冲液pH4.2；检测波长263nm；流动相总流量1ml/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0-3min，34％A，66％B；3-10min，45％A，55％B；10-20min，60％A，40％B；20-30min，100％A；30-40min，100％A。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis BGSC 3A2)
<400> 1
catatggagc gtaaaaccgt actggtcatc gctgatctgg gtggctgccc gccgcacatg 60
ttttataaga gcgctgctga aaaatataac ctggtcagct ttattccacg tccttttgca 120
attaccgcat cccatgcagc actgattgaa aaatacagcg tcgcggttat caaagataaa 180
gactatttta aatctctggc tgattttgag catcctgact ccatttattg ggcgcatgag 240
gatcacaaca aacctgagga agaggttgtt gagcaaatcg ttaaagttgc cgaaatgttt 300
ggtgcggatg ccatcaccac caacaatgaa ctgttcattg ctccgatggc gaaagcctgt 360
gaacgcctgg gcctgcgtgg tgccggcgtg caggcagccg aaaatgcccg tgataaaaat 420
aagatgcgtg acgcttttaa caaagccggt gttaaaagca tcaaaaacaa acgcgtgacc 480
actctggaag atttccgtgc tgctctggaa gagatcggca ccccgctgat cctgaaaccg 540
acctacctgg cgtcttctat cggtgtaacg ctgattacgg acactgagac ggcagaagat 600
gaattcaacc gtgtgaacga ctatctgaaa tctattaacg tgccaaaagc ggttacgttc 660
gaagcgccgt tcatcgctga agaattcctg cagggtgagt acggtgactg gtatcaaacc 720
gaaggttact ccgactacat ctctatcgaa ggcatcatgg ctgacggtga gtacttcccg 780
atcgcgattc acgataaaac cccgcaaatc ggtttcaccg aaacctccca cattactccg 840
tccattctgg atgaagaagc caaaaagaaa attgtggaag ctgcgaagaa ggcaaacgaa 900
ggtctgggcc tgcagaactg cgcaacccac accgaaatca aactgatgaa aaaccgtgaa 960
ccgggtctga tcgaatctgc agcgcgcttc gcgggctgga acatgatccc gaacattaag 1020
aaggttttcg gcctggatat ggcgcagctg ctgctggatg tactgtgttt cggcaaagac 1080
gcggatctgc cggacggcct gctggatcag gaaccgtact acgttgcgga ctgccacctg 1140
tacccgcagc acttcaaaca gaacggccag atcccggaaa ctgctgaaga cctggtaatc 1200
gaagcgatcg acatcccgga cggtctgctg aaaggtgaca ctgaaatcgt ttctttctcc 1260
gcggcagcac caggcactag cgttgacctg accctgttcg aagctttcaa ctccatcgct 1320
gcattcgaac tgaaatgctc taacagccag gacgtggctg aaagcatccg ccagatccag 1380
cagcacgcaa aactgactgc gaaatacgtg ctgccggtat aactcgag 1428
<210> 2
<211> 2067
<212> DNA
<213> 大肠杆菌K-12 (mg 1655E.coli K-12 MG 1655)
<400> 2
atgggtcagg aaaagctata catcgaaaaa gagctcagtt ggttatcgtt caatgaacgc 60
gtgcttcagg aagcggcgga caaatctaac ccgctgattg aaaggatgcg tttcctgggg 120
atctattcca ataaccttga tgagttctat aaagtccgct tcgctgaact gaagcgacgc 180
atcattatta gcgaagaaca aggctccaac tctcattccc gccatttact gggcaaaatt 240
cagtcccggg tgctgaaagc cgatcaggaa ttcgacggcc tctacaacga gctattgctg 300
gagatggcgc gcaaccagat cttcctgatt aatgaacgcc agctctccgt caatcaacaa 360
aactggctgc gtcattattt taagcagtat ctgcgtcagc acattacgcc gattttaatc 420
aatcctgaca ctgacttagt gcagttcctg aaagatgatt acacctatct ggcggtggaa 480
attatccgtg gcgataccat ccgttacgcg ctgctggaga tcccatcaga taaagtgccg 540
cgctttgtga atttaccgcc agaagcgccg cgtcgacgca agccgatgat tcttctggat 600
aacattctgc gttactgcct tgatgatatt ttcaaaggct tctttgatta tgacgcgctg 660
aatgcctatt caatgaagat gacccgcgat gccgaatacg atttagtgca tgagatggaa 720
gccagcctga tggagttgat gtcttccagt ctcaagcagc gtttaactgc tgagccggtg 780
cgttttgttt atcagcgcga tatgcccaat gcgctggttg aagtgttacg cgaaaaactg 840
actatttccc gctacgactc catcgtcccc ggcggtcgtt atcataattt taaagacttt 900
attaatttcc ccaatgtcgg caaagccaat ctggtgaaca aaccactgcc gcgtttacgc 960
catatttggt ttgataaagc ccagttccgc aatggttttg atgccattcg cgaacgcgat 1020
gtgttgctct attatcctta tcacaccttt gagcatgtgc tggaactgct gcgtcaggct 1080
tcgttcgacc cgagcgtact ggcgattaaa attaacattt accgcgtggc gaaagattca 1140
cgcatcatcg actcgatgat ccacgccgca cataacggta agaaagtcac cgtggtggtt 1200
gagttacagg cgcgtttcga cgaagaagcc aacattcact gggcgaagcg cctgaccgaa 1260
gcaggcgtgc acgttatctt ctctgcgccg gggctgaaaa ttcacgccaa actgttcctg 1320
atttcacgta aagaaaacgg tgaagtggtg cgttatgcac acatcgggac cgggaacttt 1380
aacgaaaaaa ccgcgcgtct ttatactgac tattcgttgc tgaccgccga tgcgcgcatc 1440
accaacgaag tacggcgggt atttaacttt attgaaaacc cataccgtcc ggtgacattt 1500
gattatttaa tggtatcgcc gcaaaactcc cgccgcctat tgtatgaaat ggtggaccgc 1560
gagatcgcca acgcgcagca agggctgccc agtggtatca ccctgaagct aaataacctt 1620
gtcgataaag gcctggttga tcgtctgtat gcggcctcca gctccggcgt accggttaat 1680
ctgctggttc gcggaatgtg ttcgctgatc cccaatctgg aaggcattag cgacaacatt 1740
cgtgccatca gtattgttga ccgttacctt gaacatgacc gggtttatat ttttgaaaat 1800
ggcggcgata aaaaggtcta cctttcttcc gccgactgga tgacgcgcaa tattgattat 1860
cgtattgaag tggcgacgcc gctgctcgat ccgcgcctga agcagcgggt actggacatc 1920
atcgacatat tgttcagcga tacggtcaaa gcacgttata tcgataaaga actcagtaat 1980
cgctacgttc cccgcggcaa tcgccgcaaa gtacgggcgc agttggcgat ttatgactac 2040
atcaaatcac tcgaacaacc tgaataa 2067

Claims (5)

1.一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：以β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl2为激活剂，加入L-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，在pH值为6.5-8.5,30-45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成L-肌肽。
2.根据权利要求1所述的一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)分别构建L-氨基酸连接酶的基因重组表达载体pET-ywfE和聚磷酸盐激酶的基因重组表达载体pET-PPK，其中，L-氨基酸连接酶编码基因来源于Bacillus subtilis BGSC3A2，GI：1094636766，该序列经密码子优化后如SEQ ID NO.1所示；聚磷酸盐激酶编码基因来源于E.coli K-12(MG1655)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
(2)分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程重组菌株E.coli pET-ywfE和E.coli pET-PPK；
(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达的L-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶的菌体；
(4)破碎步骤(3)中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；
(5)将步骤(4)中获得的混合酶液加入含有80-150mMβ-丙氨酸、80-150mM L-组氨酸、5mM MgCl2、3.0-6.0mM ATP和30-50mM六偏磷酸钠的催化液中，在pH值为6.5-8.5,温度为30-45℃条件下进行酶促反应合成肌肽。
3.根据权利要求2所述的一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)中重组菌株中的培养方法为:重组菌株按体积百分比的1-2％接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180-220rpm培养至OD600达到0.6-0.8时添加终浓度0.2-0.5mM IPTG，于25℃诱导培养8-10h，收集菌体。
4.根据权利要求2所述的一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述LB培养基每升包括10g氯化钠，5g酵母粉，10g蛋白胨，pH7.2-7.4。
5.根据权利要求2所述的一种利用L-氨基酸连接酶一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于所述催化液为50mM磷酸缓冲液中含有浓度为100mMβ-丙氨酸、100mM L-组氨酸、5mMMgCl2、5mM ATP和50mM六偏磷酸钠。
CN201910040733.0A 2019-01-16 2019-01-16 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法 Active CN109593805B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910040733.0A CN109593805B (zh) 2019-01-16 2019-01-16 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910040733.0A CN109593805B (zh) 2019-01-16 2019-01-16 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109593805A true CN109593805A (zh) 2019-04-09
CN109593805B CN109593805B (zh) 2021-02-09

Family

ID=65965304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910040733.0A Active CN109593805B (zh) 2019-01-16 2019-01-16 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109593805B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283859A (zh) * 2019-07-15 2019-09-27 苏州富士莱医药股份有限公司 微生物酶法合成l-肌肽的方法
CN111440777A (zh) * 2020-06-10 2020-07-24 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 L-氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用
CN116410938A (zh) * 2023-04-14 2023-07-11 深圳瑞德林生物技术有限公司 β-丙氨酸连接酶突变体及其应用
CN116622795A (zh) * 2023-07-20 2023-08-22 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用
CN117659116A (zh) * 2023-12-05 2024-03-08 珠海瑞德林生物有限公司 酪氨酸寡肽的制备方法
CN117721165A (zh) * 2024-02-08 2024-03-19 天津凯莱英生物科技有限公司 Atp再生体系和多肽的合成方法
CN117659116B (zh) * 2023-12-05 2024-05-10 珠海瑞德林生物有限公司 酪氨酸寡肽的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861598A (zh) * 2016-04-27 2016-08-17 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法再生atp的方法及其应用
CN107217048A (zh) * 2017-07-10 2017-09-29 江苏诚信药业有限公司 一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法和应用
CN109136309A (zh) * 2017-06-15 2019-01-04 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861598A (zh) * 2016-04-27 2016-08-17 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法再生atp的方法及其应用
CN109136309A (zh) * 2017-06-15 2019-01-04 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种利用腺苷代替atp进行酶促反应的生产方法
CN107217048A (zh) * 2017-07-10 2017-09-29 江苏诚信药业有限公司 一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法和应用

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283859A (zh) * 2019-07-15 2019-09-27 苏州富士莱医药股份有限公司 微生物酶法合成l-肌肽的方法
CN111440777A (zh) * 2020-06-10 2020-07-24 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 L-氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用
CN116410938A (zh) * 2023-04-14 2023-07-11 深圳瑞德林生物技术有限公司 β-丙氨酸连接酶突变体及其应用
CN116410938B (zh) * 2023-04-14 2024-03-12 深圳瑞德林生物技术有限公司 β-丙氨酸连接酶突变体及其应用
CN116622795A (zh) * 2023-07-20 2023-08-22 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用
CN116622795B (zh) * 2023-07-20 2023-10-13 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 L-氨基酸连接酶的制备方法及其在二肽合成上的应用
CN117659116A (zh) * 2023-12-05 2024-03-08 珠海瑞德林生物有限公司 酪氨酸寡肽的制备方法
CN117659116B (zh) * 2023-12-05 2024-05-10 珠海瑞德林生物有限公司 酪氨酸寡肽的制备方法
CN117721165A (zh) * 2024-02-08 2024-03-19 天津凯莱英生物科技有限公司 Atp再生体系和多肽的合成方法
CN117721165B (zh) * 2024-02-08 2024-05-03 天津凯莱英生物科技有限公司 Atp再生体系和多肽的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109593805B (zh) 2021-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593805A (zh) 一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法
CN109851658A (zh) 一种一步法合成l-肌肽的方法及截短的l-肌肽合成酶
Gut et al. Structural basis for Streptococcus pneumoniae NanA inhibition by influenza antivirals zanamivir and oseltamivir carboxylate
CN109652484B (zh) 一种全细胞高效催化合成l-肌肽的方法
CN108486088A (zh) 腈水解酶突变体及其应用
CN100424096C (zh) 含有hiv转导结构域的生存素突变体及制备方法和应用
Kebeish et al. Molecular cloning, biochemical characterization, and antitumor properties of a novel L-asparaginase from Synechococcus elongatus PCC6803
CN109251882A (zh) 一株异源表达耐热腈水合酶的大肠杆菌重组菌及其应用
CN106661601A (zh) 氧化型γ‑谷氨酰半胱氨酸及氧化型谷胱甘肽的制造方法
CN109652395A (zh) 一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其应用
KR20170074120A (ko) 과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법
CN111269870A (zh) 一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用
Fleminger et al. The moonlighting activities of dihydrolipoamide dehydrogenase: Biotechnological and biomedical applications
Malyan Noncatalytic nucleotide binding sites: properties and mechanism of involvement in ATP synthase activity regulation
CN107384990A (zh) 一种体外酶法催化肝素前体制备肝素的方法
CN107326034B (zh) 一种壳聚糖酶及其基因和应用
CN113046401A (zh) 生物酶催化制备氨基葡萄糖的方法
CN106222231A (zh) 一种快速生产高光学纯度d‑赖氨酸的方法
CN112795605A (zh) 一种酶催化制备氨基葡萄糖的方法
CN115896215A (zh) 阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物
CN109609536B (zh) 一种全细胞一步合成l-肌肽的方法
Nguyen et al. A dual-functional peptide, Kpt from Ruegeria pomeroyi DSS-3 for protein purification and silica precipitation
CN109971803A (zh) 一种l-赤藓酮糖和赤藓糖醇生产方法
CN111172213B (zh) 一种用双酶串联制备l-2-氨基丁酸的方法
CN1415015B (zh) L-六氢吡啶羧酸的生物学制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220125

Address after: 215400 Building 1 and 2, No. 98, Zhaoxi Road, Shaxi Town, Taicang City, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: Suzhou Bainuo Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 215500 Changshou City South Three Ring Road No. 99, Suzhou, Jiangsu

Patentee before: CHANGSHU INSTITUTE OF TECHNOLOGY