CN106661601A

CN106661601A - 氧化型γ‑谷氨酰半胱氨酸及氧化型谷胱甘肽的制造方法

Info

Publication number: CN106661601A
Application number: CN201580039563.4A
Authority: CN
Inventors: 野尻增俊; 八十原良彦
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2017-05-10
Also published as: WO2016002884A1; EP3165610A4; US20170145466A1; JPWO2016002884A1; EP3165610A1

Abstract

本发明所要解决的课题在于提供一种通过简便的工序来制造氧化型谷胱甘肽GSSG及其前体氧化型γ‑谷氨酰半胱氨酸的方法。作为解决上述课题的方法，本发明的GSSG的制造方法包括：使L‑胱氨酸与L‑谷氨酸发生反应而生成氧化型γ‑谷氨酰半胱氨酸的工序A’、以及使氧化型γ‑谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸发生反应而生成GSSG的工序B’。

Description

氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型谷胱甘肽的制造方法

技术领域

本发明涉及制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的方法。

本发明还涉及制造氧化型谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽是由L-半胱氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸这3个氨基酸构成的肽，不仅存在于人体，也存在于其它动物、植物、微生物等多种生物体内，参与活性氧的消除作用、解毒作用、氨基酸代谢等，对生物体是重要的化合物。

谷胱甘肽在生物体内以还原型谷胱甘肽(N-(N-γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸，以下有时称为“GSH”)和氧化型谷胱甘肽(以下有时称为“GSSG”)的任一种形态而存在，所述还原型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被还原的SH的形态，所述氧化型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被氧化而在谷胱甘肽的2个分子之间形成了二硫键的形态。

已知GSSG比GSH的保存稳定性更高(专利文献1等)。谷胱甘肽在生物体内通常多以还原型的GSH的形式存在，使用酵母等容易大量生产GSH，相比之下，一直难以高效地大量生产GSSG。以往通常首先制造GSH，然后用化学或生物的方法使其氧化，从而得到GSSG。例如，在专利文献1中公开了如下方法，首先制造含有GSH的酵母提取物，接着将酵母提取物的pH调整为6以上且小于11，在溶解氧的存在下将GSH转化为GSSG。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3160335号公报

专利文献2：日本特表2013-505712号公报

专利文献3：日本特开2013-188177号公报

发明内容

发明要解决的课题

本发明要解决的课题在于提供一种通过简便的工序来制造GSSG及其前体化合物的方法。

解决课题的方法

本发明人等发现，可以以较廉价的L-胱氨酸作为原料，通过简便的工序来制造GSSG及其前体氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸，从而完成了本发明。需要说明的是，L-胱氨酸是L-半胱氨酸的硫醇基被氧化，2分子的L-半胱氨酸经由二硫键键合而成的化合物。对于L-胱氨酸而言，虽然已知用作用于制造L-半胱氨酸的原料的例子(专利文献2)、用作用于利用乳酸发酵进行GSH生产的原料的例子(专利文献3)，但从L-胱氨酸直接制造GSSG的方法尚不存在。

本发明具体而言包含以下发明。

(1)一种氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法，该方法包括：

工序A，在选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及双功能谷胱甘肽合成酶中至少1种酶和三磷酸腺苷(ATP，也称为腺苷5’-三磷酸)的存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应，由此生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

根据本发明，可以从较廉价的L-胱氨酸直接制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

(2)根据(1)中记载的方法，其中，所述工序A与将二磷酸腺苷(ADP，也称为腺苷5’-二磷酸)再生为ATP的ATP再生反应配合而进行。

工序A消耗ATP而生成ADP，但根据本发明，能够一边再生ATP，一边持续地进行工序A。

(3)根据(1)或(2)中记载的方法，其中，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶源自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

这样的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的从L-胱氨酸和L-谷氨酸生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性特别高，因此优选。

(4)根据(1)或(2)中记载的方法，其中，所述双功能谷胱甘肽合成酶源自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。

这样的双功能谷胱甘肽合成酶的从L-胱氨酸和L-谷氨酸生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性特别高，因此优选。

(5)一种氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：

工序B，在谷胱甘肽合成酶和三磷酸腺苷(ATP)的存在下使氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸发生反应，由此生成氧化型谷胱甘肽。

根据本发明，能够通过简便的工序来制造氧化型谷胱甘肽。

(6)根据(5)中记载的方法，其中，所述工序B与将二磷酸腺苷(ADP)再生为ATP的ATP再生反应配合而进行。

工序B消耗ATP而生成ADP，但根据本发明，能够一边再生ATP，一边持续地进行工序B。

(7)根据(5)或(6)中记载的方法，其中，所述谷胱甘肽合成酶源自大肠埃希氏菌。

这样的谷胱甘肽合成酶的从氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸生成氧化型谷胱甘肽的活性特别高，因此优选。

(8)根据(5)～(7)中任一项记载的方法，该方法还包括：

工序A，在选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和双功能谷胱甘肽合成酶中至少1种酶及三磷酸腺苷(ATP)的存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应，由此生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸，

所述工序B中使用的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸是通过所述工序A生成的。

根据本发明，能够通过简便的工序从较廉价的L-胱氨酸制造氧化型谷胱甘肽。

(9)根据(8)中记载的方法，其中，所述工序A与将二磷酸腺苷(ADP)再生为ATP的ATP再生反应配合而进行。

(10)根据(8)或(9)中记载的方法，其中，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶源自大肠埃希氏菌。

(11)根据(8)或(9)中记载的方法，其中，所述双功能谷胱甘肽合成酶源自无乳链球菌。

(12)一种氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法，该方法包括：

工序A’，通过使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

根据本发明，能够从较廉价的L-胱氨酸直接制造氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。在本发明中，更优选所述工序A’为(1)中记载的所述工序A。

(13)一种氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：

工序B’，通过使氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸发生反应而生成氧化型谷胱甘肽。

根据本发明，能够通过简便的工序制造氧化型谷胱甘肽。在本发明中，更优选所述工序B’为(5)中记载的所述工序B。

(14)根据(13)中记载的方法，该方法还包括：

工序A’，通过使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的工序A’，

所述工序B’中使用的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸是通过所述工序A’生成的。

根据本发明，能够通过简便的工序从较廉价的L-胱氨酸制造氧化型谷胱甘肽。在本发明中，更优选所述工序A’为(1)中记载的所述工序A。

需要说明的是，在本说明书中，“L-胱氨酸”、“L-谷氨酸”、“甘氨酸”“氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸”、“氧化型谷胱甘肽”、“L-半胱氨酸”、“γ-谷氨酰半胱氨酸”、“谷胱甘肽”、“三磷酸腺苷”、“二磷酸腺苷”、“一磷酸腺苷”、“聚磷酸”、“缩合磷酸”等各个用语分别并不限定于各种化合物的形态，也可以是游离的形态，包括钠盐、钾盐等盐的形态、水合物等溶剂合物的形态、电离后的离子的形态的情况。

氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的游离形态是下式所示的化合物：

化学式1

氧化型谷胱甘肽的游离形态是下式所示的化合物：

化学式2

本说明书包括作为本申请优先权的基础的日本专利申请番号2014-137202号所公开的内容。

发明的效果

根据本发明，可以通过简便的工序使用廉价的原料生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

具体实施方式

＜本发明中使用的酶＞

在本说明书中，有时分别将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶简称为“GSH I”，将谷胱甘肽合成酶简称为“GSH II”，将双功能谷胱甘肽合成酶简称为“GSH F”、将腺苷酸激酶简称为“ADK”，将聚磷酸依赖性AMP转移酶简称为“PAP”。

＜GSH I＞

本发明所使用的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)是具有将L-Cys识别为底物并催化下述反应的活性的酶，所述反应是通过在ATP的存在下使L-Cys与L-Glu键合而生成γ-Glu-Cys的反应，只要具有该活性即可，对其来源、结构等没有特别限定。在本发明中，将该活性称为γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性。该活性的1U是指在30℃下1分钟生成1μmol的γ-谷氨酰半胱氨酸的活性，是在以下测定条件下测定的。在本发明中利用了如下新见解，即，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶也具有通过在ATP的存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性。

(测定条件)

向含有10mM ATP、15mM L-谷氨酸、15mM L-半胱氨酸、10mM硫酸镁的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液(pH8.0)中添加酶液，并在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸而使反应终止。使用高效液相色谱对反应液中的γ-谷氨酰半胱氨酸进行定量。

上述高效液相色谱的条件如下所述。在该条件下，按照还原型谷胱甘肽(GSH)、还原型γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)、氧化型γ-GC、氧化型谷胱甘肽(GSSG)的顺序洗脱。

[HPLC条件]

柱：ODS-HG-3(4.6mmφ×150mm、野村化学株式会社制造)；

洗脱液：将磷酸二氢钾12.2g和庚烷磺酸钠3.6g用蒸馏水1.8L溶解后，用磷酸将该溶液调节至pH2.8，再追加甲醇186ml进行溶解而得到的液体；

流速：1.0ml/分；

柱温：40℃；

测定波长：210nm

作为GSH I，优选使用每1mg蛋白质的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性(比活性)为0.5U以上的GSH I。

GSH I的来源没有特别限定，可以使用源自微生物、动物、植物等的GSH I。优选源自微生物的GSH I，特别优选源自大肠埃希氏菌等肠内细菌、棒状杆菌等细菌、酵母等真核微生物等的GSH I。

将源自大肠埃希氏菌的GSH I的碱基序列、以及由该碱基序列所编码的氨基酸序列的具体例子分别示于序列号1和序列号9。

另外，作为GSH I，并不限定于由序列号9所示的氨基酸序列构成的GSH I，也可以使用其活性变异体、其它种直系同源物等具有GSH I活性的其它多肽。具有GSH I活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下，显示出使用了由序列号9所示的氨基酸序列构成的GSH I的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽，优选为与在ATP存在下从L-胱氨酸和L-谷氨酸生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性相关、且显示出使用了由序列号9所示的氨基酸序列构成的GSH I的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。上述活性变异体、其它种直系同源物等具有GSH I活性的其它多肽包括：例如，由序列号9所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的多肽(特别优选为由序列号9所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者中总计1～多个氨基酸被取代、缺失和/或添加、优选为缺失和/或添加而得到的氨基酸序列所构成的多肽)、由相对于序列号9所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸同源性(同源性)的氨基酸序列所构成的多肽。另外，也可以使用选自下述至少一种多肽的具有GSH I活性的片段作为上述其它多肽：由序列号9所示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号9所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的上述多肽、以及由相对于序列号9所示的氨基酸序列具有上述氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的上述多肽，作为该片段，可以使用氨基酸数量优选为250以上、更优选为300以上、更优选为400以上、更优选为500以上的多肽。另外，该片段也具有在ATP的存在下从L-胱氨酸和L-谷氨酸生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性。在本说明书中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。“氨基酸同源性”是指，对两个氨基酸序列进行排列(对齐)，根据需要导入间隙，使得两者的氨基酸一致程度达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号9所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。氨基酸同源性可以使用利用BLAST、FASTA进行的蛋白质的检索系统而算出(Karlin,S.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877；Altschul,S.F.et al.,1990,J.Mol.Biol.,215:403-410；Pearson,W.R.et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448)。另外，氨基酸的取代优选为保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指电荷、侧链、极性、芳香性等性质相似的氨基酸之间的取代。性质相似的氨基酸例如可以分类为：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、非极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。上述各多肽可以进行适当化学修饰。

可以用于GSH I的制备的、编码GSH I的基因(DNA或RNA)的碱基序列并不限定于序列号1所示的碱基序列，可以是编码作为目标的GSH I的氨基酸序列的、与宿主生物的种类相对应的适当的碱基序列。

＜GSH II＞

可以用于本发明的谷胱甘肽合成酶(GSH II)是具有识别γ-Glu-Cys作为底物并且催化通过在ATP存在下使其与Gly键合而生成γ-Glu-Cys-Gly的反应的活性的酶，只要具有该活性即可，对其来源、结构等没有特别限定。在本发明中，将该活性称为谷胱甘肽合成酶活性。该活性的1U是指在30℃下1分钟生成1μmol谷胱甘肽的活性，是在以下测定条件下测定的。在本发明中利用了如下新见解，即，谷胱甘肽合成酶也具有通过在ATP的存在下使氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸发生反应而生成氧化型谷胱甘肽的活性。

(测定条件)

向含有10mM ATP、15mMγ-谷氨酰半胱氨酸、15mM甘氨酸、10mM硫酸镁的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(pH8.0)中添加酶液，并在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸而使反应终止。使用高效液相色谱对反应液中的谷胱甘肽进行定量。

高效液相色谱的条件使用与GSH I的活性测定法相关的上述条件相同的条件。

作为GSH II，优选使用每1mg蛋白质的谷胱甘肽合成酶活性(比活性)为0.5U以上的GSH II。

GSH II的来源没有特别限定，可以使用源自微生物、动物、植物等的GSH II。优选源自微生物的GSH II，特别优选源自大肠埃希氏菌等肠内细菌、棒状杆菌等细菌、酵母等真核微生物等的GSH II。

将源自大肠埃希氏菌的GSH II的碱基序列、以及由该碱基序列所编码的氨基酸序列的具体例子分贝示于序列号4和序列号10。

另外，作为GSH II，并不限定于由序列号10所示的氨基酸序列构成的GSH II，也可以使用其活性变异体、其它种直系同源物等具有GSH II活性的其它多肽。具有GSH II活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下，显示出使用了由序列号10所示的氨基酸序列构成的GSH II的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽，优选为与在ATP存在下从氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸生成氧化型谷胱甘肽的活性相关、且显示出使用了由序列号10所示的氨基酸序列构成的GSH II的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。上述活性变异体、其它种直系同源物等具有GSH II活性的其它多肽包括：例如，由序列号10所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的多肽(特别优选为由序列号10所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两方中总计1～多个氨基酸被取代、缺失和/或添加、优选为缺失和/或添加而得到的氨基酸序列所构成的多肽)、由相对于序列号10所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的多肽。另外，也可以使用选自下述至少一种多肽的具有GSH II活性的片段作为上述其它多肽：由序列号10所示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号10所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的上述多肽、以及由相对于序列号10所示的氨基酸序列具有上述氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的上述多肽，作为该片段，可以使用氨基酸数量优选为150以上、更优选为200以上、更优选为300以上的多肽。另外，该片段具有在ATP的存在下从氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸生成氧化型谷胱甘肽的活性。“氨基酸同源性”是指，对两个氨基酸序列进行排列(对齐)，根据需要导入间隙，使得两者的氨基酸一致程度达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号10所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。另外，氨基酸的取代优选为保守氨基酸取代。这里，关于“多个”的优选范围、氨基酸同源性的计算方法、保守氨基酸取代，如与GSH I相关说明所述。上述各多肽可以进行适当化学修饰。

可以用于GSH II的制备的、编码GSH II的基因(DNA或RNA)的碱基序列并不限定于序列号4所示的碱基序列，可以是编码作为目标的GSH II的氨基酸序列的、与宿主生物的种类相对应的适当的碱基序列。

＜GSH F＞

可以用于本发明的双功能谷胱甘肽合成酶(GSH F)是同时具有如下两种活性的酶，即，识别L-Cys作为底物且催化通过在ATP存在下使其与L-Glu键合而生成γ-Glu-Cys的反应的活性、以及识别γ-Glu-Cys作为底物且催化通过在ATP存在下使其与Gly键合而生成γ-Glu-Cys-Gly的反应的活性，只要具有该活性即可，对其起源、结构等没有特别限定。在本发明中，将该活性称为双功能谷胱甘肽合成酶活性。该活性的1U是指在30℃下1分钟生成1μmol的γ-Glu-Cys-Gly(谷胱甘肽)的活性，是在以下测定条件下测定的。在本发明中利用了如下新见解，即，双功能谷胱甘肽合成酶也具有通过在ATP存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性。

(测定条件)

向含有10mM ATP、15mM L-谷氨酸、15mM L-半胱氨酸、15mM甘氨酸、10mM硫酸镁的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(pH8.0)中添加酶液，并在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸而使反应终止。使用高效液相色谱对反应液中的谷胱甘肽进行定量。

作为GSH F，优选使用每1mg蛋白质的双功能谷胱甘肽合成酶活性(比活性)为0.5U以上的GSH F。

GSH F的来源没有特别限定，可以使用源自微生物、动物、植物等的GSH F。优选源自微生物的GSH F。特别优选源自细菌的GSH F，具体而言，优选源自下述细菌中至少1种的GSH F：无乳链球菌、变异链球菌(Streptococcus mutans)、猪链球菌(Streptococcussuis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等链球菌(Streptococcus)属细菌；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等乳杆菌(Lactobacillus)属细菌；嗜冷脱硫枝条菌(Desulfotalea psychrophila)等脱硫枝条菌(Desulfotalea)属细菌；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等梭菌(Clostridium)属细菌；无害李斯特氏菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)等李斯特氏菌(Listeria)属细菌；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)等肠球菌(Enterococcus)属细菌；麦氏巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)等巴斯德氏菌(Pasteurella)属细菌；产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimiasucciniciprodecens)等海姆氏菌(Mannheimia)属细菌；以及睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus)等嗜血杆菌(Haemophilus)属细菌。

源自无乳链球菌的GSH F的碱基序列、及由该碱基序列编码的氨基酸序列的具体例子分别示于序列号11和序列号12。另外，由序列号7的第4碱基～第2253碱基构成的碱基序列是编码由序列号12所示的氨基酸序列构成的、源自无乳链球菌的GSH F的碱基序列，是使其符合了大肠埃希氏菌中密码子使用频率的碱基序列的例子。

另外，作为GSH F，并不限定于由序列号12所示的氨基酸序列构成的GSH F，也可以使用其活性变异体、其它种直系同源物等具有GSH F活性的其它多肽。具有GSH F活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下，显示出使用了由序列号12所示的氨基酸序列构成的GSH F的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽，优选为与在ATP存在下从L-胱氨酸和L-谷氨酸生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性相关、且显示出使用了由序列号12所示的氨基酸序列构成的GSH F的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。上述活性变异体、其它种直系同源物等具有GSH F活性的其它多肽包括：例如，由序列号12所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的多肽(特别优选为由序列号12所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两方中总计1～多个氨基酸被取代、缺失和/或添加、优选为缺失和/或添加而得到的氨基酸序列所构成的多肽)、由相对于序列号12所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的多肽。另外，也可以使用选自下述至少一种多肽的具有GSHF活性的片段作为上述其它多肽：由序列号12所示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号12所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的上述多肽、以及由相对于序列号12所示的氨基酸序列具有上述氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的上述多肽，作为该片段，可以使用氨基酸数量优选为400以上、更优选为500以上、更优选为600以上、更优选为700以上、更优选为730以上的多肽。另外，该片段具有在ATP的存在下从L-胱氨酸和L-谷氨酸生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的活性。“氨基酸同源性”是指，对两个氨基酸序列进行排列(对齐)，根据需要导入间隙，使得两者的氨基酸一致程度达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号12所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。另外，氨基酸的取代优选为保守氨基酸取代。这里，关于“多个”的优选范围、氨基酸同源性的计算方法、保守氨基酸取代，如与GSH I相关说明所述。上述各多肽可以进行适当化学修饰。

可以用于GSH F的制备的、编码GSH F的基因(DNA或RNA)的碱基序列并不限定于序列号11所示的碱基序列，可以是编码作为目标的GSH II的氨基酸序列的、与宿主生物的种类相对应的适当的碱基序列。

＜ADK＞

可以用于本发明的腺苷酸激酶(ADK)是具有催化从2分子ADP分别生成ATP、AMP各1分子的反应的活性的酶，只要具有该活性即可，对其来源、结构等没有特别限定。在本发明中，将该活性称为ADK活性。该活性的1U是指在30℃下1分钟生成1μmol的AMP的活性，是在以下测定条件下测定的。

(测定条件)

向含有10mM ADP、70mM硫酸镁的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(pH8.0)中添加酶液，并在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸而使反应终止。使用高效液相色谱对反应液中的AMP进行定量。

上述高效液相色谱的条件如下所述。在该条件下按照三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(5’-腺苷酸)(AMP)的顺序洗脱。

[HPLC条件]

柱：ODS-HG-3(4.6mmφ×150mm、野村化学株式会社制造)；

流速：1.0ml/分；

柱温：40℃；

测定波长：210nm

作为ADK，优选使用每1mg蛋白质的ADK活性(比活性)为20U以上的ADK。

ADK的来源没有特别限定，可以使用源自微生物、动物、植物等的ADK。优选源自微生物的ADK。特别优选源自细菌的ADK，具体而言，优选源自大肠埃希氏菌的ADK。

将源自大肠埃希氏菌的ADK的碱基序列、以及由该碱基序列所编码的氨基酸序列的具体例子分别示于序列号13和序列号14。

另外，作为ADK，并不限定于由序列号14所示的氨基酸序列所构成的ADK，也可以使用其活性变异体、其它种直系同源物等具有ADK活性的其它多肽。具有ADK活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下，显示出使用了由序列号14所示的氨基酸序列构成的ADK的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。上述活性变异体、其它种直系同源物等具有ADK活性的其它多肽包括：例如，由序列号14所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的多肽(特别优选为由序列号14所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者中总计1～多个氨基酸被取代、缺失和/或添加、优选为缺失和/或添加而得到的氨基酸序列所构成的多肽)、由相对于序列号14所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的多肽。另外，也可以使用选自下述至少一种多肽的具有ADK活性的片段作为上述其它多肽：由序列号14所示的氨基酸序列所构成的多肽、由序列号14所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的上述多肽、以及由相对于序列号14所示的氨基酸序列具有上述氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的上述多肽，作为该片段，可以使用氨基酸数量优选为100以上、更优选为150以上、更优选为200以上的多肽。“氨基酸同源性”是指，对两个氨基酸序列进行排列(对齐)，根据需要导入间隙，使得两者的氨基酸一致程度达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号14所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。另外，氨基酸的取代优选为保守氨基酸取代。这里，关于“多个”的优选范围、氨基酸同源性的计算方法、保守氨基酸取代，如与GSH I相关说明所述。上述各多肽可以进行适当化学修饰。

可以用于ADK的制备的、编码ADK的基因(DNA或RNA)的碱基序列并不限定于序列号13所示的碱基序列，可以是编码作为目标的ADK的氨基酸序列的、与宿主生物的种类相对应的适当的碱基序列。

＜PAP＞

可以用于本发明的聚磷酸依赖性AMP转移酶(PAP)是具有催化将聚磷酸作为磷酸供体对AMP进行磷酸化而生成ADP的反应的活性的酶，只要具有该活性即可，对其来源、结构等没有特别限定。在本发明中，将该活性称为PAP活性。该活性的1U是指在30℃下1分钟生成1μmol的ADP的活性，是在以下测定条件下测定的。

(测定条件)

向含有5mM偏磷酸钠、10mM AMP、70mM硫酸镁的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(pH8.0)中添加酶液，并在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸而使反应终止。使用高效液相色谱对反应液中的ADP进行定量。

高效液相色谱的条件使用与ADK的活性测定法相关的上述条件相同的条件。

作为PAP，优选使用每1mg蛋白质的PAP活性(比活性)为20U以上的PAP。

PAP的来源没有特别限定，可以使用源自微生物、动物、植物等的PAP。优选源自微生物的PAP。特别优选源自细菌的PAP，具体而言，优选源自约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)的PAP。

将源自约氏不动杆菌的PAP的碱基序列、以及由该碱基序列所编码的氨基酸序列的具体例子分别示于序列号15和序列号16。另外，由序列号8的第4碱基～第1428碱基所构成的碱基序列是编码由序列号16所示的氨基酸序列构成的、源自约氏不动杆菌的PAP的碱基序列，是符合了大肠埃希氏菌中的密码子使用频率的的碱基序列的例子。

另外，作为PAP，并不限定于由序列号16所示的氨基酸序列所构成的PAP，也可以使用其活性变异体、其它种直系同源物等具有PAP活性的其它多肽。具有PAP活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下，显示出使用了由序列号16所示的氨基酸序列构成的PAP的情况下的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。上述活性变异体、其它种直系同源物等具有PAP活性的其它多肽包括：例如，由序列号16所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的多肽(特别优选为由序列号16所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者中总计1～多个氨基酸被取代、缺失和/或添加、优选为缺失和/或添加而得到的氨基酸序列所构成的多肽)、由相对于序列号16所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的多肽。另外，也可以使用选自下述至少一种多肽的具有PAP活性的片段作为上述其它多肽：由序列号16所示的氨基酸序列所构成的多肽、由序列号16所示的氨基酸序列中1～多个氨基酸被添加、缺失或取代而得到的氨基酸序列所构成的上述多肽、以及由相对于序列号16所示的氨基酸序列具有上述氨基酸同源性的氨基酸序列所构成的上述多肽，作为该片段，可以使用氨基酸数量优选为250以上、更优选为300以上、更优选为400以上、更优选为450以上的多肽。“氨基酸同源性”是指，对两个氨基酸序列进行排列(对齐)，根据需要导入间隙，使得两者的氨基酸一致程度达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号16所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。另外，氨基酸的取代优选为保守氨基酸取代。这里，关于“多个”的优选范围、氨基酸同源性的计算方法、保守氨基酸取代，如与GSH I相关说明所述。上述各多肽可以进行适当化学修饰。

可以用于PAP的制备的、编码PAP的基因(DNA或RNA)的碱基序列并不限定于序列号15所示的碱基序列，可以是编码作为目标的PAP的氨基酸序列的、与宿主生物的种类相对应的适当的碱基序列。

＜酶的制备＞

获得本发明中使用的上述各种酶的方法没有特别限定。上述各种酶可以由具有该酶的活性的生物、例如微生物的野生株或变异株来制备。作为具有目标的酶的活性的生物，可以是原本具有该酶的活性的生物和该酶的活性得到了增强的生物中的任一种。作为酶的活性得到了增强的生物，可以列举通过基因工程的方法对编码上述各种酶的基因表达进行了增强的重组生物细胞。需要说明的是，“酶的活性得到了增强的生物”包括以下两者：对于原本具有该酶的活性的生物而言该酶的活性增加了的生物、以及对于原本不具有该酶的活性的生物而言赋予了该酶的活性的生物。

使用基因工程的方法得到的重组生物细胞是指，代表性的而言，将编码目标酶的基因(DNA或RNA)插入适当的载体制成重组载体，通过该重组载体对适当的宿主生物细胞进行转化而得到的、具有生产该酶的能力的重组生物细胞。通过培养该重组生物细胞，能够制造作为目标的上述各种酶。作为宿主生物细胞，可以列举：细菌、酵母、丝状真菌、植物细胞、动物细胞等，从导入及表达效率的观点考虑，优选细菌，特别优选大肠埃希氏菌。

＜工序A及工序A’＞

利用本发明的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法包括：工序A，在选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及双功能谷胱甘肽合成酶中至少1种酶和ATP的存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。

另外，利用本发明的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法包括：工序A’，通过使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸。工序A’可以通过酶反应来进行，也可以不使用酶而通过化学反应来进行，优选为通过酶反应进行的工序，特别优选为上述工序A。由于底物化合物不需要利用官能团进行保护等、反应特异性高等原因，酶反应比化学合成反应更有利。

作为利用不使用酶的化学反应进行的工序A’，没有特别限定，可以列举例如如下工序：使将2个羧基用适当的保护基团进行了保护的L-胱氨酸与将α-羧基和氨基用适当的保护基团进行了保护的L-谷氨酸进行反应，使1分子L-谷氨酸的γ-羧基分别对1分子L-胱氨酸中的2个氨基进行脱水缩合而形成肽键。在该工序中，脱水缩合反应后根据需要对1个以上的保护基团进行脱保护。作为对羧基的保护基团，可以使用苄基等公知的羧基用保护基团，作为对氨基的保护基，可以使用叔丁氧羰(Boc)基、9-芴甲氧羰(Fmoc)基等公知的氨基用保护基团。

在工序A中，GSH I和/或GSH F可以以活细胞的形式直接使用具有GSH I和/或GSHF活性的生物细胞，也可以以虽然死亡但未受损的上述细胞的形态来使用，还可以使用GSHI和/或GSH F存在于细胞外的形态，具体而言，可以以上述生物细胞的粉碎物(与破碎物含义相同)的形态使用，也可以以由上述细胞分离纯化而得到的蛋白质的形态来使用。这里，具有GSH I和/或GSH F活性的蛋白质的纯化程度没有特别限定，可以是粗纯化。优选在工序A中不使用具有GSH I和/或GSH F活性的活细胞，更优选为在工序A中不使用具有GSH I和/或GSH F活性的活细胞及未受损的死细胞。特别是在使用存在于细胞外的GSH I和/或GSH F的情况下，具体而言，在使用上述细胞的粉碎物的形态的GSH I和/或GSH F、或者在使用由上述细胞分离纯化而得到的蛋白质的形态的GSH I和/或GSH F的情况下，可以认为，与使用活细胞的情况相比，反应混合液中作为原料的L-胱氨酸及作为产物的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸容易保持氧化型的状态，能够高效地得到氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸，因此优选。在将存在于细胞外的GSH I和/或GSH F用于工序A的情况下，反应体系内不存在活细胞引起的还原作用，因此可以推测发生上述作用。该倾向在反应混合液与空气接触的条件时特别明显。另外，在将GSH I和/或GSH F以具有该活性的活细胞的形态用于工序A的情况下，反应体系中存在一磷酸腺苷(AMP)容易分解的倾向。AMP是下面叙述的ATP再生反应的中间体之一，因此，如果AMP分解，则ATP再生反应的效率降低。另一方面，在将存在于细胞外的GSH I和/或GSH F用于工序A的情况下，AMP不容易发生分解，能够高效地促进ATP再生反应，因此优选。即，通过使用存在于细胞外的GSH I和/或GSH F进行本发明的工序A，能够兼顾抑制AMP的分解和抑制氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的还原。

在本说明书中，细胞的“粉碎”(与“破碎”含义相同)是指对细胞的表面结构造成损伤的处理，且使其达到细胞内形成的酶能够进出细胞外的程度，不需要使细胞碎片化。在本说明书中，细胞的“粉碎物”(“破碎物”)是指经过粉碎处理的细胞的处理物。细胞的粉碎处理(破碎处理)可以通过以适当的顺序进行1个或多个粉碎处理来实施。作为细胞的粉碎处理，可以列举：物理处理、化学处理、酶处理等。作为物理处理，可以列举例如：使用高压匀浆器、超声匀浆器、弗氏细胞压碎器、球磨机等，或者上述处理的组合。作为上述化学处理，可以列举例如：使用盐酸、硫酸等酸(优选为强酸)的处理、使用氢氧化钠、氢氧化钾等碱(优选为强碱)的处理等、上述处理的组合。作为上述酶处理，可以列举例如：使用溶菌酶、藤黄节杆菌酶(zymolyase)、葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶等的方法、上述方法的组合。

在工序A和/或工序A’中用作底物的L-胱氨酸和L-谷氨酸、以及在工序A中使用的ATP可以各自以盐的形态、游离的形态、水合物等溶剂合物的形态等各种形态添加于反应体系中。

在工序A和/或工序A’的反应体系(例如，反应混合液)中实质上不含有L-半胱氨酸，具体而言，在工序A和/或工序A’的反应体系中，相对于L-胱氨酸和L-半胱氨酸的总摩尔量，L-胱氨酸含有70摩尔％以上，更优选含有80摩尔％以上，更优选含有90摩尔％以上，进一步优选含有95摩尔％以上，进一步优选含有98摩尔％以上，最优选含有100摩尔％。相对于L-胱氨酸和L-半胱氨酸的总摩尔量，L-胱氨酸的比例在上述范围内这样的必要条件优选至少在工序A和/或工序A’的反应开始时得到满足，更优选在从工序A和/或工序A’的开始时至反应后的期间内得到满足。

在工序A中，在ATP的存在下使GSH I和/或GSH F与含有L-胱氨酸和L-谷氨酸的反应体系发生反应。反应可以在含有调节至适当pH的水等溶剂的反应混合液中进行。作为这时的条件，没有特别限定，底物浓度(L-胱氨酸和L-谷氨酸的总浓度)优选为约0.1～99重量％，更优选为1～20重量％。对于反应开始时的底物中L-胱氨酸与L-谷氨酸的量之比而言，相对于L-胱氨酸1摩尔，可以将L-谷氨酸设为2摩尔左右，例如，相对于L-胱氨酸1摩尔，可以将L-谷氨酸设为1～4摩尔，优选设为1.5～3摩尔。反应温度可以优选设为10～60℃，更优选设为20～50℃。反应的pH可以优选设为4～11，更优选设为6～9。反应时间可以优选设为1～120小时，更优选设为1～72小时。在反应混合液与空气接触的状态下进行工序A和/或工序A’的反应时，作为原料的L-胱氨酸及作为产物的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸容易保持氧化型的状态，因此优选。在工序A和/或工序A’的反应后的反应体系(例如，反应混合液)中实质上不含有还原型γ-谷氨酰半胱氨酸，具体而言，在工序A和/或工序A’的反应后的反应体系中，相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的总摩尔量，氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸含有70摩尔％以上，更优选含有80摩尔％以上，更优选含有90摩尔％以上，进一步优选含有95摩尔％以上，进一步优选含有98摩尔％以上，最优选含有100摩尔％。

反应混合液中的各种酶的浓度可以适当调整，例如，作为各种酶的蛋白质浓度，下限为1μg/ml以上，上限没有特别设定，但优选在100mg/ml以下的范围内适当调整。在工序A中使用GSH I的情况下，工序A的反应混合液中的GSH I活性没有特别限定，下限优选为0.1U/ml以上，上限没有特别设定，但通常可以设为10000U/ml以下。在工序A中使用GSH F的情况下，工序A反应混合液中的GSH F活性没有特别限定，下限优选为0.1U/ml以上，上限没有特别设定，但通常可以设为10000U/ml以下。

反应混合液中的ATP浓度可以根据作为底物的胱氨酸的浓度、有无ATP再生体系而适当调整。在工序A中，相对于胱氨酸，以摩尔比计消耗2倍的ATP。在将工序A与ATP再生反应配合而实施的情况下，可以大幅降低ATP相对于胱氨酸的添加量。因此，工序A中的反应混合液中的ATP浓度的上限没有特别限定，但优选相对于胱氨酸浓度以摩尔浓度比计为4倍以下，更优选为2.2倍以下。另外，工序A中的反应混合液中的ATP浓度的下限没有特别限定，但优选相对于胱氨酸浓度以摩尔浓度比计为0.0001倍以上，更优选为0.001倍以上，进一步优选为0.01倍以上。

＜工序B及工序B’＞

利用本发明的氧化型谷胱甘肽(GSSG)的制造方法包括：工序B，在谷胱甘肽合成酶(GSH II)和ATP的存在下使氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸发生反应而生成氧化型谷胱甘肽。

另外，利用本发明的GSSG的制造方法包括：工序B’，通过在GSH II和ATP的存在下使氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸发生反应而生成氧化型谷胱甘肽的工序B’。工序B’可以通过酶反应来进行，也可以不使用酶而通过化学反应来进行，优选为通过酶反应进行的工序，特别优选为上述工序B。由于底物化合物不需要利用官能团进行保护等、反应特异性高等原因，酶反应比化学合成反应更有利。

作为利用不使用酶的化学反应进行的工序B’，没有特别限定，可以列举例如如下工序：使将L-谷氨酸残基中的α-羧基和氨基用适当的保护基团进行了保护的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与将羧基用适当的保护基团进行了保护的甘氨酸进行反应，使1分子甘氨酸的氨基分别对1分子氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸中的2个羧基进行脱水缩合而形成肽键。在该工序中，脱水缩合反应后根据需要对1个以上的保护基团进行脱保护。作为对羧基的保护基团，可以使用苄基等公知的羧基用保护基团，作为对氨基的保护基，可以使用叔丁氧羰(Boc)基、9-芴甲氧羰(Fmoc)基等公知的氨基用保护基团。

在工序B中，GSH II可以以活细胞的形式直接使用具有GSH II活性的生物细胞，也可以以虽然死亡但未受损的上述细胞的形态来使用，还可以使用GSH II存在于细胞外的形态，具体而言，可以以上述生物细胞的粉碎物(与破碎物含义相同)的形态使用，也可以以由上述细胞分离纯化而得到的蛋白质的形态来使用。这里，具有GSH II活性的蛋白质的纯化程度没有特别限定，可以是粗纯化。关于细胞的“粉碎物”，如前文所述。优选在工序B中不使用具有GSH II活性的活细胞。优选在工序B中不使用具有GSH II活性的活细胞，更优选在工序B中不使用具有GSH II活性的活细胞及未受损的死细胞。特别是在使用存在于细胞外的GSH II的情况下，具体而言，在使用上述细胞的粉碎物的形态的GSH II、或者在使用由上述细胞分离纯化而得到的蛋白质的形态的GSH II的情况下，可以认为，与使用活细胞的情况相比，反应混合液中作为原料的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸及作为产物的氧化型谷胱甘肽容易保持氧化型的状态，能够高效地得到氧化型谷胱甘肽，因此优选。在将存在于细胞外的GSH II用于工序B的情况下，反应体系内不存在活细胞引起的还原作用，因此可以推测发生上述作用。该倾向在反应混合液与空气接触的条件时特别明显。另外，在将GSH II以具有该活性的活细胞的形态用于工序B的情况下，反应体系中存在一磷酸腺苷(AMP)容易分解的倾向。如果AMP分解，则ATP再生反应的效率降低。另一方面，在将存在于细胞外的GSH II用于工序B的情况下，AMP不容易发生分解，能够高效地促进ATP再生反应，因此优选。即，通过使用存在于细胞外的GSH II进行本发明的工序B，能够兼顾抑制AMP的分解和抑制氧化型谷胱甘肽及氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的还原。

在工序B和/或工序B’中用作底物的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸、以及在工序B中使用的ATP可以各自以盐的形态、游离的形态、水合物等溶剂合物的形态等各种形态添加于反应体系中。

在工序B和/或工序B’的反应体系(例如，反应混合液)中实质上不含有还原型γ-谷氨酰半胱氨酸，具体而言，在工序B和/或工序B’的反应体系中，相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的总摩尔量，氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸含有70摩尔％以上，更优选含有80摩尔％以上，更优选含有90摩尔％以上，进一步优选含有95摩尔％以上，进一步优选含有98摩尔％以上，最优选含有100摩尔％。相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的总摩尔量，氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的比例在上述范围内这样的必要条件优选至少在工序B和/或工序B’的反应开始时得到满足，更优选在从工序B和/或工序B’的开始时至反应后的期间内得到满足。

在工序B中，在ATP的存在下使GSH II与含有氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸的反应体系发生反应。反应可以在含有调节至适当pH的水等溶剂的反应混合液中进行。作为这时的条件，没有特别限定，底物浓度(氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸的总浓度)优选为约0.1～99重量％，更优选为1～20重量％。对于反应开始时的底物中氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸的量之比而言，相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸1摩尔，可以将甘氨酸设为2摩尔左右，例如，相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸1摩尔，可以将甘氨酸设为1～4摩尔，优选设为1.5～3摩尔。反应温度可以优选设为10～60℃，更优选设为20～50℃。反应的pH可以优选设为4～11，更优选设为6～9。反应时间可以优选设为1～120小时，更优选设为1～72小时。在反应混合液与空气接触的状态下进行工序B和/或工序B’的反应时，作为原料的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和作为产物的氧化型谷胱甘肽容易保持氧化型的状态，因此优选。在工序B和/或工序B’的反应后的反应体系(例如，反应混合液)中实质上不含有还原型谷胱甘肽，具体而言，在工序B和/或工序B’的反应后的反应体系中，相对于氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的总摩尔量，氧化型谷胱甘肽含有70摩尔％以上，更优选含有80摩尔％以上，更优选含有90摩尔％以上，进一步优选含有95摩尔％以上，进一步优选含有98摩尔％以上，最优选含有100摩尔％。

工序B中作为原料的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸可以通过上述工序A得到。可以从工序A结束后的反应混合物中分离氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸并用于工序B，也可以不分离氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸而在工序A结束后的反应混合物中追加GSH II和甘氨酸进行工序B。或者，在GSH II和甘氨酸的各要素中至少1项不足而无法进行工序B的条件下进行工序A，接着，可以不从工序A结束后的反应混合液中分离氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸而向反应混合液中追加上述不足的要素来进行工序B。

另外，工序A的反应与工序B的反应不需要依次进行，也可以同时进行。即，可以在用于工序A的上述酶、用于工序B的上述酶和ATP的存在下使含有L-胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸的原料混合物进行反应。另外，该实施方式是本发明的实施方式之一，其中，工序B中用作原料的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸是通过工序A生成的。

同样地，工序B’中作为原料的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸可以通过上述工序A’得到。可以从工序A’结束后的反应混合物中分离氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸并用于工序B’，也可以不分离氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸而向工序A’结束后的反应混合物中追加甘氨酸并适当调整反应条件来进行工序B’。另外，工序A’的反应与工序B’的反应不需要依次进行，可以同时进行。即，可以使含有L-胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸的原料混合物进行反应。另外，该实施方式是本发明的实施方式之一，其中，工序B’中用作原料的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸是通过工序A’生成的。

反应混合液中的各种酶的浓度可以适当调整，例如，作为各种酶的蛋白质浓度，下限为1μg/ml以上，上限没有特别设定，但优选在100mg/ml以下的范围内适当调整。在工序B中使用GSH II的情况下，工序B的反应混合液中的GSH II活性没有特别限定，下限优选为0.1U/ml以上，上限没有特别设定，但通常可以设为10000U/ml以下。

反应混合液中的ATP浓度可以根据作为底物的氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的浓度、有无ATP再生体系而适当调整。在工序B中，相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸，以摩尔比计消耗2倍的ATP。在将工序B与ATP再生反应配合而实施的情况下，可以大幅降低ATP相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的添加量。因此，工序B中的反应混合液中的ATP浓度的上限没有特别限定，但优选相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸浓度以摩尔浓度比计为4倍以下，更优选为2.2倍以下。另外，工序B中的反应混合液中的ATP浓度的下限没有特别限定，但优选相对于氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸浓度以摩尔浓度比计为0.0001倍以上，更优选为0.001倍以上，进一步优选为0.01倍以上。

＜ATP再生反应＞

工序A和B均是消耗ATP生成ADP的工序。由于ATP是较昂贵的原料，因此优选将工序A和B与ATP再生反应配合而进行，所述ATP再生反应从该工序中产生的ADP再生ATP。

作为ATP再生反应，可以列举使用磷酸基供应源和磷酸转移酶将ADP再生为ATP的反应。

将ATP再生反应的简图的一个例子示于以下。该简图是使用聚磷酸(缩合磷酸)作为磷酸基供应源，使用聚磷酸依赖性AMP转移酶(PAP)和腺苷酸激酶(ADK)的组合作为磷酸转移酶的ATP再生反应的简图。

化学式3

在简图中，AMP表示一磷酸腺苷，PAP表示聚磷酸依赖性AMP转移酶，ADK表示腺苷酸激酶，PolyP_n表示磷原子为n个的聚磷酸(缩合磷酸)，PolyP_n-1表示磷原子为n-1个的聚磷酸(缩合磷酸)，“反应原料”表示工序A或B中的反应原料，“产物”表示工序A或B中的产物。

即，通过在聚磷酸、PAP和ADK的存在下进行工序A和B，消耗ATP而产生的ADP在ADK的作用下转变为ATP和AMP，由ADK的作用产生的AMP在PAP的作用下转变为ADP。该ATP再生反应可以与工序A和B的反应配合进行。

作为ADK和PAP，可以活细胞的形式直接使用具有各种酶的活性的生物细胞，也可以以虽然死亡但未受损的上述细胞的形态来使用，还可以使用ADK和/或PAP存在于细胞外的形态，具体而言，可以以上述生物细胞的粉碎物(与破碎物含义相同)的形态使用，也可以以由上述细胞分离纯化而得到的蛋白质的形态来使用。这里，具有ADK或PAP各活性的蛋白质的纯化程度没有特别限定，可以是粗纯化。关于细胞的“粉碎物”，如前文所述。优选在工序A或B中不使用具有ADK和/或PAP活性的活细胞，更优选在工序A或B中不使用具有ADK和/或PAP活性的活细胞及未受损的死细胞。

在ATP再生反应中使用的酶，优选使用存在于细胞外的ADK和/或PAP，具体而言，优选使用上述生物细胞的粉碎物的形态的ADK和/或PAP、或者由上述细胞分离而得到的蛋白质的形态的ADK和/或PAP。在将ADK和/或PAP以具有该活性的活细胞的形态用于ATP再生反应的情况下，存在AMP容易分解的倾向。如果AMP分解，则ATP再生反应的效率降低。另一方面，在将存在于细胞外的ADK和/或PAP用于ATP再生反应时，AMP不容易发生分解，能够高效地促进ATP再生反应，因此优选。需要说明的是，在不使用活细胞进行工序A和/或工序B的情况下，由于不存在活细胞引起的还原作用，因此能够抑制氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和/或氧化型谷胱甘肽的还原，是有利的。即，通过将存在于细胞外的ADK和/或PAP用于ATP再生反应来进行本发明的工序A和/或工序B，能够兼顾抑制AMP的分解和抑制氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸和/或氧化型谷胱甘肽的还原。

ATP再生反应中使用的各种酶在反应混合液中的浓度可以适当调整，例如，作为各种酶的蛋白质浓度，下限为1μg/ml以上，上限没有特别设定，但优选在100mg/ml以下的范围内适当调整。在使ATP再生反应与工序A或B配合的情况下，反应混合液中的ADK活性没有特别限定，下限优选为5U/ml以上，上限没有特别设定，但通常可以设为500000U/ml以下，反应混合液中的PAP活性没有特别限定，下限优选为1U/ml以上，上限没有特别设定，但通常可以设为100000U/ml以下。

聚磷酸(缩合磷酸)添加量可以根据反应底物的量而适当调节。聚磷酸可以以钠盐、钾盐等盐的形态、游离的形态、水合物等溶剂合物的形态等各种形态进行添加。聚磷酸的聚合度(每1分子的磷原子数)没有特别限定。需要说明的是，实施例和比较例中使用的偏磷酸Na是各种聚合度的缩合磷酸钠盐的混合物。

实施例

＜实验1＞

源自大肠埃希氏菌K12株的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)的制备

制备了如下所述的DNA引物：具有在源自大肠埃希氏菌K12株的GSH I基因(序列号1)的N末端部分的碱基序列键合了限制酶SacI的切割位点和SD序列而成的序列的DNA引物(Primer-1：序列号2)、具有在C末端部分的碱基序列键合了限制酶KpnI切割位点而成的序列的DNA引物(Primer-2：序列号3)。使用该DNA引物，通过PCR对该序列之间的DNA进行扩增，由此获得包含GSH I基因全长的DNA片段。此时，用于PCR扩增的模板为大肠杆菌K12株的基因组DNA。对得到的DNA片段的碱基序列进行分析，确认了包含GSH I基因的全长(序列号1)。将得到的DNA片段插入质粒pUC18(TAKARA BIO公司制造、GenBank收录号：L09136)的lac启动子下游的SacI识别位点与KpnI识别位点之间，构建了重组载体pUCGSHI。使用该重组载体pUCGSHI对大肠埃希氏菌HB101感受态细胞(TAKARA BIO公司制造)进行转化，得到了大肠埃希氏菌HB101(pUCGSHI)。将得到的转化体接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％、pH7.0)50ml中，在37℃下振荡培养24小时。测定了酶活性，结果是GSH I活性为5U/ml，源自用作宿主细胞的大肠埃希氏菌的ADK活性为90U/ml。接着，通过离心分离收集菌体，并悬浮于2.5ml的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中进行超声破碎，制成酶液。

＜实验2＞

源自大肠埃希氏菌K12株的谷胱甘肽合成酶(GSH II)的制备

制备了如下所述的DNA引物：具有在源自大肠杆菌K12株的GSH II基因(序列号4)的N末端部分的碱基序列键合了限制酶NdeI的切割位点而成的序列的DNA引物(Primer-3：序列号5)、具有在C末端部分的碱基序列键合了限制酶EcoRI切割位点而成的序列的DNA引物(Primer-4：序列号6)。使用该DNA引物，通过PCR对该序列之间的DNA进行扩增，由此获得包含GSH II基因全长的DNA片段。此时，用于PCR扩增的模板为大肠杆菌K12株的基因组DNA。对得到的DNA片段的碱基序列进行分析，确认了包含GSH II基因的全长(序列号4)。将得到的DNA片段插入质粒pUCN18(通过PCR法将pUC18(TAKARA BIO公司制造、GenBank收录号：L09136)的第185号的T改变为A，破坏NdeI位点，再将第471-472号的GC改变为TG，由此新导入了NdeI位点而得到的质粒)的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，构建了重组载体pNGSHII。使用该重组载体pNGSHII，对大肠埃希氏菌HB101感受态细胞(TAKARA BIO公司制造)进行转化，得到了大肠埃希氏菌HB101(pNGSHII)。将得到的转化体接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl0.5％、pH7.0)50ml中，在37℃下振荡培养24小时。测定了酶活性，结果是GSH II活性为5U/ml，源自用作宿主细胞的大肠埃希氏菌的ADK活性为90U/ml。接着，通过离心分离收集菌体，并悬浮于2.5ml的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中进行超声破碎，制成酶液。

＜实验3＞

源自无乳链球菌的双功能谷胱甘肽合成酶(GSH F)的制备

使用基因合成法获得了源自无乳链球菌的GSH F基因片段(序列号7)(Eurogentec公司制造)，所述GSH F基因片段以在大肠埃希氏菌中表达的用途对密码子进行了最优化、且在N末端部分的碱基序列键合了限制酶NdeI的切割位点、在C末端部分的碱基序列键合了限制酶EcoRI切割位点。将得到的基因片段插入质粒pUCN18(通过PCR法将pUC18(TAKARABIO公司制造、GenBank收录号：L09136)的第185号的T改变为A，破坏NdeI位点，再将第471-472号的GC改变为TG，由此新导入了NdeI位点而得到的质粒)的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，构建了重组载体pNGSHF。使用该重组载体pNGSHF对大肠埃希氏菌HB101感受态细胞(TAKARA BIO公司制造)进行转化，得到了大肠埃希氏菌HB101(pNGSHF)。将得到的转化体接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％、pH7.0)50ml中，在37℃下振荡培养24小时。测定了酶活性，结果是GSH F活性为3U/ml，源自用作宿主细胞的大肠埃希氏菌的ADK活性为90U/ml。接着，通过离心分离收集菌体，并悬浮于2.5ml的100mM磷酸缓冲液中进行超声破碎，制成酶液。

＜实验4＞

源自约氏不动杆菌的AMP磷酸转移酶(PAP)的制备

使用基因合成法获得了源自约氏不动杆菌的PAP基因片段(序列号8)(Eurogentec公司制造)，所述PAP基因片段以在大肠杆菌中表达的用途对密码子进行了最优化、且在N末端部分的碱基序列键合了限制酶NdeI的切割位点、在C末端部分的碱基序列键合了限制酶EcoRI切割位点。将得到的基因片段插入质粒pUCN18(通过PCR法将pUC18(TAKARA BIO公司制造、GenBank收录号：L09136)的第185号的T改变为A，破坏NdeI位点，再将第471-472号的GC改变为TG，由此新导入了NdeI位点而得到的质粒)的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，构建了重组载体pNPAP。使用该重组载体pNPAP对大肠埃希氏菌HB101感受态细胞(TAKARA BIO公司制造)进行转化，得到了大肠埃希氏菌HB101(pNPAP)。将得到的转化体接种于含有200μg/ml氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％、pH7.0)50ml中，在37℃下振荡培养24小时。测定了酶活性，结果是PAP活性为40U/ml、源自用作宿主细胞的大肠埃希氏菌的ADK活性为90U/ml。接着，通过离心分离收集菌体，并悬浮于2.5ml的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中进行超声破碎，制成酶液。

＜产率的计算＞

本说明书的实验中的各化合物的产率的计算方法如下所述。

通过用高效液相色谱对反应产物进行分析来定量，通过下式求出产率。

产率：各化合物的产量(mol)/初始L-胱氨酸(mol)×100

上述高效液相色谱的条件如下所述。该洗脱条件下，按照还原型谷胱甘肽(GSH)、还原型γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)、氧化型γ-GC、氧化型谷胱甘肽(GSSG)的顺序洗脱。

[产率的分析]

柱：ODS-HG-3(4.6mmφ×150mm、野村化学株式会社制造)；

流速：1.0ml/分；

柱温：40℃；

测定波长：210nm。

＜实施例1＞

化学式4

将L-谷氨酸单钠单水合物0.3629g(2.15mmol)、L-胱氨酸二盐酸盐0.3113g(0.99mmol)、硫酸镁七水合物0.7079g、ATP 0.0583g(0.11mmol)、偏磷酸Na 0.8g、蒸馏水12g进行混合，用15重量％氢氧化钠水溶液0.8g调节pH至7.5。向其中添加实验1中制备的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)酶液2g、实验4中制备的PAP酶液2g，开始反应。反应温度在30℃下进行。1小时反应后，对反应液进行分析，结果是确认了氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的生成。产率以相对于初始L-胱氨酸计，在1小时反应后为20mol％，22小时反应后为95mol％。此时，22小时反应后的还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的产率以相对于初始L-胱氨酸计为1mol％以下。

需要说明的是，实验1中制备的GSH I酶液和实验4中制备的PAP酶液中包含源自用作宿主细胞的大肠埃希氏菌的ADK，因此不需要另外制备ADK。

＜实施例2＞

化学式5

向上述实施例1的反应22小时后的反应液中添加甘氨酸0.19g(2.53mmol)、实验2中制备的谷胱甘肽合成酶(GSH II)酶液2g、实验4中制备的PAP酶液2g，开始反应。此时，用15质量％氢氧化钠水溶液0.2g将pH调节至7.5。1小时反应后对反应液进行分析，结果是确认了氧化型谷胱甘肽的生成。产率以相对于初始L-胱氨酸计，1小时反应后为20mol％，6小时反应后为86mol％。此时，6小时反应后的还原型谷胱甘肽的产率以相对于初始L-胱氨酸计为1mol％以下。

需要说明的是，实验2中制备的GSH II酶液和实验4中制备的PAP酶液中包含源自用作宿主细胞的大肠埃希氏菌的ADK，因此不需要另外制备ADK。

＜实施例3＞

化学式6

将L-谷氨酸单钠单水合物0.0717g(0.42mmol)、L-胱氨酸二盐酸盐0.0643g(0.21mmol)、硫酸镁七水合物0.2053g、ATP0.24g(0.44mmol)、蒸馏水17g进行混合，用15重量％氢氧化钠水溶液0.26g将pH调节至7.5。向其中添加实验1中制备的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)酶液2g，开始反应。反应温度在30℃下进行。2小时反应后对反应液进行分析，结果是确认了氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的生成。产率以相对于初始L-胱氨酸计，2小时反应后为12mol％，23小时反应后为95mol％。此时，23小时反应后的还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的产率以相对于初始L-胱氨酸计为1mol％以下。

＜实施例4＞

化学式7

向上述实施例3的反应23小时后的反应液中添加甘氨酸0.0426g(0.57mmol)、硫酸镁七水合物0.2064g、ATP 0.2392g(0.4mmol)、实验2中制备的谷胱甘肽合成酶(GSH II)酶液2g，开始反应。此时，用15质量％氢氧化钠水溶液0.2g将pH调节为7.5。1小时反应后对反应液进行分析，结果是确认了氧化型谷胱甘肽的生成。产率以相对于初始L-胱氨酸计，1小时反应后为6mol％，5小时反应后为70mol％。此时，5小时反应后的还原型谷胱甘肽的产率以相对于初始L-胱氨酸计为1mol％以下。

＜实施例5＞

化学式8

将L-谷氨酸单钠单水合物0.3662g(2.17mmol)、L-胱氨酸二盐酸盐0.3121g(1.00mmol)、硫酸镁七水合物0.7019g、ATP 0.058g(0.11mmol)、偏磷酸Na 0.8g、蒸馏水12g进行混合，用15重量％氢氧化钠水溶液0.8g将pH调节至7.5。向其中添加实验3中制备的双功能谷胱甘肽合成酶(GSH F)酶液2g、实验4中制备的PAP酶液2g，开始反应。反应温度在30℃下进行。1小时反应后对反应液进行分析，结果是确认了氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的生成。产率以相对于初始L-胱氨酸计，1小时反应后为9mol％，19小时反应后为61mol％。此时，19小时反应后的还原型γ-谷氨酰半胱氨酸的产率以相对于初始L-胱氨酸计为1mol％以下。

需要说明的是，实验3中制备的GSH F酶液和实验4中制备的PAP酶液中包含源自用作宿主细胞的大肠埃希氏菌的ADK，因此不需要另外制备ADK。

配列表自由文本

序列号2：引物

序列号3：引物

序列号5：引物

序列号6：引物

本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过直接引用加入本说明书中。

序列表

<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）

<120> 氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸及氧化型谷胱甘肽的制造方法

<130> B140113

<150> JP 2014-137202

<151> 2014-07-02

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgatcccgg acgtatcaca ggcgctggcc tggctggaaa aacatcctca ggcgttaaag 60

gggatacagc gtgggctgga gcgcgaaact ttgcgtgtta atgctgatgg cacactggca 120

acaacaggtc atcctgaagc attaggttcc gcactgacgc acaaatggat tactaccgat 180

tttgcggaag cattgctgga attcattaca ccagtggatg gtgatattga acatatgctg 240

acctttatgc gcgatctgca tcgttatacg gcgcgcaata tgggcgatga gcggatgtgg 300

ccgttaagta tgccatgcta catcgcagaa ggtcaggaca tcgaactggc acagtacggc 360

acttctaaca ccggacgctt taaaacgctg tatcgtgaag ggctgaaaaa tcgctacggc 420

gcgctgatgc aaaccatttc cggcgtgcac tacaatttct ctttgccaat ggcattctgg 480

caagcgaagt gcggtgatat ctcgggcgct gatgccaaag agaaaatttc tgcgggctat 540

ttccgcgtta tccgcaatta ctatcgtttc ggttgggtca ttccttatct gtttggtgca 600

tctccggcga tttgttcttc tttcctgcaa ggaaaaccaa cgtcgctgcc gtttgagaaa 660

accgagtgcg gtatgtatta cctgccgtat gcgacctctc ttcgtttgag cgatctcggc 720

tataccaata aatcgcaaag caatcttggt attaccttca acgatcttta cgagtacgta 780

gcgggcctta aacaggcaat caaaacgcca tcggaagagt acgcgaagat tggtattgag 840

aaagacggta agaggctgca aatcaacagc aacgtgttgc agattgaaaa cgaactgtac 900

gcgccgattc gtccaaaacg cgttacccgc agcggcgagt cgccttctga tgcgctgtta 960

cgtggcggca ttgaatatat tgaagtgcgt tcgctggaca tcaacccgtt ctcgccgatt 1020

ggtgtagatg aacagcaggt gcgattcctc gacctgttta tggtctggtg tgcgctggct 1080

gatgcaccgg aaatgagcag tagcgaactt gcctgtacac gcgttaactg gaaccgggtg 1140

atcctcgaag gtcgcaaacc gggtctgacg ctgggtatcg gctgcgaaac cgcacagttc 1200

ccgttaccgc aggtgggtaa agatctgttc cgcgatctga aacgcgtcgc gcaaacgctg 1260

gatagtatta acggcggcga agcgtatcag aaagtgtgtg atgaactggt tgcctgcttc 1320

gataatcccg atctgacttt ctctgcccgt atcttaaggt ctatgattga tactggtatt 1380

ggcggaacag gcaaagcatt tgcagaagcc taccgtaatc tgctgcgtga agagccgctg 1440

gaaattctgc gcgaagagga ttttgtagcc gagcgcgagg cgtctgaacg ccgtcagcag 1500

gaaatggaag ccgctgatac cgaaccgttt gcggtgtggc tggaaaaaca cgcctga 1557

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 2

gcagagctct aaggaggtta caatgatccc ggacgtatca cag 43

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 3

gcgggtacct tatcaggcgt gtttttccag ccacacc 37

<210> 4

<211> 951

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 4

atgatcaagc tcggcatcgt gatggacccc atcgcaaaca tcaacatcaa gaaagattcc 60

agttttgcta tgttgctgga agcacagcgt cgtggttacg aacttcacta tatggagatg 120

ggcgatctgt atctgatcaa tggtgaagcc cgcgcccata cccgcacgct gaacgtgaag 180

cagaactacg aagagtggtt ttcgttcgtc ggtgaacagg atctgccgct ggccgatctc 240

gatgtgatcc tgatgcgtaa agacccgccg tttgataccg agtttatcta cgcgacctat 300

attctggaac gtgccgaaga gaaagggacg ctgatcgtta acaagccgca gagcctgcgc 360

gactgtaacg agaaactgtt taccgcctgg ttctctgact taacgccaga aacgctggtt 420

acgcgcaata aagcgcagct aaaagcgttc tgggagaaac acagcgacat cattcttaag 480

ccgctggacg gtatgggcgg cgcgtcgatt ttccgcgtga aagaaggcga tccaaacctc 540

ggcgtgattg ccgaaaccct gactgagcat ggcactcgct actgcatggc gcaaaattac 600

ctgccagcca ttaaagatgg cgacaaacgc gtgctggtgg tggatggcga gccggtaccg 660

tactgcctgg cgcgtattcc gcaggggggc gaaacccgtg gcaatctggc tgccggtggt 720

cgcggtgaac ctcgtccgct gacggaaagt gactggaaaa tcgcccgtca gatcgggccg 780

acgctgaaag aaaaagggct gatttttgtt ggtctggata tcatcggcga ccgtctgact 840

gaaattaacg tcaccagccc aacctgtatt cgtgagattg aagcagagtt tccggtgtcg 900

atcaccggaa tgttaatgga tgccatcgaa gcacgtttac agcagcagta a 951

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 5

agcatcgtac atatgatcaa gctcggcatc gtgatg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 6

gcagaattct cattactgct gctgtaaacg tgcttc 36

<210> 7

<211> 2265

<212> DNA

<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)

<400> 7

catatgatta ttgaccgtct gctgcaacgc tcccatagcc atctgccgat cctgcaagcc 60

acctttggtc tggaacgtga atccctgcgc attcatcagc cgacccagcg tgtggcccag 120

acgccgcatc cgaaaaccct gggctctcgc aactatcacc cgtacatcca aacggattat 180

agtgaaccgc agctggaact gattaccccg atcgccaaag actctcagga agcaatccgt 240

tttctgaaag ccatttcaga tgttgcaggt cgctcgatta atcatgacga atatctgtgg 300

ccgctgagta tgccgccaaa agtccgtgaa gaagatattc aaatcgctca gctggaagat 360

gcgttcgaat atgactaccg caaatatctg gaaaaaacct acggcaaact gattcagtcc 420

atctcaggta ttcactataa cctgggcctg ggtcaagaac tgctgacctc gctgtttgaa 480

ctgagccagg cggataacgc cattgacttc cagaatcaac tgtatatgaa actgtctcag 540

aattttctgc gttaccgctg gctgctgacc tatctgtacg gcgccagtcc ggtggcagaa 600

gaagatttcc tggaccagaa actgaacaat ccggtccgtt ccctgcgcaa ctcacatctg 660

ggttatgtga atcacaaaga tattcgtatc tcgtatacca gcctgaaaga ttacgtgaac 720

gacctggaaa atgctgttaa atctggccag ctgattgcgg aaaaagaatt ttatagcccg 780

gttcgtctgc gcggctctaa agcctgccgt aactatctgg aaaaaggtat cacgtacctg 840

gaatttcgca ccttcgatct gaatccgttt agtccgattg gtatcaccca ggaaacggtg 900

gataccgttc acctgtttct gctggcgctg ctgtggattg acagctctag tcacatcgat 960

caggacatta aagaagccaa ccgcctgaat gatctgatcg cactgagcca tccgctggaa 1020

aaactgccga accaggctcc ggtttcagat ctggtcgacg caatgcaatc ggtgattcag 1080

cactttaatc tgagcccgta ttaccaagat ctgctggaaa gtgttaaacg tcagatccaa 1140

tccccggaac tgaccgttgc gggtcagctg ctggaaatga ttgaaggtct gtccctggaa 1200

accttcggcc agcgccaggg tcagatctat catgattacg catgggaagc tccgtatgcg 1260

ctgaaaggct acgaaacgat ggaactgagc acccaactgc tgctgttcga tgttattcag 1320

aaaggtgtga actttgaagt tctggatgaa caagaccagt tcctgaaact gtggcataat 1380

tcccacatcg aatatgtgaa aaacggcaat atgacgtcaa aagataacta catcgttccg 1440

ctggcgatgg ccaataaagt ggttaccaag aaaattctgg acgaaaaaca ctttccgacg 1500

ccgttcggtg atgaatttac cgaccgtaaa gaagcgctga actatttttc gcaaatccag 1560

gataaaccga ttgtcgtgaa accgaaaagc acgaacttcg gcctgggtat ttctatcttt 1620

aaaaccagtg ccaatctggc atcctacgaa aaagctattg atatcgcgtt tacggaagac 1680

agcgcgatcc tggtcgaaga atatattgaa ggcaccgaat accgtttctt tgtgctggag 1740

ggtgattgta tcgcggtcct gctgcgtgtg gccgcaaatg ttgttggtga cggtatccat 1800

accatttccc aactggtgaa actgaaaaac cagaatccgc tgcgtggcta tgatcaccgc 1860

tcaccgctgg aagttatcga actgggtgaa gtcgaacagc tgatgctgga acagcaaggc 1920

tacacggtga actcgatccc gccggaaggt accaaaattg aactgcgtcg caactctaat 1980

atcagtacgg gcggtgatag cattgacgtt accaatacga tggatccgac ctataaacag 2040

ctggcagctg aaatggcaga agctatgggc gcatgggtct gtggtgtgga tctgattatc 2100

ccgaacgcta cgcaggcgta cagcaaagac aagaaaaacg cgacctgcat tgaactgaac 2160

tttaatccgc tgatgtatat gcatacctac tgtcaagaag gtccgggtca gagcatcacg 2220

ccgcgcatcc tggcaaaact gtttccggaa ctgtaatgag aattc 2265

<210> 8

<211> 1440

<212> DNA

<213> 约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)

<400> 8

catatggata ccgaaacgat tgcctccgcc gtcctgaacg aagaacaact gtcgctggat 60

ctgattgaag cacaatacgc tctgatgaac acccgcgatc agtcgaatgc gaaaagcctg 120

gtgattctgg tttccggcat cgaactggcc ggcaaaggtg aagcagtcaa acagctgcgc 180

gaatgggtgg acccgcgttt tctgtatgtt aaagccgatc cgccgcacct gtttaatctg 240

aaacagccgt tctggcaacc gtatacccgc tttgttccgg cggagggtca gattatggtc 300

tggttcggca actggtacgg tgatctgctg gctaccgcga tgcacgcatc gaaaccgctg 360

gatgacacgc tgtttgatga atatgtcagc aatatgcgtg cgttcgaaca ggatctgaaa 420

aacaataacg tcgacgtgct gaaagtgtgg tttgatctgt cctggaaatc actgcaaaaa 480

cgcctggatg acatggatcc gtctgaagtt cattggcaca aactgcatgg cctggactgg 540

cgtaacaaaa aacagtacga taccctgcaa aaactgcgta cccgctttac ggatgactgg 600

cagattatcg atggtgaaga tgaagacctg cgcaatcaca acttcgccca agcaattctg 660

acggccctgc gtcattgccc ggaacacgaa aagaaagcgg ccctgaaatg gcagcaagca 720

ccgattccgg acatcctgac ccagtttgaa gtgccgcaag ctgaagatgc gaactacaaa 780

tcagaactga aaaaactgac gaaacaggtt gctgatgcga tgcgttgtga tgaccgcaaa 840

gtggttatcg ccttcgaagg catggacgca gctggtaaag gcggtgcaat taaacgcatc 900

gttaaaaaac tggatccgcg tgaatacgaa attcatacca tcgcggcccc ggaaaaatat 960

gaactgcgtc gcccgtacct gtggcgcttt tggtctaaac tgcagagtga tgacattacc 1020

atcttcgatc gtacgtggta tggccgcgtt ctggtcgaac gtgtcgaagg ttttgcgacc 1080

gaagtggaat ggcagcgcgc ctacgcagaa attaatcgtt ttgagaaaaa cctgagctct 1140

agtcagacgg tgctgattaa attctggctg gctatcgata aagacgaaca agcagctcgt 1200

tttaaagccc gcgaaagcac cccgcataaa cgtttcaaaa tcacggaaga agattggcgt 1260

aatcgcgaca aatgggatga ctatctgaaa gcggccgcag atatgttcgc tcacaccgac 1320

acgtcctatg cgccgtggta cattatctca accaacgata aacagcaagc tcgtatcgaa 1380

gtcctgcgtg ccatcctgaa acaactgaaa gccgaccgtg acaccgacta atgagaattc 1440

<210> 9

<211> 518

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 9

Met Ile Pro Asp Val Ser Gln Ala Leu Ala Trp Leu Glu Lys His Pro

1 5 10 15

Gln Ala Leu Lys Gly Ile Gln Arg Gly Leu Glu Arg Glu Thr Leu Arg

20 25 30

Val Asn Ala Asp Gly Thr Leu Ala Thr Thr Gly His Pro Glu Ala Leu

35 40 45

Gly Ser Ala Leu Thr His Lys Trp Ile Thr Thr Asp Phe Ala Glu Ala

50 55 60

Leu Leu Glu Phe Ile Thr Pro Val Asp Gly Asp Ile Glu His Met Leu

65 70 75 80

Thr Phe Met Arg Asp Leu His Arg Tyr Thr Ala Arg Asn Met Gly Asp

85 90 95

Glu Arg Met Trp Pro Leu Ser Met Pro Cys Tyr Ile Ala Glu Gly Gln

100 105 110

Asp Ile Glu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Ser Asn Thr Gly Arg Phe Lys

115 120 125

Thr Leu Tyr Arg Glu Gly Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Ala Leu Met Gln

130 135 140

Thr Ile Ser Gly Val His Tyr Asn Phe Ser Leu Pro Met Ala Phe Trp

145 150 155 160

Gln Ala Lys Cys Gly Asp Ile Ser Gly Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile

165 170 175

Ser Ala Gly Tyr Phe Arg Val Ile Arg Asn Tyr Tyr Arg Phe Gly Trp

180 185 190

Val Ile Pro Tyr Leu Phe Gly Ala Ser Pro Ala Ile Cys Ser Ser Phe

195 200 205

Leu Gln Gly Lys Pro Thr Ser Leu Pro Phe Glu Lys Thr Glu Cys Gly

210 215 220

Met Tyr Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Leu Ser Asp Leu Gly

225 230 235 240

Tyr Thr Asn Lys Ser Gln Ser Asn Leu Gly Ile Thr Phe Asn Asp Leu

245 250 255

Tyr Glu Tyr Val Ala Gly Leu Lys Gln Ala Ile Lys Thr Pro Ser Glu

260 265 270

Glu Tyr Ala Lys Ile Gly Ile Glu Lys Asp Gly Lys Arg Leu Gln Ile

275 280 285

Asn Ser Asn Val Leu Gln Ile Glu Asn Glu Leu Tyr Ala Pro Ile Arg

290 295 300

Pro Lys Arg Val Thr Arg Ser Gly Glu Ser Pro Ser Asp Ala Leu Leu

305 310 315 320

Arg Gly Gly Ile Glu Tyr Ile Glu Val Arg Ser Leu Asp Ile Asn Pro

325 330 335

Phe Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Gln Gln Val Arg Phe Leu Asp Leu

340 345 350

Phe Met Val Trp Cys Ala Leu Ala Asp Ala Pro Glu Met Ser Ser Ser

355 360 365

Glu Leu Ala Cys Thr Arg Val Asn Trp Asn Arg Val Ile Leu Glu Gly

370 375 380

Arg Lys Pro Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Cys Glu Thr Ala Gln Phe

385 390 395 400

Pro Leu Pro Gln Val Gly Lys Asp Leu Phe Arg Asp Leu Lys Arg Val

405 410 415

Ala Gln Thr Leu Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Ala Tyr Gln Lys Val

420 425 430

Cys Asp Glu Leu Val Ala Cys Phe Asp Asn Pro Asp Leu Thr Phe Ser

435 440 445

Ala Arg Ile Leu Arg Ser Met Ile Asp Thr Gly Ile Gly Gly Thr Gly

450 455 460

Lys Ala Phe Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Leu Leu Arg Glu Glu Pro Leu

465 470 475 480

Glu Ile Leu Arg Glu Glu Asp Phe Val Ala Glu Arg Glu Ala Ser Glu

485 490 495

Arg Arg Gln Gln Glu Met Glu Ala Ala Asp Thr Glu Pro Phe Ala Val

500 505 510

Trp Leu Glu Lys His Ala

515

<210> 10

<211> 316

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 10

Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Met Asp Pro Ile Ala Asn Ile Asn Ile

1 5 10 15

Lys Lys Asp Ser Ser Phe Ala Met Leu Leu Glu Ala Gln Arg Arg Gly

20 25 30

Tyr Glu Leu His Tyr Met Glu Met Gly Asp Leu Tyr Leu Ile Asn Gly

35 40 45

Glu Ala Arg Ala His Thr Arg Thr Leu Asn Val Lys Gln Asn Tyr Glu

50 55 60

Glu Trp Phe Ser Phe Val Gly Glu Gln Asp Leu Pro Leu Ala Asp Leu

65 70 75 80

Asp Val Ile Leu Met Arg Lys Asp Pro Pro Phe Asp Thr Glu Phe Ile

85 90 95

Tyr Ala Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Ala Glu Glu Lys Gly Thr Leu Ile

100 105 110

Val Asn Lys Pro Gln Ser Leu Arg Asp Cys Asn Glu Lys Leu Phe Thr

115 120 125

Ala Trp Phe Ser Asp Leu Thr Pro Glu Thr Leu Val Thr Arg Asn Lys

130 135 140

Ala Gln Leu Lys Ala Phe Trp Glu Lys His Ser Asp Ile Ile Leu Lys

145 150 155 160

Pro Leu Asp Gly Met Gly Gly Ala Ser Ile Phe Arg Val Lys Glu Gly

165 170 175

Asp Pro Asn Leu Gly Val Ile Ala Glu Thr Leu Thr Glu His Gly Thr

180 185 190

Arg Tyr Cys Met Ala Gln Asn Tyr Leu Pro Ala Ile Lys Asp Gly Asp

195 200 205

Lys Arg Val Leu Val Val Asp Gly Glu Pro Val Pro Tyr Cys Leu Ala

210 215 220

Arg Ile Pro Gln Gly Gly Glu Thr Arg Gly Asn Leu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Arg Gly Glu Pro Arg Pro Leu Thr Glu Ser Asp Trp Lys Ile Ala Arg

245 250 255

Gln Ile Gly Pro Thr Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Phe Val Gly Leu

260 265 270

Asp Ile Ile Gly Asp Arg Leu Thr Glu Ile Asn Val Thr Ser Pro Thr

275 280 285

Cys Ile Arg Glu Ile Glu Ala Glu Phe Pro Val Ser Ile Thr Gly Met

290 295 300

Leu Met Asp Ala Ile Glu Ala Arg Leu Gln Gln Gln

305 310 315

<210> 11

<211> 2253

<212> DNA

<213> 无乳链球菌

<400> 11

atgattatcg atcgactgtt acaaagaagc cactctcatc taccgattct acaagctaca 60

tttggcttag agagagaaag ccttcgtatt caccaaccca ctcaaagggt tgctcaaaca 120

ccccatccca aaacattagg gagtcgtaac tatcatcctt atatccaaac ggattatagt 180

gaacctcaat tagaactcat tacacctatt gcaaaggata gccaagaagc cattcgattt 240

ttgaaagcta taagtgatgt tgctggacgc tctatcaacc acgatgaata cttatggccg 300

ctttctatgc cacccaaagt gagggaagaa gacatacaga ttgcccaatt agaggatgct 360

tttgaatatg attatcgcaa atatttggag aagacttatg gaaaactaat acaatccatc 420

tctggaattc actataatct cggtttaggt caagagttat taacttctct ctttgaattg 480

agtcaagcag ataatgctat tgattttcag aaccagcttt acatgaaatt gtctcaaaat 540

tttttacgtt accgttggtt actaacttat ctatacggag cgagcccagt agctgaagaa 600

gactttttag atcagaaact gaataaccct gtccggtcac ttagaaatag tcacttaggt 660

tatgtgaatc ataaagatat tcgtatttct tatactagct tgaaggatta tgtcaacgat 720

ctagaaaatg ctgtaaaaag tgggcaattg attgctgaga aagaatttta ttcacctgtt 780

cgtctccgtg gtagtaaggc ctgtcgtaat tatttagaaa aaggaattac atatttagag 840

tttcgcactt ttgatctcaa cccatttagc ccaatcggta taacgcagga aactgttgat 900

actgttcacc ttttcttatt ggcgcttttg tggatagatt ctagtagtca tattgaccaa 960

gatatcaagg aagccaatag attaaatgac cttatagcac ttagtcatcc attagaaaaa 1020

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tttaacttat caccttacta tcaagaccta ttggaatctg taaaaaggca aattcagtca 1140

cctgaattaa cggtagctgg tcaactttta gaaatgattg aaggactttc cttagaaaca 1200

tttggacaaa gacaaggaca aatttatcac gattatgctt gggaagctcc ctacgcctta 1260

aagggatatg aaacgatgga actttctacc caattgctac tatttgacgt tatccaaaaa 1320

ggagtcaact tcgaagtgct ggatgaacaa gatcaattcc taaaattatg gcacaatagt 1380

catattgagt acgttaaaaa tggtaatatg acctcaaaag ataactatat tgtaccgctc 1440

gctatggcta acaaagttgt tacaaaaaaa atcctagatg aaaagcattt cccaactcct 1500

tttggagatg aatttactga ccgtaaagag gcacttaact atttttcaca aatccaagat 1560

aaaccaatcg tcgttaagcc aaaatctaca aactttggtt taggcatttc tatttttaaa 1620

acatcagcta acttagcttc ttatgaaaaa gcaattgaca tcgcttttac cgaagatagt 1680

gctattcttg tggaagaata tattgagggt accgaatacc gtttcttcgt ccttgagggg 1740

gactgtattg ctgtattgct tagggtagca gctaatgtcg ttggagatgg tattcatact 1800

attagtcagc tagttaaact taaaaaccaa aaccctctca gaggctatga tcatcgctct 1860

cctctagagg ttattgagct cggagaagta gaacagttaa tgttggaaca acaaggatac 1920

actgttaaca gtatccctcc agaaggaaca aaaatagaac ttcgccgtaa ttctaatatt 1980

tccactggcg gtgactctat agatgtaaca aatacaatgg atcctacata taaacaacta 2040

gcagctgaga tggcagaggc tatgggggct tgggtttgtg gagttgattt aattattcct 2100

aatgccactc aagcatactc aaaagataag aaaaatgcta cttgcattga actaaacttt 2160

aacccattga tgtatatgca cacctactgt caagaggggc ctggtcaatc tattacacct 2220

cgaattttgg ctaaactgtt cccagaatta taa 2253

<210> 12

<211> 750

<212> PRT

<213> 无乳链球菌

<400> 12

Met Ile Ile Asp Arg Leu Leu Gln Arg Ser His Ser His Leu Pro Ile

1 5 10 15

Leu Gln Ala Thr Phe Gly Leu Glu Arg Glu Ser Leu Arg Ile His Gln

20 25 30

Pro Thr Gln Arg Val Ala Gln Thr Pro His Pro Lys Thr Leu Gly Ser

35 40 45

Arg Asn Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Tyr Ser Glu Pro Gln Leu

50 55 60

Glu Leu Ile Thr Pro Ile Ala Lys Asp Ser Gln Glu Ala Ile Arg Phe

65 70 75 80

Leu Lys Ala Ile Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Ile Asn His Asp Glu

85 90 95

Tyr Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Val Arg Glu Glu Asp Ile

100 105 110

Gln Ile Ala Gln Leu Glu Asp Ala Phe Glu Tyr Asp Tyr Arg Lys Tyr

115 120 125

Leu Glu Lys Thr Tyr Gly Lys Leu Ile Gln Ser Ile Ser Gly Ile His

130 135 140

Tyr Asn Leu Gly Leu Gly Gln Glu Leu Leu Thr Ser Leu Phe Glu Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ala Asp Asn Ala Ile Asp Phe Gln Asn Gln Leu Tyr Met Lys

165 170 175

Leu Ser Gln Asn Phe Leu Arg Tyr Arg Trp Leu Leu Thr Tyr Leu Tyr

180 185 190

Gly Ala Ser Pro Val Ala Glu Glu Asp Phe Leu Asp Gln Lys Leu Asn

195 200 205

Asn Pro Val Arg Ser Leu Arg Asn Ser His Leu Gly Tyr Val Asn His

210 215 220

Lys Asp Ile Arg Ile Ser Tyr Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Val Asn Asp

225 230 235 240

Leu Glu Asn Ala Val Lys Ser Gly Gln Leu Ile Ala Glu Lys Glu Phe

245 250 255

Tyr Ser Pro Val Arg Leu Arg Gly Ser Lys Ala Cys Arg Asn Tyr Leu

260 265 270

Glu Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Phe Arg Thr Phe Asp Leu Asn Pro

275 280 285

Phe Ser Pro Ile Gly Ile Thr Gln Glu Thr Val Asp Thr Val His Leu

290 295 300

Phe Leu Leu Ala Leu Leu Trp Ile Asp Ser Ser Ser His Ile Asp Gln

305 310 315 320

Asp Ile Lys Glu Ala Asn Arg Leu Asn Asp Leu Ile Ala Leu Ser His

325 330 335

Pro Leu Glu Lys Leu Pro Asn Gln Ala Pro Val Ser Asp Leu Val Asp

340 345 350

Ala Met Gln Ser Val Ile Gln His Phe Asn Leu Ser Pro Tyr Tyr Gln

355 360 365

Asp Leu Leu Glu Ser Val Lys Arg Gln Ile Gln Ser Pro Glu Leu Thr

370 375 380

Val Ala Gly Gln Leu Leu Glu Met Ile Glu Gly Leu Ser Leu Glu Thr

385 390 395 400

Phe Gly Gln Arg Gln Gly Gln Ile Tyr His Asp Tyr Ala Trp Glu Ala

405 410 415

Pro Tyr Ala Leu Lys Gly Tyr Glu Thr Met Glu Leu Ser Thr Gln Leu

420 425 430

Leu Leu Phe Asp Val Ile Gln Lys Gly Val Asn Phe Glu Val Leu Asp

435 440 445

Glu Gln Asp Gln Phe Leu Lys Leu Trp His Asn Ser His Ile Glu Tyr

450 455 460

Val Lys Asn Gly Asn Met Thr Ser Lys Asp Asn Tyr Ile Val Pro Leu

465 470 475 480

Ala Met Ala Asn Lys Val Val Thr Lys Lys Ile Leu Asp Glu Lys His

485 490 495

Phe Pro Thr Pro Phe Gly Asp Glu Phe Thr Asp Arg Lys Glu Ala Leu

500 505 510

Asn Tyr Phe Ser Gln Ile Gln Asp Lys Pro Ile Val Val Lys Pro Lys

515 520 525

Ser Thr Asn Phe Gly Leu Gly Ile Ser Ile Phe Lys Thr Ser Ala Asn

530 535 540

Leu Ala Ser Tyr Glu Lys Ala Ile Asp Ile Ala Phe Thr Glu Asp Ser

545 550 555 560

Ala Ile Leu Val Glu Glu Tyr Ile Glu Gly Thr Glu Tyr Arg Phe Phe

565 570 575

Val Leu Glu Gly Asp Cys Ile Ala Val Leu Leu Arg Val Ala Ala Asn

580 585 590

Val Val Gly Asp Gly Ile His Thr Ile Ser Gln Leu Val Lys Leu Lys

595 600 605

Asn Gln Asn Pro Leu Arg Gly Tyr Asp His Arg Ser Pro Leu Glu Val

610 615 620

Ile Glu Leu Gly Glu Val Glu Gln Leu Met Leu Glu Gln Gln Gly Tyr

625 630 635 640

Thr Val Asn Ser Ile Pro Pro Glu Gly Thr Lys Ile Glu Leu Arg Arg

645 650 655

Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp Val Thr Asn Thr

660 665 670

Met Asp Pro Thr Tyr Lys Gln Leu Ala Ala Glu Met Ala Glu Ala Met

675 680 685

Gly Ala Trp Val Cys Gly Val Asp Leu Ile Ile Pro Asn Ala Thr Gln

690 695 700

Ala Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Asn Ala Thr Cys Ile Glu Leu Asn Phe

705 710 715 720

Asn Pro Leu Met Tyr Met His Thr Tyr Cys Gln Glu Gly Pro Gly Gln

725 730 735

Ser Ile Thr Pro Arg Ile Leu Ala Lys Leu Phe Pro Glu Leu

740 745 750

<210> 13

<211> 645

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 13

atgcgtatca ttctgcttgg cgctccgggc gcggggaaag ggactcaggc tcagttcatc 60

atggagaaat atggtattcc gcaaatctcc actggcgata tgctgcgtgc tgcggtcaaa 120

tctggctccg agctgggtaa acaagcaaaa gacattatgg atgctggcaa actggtcacc 180

gacgaactgg tgatcgcgct ggttaaagag cgcattgctc aggaagactg ccgtaatggt 240

ttcctgttgg acggcttccc gcgtaccatt ccgcaggcag acgcgatgaa agaagcgggc 300

atcaatgttg attacgttct ggaattcgac gtaccggacg aactgatcgt tgaccgtatc 360

gtcggtcgcc gcgttcatgc gccgtctggt cgtgtttatc acgttaaatt caatccgccg 420

aaagtagaag gcaaagacga cgttaccggt gaagaactga ctacccgtaa agatgatcag 480

gaagagaccg tacgtaaacg tctggttgaa taccatcaga tgacagcacc gctgatcggc 540

tactactcca aagaagcaga agcgggtaat accaaatacg cgaaagttga cggcaccaag 600

ccggttgctg aagttcgcgc tgatctggaa aaaatcctcg gctaa 645

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 14

Met Arg Ile Ile Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ala Gly Lys Gly Thr Gln

1 5 10 15

Ala Gln Phe Ile Met Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Ser Thr Gly

20 25 30

Asp Met Leu Arg Ala Ala Val Lys Ser Gly Ser Glu Leu Gly Lys Gln

35 40 45

Ala Lys Asp Ile Met Asp Ala Gly Lys Leu Val Thr Asp Glu Leu Val

50 55 60

Ile Ala Leu Val Lys Glu Arg Ile Ala Gln Glu Asp Cys Arg Asn Gly

65 70 75 80

Phe Leu Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Ile Pro Gln Ala Asp Ala Met

85 90 95

Lys Glu Ala Gly Ile Asn Val Asp Tyr Val Leu Glu Phe Asp Val Pro

100 105 110

Asp Glu Leu Ile Val Asp Arg Ile Val Gly Arg Arg Val His Ala Pro

115 120 125

Ser Gly Arg Val Tyr His Val Lys Phe Asn Pro Pro Lys Val Glu Gly

130 135 140

Lys Asp Asp Val Thr Gly Glu Glu Leu Thr Thr Arg Lys Asp Asp Gln

145 150 155 160

Glu Glu Thr Val Arg Lys Arg Leu Val Glu Tyr His Gln Met Thr Ala

165 170 175

Pro Leu Ile Gly Tyr Tyr Ser Lys Glu Ala Glu Ala Gly Asn Thr Lys

180 185 190

Tyr Ala Lys Val Asp Gly Thr Lys Pro Val Ala Glu Val Arg Ala Asp

195 200 205

Leu Glu Lys Ile Leu Gly

210

<210> 15

<211> 1428

<212> DNA

<213> 约氏不动杆菌

<400> 15

atggatacag aaacgatcgc cagtgcagtg ctgaatgaag aacagctttc actggactta 60

attgaagcgc aatatgcgtt gatgaatacc cgtgatcaga gcaatgcaaa aagtttagtg 120

attttggtca gtggaatcga acttgcgggt aaaggcgaag cggtgaaaca gctccgcgaa 180

tgggtcgatc ctcgtttttt atatgtcaaa gccgatccac cgcatctgtt taatctaaaa 240

cagccttttt ggcagcccta tacccgattt gtgcctgccg aagggcaaat tatggtgtgg 300

tttggtaatt ggtatgggga tttgttggct acggccatgc atgcttcaaa gcctttagat 360

gacactttgt ttgatgaata cgtcagcaat atgcgggctt ttgaacagga cttaaaaaat 420

aacaacgtag atgtcttaaa agtttggttc gatttgtcgt ggaagtctct gcaaaagcgt 480

ctagatgata tggacccgag cgaagtgcat tggcataagt tgcatgggct agactggcgc 540

aataaaaaac aatatgacac cttacaaaag ctacgtacgc gcttcaccga tgactggcaa 600

atcattgatg gtgaagatga ggatttgcgt aatcacaatt ttgcacaagc aattttaacg 660

gcactacgac actgcccaga gcatgaaaaa aaggccgcgc taaaatggca gcaagcacca 720

ataccagata ttctgactca gtttgaagtc cctcaagctg aggatgcgaa ctataaatca 780

gaattgaaaa aactcaccaa acaagtggcc gatgccatgc gctgtgatga ccgtaaagtg 840

gtgattgctt ttgaaggtat ggatgctgcg ggtaaagggg gggcgattaa gcgtattgtg 900

aaaaagctcg acccacgaga atatgaaatt cataccattg ccgcacctga aaaatatgag 960

ttacgccgtc cttatctgtg gcgtttttgg agcaaattgc agtcggatga catcactatt 1020

tttgatcgga cgtggtatgg acgcgtttta gtcgagcggg tagaaggctt cgcaaccgag 1080

gtagagtggc aacgcgctta tgcggaaatc aatcgttttg aaaaaaacct cagtagcagc 1140

caaaccgtgc tgattaagtt ttggctggcg attgataaag atgaacaagc agcgcgtttt 1200

aaagcccgcg aaagtactcc gcataaacgt tttaaaatta ccgaagaaga ttggcgcaat 1260

cgcgacaaat gggatgacta tttaaaggca gccgcggata tgtttgcgca taccgacacc 1320

agctatgcgc cttggtatat tatttccacc aatgataaac aacaggcccg cattgaagtc 1380

ttaagggcaa ttttaaaaca gctcaaagcg gatcgcgaca cggattaa 1428

<210> 16

<211> 475

<212> PRT

<213> 约氏不动杆菌

<400> 16

Met Asp Thr Glu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Asn Glu Glu Gln Leu

1 5 10 15

Ser Leu Asp Leu Ile Glu Ala Gln Tyr Ala Leu Met Asn Thr Arg Asp

20 25 30

Gln Ser Asn Ala Lys Ser Leu Val Ile Leu Val Ser Gly Ile Glu Leu

35 40 45

Ala Gly Lys Gly Glu Ala Val Lys Gln Leu Arg Glu Trp Val Asp Pro

50 55 60

Arg Phe Leu Tyr Val Lys Ala Asp Pro Pro His Leu Phe Asn Leu Lys

65 70 75 80

Gln Pro Phe Trp Gln Pro Tyr Thr Arg Phe Val Pro Ala Glu Gly Gln

85 90 95

Ile Met Val Trp Phe Gly Asn Trp Tyr Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ala

100 105 110

Met His Ala Ser Lys Pro Leu Asp Asp Thr Leu Phe Asp Glu Tyr Val

115 120 125

Ser Asn Met Arg Ala Phe Glu Gln Asp Leu Lys Asn Asn Asn Val Asp

130 135 140

Val Leu Lys Val Trp Phe Asp Leu Ser Trp Lys Ser Leu Gln Lys Arg

145 150 155 160

Leu Asp Asp Met Asp Pro Ser Glu Val His Trp His Lys Leu His Gly

165 170 175

Leu Asp Trp Arg Asn Lys Lys Gln Tyr Asp Thr Leu Gln Lys Leu Arg

180 185 190

Thr Arg Phe Thr Asp Asp Trp Gln Ile Ile Asp Gly Glu Asp Glu Asp

195 200 205

Leu Arg Asn His Asn Phe Ala Gln Ala Ile Leu Thr Ala Leu Arg His

210 215 220

Cys Pro Glu His Glu Lys Lys Ala Ala Leu Lys Trp Gln Gln Ala Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ile Leu Thr Gln Phe Glu Val Pro Gln Ala Glu Asp Ala

245 250 255

Asn Tyr Lys Ser Glu Leu Lys Lys Leu Thr Lys Gln Val Ala Asp Ala

260 265 270

Met Arg Cys Asp Asp Arg Lys Val Val Ile Ala Phe Glu Gly Met Asp

275 280 285

Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Lys Arg Ile Val Lys Lys Leu Asp

290 295 300

Pro Arg Glu Tyr Glu Ile His Thr Ile Ala Ala Pro Glu Lys Tyr Glu

305 310 315 320

Leu Arg Arg Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Ser Lys Leu Gln Ser Asp

325 330 335

Asp Ile Thr Ile Phe Asp Arg Thr Trp Tyr Gly Arg Val Leu Val Glu

340 345 350

Arg Val Glu Gly Phe Ala Thr Glu Val Glu Trp Gln Arg Ala Tyr Ala

355 360 365

Glu Ile Asn Arg Phe Glu Lys Asn Leu Ser Ser Ser Gln Thr Val Leu

370 375 380

Ile Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Lys Asp Glu Gln Ala Ala Arg Phe

385 390 395 400

Lys Ala Arg Glu Ser Thr Pro His Lys Arg Phe Lys Ile Thr Glu Glu

405 410 415

Asp Trp Arg Asn Arg Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Ala

420 425 430

Asp Met Phe Ala His Thr Asp Thr Ser Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile Ile

435 440 445

Ser Thr Asn Asp Lys Gln Gln Ala Arg Ile Glu Val Leu Arg Ala Ile

450 455 460

Leu Lys Gln Leu Lys Ala Asp Arg Asp Thr Asp

465 470 475

Claims

1.一种氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述工序A’是通过在选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及双功能谷胱甘肽合成酶中至少1种酶和三磷酸腺苷(ATP)的存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的工序A。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述工序A与将二磷酸腺苷(ADP)再生为ATP的ATP再生反应配合而进行。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶源自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述双功能谷胱甘肽合成酶源自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。

6.一种氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述工序B’是通过在谷胱甘肽合成酶和三磷酸腺苷(ATP)的存在下使氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸发生反应而生成氧化型谷胱甘肽的工序B。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述工序B与将二磷酸腺苷(ADP)再生为ATP的ATP再生反应配合而进行。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述谷胱甘肽合成酶源自大肠埃希氏菌。

10.根据权利要求6～9中任一项所述的方法，该方法还包括：

工序A’，通过使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸，

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述工序A’是通过在选自γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及双功能谷胱甘肽合成酶中至少1种酶和三磷酸腺苷(ATP)的存在下使L-胱氨酸与L-谷氨酸发生反应而生成氧化型γ-谷氨酰半胱氨酸的工序A。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述工序A与将二磷酸腺苷(ADP)再生为ATP的ATP再生反应配合而进行。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶源自大肠埃希氏菌。

14.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述双功能谷胱甘肽合成酶源自无乳链球菌。