JPWO2016002884A1 - 酸化型γ−グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、酸化型グルタチオンＧＳＳＧ及びその前駆体である酸化型γ−グルタミルシステインを簡便な工程により製造する方法を提供することを解決課題とする。本発明のＧＳＳＧの製造方法は、上記課題を解決する手段として、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させて酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’と、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させてＧＳＳＧを生成する工程Ｂ’とを含む。

Description

本発明は酸化型γ−グルタミルシステインを製造する方法に関する。

本発明はまた酸化型グルタチオンを製造する方法に関する。

グルタチオンは、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝など、生体にとって重要な化合物である。

グルタチオンは生体内で、Ｌ−システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型グルタチオン（Ｎ−（Ｎ−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシン、以下「ＧＳＨ」と称することがある）と、Ｌ−システイン残基のチオール基が酸化されグルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型グルタチオン（以下「ＧＳＳＧ」と称することがある）とのいずれかの形態で存在する。

ＧＳＳＧはＧＳＨよりも保存安定性が高いことが知られている（特許文献１等）。グルタチオンは生体内では通常還元型のＧＳＨとして存在している場合が多く、酵母等を用いてＧＳＨを大量生産することは容易であるのに対して、ＧＳＳＧを効率的に大量生産することは従来容易ではなかった。ＧＳＨを先に製造し、それを化学的又は生物的な手法で酸化させてＧＳＳＧを得ることが従来一般的であった。例えば特許文献１では、先にＧＳＨを含む酵母エキスを製造し、次いで酵母エキスのｐＨを６以上１１未満に調整し、溶存酸素の存在下にＧＳＨをＧＳＳＧに変換するという方法が開示されている。

特許第３１６０３３５号公報 特表２０１３−５０５７１２号公報 特開２０１３−１８８１７７号公報

本発明はＧＳＳＧ及びその前駆体化合物を簡便な工程により製造する方法を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは比較的安価なＬ−シスチンを原料として、ＧＳＳＧ及びその前駆体である酸化型γ−グルタミルシステインを簡便な工程により製造することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお、Ｌ−シスチンは、Ｌ−システインのチオール基が酸化されて２分子のＬ−システインがジスルフィド結合を介して結合してなる化合物である。Ｌ−シスチンは、Ｌ−システインを製造するための原料として用いられる例（特許文献２）や、乳酸菌発酵によるＧＳＨ生産のための原料として用いられる例（特許文献３）が知られているが、Ｌ−シスチンから直接ＧＳＳＧを製造する方法は存在しなかった。

本発明は具体的には以下の発明を包含する。

（１）γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ，アデノシン５’−三リン酸ともいう）との存在下で、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａを含むことを特徴とする、酸化型γ−グルタミルシステインの製造方法。

本発明により比較的安価なＬ−シスチンから酸化型γ−グルタミルシステインを直接製造することができる。

（２）前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ，アデノシン５’−二リン酸ともいう）をＡＴＰへと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（１）に記載の方法。

工程ＡはＡＴＰを消費してＡＤＰを生成するが、本発明によればＡＴＰを再生しながら、工程Ａを持続的に行うことが可能である。

（３）前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来である、（１）又は（２）に記載の方法。

このようなγ−グルタミルシステイン合成酵素は、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸から酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（４）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（１）又は（２）に記載の方法。

このような２機能性グルタチオン合成酵素は、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸から酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（５）グルタチオン合成酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との存在下で、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成する工程Ｂを含むことを特徴とする、酸化型グルタチオンの製造方法。

本発明によれば酸化型グルタチオンを簡便な工程で製造することができる。

（６）前記工程Ｂが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をＡＴＰへと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（５）に記載の方法。

工程ＢはＡＴＰを消費してＡＤＰを生成するが、本発明によればＡＴＰを再生しながら、工程Ｂを持続的に行うことが可能である。

（７）前記グルタチオン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来である、（５）又は（６）に記載の方法。

このようなグルタチオン合成酵素は、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンから酸化型グルタチオンを生成する活性が特に高いため好ましい。

（８）γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との存在下で、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａを更に含み、
前記工程Ｂに用いられる酸化型γ−グルタミルシステインが、前記工程Ａにより生成されたものである、
（５）〜（７）のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、比較的安価なＬ−シスチンから酸化型グルタチオンを簡便な工程により製造することができる。

（９）前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をＡＴＰへと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、（８）に記載の方法。

工程ＡはＡＴＰを消費してＡＤＰを生成するが、本発明によればＡＴＰを再生しながら、工程Ａを持続的に行うことが可能である。

（１０）前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来である、（８）又は（９）に記載の方法。

このようなγ−グルタミルシステイン合成酵素は、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸から酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（１１）前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、（８）又は（９）に記載の方法。

このような２機能性グルタチオン合成酵素は、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸から酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性が特に高いため好ましい。

（１２）Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする、酸化型γ−グルタミルシステインの製造方法。

本発明により比較的安価なＬ−シスチンから酸化型γ−グルタミルシステインを直接製造することができる。本発明では、より好ましくは、前記工程Ａ’が（１）に記載の前記工程Ａである。

（１３）酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする、酸化型グルタチオンの製造方法。

本発明によれば酸化型グルタチオンを簡便な工程で製造することができる。本発明では、より好ましくは、前記工程Ｂ’が（５）に記載の前記工程Ｂである。

（１４）Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を更に含み、
前記工程Ｂ’に用いられる酸化型γ−グルタミルシステインが、前記工程Ａ’により生成されたものである、（１３）に記載の方法。

本発明によれば、比較的安価なＬ−シスチンから酸化型グルタチオンを簡便な工程により製造することができる。本発明では、より好ましくは、前記工程Ａ’が（１）に記載の前記工程Ａである。

なお、本明細書において「Ｌ−シスチン」、「Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」「酸化型γ−グルタミルシステイン」、「酸化型グルタチオン」、「Ｌ−システイン」、「γ−グルタミルシステイン」、「グルタチオン」、「アデノシン三リン酸」、「アデノシン二リン酸」、「アデノシン一リン酸」、「ポリリン酸」、「縮合リン酸」等の各用語は、それぞれ、各化合物の形態を限定するものではなく、フリー体の形態であってもよいし、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態や、水和物等の溶媒和物の形態や、電離したイオンの形態である場合も包含する。

酸化型γ−グルタミルシステインのフリー体は次式で表される化合物である：
酸化型グルタチオンのフリー体は次式で表される化合物である：

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１４−１３７２０２号の開示内容を包含する。

本発明によれば、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）及び酸化型γ−グルタミルシステインを安価な原料を用いて簡便な工程により生産することが可能である。

＜本発明で用いる酵素＞
本明細書では、γ−グルタミルシステイン合成酵素を「ＧＳＨ Ｉ」、グルタチオン合成酵素を「ＧＳＨ ＩＩ」、２機能性グルタチオン合成酵素を「ＧＳＨ Ｆ」、アデニル酸キナーゼを「ＡＤＫ」、ポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼを「ＰＡＰ」とそれぞれ略記する場合がある。

＜ＧＳＨ Ｉ＞
本発明に用いられるγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ Ｉ）は、ＡＴＰの存在下でＬ−Ｃｙｓを基質として認識し、Ｌ−Ｇｌｕと結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性を、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのγ−グルタミルシステインを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。本発明では、γ−グルタミルシステイン合成酵素が、ＡＴＰの存在下で、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性も有するという新たな知見を利用する。

（測定条件）
１０ｍＭ ＡＴＰ、１５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１５ｍＭ Ｌ−システイン、１０ｍＭ 硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ 塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のγ−グルタミルシステインを定量する。

上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この条件では、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、還元型γ−グルタミルシステイン（γ−ＧＣ）、酸化型γ−ＧＣ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の順で溶出する。
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：ＯＤＳ−ＨＧ−３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解した後、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ

ＧＳＨ Ｉとしてはタンパク質１ｍｇあたりのγ−グルタミルシステイン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＧＳＨ Ｉの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨ Ｉが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨ Ｉが好ましい。

エシェリヒア・コリ由来のＧＳＨ Ｉの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１及び配列番号９に示す。

ＧＳＨ Ｉとしてはまた、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ Ｉに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨ Ｉ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨ Ｉ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ Ｉを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドであり、好ましくは、ＡＴＰの存在下でＬ−シスチンとＬ−グルタミン酸とから酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性に関して、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ Ｉを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨ Ｉ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号９に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨ Ｉ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上のポリペプチドを用いることができる。該断片もまたＡＴＰの存在下でＬ−シスチンとＬ−グルタミン酸とから酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性を有する。本明細書において「複数個」とは、例えば、２〜２０個、２〜１５個、２〜１０個、２〜７個、２〜５個、２〜４個又は２〜３個をいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号９に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。アミノ酸同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる（Karlin，S．et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877；Altschul，S．F．et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410；Pearson，W．R．et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448）。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＧＳＨ Ｉの調製に用いることができる、ＧＳＨ Ｉをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨ Ｉのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＧＳＨ ＩＩ＞
本発明に用いられるグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ ＩＩ）は、ＡＴＰの存在下でγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを基質として認識し、Ｇｌｙと結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をグルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタチオンを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。本発明では、グルタチオン合成酵素が、ＡＴＰの存在下で、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成する活性も有するという新たな知見を利用する。

（測定条件）
１０ｍＭ ＡＴＰ、１５ｍＭ γ−グルタミルシステイン、１５ｍＭ グリシン、１０ｍＭ 硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ 塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。

高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＧＳＨ Ｉの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。

ＧＳＨ ＩＩとしてはタンパク質１ｍｇあたりのグルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＧＳＨ ＩＩの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨ ＩＩが好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するＧＳＨ ＩＩが好ましい。

エシェリヒア・コリ由来のＧＳＨ ＩＩの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号４及び配列番号１０に示す。

ＧＳＨ ＩＩとしてはまた、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ ＩＩに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨ ＩＩ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨ ＩＩ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ ＩＩを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドであり、好ましくは、ＡＴＰの存在下で酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとから酸化型グルタチオンを生成する活性に関して、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ ＩＩを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨ ＩＩ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨ ＩＩ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは１５０以上、より好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上のポリペプチドを用いることができる。該断片もまたＡＴＰの存在下で酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとから酸化型グルタチオンを生成する活性を有する。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１０に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＧＳＨ ＩＩの調製に用いることができる、ＧＳＨ ＩＩをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号４に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨ ＩＩのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＧＳＨ Ｆ＞
本発明に用いられる２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ Ｆ）は、ＡＴＰ存在下でＬ−Ｃｙｓを基質として認識し、Ｌ−Ｇｌｕと結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを生成する反応を触媒する活性及びＡＴＰ存在下でγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを基質として認識し、Ｇｌｙと結合させることでγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を併せ持つ酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性を、２機能性グルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）を生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。本発明では、２機能性グルタチオン合成酵素が、ＡＴＰの存在下で、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性も有するという新たな知見を利用する。

（測定条件）
１０ｍＭ ＡＴＰ、１５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１５ｍＭ Ｌ−システイン、１５ｍＭ グリシン、１０ｍＭ 硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ 塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。

高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＧＳＨ Ｉの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。

ＧＳＨ Ｆとしてはタンパク質１ｍｇあたりの２機能性グルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＧＳＨ Ｆの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のＧＳＨ Ｆが好ましい。特に細菌由来ＧＳＨ Ｆが好ましく、具体的には、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌；デスルフォタレア・サイクロフィラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）等のデスルフォタレア（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）属細菌；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）等のパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属細菌；マンハイミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｅｃｅｎｓ）等のマンハイミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌；及び、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）等のヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌からなる群から選択される少なくとも１種に由来するＧＳＨ Ｆが好ましい。

ストレプトコッカス・アガラクチエ由来のＧＳＨ Ｆの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示す。また、配列番号７の第４塩基〜第２２５３塩基からなる塩基配列は、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるストレプトコッカス・アガラクチエ由来ＧＳＨ Ｆをコードする塩基配列であって、大腸菌でのコドン使用頻度に適合させた塩基配列の例である。

ＧＳＨ Ｆとしてはまた、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ Ｆに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＧＳＨ Ｆ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＧＳＨ Ｆ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ Ｆを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドであり、好ましくは、ＡＴＰの存在下でＬ−シスチンとＬ−グルタミン酸とから酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性に関して、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるＧＳＨ Ｆを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＧＳＨ Ｆ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１２に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１２に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＧＳＨ Ｆ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上、より好ましくは６００以上、より好ましくは７００以上、より好ましくは７３０以上のポリペプチドを用いることができる。該断片もまたＡＴＰの存在下でＬ−シスチンとＬ−グルタミン酸とから酸化型γ−グルタミルシステインを生成する活性を有する。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１２に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＧＳＨ Ｆの調製に用いることができる、ＧＳＨ Ｆをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１１に示す塩基配列には限定されず、目的とするＧＳＨ Ｆのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＡＤＫ＞
本発明に用いられるアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）は、２分子のＡＤＰからＡＴＰ、ＡＭＰを１分子ずつ生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をＡＤＫ活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのＡＭＰを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。

（測定条件）
１０ｍＭ ＡＤＰ、７０ｍＭ 硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ 塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のＡＭＰを定量した。

上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この条件ではアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（５’−アデニル酸）（ＡＭＰ）の順で溶出する。
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：ＯＤＳ−ＨＧ−３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解した後、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ

ＡＤＫとしてはタンパク質１ｍｇあたりのＡＤＫ活性（比活性）が２０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＡＤＫの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来ＡＤＫが好ましい。特に細菌由来ＡＤＫが好ましく、具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ＡＤＫが好ましい。

エシェリヒア・コリ由来のＡＤＫの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示す。

ＡＤＫとしてはまた、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるＡＤＫに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるＡＤＫを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＡＤＫ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１４に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＡＤＫ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは１００以上、より好ましくは１５０以上、より好ましくは２００以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１４に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＡＤＫの調製に用いることができる、ＡＤＫをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１３に示す塩基配列には限定されず、目的とするＡＤＫのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜ＰＡＰ＞
本発明に用いられるポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）は、ポリリン酸をリン酸ドナーとしてＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する反応を触媒する活性を有する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本発明において、当該活性をＰＡＰ活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのＡＤＰを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。

（測定条件）
５ｍＭ メタリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、７０ｍＭ 硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ 塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のＡＤＰを定量した。

高速液体クロマトグラフィーの条件は、ＡＤＫの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。

ＰＡＰとしてはタンパク質１ｍｇあたりのＰＡＰ活性（比活性）が２０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。

ＰＡＰの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来ＰＡＰが好ましい。特に細菌由来ＰＡＰが好ましく、具体的にはアシネトバクター・ジョンソニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来ＰＡＰが好ましい。

アシネトバクター・ジョンソニ由来のＰＡＰの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６に示す。また、配列番号８の第４塩基〜第１４２８塩基からなる塩基配列は、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるアシネトバクター・ジョンソニ由来ＰＡＰをコードする塩基配列であって、大腸菌でのコドン使用頻度に適合させた塩基配列の例である。

ＰＡＰとしてはまた、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＰＡＰに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＰＡＰを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体、他種オルソログ等の、ＰＡＰ活性を有する他のポリペプチドには、例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１６に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）や、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。更に、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１６に示すアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなる前記ポリペプチド、並びに、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して前記のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなる前記ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの、ＰＡＰ活性を有する断片も、前記他のポリペプチドとして使用することができ、該断片としては、アミノ酸数が好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは４５０以上のポリペプチドを用いることができる。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１６に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。ここで「複数個」の好適な範囲、アミノ酸同一性の算出方法、保存的アミノ酸置換についてはＧＳＨ Ｉに関して説明した通りである。前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。

ＰＡＰの調製に用いることができる、ＰＡＰをコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列は、配列番号１５に示す塩基配列には限定されず、目的とするＰＡＰのアミノ酸配列をコードする、宿主生物の種類に応じた適当な塩基配列であることができる。

＜酵素の調製＞
本発明で用いる上記の各酵素を取得する方法は特に限定されない。上記各酵素は該酵素の活性を有する生物、例えば微生物の野生株又は変異株から調製することができる。目的とする酵素の活性を有する生物としては、本来的に該酵素の活性を有する生物と、該酵素の活性が増強された生物とのどちらでもよい。酵素の活性が増強された生物としては、遺伝子工学の手法により上記各酵素をコードする遺伝子の発現が増強された組換え生物細胞が挙げられる。なお「酵素の活性が増強された生物」とは、本来的に該酵素の活性を有する生物において該酵素の活性が増大された生物と、本来的には該酵素の活性を有さない生物において該酵素の活性が付与された生物との両方を包含する。

遺伝子工学の手法を用いて得られる組換え生物細胞とは、典型的には、目的の酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を適当なベクターに挿入して組換えベクターとし、該組換えベクターにより適当な宿主生物細胞を形質転換して得られる、該酵素を生産する能力を有する組換え生物細胞である。該組換え生物細胞を培養することにより目的とする上記各酵素を製造することができる。宿主生物細胞としては細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率の観点から細菌が好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。

＜工程Ａ及び工程Ａ’＞
本発明による酸化型γ−グルタミルシステインの製造方法は、γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素とＡＴＰとの存在下で、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａを含むことを特徴とする。

本発明による酸化型γ−グルタミルシステインの製造方法はまた、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする。工程Ａ’は酵素反応により行ってもよいし、酵素を用いず化学的な反応により行ってもよいが、好ましくは酵素反応により行う工程であり、特に好ましくは前記工程Ａである。酵素反応によれば基質化合物の官能基による保護等が不要であることや、反応の特異性が高いことなどの理由で化学的合成反応よりも有利である。

酵素を用いない化学的な反応による工程Ａ’としては、特に限定されないが、例えば、２つのカルボキシル基を適当な保護基で保護したＬ−シスチンと、α−カルボキシル基及びアミノ基を適当な保護基で保護したＬ−グルタミン酸とを反応させて、Ｌ−シスチン１分子中の２つのアミノ基の各々に対し１分子のＬ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成する工程が挙げられる。該工程では脱水縮合反応後に必要に応じて保護基の１つ以上を脱保護する。カルボキシル基に対する保護基としてはベンジル基等の公知のカルボキシル基用保護基が使用でき、アミノ基に対する保護基としてはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の公知のアミノ基用保護基が使用できる。

工程ＡにおいてＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆは、ＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆ活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の粉砕物（破砕物と同義）の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。好ましくは、工程ＡにおいてＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、工程ＡにおいてＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。特に、細胞外に存在するＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆ、具体的には、前記細胞の粉砕物の形態のＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆ、又は、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態のＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆを用いる場合、生細胞を用いる場合と比較して、反応混合液中で原料であるＬ−シスチン及び生成物である酸化型γ−グルタミルシステインが酸化型のまま保持され易いと考えられ、酸化型γ−グルタミルシステインを効率的に得ることができるため好ましい。細胞外に存在するＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆを工程Ａに用いる場合、反応系内に生細胞による還元作用が存在しないため上記の作用が生じると推定される。この傾向は反応混合液が空気と接触する条件にあるときに特に顕著である。また、ＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆを、当該活性を有する生細胞の形態で工程Ａに用いる場合は、反応系中でアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が分解され易い傾向がある。ＡＭＰは後述するＡＴＰ再生反応の中間体の１つであるため、ＡＭＰが分解されると、ＡＴＰ再生反応の効率が低下する。一方、細胞外に存在するＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆを工程Ａに用いる場合はＡＭＰの分解が生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。すなわち、細胞外に存在するＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆを用いて本発明の工程Ａを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制と酸化型γ−グルタミルシステインの還元抑制を両立させることが可能となる。

本明細書において細胞の「粉砕」（「破砕」と同義）とは、細胞内で形成された酵素が細胞外からアクセス可能な程度に細胞の表面構造に損傷を与える処理を指し、必ずしも細胞が断片化される必要はない。本明細書において細胞の「粉砕物」（「破砕物」）は、粉砕処理された細胞の処理物を指す。細胞の粉砕処理（破砕処理）は、１つ又は複数の粉砕処理を適当な順序で行うことにより実施できる。細胞の粉砕処理としては、物理的処理、化学的処理、酵素的処理等を挙げることができる。物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、或いは、これらの組み合わせを挙げることができる。上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。上記酵素的処理としては、例えば、リゾチーム、ザイモリアーゼ、グルカナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ等を用いる方法や、これらの組み合わせを挙げることができる。

工程Ａ及び／又は工程Ａ’において基質として用いるＬ−シスチン及びＬ−グルタミン酸並びに工程Ａに用いるＡＴＰはそれぞれ塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物の形態等の各種の形態で反応系中に添加することができる。

工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応系（例えば反応混合液）中にはＬ−システインは実質的に含まれず、具体的には、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応系中では、Ｌ−シスチンとＬ−システインとの総モル量に対してＬ−シスチンが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。Ｌ−シスチンとＬ−システインとの総モル量に対するＬ−シスチンの割合が前記範囲内であるという要件は、少なくとも工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応開始時において満足されることが好ましく、工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応開始時から反応後までの期間に満足されることがより好ましい。

工程Ａでは、ＧＳＨ Ｉ及び／又はＧＳＨ Ｆを、ＡＴＰの存在下でＬ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを含む反応系に作用させる。反応は適当なｐＨに調整された水等の溶媒を含む反応混合液中で行うことができる。このときの条件としては特に限定されないが、基質濃度（Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸との合計濃度）は好ましくは約０．１〜９９重量％、より好ましくは１〜２０重量％とすることができる。反応開始時の基質中のＬ−シスチンとＬ−グルタミン酸との量比は、Ｌ−シスチン１モルに対してＬ−グルタミン酸を２モル前後とすることができ、例えばＬ−シスチン１モルに対してＬ−グルタミン酸を１〜４モル、好ましくは１．５〜３モルとすることができる。反応温度は好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜５０℃とすることができる。反応のｐＨは好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜９とすることができる。反応時間は好ましくは１〜１２０時間、より好ましくは１〜７２時間とすることができる。反応混合液が空気と接触した状態で工程Ａ及び／又は工程Ａ’の反応を進める場合、原料であるＬ−シスチン及び生成物である酸化型γ−グルタミルシステインが酸化型のまま保持され易いため好ましい。工程Ａ及び／又は工程Ａ’での反応後の反応系（例えば反応混合液）中には還元型γ−グルタミルシステインは実質的に含まれず、具体的には、工程Ａ及び／又は工程Ａ’での反応後の反応系中には、酸化型γ−グルタミルシステインと還元型γ−グルタミルシステインとの総モル量に対して酸化型γ−グルタミルシステインが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。

反応混合液中の各酵素の濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程ＡにＧＳＨ Ｉが用いられる場合、工程Ａ反応混合液中のＧＳＨ Ｉ活性は特に限定されないが下限は０．１Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は１００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。工程ＡにＧＳＨ Ｆが用いられる場合、工程Ａ反応混合液中のＧＳＨ Ｆ活性は特に限定されないが下限は０．１Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は１００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。

反応混合液中のＡＴＰの濃度は、基質であるシスチンの濃度やＡＴＰ再生系の有無に応じて適宜調整することができる。工程Ａにおいて、ＡＴＰはシスチンに対しモル比で２倍消費される。工程ＡをＡＴＰ再生反応と共役させて実施する場合は、シスチンに対するＡＴＰの添加量を大幅に低減することができる。そこで、工程Ａにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の上限は特に限定されないが、シスチン濃度に対してモル濃度比で４倍以下が好ましく、２．２倍以下がより好ましい。また、工程Ａにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の下限は特に限定されないが、シスチン濃度に対してモル濃度比で０．０００１倍以上が好ましく、０．００１倍以上がより好ましく、０．０１倍以上が更に好ましい。

＜工程Ｂ及び工程Ｂ’＞
本発明による酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の製造方法は、グルタチオン合成酵素(ＧＳＨ ＩＩ)とＡＴＰとの存在下で、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成する工程Ｂを含むことを特徴とする。

本発明によるＧＳＳＧの製造方法はまた、ＧＳＨ ＩＩとＡＴＰとの存在下で、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする。工程Ｂ’は酵素反応により行ってもよいし、酵素を用いず化学的な反応により行ってもよいが、好ましくは酵素反応により行う工程であり、特に好ましくは前記工程Ｂである。酵素反応によれば基質化合物の官能基による保護等が不要であることや、反応の特異性が高いことなどの理由で化学的合成反応よりも有利である。

酵素を用いない化学的な反応による工程Ｂ’としては、特に限定されないが、例えば、Ｌ−グルタミン酸残基中のα−カルボキシル基及びアミノ基を適当な保護基で保護した酸化型γ−グルタミルシステインと、カルボキシル基を適当な保護基で保護したグリシンとを反応させて、酸化型γ−グルタミルシステイン１分子中の２つのカルボキシル基の各々に対して１分子のグリシンのアミノ基を脱水縮合させてペプチド結合を形成する工程が挙げられる。該工程では脱水縮合反応後に必要に応じて保護基の１つ以上を脱保護する。カルボキシル基に対する保護基としてはベンジル基等の公知のカルボキシル基用保護基が使用でき、アミノ基に対する保護基としてはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の公知のアミノ基用保護基が使用できる。

工程ＢにおいてＧＳＨ ＩＩは、ＧＳＨ ＩＩ活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＧＳＨ ＩＩが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の粉砕物（破砕物と同義）の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＧＳＨ ＩＩ活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。細胞の「粉砕物」については既述の通りである。好ましくは、工程ＢにおいてＧＳＨ ＩＩ活性を有する生細胞を用いない。好ましくは、工程ＢにおいてＧＳＨ ＩＩ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、工程ＢにおいてＧＳＨ ＩＩ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。特に、細胞外に存在するＧＳＨ ＩＩ、具体的には、前記細胞の粉砕物の形態のＧＳＨ ＩＩ、又は、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態のＧＳＨ ＩＩを用いる場合、生細胞を用いる場合と比較して、反応混合液中で原料である酸化型γ−グルタミルシステイン及び生成物である酸化型グルタチオンが酸化型のまま保持され易いと考えられ、酸化型グルタチオンを効率的に得ることができるため好ましい。細胞外に存在するＧＳＨ ＩＩを工程Ｂに用いる場合、反応系内に生細胞による還元作用が存在しないため上記の作用が生じると推定される。この傾向は反応混合液が空気と接触する条件にあるときに特に顕著である。また、ＧＳＨ ＩＩを、当該活性を有する生細胞の形態で工程Ｂに用いる場合は反応系中でアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が分解され易い傾向がある。ＡＭＰが分解されると、ＡＴＰ再生反応の効率が低下する。一方、細胞外に存在するＧＳＨ ＩＩを工程Ｂに用いる場合はＡＭＰの分解が生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。すなわち、細胞外に存在するＧＳＨ ＩＩを用いて本発明の工程Ｂを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制と、酸化型グルタチオン及び酸化型γ−グルタミルシステインの還元抑制とを両立させることが可能となる。

工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’において基質として用いる酸化型γ−グルタミルシステイン及びグリシン並びに工程Ｂに用いるＡＴＰはそれぞれ塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物の形態等の各種の形態で反応系中に添加することができる。

工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応系（例えば反応混合液）中には還元型γ−グルタミルシステインは実質的に含まれず、具体的には、工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応系中では、酸化型γ−グルタミルシステインと還元型γ−グルタミルシステインとの総モル量に対して酸化型γ−グルタミルシステインが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。酸化型γ−グルタミルシステインと還元型γ−グルタミルシステインとの総モル量に対する酸化型γ−グルタミルシステインの割合が前記範囲内であるという要件は、少なくとも工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応開始時において満足されることが好ましく、工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応開始時から反応後までの期間に満足されることがより好ましい。

工程Ｂでは、ＧＳＨ ＩＩを、ＡＴＰの存在下で酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを含む反応系に作用させる。反応は適当なｐＨに調整された水等の溶媒を含む反応混合液中で行うことができる。このときの条件としては特に限定されないが、基質濃度（酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとの合計濃度）は好ましくは約０．１〜９９重量％、より好ましくは１〜２０重量％とすることができる。反応開始時の基質中の酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとの量比は、酸化型γ−グルタミルシステイン１モルに対してグリシンを２モル前後とすることができ、例えば酸化型γ−グルタミルシステイン１モルに対してグリシンを１〜４モル、好ましくは１．５〜３モルとすることができる。反応温度は好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜５０℃とすることができる。反応のｐＨは好ましくは４〜１１、より好ましくは６〜９とすることができる。反応時間は好ましくは１〜１２０時間、より好ましくは１〜７２時間とすることができる。反応混合液が空気と接触した状態で工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’の反応を進める場合、原料である酸化型γ−グルタミルシステインと生成物である酸化型グルタチオンが酸化型のまま保持され易いため好ましい。工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’での反応後の反応系（例えば反応混合液）中には還元型グルタチオンは実質的に含まれず、具体的には、工程Ｂ及び／又は工程Ｂ’での反応後の反応系中には、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの総モル量に対して酸化型グルタチオンが７０モル％以上、より好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、更に好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、最も好ましくは１００モル％含まれる。

工程Ｂで原料となる酸化型γ−グルタミルシステインは上記工程Ａにより得ることができる。工程Ａ終了後の反応混合物から酸化型γ−グルタミルシステインを分離し、工程Ｂに用いてもよいし、酸化型γ−グルタミルシステインを分離することなく、工程Ａ終了後の反応混合物にＧＳＨ ＩＩとグリシンとを追加して工程Ｂを行ってもよい。或いは、工程Ａを、ＧＳＨ ＩＩとグリシンの各要素のうち少なくとも１つが不足し工程Ｂが進行しない条件で行い、次いで工程Ａ終了後の反応混合液から酸化型γ−グルタミルシステインを分離することなく前記不足していた要素を反応混合液に追加して工程Ｂを行ってもよい。

また工程Ａの反応と工程Ｂの反応とは順次行う必要はなく同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ−シスチンと、Ｌ−グルタミン酸と、グリシンとを含む原料混合物を、工程Ａに用いる上記酵素と工程Ｂに用いる上記酵素とＡＴＰとの存在下で反応させてもよい。この実施形態もまた、工程Ｂに原料として用いられる酸化型γ−グルタミルシステインが工程Ａにより生成されたものである本発明の実施形態の１つである。

同様に、工程Ｂ’で原料となる酸化型γ−グルタミルシステインは上記工程Ａ’により得ることができる。工程Ａ’終了後の反応混合物から酸化型γ−グルタミルシステインを分離し、工程Ｂ’に用いてもよいし、酸化型γ−グルタミルシステインを分離することなく、工程Ａ’終了後の反応混合物にグリシンを追加し適宜反応条件を調整して工程Ｂ’を行ってもよい。また、工程Ａ’の反応と工程Ｂ’の反応とは順次行う必要はなく同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ−シスチンと、Ｌ−グルタミン酸と、グリシンとを含む原料混合物を反応させてもよい。この実施形態もまた、工程Ｂ’に原料として用いられる酸化型γ−グルタミルシステインが工程Ａ’により生成されたものである本発明の実施形態の１つである。

反応混合液中の各酵素の濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程ＢにＧＳＨ ＩＩが用いられる場合、工程Ｂの反応混合液中のＧＳＨ ＩＩ活性は特に限定されないが下限は０．１Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は１００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。

反応混合液中のＡＴＰの濃度は、基質である、酸化型γ−グルタミルシステインの濃度やＡＴＰ再生系の有無に応じて適宜調整することができる。工程Ｂにおいて、ＡＴＰは、酸化型γ−グルタミルシステインに対しモル比で２倍消費される。工程ＢをＡＴＰ再生反応と共役させて実施する場合は、酸化型γ−グルタミルシステインに対するＡＴＰの添加量を大幅に低減することができる。そこで、工程Ｂにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の上限は特に限定されないが、酸化型γ−グルタミルシステイン濃度に対してモル濃度比で４倍以下が好ましく、２．２倍以下がより好ましい。また、工程Ｂにおける反応混合液中のＡＴＰ濃度の下限は特に限定されないが、酸化型γ−グルタミルシステイン濃度に対してモル濃度比で０．０００１倍以上が好ましく、０．００１倍以上がより好ましく、０．０１倍以上が更に好ましい。

＜ＡＴＰ再生反応＞
工程Ａ及びＢはいずれもＡＴＰを消費しＡＤＰを生成する工程である。ＡＴＰは比較的高価な原料であるため、工程Ａ及びＢを、該工程で生じたＡＤＰからＡＴＰを再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行うことが好ましい。

ＡＴＰ再生反応としては、リン酸基供給源とホスホトランスフェラーゼとを用いてＡＤＰをＡＴＰへと再生する反応が挙げられる。

ＡＴＰ再生反応のスキームの一例を以下に示す。該スキームは、リン酸基供給源としてポリリン酸（縮合リン酸）を用い、ホスホトランスフェラーゼとして、ポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）とアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）との組み合わせを用いるＡＴＰ再生反応のスキームである。

スキームにおいて、ＡＭＰはアデノシン一リン酸を示し、ＰＡＰはポリリン酸依存的ＡＭＰトランスフェラーゼを示し、ＡＤＫはアデニル酸キナーゼを示し、ＰｏｌｙＰ_ｎはリン原子がｎ個のポリリン酸（縮合リン酸）を示し、ＰｏｌｙＰ_ｎ-1はリン原子がｎ−１個のポリリン酸（縮合リン酸）を示し、「反応原料」は工程Ａ又はＢでの反応原料を示し、「生成物」は工程Ａ又はＢでの生成物を示す。

すなわち、工程Ａ及びＢをポリリン酸とＰＡＰとＡＤＫとの存在下で行うことにより、ＡＴＰが消費されて生じたＡＤＰはＡＤＫの作用によりＡＴＰとＡＭＰとに変換され、ＡＤＫの作用により生じたＡＭＰはＰＡＰの作用によりＡＤＰに変換される。このＡＴＰ再生反応は工程Ａ及びＢの反応と共役することができる。

ＡＤＫ及びＰＡＰとしては、各酵素の活性を有する生物の細胞を生細胞のまま用いてもよいし、死滅しているが損傷していない前記細胞の形態で用いてもよいし、ＡＤＫ及び／又はＰＡＰが細胞外に存在する形態、具体的には、前記生物の細胞の粉砕物（破砕物と同義）の形態で用いてもよいし、前記細胞から分離され精製されたタンパク質の形態で用いてもよい。ここでＡＤＫ又はＰＡＰの各活性を有するタンパク質の精製の程度は特に限定されず、粗精製であってもよい。細胞の「粉砕物」については既述の通りである。好ましくは、工程Ａ又はＢにおいてＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有する生細胞を用いず、より好ましくは、工程Ａ又はＢにおいてＡＤＫ及び／又はＰＡＰ活性を有する生細胞及び損傷していない死滅細胞を用いない。

ＡＴＰ再生反応で用いる酵素としては、細胞外に存在するＡＤＫ及び／又はＰＡＰ、具体的には、前記細胞の粉砕物の形態のＡＤＫ及び／又はＰＡＰ、又は、前記細胞から分離されたタンパク質の形態のＡＤＫ及び／又はＰＡＰを用いることが好ましい。ＡＤＫ及び／又はＰＡＰを、当該活性を有する生細胞の形態でＡＴＰ再生反応に用いる場合はＡＭＰが分解され易い傾向がある。ＡＭＰが分解されると、ＡＴＰ再生反応の効率が低下する。一方、細胞外に存在するＡＤＫ及び／又はＰＡＰをＡＴＰ再生反応に用いる場合はＡＭＰの分解は生じ難く、ＡＴＰ再生反応を効率的に進めることができるため好ましい。なお、生細胞を用いず工程Ａ及び／又は工程Ｂを行う場合、生細胞による還元作用が存在しないために、酸化型γ−グルタミルシステイン及び／又は酸化型グルタチオンの還元を抑制することができ有利である。すなわち、細胞外に存在するＡＤＫ及び／又はＰＡＰをＡＴＰ再生反応に用い本発明の工程Ａ及び／又は工程Ｂを行うことにより、ＡＭＰの分解抑制と酸化型γ−グルタミルシステイン及び／又は酸化型グルタチオンの還元抑制を両立させることが可能となる。

ＡＴＰ再生反応に用いる各酵素の反応混合液中での濃度は適宜調整することができ、例えば各酵素のタンパク質濃度として下限が１μｇ／ｍｌ以上、上限は特に設けないが好ましくは１００ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で適宜調整することができる。工程Ａ又はＢにＡＴＰ再生反応を共役させる場合、反応混合液中のＡＤＫ活性は特に限定されないが下限は５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は５０００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができ、反応混合液中のＰＡＰ活性は特に限定されないが下限は１Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、上限は特に設けないが通常は１０００００Ｕ／ｍｌ以下とすることができる。

ポリリン酸（縮合リン酸）添加量は反応基質の量に応じて適宜調節すればよい。ポリリン酸はナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態、フリー体の形態、水和物等の溶媒和物の形態等の各種の形態で添加することができる。ポリリン酸の重合度（１分子あたりのリン原子数）は特に限定されない。なお、実施例及び比較例で使用したメタリン酸Ｎａは種々の重合度の縮合リン酸ナトリウム塩の混合物であった。

＜実験１＞
大腸菌Ｋ１２株由来γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ Ｉ）の調製
大腸菌Ｋ１２株に由来するＧＳＨ Ｉ遺伝子（配列番号１）のＮ末端部分の塩基配列に制限酵素ＳａｃＩの切断部位及びＳＤ配列を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列番号２）と、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＫｐｎＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列番号３）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでＧＳＨ Ｉ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。このときＰＣＲ増幅に用いた鋳型は大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡである。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、ＧＳＨ Ｉ遺伝子の全長（配列番号１）が含まれていることを確認した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ０９１３６）のｌａｃプロモーターの下流のＳａｃＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＵＣＧＳＨＩを構築した。この組換えベクターｐＵＣＧＳＨＩを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＧＳＨＩ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨ Ｉ活性は５Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜実験２＞
大腸菌Ｋ１２株由来グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ ＩＩ）の調製
大腸菌Ｋ１２株に由来するＧＳＨ ＩＩ遺伝子（配列番号４）のＮ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列番号５）と、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させた配列をもつＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列番号６）を調製した。このＤＮＡプライマーを用いて、この配列の間のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することでＧＳＨ ＩＩ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。このときＰＣＲ増幅に用いた鋳型は大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡである。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、ＧＳＨ ＩＩ遺伝子の全長（配列番号４）が含まれていることを確認した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＳＨＩＩを構築した。この組換えベクターｐＮＧＳＨＩＩを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＧＳＨＩＩ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨ ＩＩ活性は５Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜実験３＞
ストレプトコッカス・アガラクチエ由来２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ Ｆ）の調製
大腸菌での発現用にコドンを最適化し、Ｎ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させたストレプトコッカス・アガラクチエ由来のＧＳＨ Ｆ遺伝子断片（配列番号７）を遺伝子合成法にて取得（ユーロジェンテック社製）した。得られた遺伝子断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＧＳＨＦを構築した。この組換えベクターｐＮＧＳＨＦを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＧＳＨＦ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＧＳＨ Ｆ活性は３Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜実験４＞
アシネトバクター・ジョンソニ由来ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）の調製
大腸菌での発現用にコドンを最適化し、Ｎ末端部分の塩基配列に制限酵素ＮｄｅＩの切断部位、Ｃ末端部分の塩基配列に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を結合させたアシネトバクター・ジョンソニ由来のＰＡＰ遺伝子断片（配列番号８）を遺伝子合成法にて取得（ユーロジェンテック社製）した。得られた遺伝子断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＰＡＰを構築した。この組換えベクターｐＮＰＡＰを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＰＡＰ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。酵素活性を測定すると、ＰＡＰ活性は４０Ｕ／ｍｌ、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫ活性は９０Ｕ／ｍｌであった。続いて、遠心分離により菌体を集め、２．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、超音波破砕し酵素液とした。

＜収率の算出＞
本明細書の実験における各化合物の収率の算出方法は以下の通り。

反応生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより定量し、下記式により収率を求めた。
収率：各化合物の生成量（ｍｏｌ）／初発のＬ−シスチン（ｍｏｌ）×１００

上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この溶出条件では、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、還元型γ−グルタミルシステイン（γ−ＧＣ）、酸化型γ−ＧＣ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の順で溶出する。
［収率の分析］
カラム：ＯＤＳ−ＨＧ−３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解し、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ。

＜実施例１＞

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３６２９ｇ（２．１５ｍｍｏｌ）、Ｌ−シスチン２塩酸塩０．３１１３ｇ（０．９９ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．７０７９ｇ、ＡＴＰ０．０５８３ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．８ｇ、蒸留水１２ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．８ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ Ｉ）酵素液を２ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液２ｇを添加し、反応開始した。反応温度は３０℃で行なった。１時間反応後に反応液を分析したところ、酸化型γ−グルタミルシステインの生成が確認できた。収率は、対初発Ｌ−シスチンで１時間反応後に２０ｍｏｌ％であり、２２時間反応後に９５ｍｏｌ％であった。この際、２２時間反応後の還元型γ−グルタミルシステインの生成量は、対初発Ｌ−シスチンで１ｍｏｌ％以下であった。

なお、実験１で調製したＧＳＨ Ｉ酵素液と実験４で調製したＰＡＰ酵素液には、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫが含まれるため、ＡＤＫを別途調製する必要はなかった。

＜実施例２＞

上記実施例１の反応２２時間後の反応液にグリシン０．１９ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）、実験２で調製したグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ ＩＩ）酵素液を２ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液２ｇを添加し、反応を開始した。この際、１５質量％水酸化ナトリウム水溶液０．２ｇでｐＨを７．５に調整した。１時間反応後で反応液を分析したところ、酸化型グルタチオンの生成が確認できた。収率は、対初発Ｌ−シスチンで１時間反応後に２０ｍｏｌ％であり、６時間反応後に８６ｍｏｌ％であった。この際、６時間反応後の還元型グルタチオンの生成量は、対初発Ｌ−シスチンで１ｍｏｌ％以下であった。

なお、実験２で調製したＧＳＨ ＩＩ酵素液と実験４で調製したＰＡＰ酵素液には、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫが含まれるため、ＡＤＫを別途調製する必要はなかった。

＜実施例３＞

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．０７１７ｇ（０．４２ｍｍｏｌ）、Ｌ−シスチン２塩酸塩０．０６４３ｇ（０．２１ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．２０５３ｇ、ＡＴＰ０．２４ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）、蒸留水１７ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．２６ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験１で調製したγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ Ｉ）酵素液２ｇを添加し、反応開始した。反応温度は３０℃で行なった。２時間反応後に反応液を分析したところ、酸化型γ−グルタミルシステインの生成が確認できた。収率は、対初発Ｌ−シスチンで２時間反応後に１２ｍｏｌ％であり、２３時間反応後に９５ｍｏｌ％であった。この際、２３時間反応後の還元型γ−グルタミルシステインの生成量は、対初発Ｌ−シスチンで１ｍｏｌ％以下であった。

＜実施例４＞

上記実施例３の反応２３時間後の反応液にグリシン０．０４２６ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．２０６４ｇ、ＡＴＰ０．２３９２ｇ（０．４ｍｍｏｌ）、実験２で調製したグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ ＩＩ）酵素液２ｇを添加し、反応を開始した。この際、１５質量％水酸化ナトリウム水溶液０．２ｇでｐＨを７．５に調整した。１時間反応後で反応液を分析したところ、酸化型グルタチオンの生成が確認できた。収率は、対初発Ｌ−シスチンで１時間反応後に６ｍｏｌ％であり、５時間反応後に７０ｍｏｌ％であった。この際、５時間反応後の還元型グルタチオンの生成量は、対初発Ｌ−シスチンで１ｍｏｌ％以下であった。

＜実施例５＞

Ｌ−グルタミン酸Ｎａ１水和物０．３６６２ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）、Ｌ−シスチン２塩酸塩０．３１２１ｇ（１．００ｍｍｏｌ）、硫酸マグネシウム７水和物０．７０１９ｇ、ＡＴＰ０．０５８ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）、メタリン酸Ｎａ０．８ｇ、蒸留水１２ｇを混合し、１５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．８ｇでｐＨを７．５に調整した。そこへ実験３で調製した２機能性グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ Ｆ）酵素液を２ｇ、実験４で調製したＰＡＰ酵素液２ｇを添加し、反応開始した。反応温度は３０℃で行なった。１時間反応後に反応液を分析したところ、酸化型γ−グルタミルシステインの生成が確認できた。収率は、対初発Ｌ−シスチンで１時間反応後に９ｍｏｌ％であり、１９時間反応後に６１ｍｏｌ％であった。この際、１９時間反応後の還元型γ−グルタミルシステインの生成量は、対初発Ｌ−シスチンで１ｍｏｌ％以下であった。

なお、実験３で調製したＧＳＨ Ｆ酵素液と実験４で調製したＰＡＰ酵素液には、宿主細胞として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＫが含まれるため、ＡＤＫを別途調製する必要はなかった。

配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

1. Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を含むことを特徴とする、酸化型γ−グルタミルシステインの製造方法。
2. 前記工程Ａ’が、γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との存在下で、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａである、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をＡＴＰへと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項２に記載の方法。
4. 前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来である、請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項２又は３に記載の方法。
6. 酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成する工程Ｂ’を含むことを特徴とする、酸化型グルタチオンの製造方法。
7. 前記工程Ｂ’が、グルタチオン合成酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との存在下で、酸化型γ−グルタミルシステインとグリシンとを反応させることにより酸化型グルタチオンを生成する工程Ｂである、請求項６に記載の方法。
8. 前記工程Ｂが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をＡＴＰへと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項７に記載の方法。
9. 前記グルタチオン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来である、請求項７又は８に記載の方法。
10. Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａ’を更に含み、
    前記工程Ｂ’に用いられる酸化型γ−グルタミルシステインが、前記工程Ａ’により生成されたものである、
    請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記工程Ａ’が、γ−グルタミルシステイン合成酵素及び２機能性グルタチオン合成酵素からなる群から選択される少なくとも１種の酵素とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）との存在下で、Ｌ−シスチンとＬ−グルタミン酸とを反応させることにより酸化型γ−グルタミルシステインを生成する工程Ａである、
    請求項１０に記載の方法。
12. 前記工程Ａが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をＡＴＰへと再生するＡＴＰ再生反応と共役させて行われる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記γ−グルタミルシステイン合成酵素がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来である、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記２機能性グルタチオン合成酵素がストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来である、請求項１１又は１２に記載の方法。